Obligát anaerob mikroorganizmusok

felszaporítása

Obligát anaerob mikroorganizmusok

Obligát anaerobnak nevezünk egy mikroorganizmust, ha az csak anaerob viszonyok között képes létezni. Abból adódik az obligát jellege, hogy nem rendelkezik kataláz enzimmel. A kataláz enzim segítségével bontaná az oxigén jelenlétében keletkező peroxidot, ami méreg számára.

2O2- + 2H+ szuperoxid dizmutáz H2O2 + O2

H2O2 kataláz H2O + ½ O2

E két jellemző reakció hiányzik az obligát anaerob mikroorganizmusok esetén.

Obligát anaerob mikroorganizmusok fontossága

A kizárólag anaerob mikroorganizmusok a talaj alsóbb oxigénhiányos rétegeiben helyezkednek el az aerob és a fakultatív anaerob életterek alatt. Életfunkcióik fenntartásához anaerob oxidációval nyernek energiát. Ez többféle vegyület jelenlétében lehetséges. Ezek szerint beszélünk nitrátlégzésről, szulfátlégzésről és karbonátlégzésről. A környezetbe kerülő szennyezések lebontásához az effajta légzésüket használjuk fel, mely során a szennyezőanyagok oxidálásával nyerik a szükséges energiát, miközben azok lebomlanak vagy kevésbé veszélyes, könnyebben bontható termékekké alakulnak.

Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

Egy környezeti elemben, esetünkben a talajban bekövetkező szennyezés elhárítása esetén rövid idő alatt és nagy mennyiségben kellene a lebontást végző mikroorganizmusoknak elszaporodnia. Ezen mikroorganizmusoknak talajban való jelenlét monitorozzuk a felszaporítás segítségével. Az eljárás a mikroorganizmusok talajmintából való könnyebb izolálását teszi lehetővé, mivel az izoláláshoz kellő számú mikroorganizmusra van szükségünk. Ha nincs kellő számú lebontást végző mikroba a talajban, akkor előre felszaporított formában juttathatunk a talajba, a lebontás meggyorsítása érdekében.

Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

A felszaporítás általában laboratóriumi körülmények között zajlik. A következőkben néhány obligát anaerob mikroorganizmus felszaporítását mutatom be részletesen.

Szulfát redukálók CO2 redukálók

Cellulóz lebontó Clostridia felszaporítása

Szulfát redukálókfelszaporítása

A szulfát redukálók obligát anaerob baktériumok, melyek az anaerob talajban és vízben fordulnak elő. Heterotrófok és hexózokat, alkoholokat, szerves savakat hasznosítanak szénforrásként. A szulfát mellett a szulfitot és a tioszulfátot is kénhidrogénné redukálja.

Szulfát redukálók felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: 0,2 %-os NaCl oldat

0,2 g NaCl-ot 80 ml desztillált vízben feloldva, majd 100 ml-ig szintén desztillált vízzel jelre töltve és autoklávozva készül. Só oldat hozzávalói

0,5 g K2HPO4

1,0 g NH4Cl

1,0 g CaSO4

2,0 g MgSO4.7H2O5,0 g Na laktát (70% m/m)10,0 g agar930,0 ml desztillált vízAz oldat pH-ját 8,1-re állítjuk.

Vas-ammónium-szulfát [FeSO4(NH4)2.6H2O] oldat

FeSO4(NH4)2SO4.6H2O oldat 3 egymást követő napon át tartó, napi 1 órás gőzölésével készül. Élesztő kivonat-oldat

10%-os oldatot készítünk és autoklávozzuk. Nátrium-tioglikolát oldat (10%) Tápoldat, 1 l

Autoklávozzuk az oldatot, lehűtjük, majd anaerob steril fülkében dolgozunk. 50 ml sterilszűrt vas-ammónia-szulfát oldatot, 10 ml élesztő kivonat-oldatot és 10 ml nátrium-tioglicerát oldatot adunk hozzá, majd a só oldathoz adagoljuk. Állítsuk be a végső pH-t 7,2-7,6 közé. Végül porciózzuk a táptalajt steril kémcsövekbe.

Szulfát redukálók felszaporítása

Az eljárás

A talaj mintával anaerob steril fülkében dolgozzunk, először szuszpendáltassuk NaCl oldatban. Készítsünk 1:10-es hígítást NaCl oldattal és oltsuk be a kémcsöveket 0,1-1,0 talaj szuszpenzióval. A legalább 4 hetes inkubációs periódus után válnak láthatóvá a szulfát redukáló baktérium telepek.

Szulfát redukálók felszaporítása

A szén-dioxid redukálók szintén obligát anaerob baktériumok. A következő reakciót katalizálják:

H2+CO2 CH4, acetát

Csak vízzel elárasztott anaerob talajokban találhatók.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: Vitamin oldat

1000,00 ml desztillált víz2,00 mg biotin2,00 mg folsav10,00 mg piridoxin-hidroklorid5,00 mg tiamin-hidroklorid5,00 mg ribiflavin5,00 mg nikotinsav5,00 mg kalcium-pantotenát0,01 mg B12 vitamin5,00 mg p-aminobenzoesav1,00 mg liposav4 oC-on tárolva.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Ásványi oldat0,50 g Titripex I6,20 g MgSO4.7H2O0,55 g MnSO4.7H2O1,00 g NaCl0,10 g FeSO4.7H2O0,17 g CoCl2.6H2O0,13 g CaCl2.2H2O0,18 g ZnSO4.7H2O0,05 g CuSO4.7H2O0,018 g AlK(SO4) 2.5H2O0,010 g H3BO3

0,011 g Na2MoO4.2H2O

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Redox közeg165,5 ml desztillált víz15,5 ml NaOH (1 M)2,5 g cisztein.HCl.H2O2,5 g Na2S.9H2O

A NaOH-ot hígítsuk vízzel és óvatosan forraljuk fel O2 mentes nitrogén bevezetése mellett. Majd hűtsük jégen, adjuk hozzá a ciszteint és a Na2S-t, végül 4 hétig szobahőmérsékleten 250 ml-es edényekben autoklávozzuk. Ebből adjunk 1 ml-t a tápoldat 100 ml-éhez.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A Titriplex I-t oldjuk fel 10 ml NaOH (0,5 M)-ban és hígítsuk desztillált vízzel 500 ml-ig. Oldjuk fel a sókat is az oldatban és hígítsuk tovább 1000 ml-ig.

Resazurin oldat0,1 g resuzarint feloldunk 100 ml desztillált vízben és az oldatot átszűrjük sterilszűrőn.

Hígító folyadék

1,0 g NH4Cl

0,1 g MgSO4.7H2O

0,4 g K2HPO4

0,4 g KH2PO4

2,0 ml resazurin oldat40,0 ml redox közeg

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben és töltsük jelre 1000 ml-ig.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Brómkrezol zöld agar100 ml desztillált víz1 g agar0,01 g brómkrezol

Tápanyag oldat950,00 ml desztillált víz1,00 ml resazurin oldat1,0 g NH4Cl0,68 g KH2PO4

0,87 g K2HPO4

0,04 g MgSO4.7H2O20,00 ml vitamin oldat20,00 ml ásványi oldat2,00 g élesztő kivonat10,00 g NaHCO3

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Állítsuk be a pH-t 7,8-ra, majd fokozatosan forraljuk fel a tápanyagot oldatot N2/CO2 (80%/20%) áram bevezetése közben. A hűtés után adjunk hozzá, 0,5g cisztein.HCl.H2O-t és 0,25 g Na2S.9H2O-t. Folyamatos gázkeverék áram mellett részletekben (100 ml) töltsük ki a tápanyag oldatot lapos üvegekbe, majd autoklávozzuk 120 oC-on 30 percig. A lehűlés után, ha szükséges újból állítsuk be a 7,8-as pH-t.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Az eljárás

Anaerob, steril körülmények között (fülkében) szuszpendáltassunk 1 g talajt 10 ml hígító folyadékban. Egyenletes oszlassuk el 0,1 ml-es részleteit ezeknek a hígításoknak az agaron, folyamatos 67%-os H2 és 33%-os CO2 áram mellett. Zárjuk az üvegeket és inkubáljuk 37 oC-on néhány hétig. A metanogén és acetogén baktériumok megkülönböztetésére óvatosan öntsünk 5 ml-t a brómkrezol zöld agar oldatból a telepek tetejére. A sav-termelő telepek és a környékük sárgává fognak válni körülbelül 1 óra után, miközben a CH4 termelő telepek kékek maradnak.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A Clostridia obligát anaerob spórás baktérium, melynek elsődleges élőhelye a talaj. Szén és energiaforrásként cukrot, keményítőt, pektint, aminosavakat, szerves savakat, fehérjét és cellulózt egyaránt hasznosít. A cellulóz lebontó baktériumoknak kiemelt szerepe a növényi maradványok lebontásában, mivel azok egyik fő alkotóeleme a cellulóz.

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: Cellulóz szuszpenzió

Tegyünk felaprított cellulóz és Nátrium-karboxi-cellulóz keveréket desztillált vízbe, hogy 2%-os (m/V) szuszpenziót alkossanak.

Hígító folyadék1,0 g ammónium-szulfát

0,1 g MgSO4.7H2O2,0 g NaCl

0,1 g CaCl21,3 g K2HPO4

0,7 g KH2PO4

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és autoklávozzuk.

A típusú só oldat1 g ammónium-szulfát2 g NaCl13 g K2HPO4

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és kevertessük autoklávval.

B típusú só oldat50,00 ml desztillált víz0,05 g MgSO4.7H2O0,05 g CaCl2

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Resazurin oldat

0,1 g resuzarint oldjunk fel 100 ml desztillált vízben és szűrjük át sterilszűrőn.

Tápoldat

500 ml A típusú só oldat

200 ml cellulóz szuszpenzió

250 ml desztillált víz

1 ml resazurin oldat

15 g agar

1 g élesztő kivonat

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Összekeverés után 1000 ml-ig töltsük fel desztillált vízzel, majd autoklávozzuk. Hűtés után (45 oC), anaerob tartályban tároljuk. Oldjunk fel 0,5 g Cisztein.HCl-t 50 ml B típusú só oldatban, majd sterilre szűrjük és adjuk hozzá a tápoldathoz. 45 oC-on, steril anaerob tartóban tároljuk szétporciózva.

Az eljárás

A talajmintával anaerob steril fülkében dolgozzunk. Először szuszpendáljuk 1 g-ját 10 ml hígító oldatban, majd oltsuk be az összes meleg agar csészét 0,1 ml szuszpenzióval (pár csészét csak hígító oldattal). Oszlassuk szét, hagyjuk megszilárdulni és inkubálni 28-35 oC-on. A cellulóz-bontó baktérium növekedését a cellulóz agar tisztulása fogja jelezni.

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Forrás: Forrás: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in

Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995Academic Press Limited, London, 1995