metodos experimentales

METODOS EXPERIMENTALES

NEUROCIENCIAS II

Ablación experimental

Extirpación o destrucción de una parte del encéfalo de un animal de

laboratorio; se espera que las funciones que ya no puedan

ejecutarse sean las que controlaba previamente la región.

Ablatus – llevarse.

Estudios de lesión:

El funcionamiento de un área cerebral puede deducirse basándose en las conductas que el animal ya no puede realizar después de que se haya destruido dicha área.

El objetivo es descubrir cuáles son las funciones que realizan las diferentes regiones cerebrales y luego entender cómo se combinan estas funciones para dar lugar a determinadas conductas.

Cuidado con…

Todas las regiones del encéfalo están interconectadas.

Ser lo más específico posible.

Producción de lesiones cerebrales

Lesión por radiofrecuencia.

Las flechas señalan las minúsculas

lesiones producidas por el paso de corriente de

radiofrecuencia a través de los extremos de

electrodos de acero inoxidable, situados

en el núcleo preóptico medial del encéfalo de una rata.

Producción de lesiones cerebrales

Acido kaínico.

Destruye las neuronas estimulándolas hasta que mueren.

AK estimula los receptores glutamatérgicos.

“Lesión excitotóxica”

Lesión excitotóxica

Mas específico…. 6-hidroxidopamina (6-HD).

Es similar a las catecolaminas noradrenalina y dopamina.

Es captada selectivamente por los axones y botones terminales de neuronas noradrenérgicas o dopaminérgicas y actúa como una toxina dañándolas o destruyéndolas.

Lesión falsa (sham). Procedimiento placebo que reproduce todos los

pasos de realización de una lesión cerebral salvo el que realmente la causa (SSI).

CIRUGÍA ESTEREOTÁXICA

Cirugía estereotáxica

Cirugía cerebral que utiliza un

aparato estereotáxico para situar un

electrodo o una cánula en un

lugar específico del encéfalo.

Aparato estereotáxico

Cirugía estereotáxica

Cirugía estereotáxica

Atlas estereotáxicoPaxinos y Watson, 1998

Conjunto de fotografías o dibujos de secciones del encéfalo de un determinado animal.

Tiene coordenadas que permiten a un cirujano llegar a una determinada región del encéfalo del animal con un aparato estereotáxico.

Necesitamos una referencia externa Bregma. Es el punto de unión de las suturas sagital y coronal del cráneo. Suele utilizarse como punto de referencia en la cirugía estereotáxica cerebral.

Atlas estereotáxicoPaxinos y Watson, 1998

Atlas Neuroanatómico de rata.

Para corte coronal y sagital.

Nomenclatura

Peso rata 280-320 Kg.

Ratas macho

Página atlas estereotáxico

Cirugía extereotáxica en un paciente humano

SACRIFICIO DE ANIMALES

Depende de lo que se quiera medir

Guillotina Anestesia Perfusión intracardiaca

Se reemplaza la sangre de un animal por SSI y fijador.

Objetivo. Preparar el cerebro para su análisis histopatológico.

Perfusión intracardiaca

METODOS HISTOLÓGICOS

Fijación y obtención de

seccionesMICROTOMO

Tinción

CA1 GD

CA4

CA3

CA2 B

B

A

Corte coronal de cerebro de rata procesado con la técnica

histológica Hematoxilina Eosina mostrando: A) el rastro el

electrodo bipolar en las diferentes áreas del hipocampo, cada círculo

representa la punta de un electrodo B) acercamiento de la

zona marcada en rectángulo en A observando el rastro del electrodo

bipolar en la capa piramidal de CA1.

Microscopía electrónica

Para poder ver estructuras

anatómicas tan pequeñas como las vesículas sinápticas

y detalles de los organelos celulares.

Se pasa un haz de electrones de un

lado a otro del tejido a examinar.

Sinapsis axo-dentrítica

Microscopio electrónico de

barrido

Grado de amplificación.

Muestra objetos en tres dimensiones.

El microscopio examina (barre) el tejido mediante un

haz móvil de electrones.

La información recibida por la

reflexión del haz se utiliza para producir

una imagen tridimensional muy

detallada.

Neuronas y neuroglía.

Conociendo la función de una región determinada….

¿Cuales son las estructuras que le aportan información y cuáles la reciben de ella?

Uso de PHA-L (marcador) para marcar axones eferentes

Marcado de axones aferentes

Método de marcado

retrógrado.

Se inyectó oro fluorado en el

Núcleo Ventromedial del

Hipotálamo, donde fue captado por los botones terminales y transportado de vuelta a través de los axones hasta

sus somas celulares.

Estudio del cerebro humano

in vivo

TAC – Tomografía Axial Computarizada

RM sagital medial de un

cerebro humano

RESONANCIA MAGNETICA FUNCIONAL (IRMf)

Registro de la actividad neural

Registro con microelectrodos

MICROELECTRODOS CONJUNTO DE ELECTRODOS UNIDOS AL CRÁNEO

Registro con macroelectrodos

POLÍGRAFO

Registro de la actividad metabólica y sináptica del cerebro

Autorradiografía con 2-DG

TEP

IRMf

Medida de las secreciones cerebrales

Microdiálisis

TEP

Cánula intracraneal

Métodos neuroquímicos

Inmunocitoquímica

INMUNOFLUORESCENCIAS

(Guevara, 1998)

Placa neurítica, AbALL: Amaranthus leucocarpus

Maraña neurofibrilar, TauMRL: Machrobrachium rosenbergii

(Guevara et al, 1998)

Marañas neurofibrilares. (Tomada de Guevara, 1998).

HSP70AstrocitosNucleos

HSP70AstrocitosNucleos

AD Control

NCAM-PSAA, B, C:

NCAM-PSAMaraña Neurofibrilar

A B

C D

D:NCAM-PSA

Placa Neurítica

ColocalizaciónEstructuras

Meganeuríticas

IGF-IIR : FITCHSP90 : Rodamina

Nucleos : DAPI

IGF-IIR : FITCNCAM-PSA : Rodamina

Nucleos: DAPI

FIN……………..