metabolismo do dna
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Metabolismo do DNAMetabolismo do DNA
• Replicação do DNA
• fidelidade + velocidade
• Reparo
• múltiplos processos - resolução de injúrias
• Recombinação
• rearranjo da informação genética
Fidelidade da ReplicaFidelidade da Replicaççãoão
• Conceito de “molde”
• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.
• Universalidade de processo e mecanismos de catálise para todos os organismos estudados.
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
Watson & Crick
Meselsohn e Stahl,1958
.
A replicação do DNA ésemiconservativa
15N
15N + 14N
15N + 14N
14N
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
OrigemOrigem de de replicareplicaççãoão
Fago λ• Seqüência nucleotídica
variável
• únicas X múltiplas
• múltiplas repetições curtas
• proteínas ligantes
(organização do sítio)
• ⇑ conteúdo AT
Características comuns
Regras fundamentaisRegras fundamentais
• A replicação do DNA é semiconservativa
• A replicação tem uma origem e procede bidirecionalmente
• A síntese de DNA ocorre na direção 5’-3’ e é semidescontínua
SSííntesentese semi semi descontdescontíínuanua: : diredireççãoão 55’’ →→ 33’’
SSííntesentese de DNA: as DNA de DNA: as DNA PolimerasesPolimerases
A. Kornberg 1955: DNA polimeraseI
Requerimentos:
fita molde
iniciador (oligo 3’ OH livre)
DNA DNA PolPol I+ II e III: I+ II e III: pappapééisis definidosdefinidos
DNA Pol I -> 90% da atividade Polimerásica
Adição de nt ~20 x inferior ao movimento da forquilha
Processividade baixa
gene defectivo (DNA Pol I inativa) → linhagem viável (J. Cairns: 1969)
DNA polimerase II: reparo
DNA DNA polimerasepolimerase III: III: replicareplicaççãoão
A A precisãoprecisão do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
• E. coli = 1 erro / 109-1010 nucleotídeos adicionados
• DNA polimerases: 1 erro / 104-105
• Erro in vivo: +++ mecanismos enzimáticos
• Atividade exonucleásica 3’→ 5’ = prova de leitura
• Outros sistemas de reparo
↓
1 erro/104-105
PolimerizaPolimerizaççãoão && DNA DNA PolimerasePolimerase
fita molde
fita nova
DNA DNA polimerasespolimerases I, II, IIII, II, III
GENEESTRUTURAL
POL A POL B POL C
SUBUNIDADES 1 >4 >103’→5’ EXON. SIM SIM SIM
5’→3’ EXON. SIM NÃO NÃO
NT+/SEGUNDO
16-20 ~7 250-1000
PROCESSIVI// 3-200 >10.000 > 500.000
EmpacotamentoEmpacotamento X X precisãoprecisão funcionalfuncional
Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers
CompactaCompactaççãoão ddo DNA o DNA GenômicoGenômico
Precisão e dinâmica:replicação e transcrição
Principles Of Biochemistry (Second Edition)Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M. CoxWorth Publishers
NemNem ssóó de DNA de DNA polimerasepolimerase vive a vive a ssííntesentese de DNA. . .de DNA. . .
• Catálise: + um nucleosídeo (5’-PO) ao 3’OH livre da cadeia
“Toda” DNA polimerase necessita da presença de um iniciador
para catalisar a + de nucleotídeos
• A dupla fita é antiparalela (polaridade química)
• As DNA polimerases não desespiralizam o DNA
MaquinariaMaquinaria: DNA: DNA replicase/replissomoreplicase/replissomo
Separação das Fitas: Helicases
Estresse Topológico: Topoisomerases
Manutenção da “bolha”: SSB
Adição de Iniciadores: Primases
Retirada de Oligo-RNA: Polimerase I
Resolução dos “Nicks”: DNA Ligase
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
IniciaIniciaççãoão
Elongação
Terminação
IniciaIniciaççãoão
Estágio que
controla a replicação
IniciaIniciaççãoãoDNA molde superespiralado
OriC
Tetrâmeros de DnaA+ sítios de ligação
Monômeros DnaA = + sítios de ligação
Monômeros de DnaAenrolados sobre OriC
DnaA: 20 a 40 monômeros
Complexo Inicial
Hexâmeros de DnaB e C
Subunidades de DnaC
Complexo Aberto
Região OriC aberta
Ligação de SSB às regiões fita simples
Complexo de pré iniciação
“liberação” da região com DnaA associada
Região OriC aberta
Iniciação e replicação
Sítio Replicador:3 x 13nt – GATCTNTTNTTTT4 x 9nt – TTATCCACA
IniciaIniciaççãoão
Estágio que controlaa replicação
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
Iniciação
ElongaElongaççãoão
Terminação
Duas operações similares
Dois mecanismos distintos
fita líder (contínua)
fita lerda ou atrasada (descontínua)
Enzimas necessárias: DNA helicase, DNA topoisomerase,
SSB, primase, etc...
ElongaElongaççãoão
ElongaElongaççãoão
ElongaElongaççãoão: : SSííntesentese dada fitafita atrasadaatrasada
ligase
DNA pol III +
DNA pol I
DNA pol III +
DNA pol I
primase(iniciase)
ElongaElongaççãoão
http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp11/1102003.html
http://www.youtube.com/watch?v=teV62zrm2P0
DNA DNA polimerasepolimerase II
Atividade exonucleásica 5’-3’
Síntese da fita lerda
EstEstáágiosgios do do processoprocesso de de replicareplicaççãoão
Iniciação
Elongação
TerminaTerminaççãoão
Sítios TER (E. coli) + proteína TUS (Helicase impedida)
Separação das moléculas completas: Topoisomerase IV (tipo 2)
Partição das duas moléculas (?) mecanismo pouco conhecido
TerminaTerminaççãoão
CCéélulaslulas EucariEucarióóticasticas
Características gerais da replicação são as mesmas em pró e eucariotos.
Outras Proteínas/fatores, funções ≅ , complexidade ⇑
Mapeamento de diversas origens sugerem:
regiões permissivas para iniciação (bidirecional)
heterogeneidade em tamanho e comportamento
Mamíferos: decisão sobre sítio de iniciação a cada fase S.
Seqüência X Estrutura
EucariotosEucariotos X X ProcariotosProcariotos
Diferença: cromossomos lineares.
Telômeros: estrutura especializada na extremidade dos
cromossomos lineares.
Repetições em Tandem: TxGy
Replicação
Replicação do DNA é semi-conservativa;
Campisi et al. Experimental Gerontology 2001; 36: 1619-1637
Síntese pela telomerase (Transcriptase reversa)
Perda de extremidades a cada divisão celular;
(humanos 50-150pb por divisão)
TelômeroTelômero e telomerasee telomerase
5’
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
E o cromossomo encurta progressivamente. . .
Falta molde na extremidade 3’ para síntese. . .
http://www.youtube.com/watch?v=AJNoTmWsE0s
Telomerase
Transcriptase reversa
RNA (molde)
proteína
atividade células tumorais e germinativas
http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/13DNAreplication/Telomerase.html
Estrutura
LeBel, C. et al. J Cell Sci 2005;118: 2785-2788
Centrômero
Centrômero
TAS
TAS
T-loop
Humano
Camundongo
Griffith,JD. et al. Cell 1999; 97: 503-514
A replicação da extremidade gera 3’ fita simples – formação de estrutura de laço (T-loop);
TAS – seqüências associadas a telômeros
TelômeroTelômeross
FunçãoTelômeros são essenciais para a integridade do genoma
Protegem as regiões terminais de degradação
Distinguem a extremidade normal de região de dano
Organização funcional dos cromossomos no núcleo
Funciona como relógio molecular (replicações e senescência)
Estrutura: proteínas associadas
Rodier et al/The international Journal of Biochemistry & Cell Biology 2005; 37:977-990
Tankirase- poly ADP-ribosilaseRMN- Complexo RAD50-MRE11-NSB1WRN- DNA helicase e exonuclease
TelômeroTelômeross
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