maq-eaux 08
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Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux – Institut Pasteur d’Algérie – Mai 2008
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Organise
En Collaboration avec le Bureau de Liaison de l’OMS à Alger
NEUVIEME COURS NATIONAL D’HYGIENE ET DE MICROBIOLOGIE DES ALIMENTS
UNITE :
« MICROBIOLOGIE DES EAUX ET DES BOISSONS »
du 03 au 14 Juin 2006
MANUEL DE TRAVAUX PRATIQUES DES EAUX
Responsable des Travaux Pratiques : Dr LEBRES – IPA
Assistants : Mr Azizi Djamal Mr Boudjellab Badreddine
Mr Toaouchichet Belkacem
Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux – Institut Pasteur d’Algérie – Mai 2008
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SOMMAIRE Analyse des Eaux
Intitulé
Codification Version Date
Recherche et Dénombrement des
Microorganismes revivifiables. Méthode par comptage des colonies obtenues à
30°C, dans les eaux de forage.
MO.MR.EA 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des Microorganismes revivifiables. Méthode par comptage des colonies obtenues à
22 et à 37°C, dans les eaux minérales embouteillées.
MO.MR.EM 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des
Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli dans les eaux par
filtration.
MO.CTT.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli dans les eaux en
milieu liquide.
MO.CTT.ML 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des Entérocoques intestinaux et
Streptocoques fécaux dans les eaux par filtration.
MO.ST.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des Entérocoques intestinaux et
Streptocoques fécaux dans les eaux en milieu liquide.
MO.ST.ML 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement de
Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux.
MO.SA.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement de
Pseudomonas aeruginosa par filtration dans les eaux.
MO.PA.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des Anaérobies Sulfito-Réducteurs par
filtration par comptage des colonies à 44°C dans les eaux
MO.ASR.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche des Salmonella dans les
eaux par filtration.
MO.SL.MS 00 02 / 1 / 06
Recherche de Vibrion cholérique dans les eaux.
MO.VC.MS 00 02 / 1 / 06
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LE PRELEVEMENT
AU ROBINET
ASEPTIE MAXIMUM
FLAMBAGE - DESINFECTION
EVACUATION DES PREMIERS LITRES
DEBIT DE REMPLISSAGE
VOLUME A PRELEVER
PUITS ET FORAGES
CONNAITRE LA NAPPE
CONNAITRE L'USAGE DE CES EAUX
LE TRANSPORT
TEMPERATURE
MULTIPLICATION
MORTALITE
TEMPERATURE DE 4°C
DELAIS
LES PLUS COURTS POSSIBLES
EAUX EMBOUTEILLES
LE DENOMBREMENT DOIT AVOIR LIEU DANS LES
HEURES QUI SUIVENT L'EMBOUTEILLAGE
LES FLACONS
NATURE
VERRE
FLACONS A USAGE UNIQUE
STERILISATION
PAR LA CHALEUR
PAR L'OXYDE D'ETHYLENE
PAR LES RAYONS GAMMA
CONTROLE DE STERILITE
STERILISATION EXTERIEURE
NEUTRALISANTS
THIOSULFATE DE SODIUM (Pastilles)
EDTA
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Mode opératoire / Enregistrement
Code : MO.MR.EM Version : 00 Date : 02/ 01 / 06
Page : 1 / 3
Recherche et dénombrement des Microorganismes revivifiables à 22 et à 37°C dans les eaux minérales embouteillées.
Sommaire : 1. Objet et domaine d’application.
2. Définition. 3. Référentiels.
4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des microorganismes
dans les eaux minérales embouteillées destinés à la consommation humaine par comptage des colonies à 22° et à 30°C.
2. Définition.
Dans le sens de cette méthode, on entend par microorganismes : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué selon la méthode spécifiée.
3. Référentiels.
Norme NF EN ISO 6222 : Dénombrement des micro organismes revivifiables : comptage des colonies par ensemencement dans un milieu de culture nutritif gélosé.
Norme NF V 08-010 : Règles générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
Norme NF EN ISO 6887-1 : Suspension mère et dilutions décimales ; 1. règles générales.
Norme NF V 08-057-2 : Microbiologie alimentaire – Directives générales pour la préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme NF ISO 17025 relative aux prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
4. Mode Opératoire.
A partir de l’eau à analyser (SM = 1) et/ou des dilutions décimales 10-1
et 10-2
, porter
aseptiquement 1 ml en double dans deux boites de Pétri vides, numérotées et préparées à cet usage comme l’indique le schéma n°2 ci-après.
Compléter ensuite avec environ 19 ml de gélose TGEA fondue puis refroidie à 45 ± 2°C. Le temps qui s’écoule entre le moment où l’on a distribué l’inoculum dans la boite
et celui où le milieu est coulé ne doit pas excéder 15 minutes.
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Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour
permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose, sur une surface fraîche et horizontale.
Laisser solidifier les boites sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 5 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Cette double couche , a un rôle protecteur contre les contaminations externes diverses.
Les boites seront partagées en deux séries distinctes :
La première série sera incubée à 22 ± 2°C pendant 68 ± 4 heures ,
La seconde série sera incubée à 36 ± 2°C, pendant 44 ± 4°C heures.
5. Lecture et interprétation.
Les colonies de microorganismes revivifiables apparaissent en masse sous formes
lenticulaires et bien distinctes. Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successives. Il faut qu’une boite renferme au moins 15 colonies. Calculer ensuite la valeur du nombre N, de microorganismes revivifiables à 22 ± 2°C à part et celle du nombre N de microorganismes revivifiables à 36 ± 2°C à part, en tant
que moyenne pondérée, à l’aide de l’équation suivante :
Σ c N = 1,1 x d
où :
Σ c : est la somme des colonies dénombrées sur deux boites de dilutions successives
retenues. d : est le taux de dilution correspondant à la première di lution.
Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs après la virgule.
Le résultat final de microorganismes revivifiables dénombrés à 22°C et à 37°C par ml
d’eau est noté par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x
où x est la
puissance appropriée de 10.
Exemple :
Un dénombrement de microorganismes à 37°C a donné les résultats suivants :
à la première dilution retenue 10-2
: on a 158 colonies.
à la seconde dilution retenue 10-3
: on a 14 colonies.
Σ c 158 + 14 172 N = = = = 15636
1,1 x d 1,1 x 10-2
0,011
Arrondir à deux chiffres significatifs, soit 16000 ou mieux encore :
1,6 x 104 microorganismes par ml d’eau à 22°C ou à 37°C
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Recherche et dénombrement des Microorganismes revivifiables à 22 et à 37°C dans les eaux minérales embouteillées.
1 ml 1ml
Eau à
Analyser 10-1
10-2
1 ml 1 ml 1 ml
Ajouter environ 19 ml de gélose TGEA Laisser solidifier sur paillasse puis incuber à :
22 ± 2°C, 68 ± 4 heures
1 ml 1 ml 1 ml
Ajouter environ 19 ml de gélose TGEA Laisser solidifier sur paillasse puis incuber à :
36 ± 2°C, 44 ± 4 heures
Dénombrer les colonies lenticulaires ayant poussé en masse dans chacune des boites, puis calculer la valeur de N à 22°C puis celle de N à 36°C. Obligatoire Facultatif
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Mode opératoire / Enregistrement
Code : MO.CTT.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06
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Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes. Méthode par filtration.
Sommaire : 1. Objet et domaine d’application.
2. Définitions. 3. Référentiels. 4. Mode opératoire.
5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Il s’agit là d’une méthode de référence qui consiste en la recherche et le
dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes éventuellement présents dans les eaux destinées à la consommation humaine, par comptage des
colonies obtenues en milieu solide après 24 à 48 heures d’incubation en aérobiose à 36 ± 2°C puis à 42 ± 2°C. La présente méthode est recommandée pour les eaux peu contaminées.
2. Définitions.
Au sens de cette méthode, on entend par Coliformes des bacilles à Gram négatifs, aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, ne possédant pas d’oxydase,
capables de se multiplier en présence de sels biliaires et capables de fermenter le lactose avec production d’acide et de gaz en 24 à 48 heures à une température comprise entre 36 et 37°C.
Les Coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés que les coliformes mais à 42 ± 2°C.
Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolérants ayant la particularité de produire de l’indole à partir du tryptophane présent dans le milieu à 42 ± 2°C.
3. Référentiels.
Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries Coliformes partie 1. Méthode par filtration sur membrane.
Norme NF T90-413 : Recherche et dénombrement des coliformes et des
coliformes thermo tolérants. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routine.
Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli
(annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire. La recherche des bactéries coliformes par filtration sur membrane nécessite une
préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes : Essai standard.
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en
quantité suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile.
Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de
0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.
Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types d’eaux à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la
membrane à l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, sur la surface d’une plaque de gélose TTC préalablement préparée. Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 21 ± 3 heures voire 44 ± 4 heures et servira à la recherche
des bactéries coliformes, suivie de l’identification biochimique des Escherichia coli.
Essai rapide.
Un deuxième test dit test rapide peut être effectué parallèlement à l’essai standard et dans les mêmes conditions. Il consiste à filtrer une seconde fois 100 à
250 ml d’eau à analyser selon les types d’eaux à analyser, devant un bec bunsen à travers une seconde membrane qui sera placée dans un premier temps sur une
plaque de gélose TSA à la caséine à incuber couvercle en bas d’abord à 36 ± 2°C pendant 4 à 5 heures puis transférer la membrane sur gélose TBA enrichie en sels biliaires à incuber à 44 ± 0,5°C pendant 19 à 20 heures. Cette méthode sert à
la recherche sélective des Escherichia coli.
5. Lecture et interprétation.
Essai standard. Après la période d’incubation spécifiée, dénombrer les colonies caractéristiques qui se
présentent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentés en jaune orangé ou en jaune (lactose positives).
Repiquer de faon aléatoire 5 à 10 colonies à des fins de confirmation basée sur le test à l’oxydase d’une part et la production d’indole d’autre part. Test à l’oxydase.
Pour les besoins de ce test, effectuer tout d’abord un repiquage sur gélose TSA à la caséine de 5 à 10 colonies, à incuber à 36 ± 2°C pendant 21 ± 2 heures, puis
effectuer le test de l’une des façons suivantes : Imbiber un disque d’oxydase avec une goutte d’eau distillée stérile puis déposer
une colonie caractéristique.
Verser 2 à 3 gouttes du réactif à l’oxydase préparé extemporanément (Tétraméthyl-p-phénylènediamine) sur un papier fi ltre puis étaler dessus une
partie de la culture.
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Dans les deux cas la réaction positive est immédiate et se traduit par un virage au bleu violet foncé.
Test à l’indole. Pour cela, transférer chaque colonie caractéristique séparément (5 à 10) dans un tube
contenant 3 ml de bouillon au tryptophane. Bien triturer la colonie dans le milieu puis incuber ce dernier à 44 ± 0,5°C pendant 21 ± 3 heures puis rechercher la production
d’indole en ajoutant 2 à 3 gouttes du réactif de Kowacs. La présence d’une coloration rouge à la surface du bouillon traduit la production d’indole à partir du tryptophane présent dans le milieu.
En conclusion,
Est considérée comme bactérie coliforme, toute colonie caractéristique (jaune), dépourvue de l’enzyme oxydase et non productrice d’indole.
Est considéré comme bactérie Escherichia coli, toute colonie caractéristique (rouge), dépourvue de l’enzyme oxydase, mais productrice d’indole à 44°C.
Calculer ensuite la valeur a du nombre de bactéries coliformes lactose positives à
part celle des Escherichia coli à part ; le résultat final sera exprimé selon l’équation
mathématique suivante :
b a = C A
où :
b : nombre de colonies caractéristiques présumées dans la boite.
A : nombre de colonies repiquées.
C : nombre total de colonies trouvées dans la boite.
Essai rapide.
Après la période d’incubation spécifiée, transférer la membrane sur un papier filtre
imbibé de réactif de Kowacs puis l’irradier sous une lampe UV pendant 10 à 30 minutes.
Sont considérés comme des Escherichia coli, les colonies qui prennent une coloration rouge : à dénombrer. Le nombre d’ Escherichia coli sera rapporté à 100 ou 250 ml d’eau à analyser.
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Formules des milieux de culture.
1. Gélose lactosée au TTC et à l’heptadécylsulfate de sodium : Milieu de base.
Lactose 20 g Peptone 10 g Extrait de Levure 06 g
Extrait de viande 05 g Bleu de bromothymol 0,05 g
Agar agar 15 à 25 g / l Eau distillée 1000 ml Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225
ml par falcon. pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
2. Solution TTC.
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) 0,05 g
Eau distillée stéri le 100 ml
3. Solution d’heptadécylsulfate de sodium. Heptadécylsulfate de sodium (Tergitol 72) 0,2 g Eau distillée stéri le 100 ml
4. Milieu complet.
Milieu de base 100 ml Solution TTC 05 ml
Solution d’heptadécylsulfate de sodium 05 ml
Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falcon. pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
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5. Bouillon au tryptophane.
Digestat tryptique de caséine 10 g
L-Tryptophane 01 g Chlorure de sodium 05 g Eau distillée 1000 ml
6. Gélose tryptonée au soja (TSA).
Digestat tryptique de caséine 15 g Peptone de soja 05 g Chlorure de sodium 05 g
Agar – agar 15 à 25 g / l Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml
par falcon. pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
7. Gélose tryptonée contenant des sels biliaires (TBA).
Tryptone 20 g
Sels biliaires 1,5 g Agar – agar 15 à 25 g / l Eau distillée 1000 ml
Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falcon.
pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
8. Réactif à l’indole, essai rapide.
p-Diméthylaminobenzaldéhide 0,5 g Acide chlorhydrique, c(HCI) = 1 mol/l 100 ml
Pour être convenablement utilisé, le réactif doit présenter une coloration jaune clair.
9. Réactif à l’oxydase.
Tétraméthyl-p-phénylènediamine 0,1 g
Eau distillée 10 ml Ce réactif n’est pas stable, il convient de le préparer juste avant le test. Prendre des précautions relatives à la protection des yeux et de la peau.
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Code : MO.CTT.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06
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Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries Coliformes. Méthode par filtration.
Filtration de 250 ml d’eau
Eau à
analyser
Entonnoir
Membrane 0,45 µ Rampe
de
Filtration A à
Pompe 3 postes
Essai standard Essai rapide
Milieu TTC Milieu digestat tryptique : TSA
36 ± 2°C 36 ± 2°C 21 ± 3 heures 4 à 5 heures
Milieu digestat tryptique + Sels biliaires TBA
44 ± 0,5°C, 19 à 20 heures TSA B.Tryp
36 ± 2°C 44 ± 0,5°C 21 ± 3 heures 21 ± 3 heures Tests Oxydase Test à l’indole Test à l’indole sur filtre
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Mode opératoire / Enregistrement
Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09
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Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli en milieu liquide.
Sommaire :
1. Objet et domaine d’application.
2. Définitions. 3. Référentiels.
4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode de routine, consiste en la recherche et le dénombrement des bactéries coliformes, coliformes thermo tolérants et des Escherichia coli dans les eaux
destinées à la consommation humaine, en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (NPP).
2. Définitions.
Au sens de cette méthode, on entend par Coliformes des bacilles à Gram négatifs, aérobies ou anaérobies facultatifs, non sporulés, ne possédant pas d’oxydase, capables de se multiplier en présence de sels biliaires et capables de fermenter le
lactose avec production d’acide et de gaz en 24 à 48 heures à une température comprise entre 36 et 37°C.
Les Coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés que les coliformes mais à 42 ± 2°C. Les Escherichia coli sont des coliformes thermo tolérants ayant la particularité de
produire de l’indole à partir du tryptophane présent dans le milieu à 42 ± 2°C.
3. Référentiels.
Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries Coliformes partie 1. Méthode par filtration sur membrane.
Norme NF T90-413 : Recherche et dénombrement des coliformes et des coliformes
thermo tolérants. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des colonies,
méthode de routine.
Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli
(annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire. La recherche et le dénombrement des bactéries coliformes, coliformes thermo
tolérants et des Escherichia coli dans les eaux, en milieu liquide par la technique du NPP, se fait en deux étapes consécutives :
le test de présomption : réservé à la recherche des Coliformes, le test de confirmation : réservé à la recherche des Coliformes thermo tolérants et
Escherichia coli.
Test de présomption.
A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement :
50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu BCPL D/C muni d’une cloche de
Durham
5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL D/C muni d’une cloche de
Durham
5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de
Durham, comme l’indique le schéma n° 2. Chassez l’air éventuellement présent dans les cloches de Durham et bien mélanger le
milieu et l’inoculum. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.
Lecture : Seront considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :
un dégagement de gaz (supérieur au 1/10é de la hauteur de la cloche), un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune (ce qui constitue le
témoin de la fermentation du lactose présent dans le milieu). Ces deux caractères étant témoins de la fermentation du lactose dans les conditions opératoires décrites.
La lecture finale se fait selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe.
Illustration :
Inoculum Test de présomption Nombre Caractéristique
1 X 50 ml + 1
5 X 10 ml +
+ + -
-
3
5 X 1 ml + +
- - -
2
Le nombre caractéristique est donc « 132 » ; ce qui correspond sur la table NPP au
nombre 14. On considère alors qu’il y a 14 Coliformes par 100 ml d’eau à analyser.
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Test de confirmation.
Le test de confirmation est basé sur la recherche de Coliformes thermo tolérants
parmi lesquels on redoute surtout la présence d’Escherichia coli. Les coliformes thermo tolérants ont les mêmes propriétés de fermentation que les coliformes mais à 44°C.
Escherichia coli est un coliforme thermo tolérant qui entre autre : - produit de l’indole à partir du tryptophane présent dans le milieu à 44°C,
- donne un résultat positif à l’essai au rouge de méthyl, - ne produit pas de l’acéthyl méthyl carbinol, - n’utilise pas le citrate comme source unique de carbone.
Les tubes de BCPL trouvés positifs lors du dénombrement des Coliformes feront l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans tube contenant le milieu
Schubert muni d’une cloche de Durham, comme l’indique le schéma n°3.
Chasser l’air éventuellement présent dans les Cloches de Durham et bien mélanger le
milieu et l’inoculum. L’incubation se fait cette fois-ci au bain marie à 44°C pendant 24 heures.
Lecture : Seront considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :
un dégagement gazeux, et un anneau rouge en surface, témoin de la production d’indole par Escherichia coli après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de Kowacs.
La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP en tenant compte du fait que Escherichia Coli est à la fois producteur de gaz et d’indole
à 44°C. Illustration En reprenant l’exemple précédent relatif au dénombrement des Coliformes, cela
suppose que nous avons 6 tubes à repiquer à savoir :
le flacon de BCPL D/C,
3 tubes sur 5 de BCPL D/C, et
2 tubes sur 5 de BCPL S/C.
Inoculum Test de présomption
Nombre Caractéristique
Test de confirmation
Nombre Caractéristique
Gaz Indole
1 X 50 ml + 1 + + 1
5 X 10 ml +
+ + -
-
3
+
+ -
-
+ +
1
5 X 1 ml + +
- - -
2
- +
+ +
1
Tableau Récapitulatif
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Le nombre caractéristique relatif au dénombrement des Coliformes fécaux est donc « 111 », ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 5.
Le résultat final sera donc de :
14 Coliformes totaux dans 100 ml d’eau à analyser 5 Coliformes fécaux dans 100 ml d’eau à analyser
Remarque :
Etant donné que les Coliformes fécaux font partie des Coliformes totaux, il est pratiquement impossible de trouver plus de Coliformes fécaux que de Coliformes totaux.
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Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09
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Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli en milieu liquide.
Eau à
Analyser
Test de présomption
1 X 50 ml 5 X 10 ml 5 X 1 ml
BCPL D/C BCPL D/C BCPL S/C
37°C, 24 à 48 heures
+ + + + - - + + - - -
1 3 2
Cours d’Hygiène et de Microbiologie des Eaux – Institut Pasteur d’Algérie – Mai 2008
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Code : MO.CTT.ML Version : 00 Date : 02/ 01 / 09
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Recherche et dénombrement des Coliformes, Coliformes thermo tolérants et Escherichia coli en milieu liquide.
Test de confirmation
Repiquage sur milieu Schubert + cloche
Incuber à 44°C, 24 heures
Ajouter 2 à 3 gouttes de réactif de Kowacs par tube
+ + ++ +- - - ++ +-
1 1 1
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Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Partie 2 : méthode par filtration sur membrane.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application.
2. Définition. 3. Référentiels.
4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fécaux dans les eaux destinées à la
consommation humaine, par filtration sur membrane.
2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par entérocoques intestinaux des bactéries qui
se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques ou ovoïdes formant des chaînettes, ne possédant pas de catalase mais possédant l’antigène du groupe D.
Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 2 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur
une gélose biliée à l’esculine et à l’azoture.
3. Référentiels.
Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416. Recherche et dénombrement
des entérocoques intestinaux. Partie 2 méthode par filtration sur membrane.
Norme NF T 90-411. Recherche et dénombrement des Streptocoques du
groupe D. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des
colonies, méthode de routine.
Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence
des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
La recherche des entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » par
filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la
membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en quantité
suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile.
Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ
entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stéri le.
Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types d’eaux à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la membrane à l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose
SLANETZ et BARTLEY préalablement préparée.
Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 44 ± 4 heures.
5. Lecture et interprétation
Après la période d’incubation spécifiée, les entérocoques intestinaux ou
Streptocoques du groupe « D » apparaissent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées en rouge, marron ou rose.
Transférer aseptiquement la membrane du milieu de Slanetz et Bartley sur une plaque de gélose Bile esculine azoture (BEA) préchauffée préalablement à 44°C. Cette dernière sera incubée à son tour à 44 ± 0,5°C pendant 2 heures.
Les colonies caractéristiques prennent alors une coloration noire traduisant ainsi l’hydrolyse de l’esculine présente dans le milieu.
Compter le nombre de colonies et le rapporter à 100 ou 250 ml d’eau à analyser.
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Formules des milieux de culture.
1. Milieu de SLANETZ et BARTLEY. Milieu de base.
Tryptose 20,0 g Extrait de Levure 05,0 g Glucose 02,0 g
Hydrogénophosphate dipotassique (K2HPO4) 04,0 g
Azoture de Sodium (NaN3) 0,4 g
Agar – Agar 08 à 18 g Eau distillée 1000 ml
Dissoudre les ingrédients dans l’eau bouillante jusqu’à dissolution complète.
2. Solution TTC
Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium 01 g Eau 100 ml
Dissoudre l’indicateur dans l’eau par agitation. Stériliser par filtration à 0,2 µ.
3. Milieu Complet.
Milieu de base 1000 ml Solution de TTC 10 ml
Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml par falcon.
pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1 Après refroidissement à 50 ou 60°C, ajouter la solution TTC. Ajuster si nécessaire le pH à l’aide d’une solution de carbonate de sodium (100g/l)
ou d’hydroxyde de sodium (40g/l) ou d’acide chlorhydrique (36,5g/l). Les boites coulées peuvent être gardées au réfrigérateur pendant 2 semaines.
4. Gélose à la Bile, à l’Esculine et à l’Azoture.
Tryptone 17,0 g Peptone 03,0 g
Extrait de levure 05,0 g Bile de bœuf déshydratée 10,0 g Chlorure de sodium (NaCl) 05,0 g
Esculine 01,0 g Citrate d’ammonium ferrique 0,5 g
Azoture de sodium (NaN3) 0,15 g
Agar – Agar 08 à 10 g
Eau 1000 ml
Stérilisation 121°C pendant 15 minutes, répartition du milieu à raison de 225 ml
par falcon. pH final après stérilisation à 25°C : 7,2 ± 0,1
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Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Partie 2 : méthode par filtration sur membrane.
Filtration de 250 ml d’eau
Eau à
Analyser
Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe
de
Filtration à Pompe 3 postes
Gélose SLANETZ et BARTLEY
36 ± 2°C, 44 ± 4 heures (en cas de colonies caractéristiques)
Gélose Bile, Esculine, Azoture. 44 ± 0,5°C, 2 heures
Compter le nombre de colonies caractéristiques
et le rapporter à 100 ou 250 ml d’eau à analyser.
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Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Sommaire :
1. Objet et domaine d’application. 2. Définition.
3. Référentiels. 4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des
entérocoques intestinaux ou Streptocoques du groupe « D » de la classification de Lance Field, ou encore Streptocoques fécaux dans les eaux destinées à la consommation humaine, par filtration sur membrane.
2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par entérocoques intestinaux des bactéries qui se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques ou ovoïdes formant
des chaînettes, ne possédant pas de catalase mais possédant l’antigène du groupe D. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 37°C sur un milieu sélectif à
l’azoture de sodium en donnant des colonies caractéristiques réduisant le TTC et qui de plus hydrolysent l’esculine en 2 heures à 44°C après repiquage d’une colonie sur une gélose biliée à l’esculine et à l’azoture.
3. Référentiels.
Norme NF T 90-411. Recherche et dénombrement des Streptocoques du groupe D. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Norme ISO 7899- 2 et Norme NF T 90-416. Recherche et dénombrement des entérocoques intestinaux. Partie 2 méthode par filtration sur membrane.
Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routine.
Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
La recherche et le dénombrement des Streptocoques du groupe « D » dans les eaux,
en milieu liquide par la technique du NPP, se fait en deux étapes consécutives : le test de présomption : réservé à la recherche présomptive des Streptocoques.
le test de confirmation : réservé à la confirmation réelle des Streptocoques du groupe
« D ».
Test de présomption.
A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement :
50 ml dans un flacon contenant 50 ml de milieu ROTHE D/C.
5 fois 10 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE D/C
5 fois 1 ml dans 5 tubes contenant 10 ml de milieu ROTHE S/C.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum.
L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures.
Lecture :
Seront considérés comme présomptifs les tubes présentant un trouble microbien ; seulement ces derniers :
- ne doivent en aucun cas faire l’objet de dénombrement - doivent par contre, absolument faire l’objet d’un repiquage sur milieu LITSKY EVA
dans le but d’être justement confirmés.
Illustration :
Inoculum Test de présomption
1 X 50 ml -
5 X 10 ml + + -
- -
5 X 1 ml +
+ +
- -
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Test de confirmation..
Le test de confirmation est basé sur la confirmation des Streptocoques du groupe
« D » éventuellement présents dans le test de présomption. Les tubes de ROTHE trouvés positifs feront donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’une öse bouclée dans tube contenant le milieu LITSKY EVA.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum. L’incubation se fait cette fois-ci à 37°C, pendant 24 heures.
Lecture :
Seront considérés comme positifs, les tubes présentant à la fois :
un trouble microbien, et une pasti lle violette (blanchâtre) au fond des tubes.
La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP qui figure en annexe.
Illustration
En reprenant l’exemple précédent relatif au test de présomption, cela suppose que nous avons 5 tubes à repiquer à savoir :
2 tubes sur 5 de ROTHE D/C, et
3 tubes sur 5 de ROTHE S/C.
Inoculum Test de présomptio
n
Test de confirmation Nombre Caractéristique Trouble Pastille violette
1 X 50 ml - 0
5 X 10 ml +
+ -
- -
+
+
+
+
2
5 X 1 ml +
+ + -
-
-
+ +
+
+ -
1
Tableau Récapitulatif
Le nombre caractéristique relatif au dénombrement des Streptocoques fécaux est donc « 021 », ce qui correspond sur la table du NPP au chiffre 3.
Le résultat final sera donc de :
3 Streptocoques fécaux dans 100 ml d’eau à analyser
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Recherche et dénombrement des Entérocoques intestinaux. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Test de présomption
Eau à Analyser
1 X 50 ml 5 X 10 ml 5 X 1 ml
ROTHE D/C ROTHE D/C ROTHE S/C
37°C, 24 à 48 heures
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Recherche et dénombrement des Streptocoques du groupe D. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Test de confirmation
Repiquage sur milieu Lytski Eva (1 öse)
37°C, 24 heures
- + + - + -
0 2 1
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Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs. Méthode par incorporation en gélose en tubes profonds.
Sommaire. 1. Objet et domaine d’application.
2. Définition. 3. Référentiels. 4. Mode opératoire.
5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des spores des bactéries
anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs dans les eaux destinées à la consommation humaine, par incorporation en gélose en tubes
profonds.
2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par bactéries anaérobies sulfito-réductrices des bactéries qui se présentent sous forme de bacilles à Gram positif et qui en se
développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48 heures en gélose profonde de type gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, donnent des colonies caractéristiques qui sont de couleur
blanche entourées d’une auréole noire. Cette dernière est le témoin de la réduction du sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de
Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire. La présence de spores de bactéries ASR dans les eaux, sans flore d’accompagnement, constitue généralement un véritable indice de contamination
ancienne.
3. Référentiels.
Norme NF T 90-415. Recherche et dénombrement des spores de bactéries
anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs. Méthode générale par incorporation en gélose en tubes profonds.
Norme NF T 90-417. Recherche et dénombrement des spores de
microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs et de Clostridium. Partie.2 Méthode par fi ltration sur membrane.
Norme ISO 6461 – 2. Recherche et dénombrement des spores de micro- organismes anaérobies sulfito-réducteurs Clostridia. Méthode par fi ltration.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
A partir de l’eau à analyser :
Transférer environ 25 ml dans un tube stérile, qui sera par la suite soumis à un
chauffage de l’ordre de 75°C pendant 15 minutes, dans le but de détruire toutes les formes végétatives des bactéries anaérobies sulfito-réductrices éventuellement présentes. Un autre flacon rempli d’une autre eau servira de témoin de
température.
Après chauffage, refroidir immédiatement le flacon destiné à l’analyse, sous l’eau de robinet.
Répartir ensuite le contenu de ce tube, dans 4 tubes différents et stériles, à raison de 5 ml par tube.
Ajouter environ 18 à 20 ml de gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose
Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, fondue puis refroidie à 47 1°C,
additionnée de leurs additifs spécifiques.
Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en évitant d’introduire des bulles d’air et de l’oxygène.
Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber à :
o 44 4°C, pendant 20 4 heures, dans le cas de la gélose TSC ou TSN.
o 36 2°C, pendant 44 4 heures, dans le cas de la gélose Viande Foie.
5. Lecture et interprétation.
La première lecture doit absolument être faite à 16 heures car très souvent les spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices sont envahissantes auquel cas
on se trouvera en face d’un tube complètement noir rendant ainsi l’interprétation difficile voire impossible et l’analyse sera à refaire en utilisant des di lutions
décimales de 10-1
voire 10-2
, la deuxième lecture se fera à 24 heures et la
troisième et dernière à 44 4 heures.
Dénombrer toute colonie noire de 0,5 mm de diamètre, ayant poussé en masse et
rapporter le nombre total des colonies dans les quatre tubes à 20 ml d’eau à analyser.
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Identification biochimique.
Certains auteurs préconisent l’identification biochimique de toute colonie suspecte car
très souvent il y a développement de colonies de Staphylocoques et de Bacillus à côté, qu’on prendrait à tord pour des colonies d’anaérobies sulfito-réductrices. Pour cela il s’agit de casser le tube à l’aide d’une lime métallique à 1 cm au dessus de
la colonie suspecte et de prendre exactement le centre de la dite colonie. Le centre de la colonie noire suspecte (qui est en réalité blanche mais entourée d’une
auréole noire) sera alors déposé soigneusement dans un tube contenant du bouillon T G Y ou T Y préalablement régénéré à 80°C pendant 15 minutes. Placer ensuite ce tube dans un agitateur (Vortex) pour bien mélanger la colonie dans
le milieu puis l’incuber à 36 2°C en anaérobiose pendant 24 à 48 heures.
Après la période d’incubation, constater le trouble du milieu, puis réaliser les étapes
suivantes :
Etat frais.
Coloration de Gram.
S’il s’agit de bacilles Gram positifs, faire un isolement sur deux boites de gélose
au sang de mouton frais : o l’une sera incubée à 36 2°C en aérobiose,
o l’autre sera incubée à 36 2°C en anaérobiose. Après 24 à 48 heures d’incubation :
o sélectionner les boites ayant poussé strictement en anaérobiose, o noter le type d’hémolyse,
o faire une coloration de Gram puis une réaction catalase, o s’assurer qu’il s’agit bien d’une souche pure, sinon purifier, o puis ensemencer une Galerie biochimique Api 20 A à incuber à 36 2°C en
anaérobiose. o Lecture et identification.
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Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs. Méthode par incorporation en gélose en tubes profonds.
Eau à Analyser
25 ml d’eau à analyser
Chauffage à 75°C, 15 minutes
Refroidissement brutal sous l’eau de robinet Répartir à raison de 5 ml par tube dans 4 tubes
Ajouter environ 18 ml de gélose TSC, TSN ou VF fondue puis refroidie à 47 2°C
Laisser solidifier puis incuber selon protocole
3 + 3 + 2 + 4 Soit 12 Spores d’ASR dans 20 ml
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Code : MO.ASR.MS Version : 00 Date : 02/ 01 / 06
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Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices. Méthode par filtration.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application. 2. Définition.
3. Référentiels. 4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs dans les eaux
destinées à la consommation humaine, par incorporation en gélose en tubes profonds.
2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par bactéries anaérobies sulfito-réductrices des
bactéries qui se présentent sous forme de bacilles à Gram positif et qui en se développant à température de 36 ± 2°C en 24 à 48 heures en gélose profonde de
type gélose Tryptose Sulfite Cyclosérine ou Tryptose Sulfite Néomycine ou encore gélose Viande Foie, donnent des colonies caractéristiques qui sont de couleur blanche entourées d’une auréole noire. Cette dernière est le témoin de la réduction du
sulfite de sodium (Na2SO3) qui se trouve dans le milieu, en sulfure qui en présence de Fe2+ qui donne FeS (sulfure de fer) de couleur noire.
La présence de spores de bactéries ASR dans les eaux, sans flore d’accompagnement, constitue généralement un véritable indice de contamination ancienne.
3. Référentiels.
Norme ISO 6461 – 2. Recherche et dénombrement des spores de micro- organismes anaérobies sulfito-réducteurs Clostridia. Méthode par fi ltration.
Norme NF T 90-415. Recherche et dénombrement des spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices et de Clostridium sulfito-réducteurs. Méthode générale par incorporation en gélose en tubes profonds.
Norme NF T 90-417. Recherche et dénombrement des spores de microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs et de Clostridium. Partie.2
Méthode par fi ltration sur membrane.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire .
La recherche des spores des bactéries anaérobies sulfito-réductrices par fi ltration sur
membrane nécessite une préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la
membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en quantité
suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile. Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,2 µ
entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.
Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
Déposer ensuite aseptiquement 100 ml, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir, enlever la membrane à l’aide de pinces stériles puis la placer dans une boite de façon à ce que la face quadri llée adhère au fond de la boite tout en évitant les bulles d’air sous le filtre.
Verser par la suite environ 18 ml de gélose TSC, TSN ou à défaut gélose VF, fondue puis refroidie à 47 ± 1°C.
Remarque : si on utilise de la gélose VF, il faudrait au préalable chauffer l’eau à une température de 75°C pendant 15 minutes dans le but d’éliminer les formes
végétatives.
Après solidification sur paillasse, cette boite sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures puis 44 ± 4 heures.
5. Lecture et interprétation
Compter les colonies caractéristiques noires aussi bien après la première période
d’incubation soit après 20 ± 4 heures qu’après la seconde période d’incubation soit après 44 ± 4 heures. Rapporter le nombre total de colonies à 100 ml d’eau à analyser.
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Recherche et dénombrement des Spores de bactéries anaérobies sulfito-réductrices. Méthode par filtration.
Filtration de 100 ml d’eau
Eau à
Analyser
Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe
de
Filtration à Pompe 3 postes
Déposer la membrane filtrante 0,2 µ, face quadrillée sur le fond de la boite Ajouter environ 18 ml de Gélose TSC, TSN ou VF
Laisser solidifier sur paillasse Incuber à 36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures (en cas de colonies caractéristiques)
Compter le nombre de colonies caractéristiques
et le rapporter à 100 ml d’eau à analyser.
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Recherche et Salmonella dans les eaux. Méthode par filtration.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application. 2. Définition. 3. Référentiels.
4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et l’identification des Salmonella présentes dans les eaux destinées à la consommation humaine, par filtration. 2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par Salmonella, des bactéries qui se présentent sous forme de bacilles à Gram négatif et qui en se développant à température de 36 ±
2°C en 24 à 48 heures, sur milieu Hektoen, forment de petites colonies, lisses à contours réguliers, pigmentées en vert ou en bleu vert à centre noir. Les Salmonella se divisent en deux grands groupes : les mineures et les majeures qui
sont hautement pathogènes (voir cours).
3. Référentiels.
Norme NF EN ISO 9308 – 1 : Recherche et dénombrement des Escherichia coli et
des bactéries Coliformes partie 1. Méthode par filtration sur membrane.
Norme NF T90-413 : Recherche et dénombrement des coliformes et des
coliformes thermo tolérants. Méthode générale par ensemencement en milieu liquide (NPP).
Norme NF V 08-051 : Dénombrement des Coliformes par comptage des colonies, méthode de routine.
Norme NF V 08-017 : Dénombrement des Coliformes fécaux et d'Escherichia coli (annexe à NF V 08-015 et NF V 08-016).
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
La recherche des Salmonella par filtration sur membrane nécessite une préparation
au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la
membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en quantité suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile.
Mettre en place de façon aseptique une membrane de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stérile.
Fixer ce dispositif la pince correspondante.
Déposer ensuite 250 ml, 500 ml ou plus selon disponibilité jusqu’à 1 voire 5 litres
d’eau à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer la membrane à l’aide d’une pince stérile puis la placer dans un flacon contenant le milieu Eau Peptonée Tamponnée.
Bien mélanger le filtre dans le milieu, puis incuber ce dernier à 36 ± 2°C pendant
20 ± 2 heures. Cette étape constitue l’enrichissement primaire.
Après incubation, procéder à un enrichissement secondaire en transférant 1 ml de
l’enrichissement primaire sur le milieu Rappapport Vassiliadis.
Bien mélanger le milieu et l’inoculum, puis incuber ce dernier à 42 ± 0,5°C pendant
20 ± 4 heures voire 44 ± 4 heures.
Après l’incubation, procéder à l’isolement sur milieu Hektoen ou XLD à incuber à
36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures.
5. Lecture et interprétation.
Repérer les colonies caractéristiques.
Faire une identification biochimique basée essentiellement sur ONPG, TSI, Urée -Indole, LDC…
Si nécessaire faire une identification antigénique basée essentiellement sur l’agglutination à l’aide des sérums de groupe OMA et OMB ou bien s’adresser à un laboratoire compétent en vue d’une confirmation.
Remarque :
Au cas où la quantité d’eau à analyser n’est pas très suffisante, transférer 10
ml directement sur Milieu Eau Peptonée Tamponnée à incuber à 36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures. Cette étape constitue l’enrichissement primaire.
Poursuivre les autres étapes comme décrit ci-dessus.
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Recherche et Salmonella dans les eaux. Méthode par filtration.
Filtration de 250 ml à 5 litres d’eau
Eau à
Analyser
Entonnoir
Membrane 0,45µ Rampe de
Filtration
Pompe à 3 postes
Eau Pep Tamp
36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures 1 ml
Milieu RV
42 ± 0,5°C pendant 20 ± 4 heures voire 44 ± 4 heures.
Gélose Hektoen ou XLD
36 ± 2°C pendant 20 ± 2 heures.
ONPG, TSI, Urée Indole, LDC, Agglutination (OMA, OMB …)
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Recherche de Vibrion cholérique dans les eaux. Méthode en milieu liquide.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application. 2. Définition. 3. Référentiels.
4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et l’identification des Vibrionacae présents dans les eaux destinées à la consommation humaine, en milieu liquide. 2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par les Vibrionacae, des bactéries qui se présentent sous forme de Bacilles à Gram Négatifs droits ou incurvés (BGN), très
mobiles, possédant une oxydase, aéro-anaérobies facultatifs, fermentant le glucose
sans production de gaz ni d'H2S, hautement pathogènes. (Voir cours).
3. Référentiels.
Norme ISO / TS 21 872-1. Recherche de Vibrions pathogènes par voie digestive. Vibrion paraheamolyticus, autres vibrions.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais. 4. Mode opératoire.
Jour 1. Enrichissement primaire. L’enrichissement primaire s’effectue sur le milieu Eau Peptonée Alcaline 10 fois
concentré contenant 50 ml de milieu, auquel on ajoute aseptiquement 450 ml d’eau à analyser au point et au moment du prélèvement.
Ce dernier sera par la suite incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. Jour 2. Enrichissement secondaire et Isolement.
Après incubation, le flacon constituant l’enrichissement primaire fera l’objet :
d’une part, d’un enrichissement secondaire sur milieu EPA en tube auquel on
ajoute 1 ml par tube.
d’autre part, d’un isolement sur gélose GNAB 1.
Dans les deux cas, l’incubation se fait à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures.
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Jour 3. Lecture des boites et Identification.
D’une part, le tube d’EPA fera l’objet d’un isolement sur GNAB 2 qui sera incubé à son tour à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures.
D’autre part, la boite de gélose GNAB 1 subira une lecture en tenant compte du fait que les Vibrions se présentent le plus souvent sous forme de grosses colonies
lisses, transparentes et très caractéristiques. Identification morphologique et biochimique.
Cinq colonies caractéristiques et distinctes feront l’objet d’une identification
morphologique et biochimique basée essentiellement sur :
Etat frais (bacilles, mobilité),
Coloration de Gram (bacilles Gram négatifs),
Oxydase (+),
Ensemencement d’un tube de KIA qui sera incubé à 37°C, 24 h
(Saccharose, Glucose, Gaz et H2S),
Ensemencement d’un tube de gélose nutritive inclinée qui sera incubé à 36 ± 2°C
pendant 20 ± 4 heures. qui servira à l’agglutination sur lame, comme suit :
Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au sérum polyvalent O1 est négative, faire une mini-galerie biochimique basée sur l'étude des acides aminés en vue de différencier les Vibrions, des Pleisiomonas et des Aéromonas selon le tableau
suivant :
LDC ODC ADH
Vibrions + + -
Aéromonas - - +
Pleisiomonas + + +
S'il s'agit du genre Vibrion, répondre : Vibrion NON Agglutinable (NAG).
Si l'agglutination avec l'eau physiologique et au sérum polyvalent O1 est positive, il s'agit d'un vibrion rough (auto agglutinable).
Si l'agglutination avec l'eau physiologique est négative et positive au sérum
polyvalent O1, répondre : Vibrion cholérique.
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Recherche de Vibrion cholérique dans les eaux. Méthode en milieu liquide.
Eau à
Analyser
450 ml
Bouillon EPA 10X [ ]
36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. 1 ml Isolement sur GNAB 1 Deuxième enrichissement
36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures.
Oxydase Gram
Etat frais
KIA LDC, ODC, ADH
GN inclinée Agglutination GNAB 2 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 h
Suite Idem
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Recherche de Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration sur membrane.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application 2. Définition.
3. Référentiels. 4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode de référence, consiste en la recherche et le dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation
humaine, par filtration sur membrane.
2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par Staphylocoques à coagulase positive,
bactéries qui se présentent sous forme de cocci à Gram positive, sphériques, isolées ou regroupées formant ainsi des grappes de raisin, possédant l’enzyme catalase et la
coagulase. Ils sont capables de se développer en 24 à 48 heures à 36 ± 2°C sur un milieu sélectif Chapman au mannitol. L’espèce type du genre est Staphylococcus aureus, elle est pathogène et la plus
redoutée. 3. Référentiels.
Norme NF T 90 421. Recherche et dénombrement des Staphylocoques à
coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et
l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
La recherche des Staphylocoques à coagulase positive ou plus particulièrement
Staphylococcus aureus, par filtration sur membrane nécessite une préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la
membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en quantité
suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile.
Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ
entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stéri le.
Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types d’eaux à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la membrane à l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose
Chapman au mannitol préalablement préparée.
Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 44 ± 4 heures.
5. Lecture et interprétation
Après la période d’incubation spécifiée, les Staphylocoques à coagulase positive ou
plus particulièrement Staphylococcus aureus, apparaissent sous forme de petites colonies lisses légèrement bombées à contours réguliers et pigmentées en soit en
jaune ( fermentation du mannitol) ou en blanc. Prendre 3 à 5 colonies au hasard, une demi colonie servira au test à la catalase, l’autre demi sera triturer dans un tube contenant du bouillon BHIB, à incuber à 36 ±
2°C pendant 20 ± 4 heures. Staphylococcus aureus, possède ces deux enzymes.
Test à la catalase. Placer séparément deux gouttes d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 20 volumes sur une lame de microscope. Prélever une demi colonie avec une tige de
verre (pipette Pasteur) ou en plastique (surtout pas de fil métallique) et l’émulsionner doucement dans une des deux gouttes.
Observer immédiatement et après 5 minutes s’il y a apparition (catalase positive) ou absence (catalase négative) de bulles d’oxygène. Dans le cas où i l y a doute, recouvrir chacune des gouttes avec lamelle de microscope et comparer l’apparition
des bulles sous les deux lamelles. Les observations peuvent se faire macroscopiquement ou à l’aide d’un microscope à faible grossissement.
Test à la coagulase libre. Après incubation du bouillon BHIB, ajouter stérilement 0,1 ml de cette culture à 0,3 ml de plasma de lapin contenu dans un tube stérile à hémolyse, et incuber de nouveau à
36 ± 2°C pendant 2 à 6 heures. Examiner la coagulation du plasma de lapin sinon ré-incuber et examiner de nouveau
à 20 ± 4 heures. Considérer que la réaction à la coagulase est positive quand le coagulum occupe plus des trois quart du volume initialement occupé par le liquide.
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Le tableau suivant résume quelques caractères biochimiques de différentes espèces de Staphylocoques.
Coagulase
Staphylocoque aureus intermedius saprophyticus epidermitis
Catalase + + + +
Coagulase + + - -
Mannitol en anaérobie
+ - - -
Résistance à la
Novobiocine (5 Micro-gr )
S
S
R
S
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Recherche de Staphylocoques à coagulase positive dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration sur membrane.
Filtration de 100 ml d’eau
Eau à Analyser
Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe
de
Filtration à Pompe 3 postes
Gélose Chapman au mannitol
Incuber à 36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures Distinguer les colonies caractéristiques
Catalase Coagulase
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Recherche de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration sur membrane.
Sommaire.
1. Objet et domaine d’application. 2. Définition.
3. Référentiels. 4. Mode opératoire. 5. Lecture et interprétation
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode de référence, consiste en la recherche Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destinées à la consommation humaine, par filtration sur membrane. 2. Définition.
Au sens de cette méthode, on entend par Pseudomonas aeruginosa, une bactérie qui se présente sous forme de bacille à Gram négatif possédant l’enzyme oxydase et
capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et
résistante à plusieurs antibiotiques. (Voir cours). 3. Référentiels.
Norme NF EN 12780. Détection et dénombrement de Pseudomonas aeruginosa
dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration.
Norme NF ISO 7218 : Règles générales pour les examens microbiologiques.
Norme XP V 08-102 : Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats : cas des dénombrements en milieu solide.
Norme NF ISO 17025 : Prescriptions générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
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4. Mode opératoire.
La recherche de Pseudomonas aeruginosa par filtration sur membrane nécessite une
préparation au préalable, qui se déroule selon les étapes suivantes :
Tout d’abord, il faudrait stériliser l’entonnoir gradué en acier inoxydable ainsi que la
membrane poreuse à l’aide d’un bec bunsen.
Les refroidir tout de suite après, avec l’eau à analyser si on en dispose en quantité suffisante ou bien avec de l’eau distillée stérile.
Mettre en place de façon aseptique une membrane de porosité nominale de 0,45 µ entre la membrane poreuse et l’entonnoir à l’aide d’une pince stéri le.
Fixer ce dispositif avec la pince correspondante.
Déposer ensuite aseptiquement 100 ou 250 ml d’eau à analyser, selon les types
d’eaux à analyser, devant un bec bunsen.
Actionner ensuite la pompe à vide pour absorber l’eau à travers la membrane.
Retirer l’entonnoir puis transférer immédiatement et aseptiquement la membrane à l’aide d’une pince à bouts arrondis stérile, à la surface d’une plaque de gélose au Cétrémide préalablement préparée.
Cette dernière sera incubée couvercle en bas à 36 ± 2°C pendant 44 ± 4 heures.
5. Lecture et interprétation
Après la période d’incubation spécifiée :
les colonies pigmentées en bleu vert donc productrices de pyocyanine sont considérées d’emblée comme des colonies de Pseudomonas aeruginosa :
compter le nombre de colonies.
Les colonies qui présentent une fluorescence sous UV, nécessitent une confirmation biochimique basée essentiellement sur un repiquage sur bouillon à
l’acétamide qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures. Après incubation, la production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, après avoir ajouter une à deux gouttes du réactif de Nessler est caractérisée par
une décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : compter le nombre de colonies.
Les colonies présentant une pigmentation brun rougeâtre sans fluorescence, nécessitent également une confirmation biochimique basée d’abord et avant tout
sur l’oxydase. Les colonies oxydase positives seront ensuite repiquées d’une part, sur bouillon à l’acétamide qui sera incubé à 36 ± 2°C pendant 20 ± 4 heures et
d’autre part, sur milieu King B. Après incubation : o La production d’ammoniac à partir du bouillon à l’acétamide, après avoir ajouter
une à deux gouttes du réactif de Nessler est caractérisée par une décoloration du jaune au rouge brique, et est en faveur de Pseudomonas aeruginosa :
compter le nombre de colonies.
o L’apparition d’une fluorescence sur milieu King B exposé aux UV (360 nm) est en faveur de Pseudomonas aeruginosa : à compter.
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6. Expression des résultats.
Le nombre total de colonies de Pseudomonas aeruginosa N, présent dans le volume
d’eau à analyser (100 ou 250 ml) est calculé par l’équation mathématique suivante :
N = P + F (cF / nF) + R (cR / nR)
Où :
P : Nombre total de colonies bleu vert (pyocyanine), caractéristiques de
Pseudomonas aeruginosa.
F : Nombre total de colonies fluorescentes.
nF : Nombre de colonies fluorescentes testées pour la production d’acétamide.
cF : Nombre de colonies fluorescentes positives pour la production d’acétamide.
R : Nombre total de colonies pigmentées en Brun-rougeâtre
nR : Nombre de colonies Brun-rougeâtre testées pour la production d’acétamide,
d’oxydase et de fluorescence sur milieu King B.
cR : Nombre de colonies Brun-rougeâtre positives pour la production d’acétamide,
d’oxydase et de fluorescence sur milieu King B.
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Recherche de Pseudomonas aeruginosa dans les eaux destinées à la consommation humaine. Méthode par filtration sur membrane.
Filtration de 100 ou 250 ml d’eau
Eau à
Analyser
Entonnoir Membrane 0,45µ Rampe
de
Filtration à Pompe 3 postes
Gélose au Cétrémide
36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 44 ± 4 heures
Colonies Bleu Vert Colonies Fluorescentes Colonies Brun-rougeâtre
(à compter) Oxydase (+)
King B
Bouillon à l’acétamide 36 ± 2°C, 20 ± 4 h puis 20 ± 4 heures
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Table NPP
1 X 50 ml 5 X 10 ml 5 X 1 ml Nombre
caractéristique
Limites de confiance
Inférieure Supérieure 0
0 0
0 0 0
0 0
0 0 0
0 1
1 1 1
1 1 1
1 1
1 1 1
1 1
1 1 1
1 1
1 1 1
1 1
1 1 1
1 1
0
0 0
1 1 1
2 2
2 3 3
4 0
0 0 0
1 1 1
1 2
2 2 2
3 3
3 3 3
4 4
4 4 4
4 5
5 5 5
5 5
0
1 2
0 1 2
0 1
2 0 1
0 0
1 2 3
0 1 2
3 0
1 2 3
0 1
2 3 4
0 1
2 3 4
5 0
1 2 3
4 5
<1
1 2
1 2 3
2 3
4 3 5
5 1
3 4 6
3 5 7
9 5
7 10 12
8 11
14 18 21
13 17
22 28 35
43 24
35 54 92
160 >240
<0,5 <0,5
<0,5 <0,5 <0,5
<0,5 <0,5
<0,5 <0,5 <0,5
<0,5 <0,5
<0,5 <0,5 <0,5
<0,5 <0,5
1
2 <0,5
1 3 3
2 3
4 5 6
4 5
7 9 12
15 8
12 18 27
39
4 6
4 6 8
6 8
11 8 13
13 4
8 11 15
8 13 17
21 13
17 23 28
19 26
34 53 66
31 47
59 85 100
120 75
100 140 220
450
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SOMMAIRE Analyse des Boissons
Intitulé
Codification Version Date
Recherche et Dénombrement des Microorganismes revivifiables. Méthode
par comptage des colonies obtenues à 30°C, dans les boissons.
MO.MR.BS 00 02 / 1 / 06
Recherche et Dénombrement des
Levures et Moisissures dans les boissons. Méthode par comptage des colonies.
MO.LM.BS 00 02 / 1 / 06
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Mode opératoire / Enregistrement
Code : MO.MR. BS Version : 00 Date : 02 / 1 / 06
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Recherche et dénombrement des Microorganismes. Méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C, dans les boissons.
Sommaire :
1. Objet et domaine d’application.
2. Définition. 3. Référentiels. 4. Mode opératoire.
5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des microorganismes revivifiables dans les boissons et boissons gazeuses destinées à la consommation
humaine par comptage des colonies à 30°C.
2. Définition.
Dans le sens de cette méthode, on entend par microorganismes revivifiables : Bactéries, Levures, Moisissures se développant en aérobiose, lorsque l’essai est effectué selon la méthode spécifiée.
3. Référentiels.
Norme NF V 08-051 : Microbiologie des aliments. Recherche et dénombrement des
micro-organismes revivifiables. Méthode par comptage des colonies obtenues à 30°C.
Norme XP V 08-102. Règles générales pour le comptage des colonies et l’expression des résultats.
Norme NF V 08-002 : Microbiologie alimentaire – Directives générales pour les examens microbiologiques.
Norme NF V -057-2 Microbiologie alimentaire – Directives générales pour la
préparation des dilutions en vue de l’examen microbiologique.
Norme NF ISO 17025. Prescriptions générales concernant la compétence des
laboratoires d’étalonnage et d’essais.
4. Mode Opératoire.
A partir des dilutions décimales allant de 10-3 à 10-1, porter aseptiquement 1 ml dans une boite de Pétri vide préparée à cet usage et numérotée.
Compléter ensuite avec environ 19 ml de gélose TGEA ou TDYM fondue puis refroidie à 47°± 1°C.
Le temps qui s’écoule entre le moment où l’on a distribué l’inoculum dans la boite et celui où le milieu est coulé ne doit pas excéder 15 minutes.
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Faire ensuite des mouvements circulaires et de va-et-vient en forme de « 8 » pour
permettre à l’inoculum de se mélanger à la gélose, sur une surface fraîche et horizontale.
Laisser solidifier sur paillasse, puis rajouter une deuxième couche d’environ 4 ml de la même gélose ou de gélose blanche. Cette doub le couche a un rôle protecteur contre les contaminations diverses.
Les boites seront incubées couvercle en bas à 30°C pendant 70 ± 2 heures avec :
première lecture à 20 ± 4 heures,
deuxième lecture à 40 ± 4 heures, et
troisième et dernière lecture à 70 ± 2 heures.
5. Lecture et interprétation.
Retenir les boites contenant moins de 300 colonies, au niveau de deux dilutions successives, mais il faut qu’une boite renferme au moins 15 colonies. Calculer le nombre N, de microorganismes revivifiables dénombrés à 30°C par ml de
produit en tant que moyenne pondérée, à l’aide de l’équation suivante :
Σ c N = 1,1 x d
où : Σ c : est la somme des colonies comptées sur les deux boites retenues. d : est le taux de dilution correspondant à la première di lution.
Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs.
Le résultat final de microorganismes dénombrés à 30°C par ml de produit est noté par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplié par 10x où x est la puissance appropriée de 10.
Exemple :
Un dénombrement de microorganismes à 30°C a donné les résultats suivants :
à la première dilution retenue 10-2
: on a 158 colonies.
A la seconde dilution retenue 10-3
: on a 14 colonies.
Σ c 158 + 14 172
N = -------------- = ------------------------ = --------------- = 15636
1,1 x d 1,1 x 10-2
0,011
Arrondir à deux chiffres significatifs, soit 16000 ou mieux :
1,6 x 104 microorganismes par ml de produit.
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Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Méthode par comptage des colonies.
Sommaire :
1. Objet et domaine d’application.
2. Définition. 3. Référentiels. 4. Mode opératoire.
5. Lecture et interprétation.
1. Objet et domaine d’application.
Cette méthode consiste en la recherche et le dénombrement des Levures et des Moisissures dans toutes les catégories de denrées alimentaires, par comptage des
colonies sur milieu solide.
2. Définitions.
Les Levures et Moisissures sont des champignons hétérotrophes, organismes
eucaryotes uni ou multicellulaires. La structure de la cellule est celle d’une cellule eucaryote. Les Levures sont des champignons unicellulaires qui constituent un groupe
morphologique et physiologique relativement homogène. Les Moisissures sont des champignons filamenteux uni ou multicellulaires.
3. Mode opératoire.
Par cette méthode, les Levures et Moisissures sont recherchées et dénombrées dans toutes les catégories de denrées alimentaires, selon le protocole suivant, en
recherchant les Levures à part et les Moisissures à part, comme le montre les schémas n°1 et 2 ci-après.
3.1 Recherche et Dénombrement des Levures.
A partir des dilutions retenues, transférer 1 ml de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la suspension mère si le produit est solide, dans une boite de Pétri, préalablement préparée et numérotée pour cet usage.
Dans les mêmes conditions, et de la même manière, transférer à l’aide d’une nouvelle pipette, 1 ml de la première dilution décimale de l’échantillon pour essai si
le produit est liquide, ou 1 ml de la seconde dilution décimale, si le produit est solide, dans une boite de Pétri, préalablement préparée et numérotée pour cet usage.
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Dans les mêmes conditions, et de la même manière, transférer à l’aide d’une
nouvelle pipette, 1 ml de la seconde dilution décimale de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la troisième dilution décimale, si le produit est
solide, dans une boite de Pétri, préalablement préparée et numérotée pour cet usage. Couler dans chacune des boites de Pétri, environ 15 ml de gélose Sabouraud au
Chloramphénicol, fondue, refroidie et maintenue à 47 ± 2°C dans un bain d’eau. Mélanger soigneusement milieu et inoculum et laisser le mélange se solidifier sur
une paillasse fraîche et horizontale. Après solidification complète du mélange et uniquement dans le cas où on suspecte le produit à analyser de contenir des microorganismes dont les colonies
envahissent la surface du milieu, couler à la surface du milieu ensemencé environ 4 ml de le gélose blanche fondue, refroidie et maintenue à 47 ± 2°C dans un bain
d’eau. Retourner les boites ainsi préparées puis les incuber selon accord, à 30°C pendant 70 ± 2 h ou plus.
3.2 Recherche et Dénombrement des Moisissures.
A partir des dilutions décimales, 10-3 à 10-1, ensemencer respectivement et par étalement 0,1 ml dans une série de trois boites de Pétri contenant de la gélose
Sabouraud au Chloramphénicol. Laisser les boites sur paillasse pendant 15 minutes à température ambiante, pour permettre la diffusion de l’inoculum puis les incuber à 30°C pendant 70 ± 2 heures
ou plus. Dans le souci de ne pas se trouver en face de boites envahies par les Moisissures,
on doit effectuer des lectures et des dénombrements tous les jours.
4. Lecture et interprétation.
4.1. Cas des Levures
Après la période d’incubation spécifiée, compter les colonies de Levures ayant poussé en profondeur dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Levures présentes dans la prise
d’essai en tant que moyenne pondérée à partir des deux dilutions successives à l’aide de l’équation suivante :
où :
Σ c : est la somme des colonies comptées dans deux boites de dilution successives. d : est la valeur de la première dilution retenue parmi les deux boites.
Exemple : (concernant les Levures)
o à la SM soit (10-1
) : 80 colonies de Levures,
o à la seconde dilution (10-2
) : 15 colonies de Levures,
o N = 80 + 15 / 1,1 x 0,1 = 863,63
Après arrondissement, le résultat est de : 9.102 Levures par gr de produit
Σ c N = 1,1 x d
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4.2. Cas des Moisissures
Après la période d’incubation spécifiée, compter les colonies de Moisissures ayant poussé en surface dans chacune des boites contenant entre 15 et 150 colonies, puis calculer la valeur du nombre N de Moisissures présentes dans la prise d’essai en tant
que moyenne pondérée à partir des deux dilutions successives à l’aide de l’équation suivante :
Σ c
N = V x 1,1 x D
Où :
Σ c : est la somme des colonies de Moisissures présentes sur les deux boites
retenues.
D : est le taux de dilution correspondant à la première di lution retenue (la
suspension mère est une dilution)
V : est le volume étalé sur chaque boite.
Arrondir les résultats calculés à deux chiffres significatifs. Pour cela :
si le dernier chiffre est inférieur à 5, le chiffre précédent n’est pas modifié,
si le dernier chiffre est supérieur ou égal à 5, le chiffre précédent est augmenté d’une unité.
Procéder de proche en proche jusqu’à ce que l’on ait deux chiffres significatifs.
Exemple.
Un dénombrement direct d’un produit solide après ensemencement avec 0,1 ml de
produit a donné les résultats suivants :
à la SM soit (10-1
) : 45 colonies de Moisissures,
à la seconde dilution (10-2
) : 6 colonies de Moisissures,
La valeur du N sera calculée ainsi :
45 + 6 51 N = = = 4636,36
0,1 x 1,1 x 10-1
0,011
Après arrondissement, le résultat est de :
4,6 x 103 Moisissures par gr de produit
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Remarques importantes :
1. Opérer de la même façon et dans les mêmes conditions, avec le diluant (TSE),
c'est-à-dire qu’il faut prendre 0,1 ml du diluant (TSE), les étaler avec un étaleur à
part et les incuber dans les mêmes conditions que les boites tests, cette boite constitue le témoin diluant (TD).
2. Incuber telle quelle, une boite du milieu utilisé à savoir le milieu Sabouraud au
chloramphénicol, cette dernière sera incubée également telle quelle dans les
mêmes conditions de température, elle constitue alors, le témoin du milieu (TM).
3. Au moment de la lecture, commencer obligatoirement par les deux boites témoins (TM et TD), si l’une d’entre elles est contaminée, l’analyse est ininterprétable donc à refaire.
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Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Méthode par comptage des colonies.
LOGIGRAMME : LEVURES
A partir des dilutions décimales :
10-1
10-2
10-3
1ml 1ml 1 ml
Ajouter ensuite environ 15 ml de gélose Sabouraud au Cmp.
Laisser solidifier sur paillasse pendant 15 mn, puis Incuber à : 30°C, 72 ± 2 heures
Dénombrer les colonies caractéristiques, puis calculer la valeur N.
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Recherche et dénombrement des Levures et Moisissures dans les boissons. Méthode par comptage des colonies.
LOGIGRAMME : MOISISSURES
A partir des dilutions décimales :
10-1
10-2
10-3
0,1ml 0,1ml 0,1 ml
Etalement à la surface de la gélose Sabouraud au Cmp. Laisser diffuser l’inoculum sur paillasse pendant 15 mn, puis Incuber à :
30°C, 72 ± 2 heures
Dénombrer les colonies caractéristiques, puis calculer la valeur N.
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Contrôle Microbiologique des boissons
1. Introduction.
Les jus de fruits sont des produits dont les caractéristiques sont généralement assez peu favorables au développement des contaminants à incidence sanitaire. A titre d’exemple, leurs principales caractéristiques sont :
• leur bas pH, • leur faible concentration en oxygène,
• leur forte concentration en acides aminés, • leur forte concentration en sucres, • leur forte concentration en vitamines.
Ces caractères limitent considérablement le nombre d’espèces susceptibles de s’y multiplier : le plus souvent elles ne permettent que la multiplication des levures.
2. Quelles peuvent être les différentes altérations ?
A. Modification de l’aspect. • Apparition d’une opalescence ou d’un trouble dans les boissons limpides
(levures). • Formation d’un anneau (levures). • Apparition de flocons surtout dans les sirops, (levures).
• Apparition de dépôt (levures). • Augmentation de viscosité, gélification (bactéries lactiques).
• Diminution du trouble dans les boissons naturellement troubles, Décoloration de boissons aux colorants naturels (levures ou de bactéries).
•
B. Augmentation de la pression dans les récipients. Ce phénomène peut avoir différentes conséquences qui vont du bombage de
contenants non rigides jusqu'à l’éclatement même (levures, bactéries lactiques ou Clostridium).
C. Modification de l’odeur et du goût. • Diminution du goût (levures),
• Odeur et goût de bière (levure), • Goût aigre (bactéries lactiques ou acétiques), • Odeur de moisi (moisissures),
• Le seuil d'altération se situe le plus souvent entre 50 000 et 100 000 micro-organismes par ml.
3. La prévention des altérations : Les efforts de prévention doivent porter sur :
• La réduction voire l'élimination des contaminations. Cette dernière s'obtient par :
la maîtrise des Points Critiques, la mise en place des BPF. La mise en place de protocoles de nettoyage et de désinfection.
• Le blocage de la multiplication des contaminants éventuellement présents.
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4. Quels sont les agents d'altération ?
Dans 90 % des cas, il s'agit de levures car :
* elles supportent des bas pH, * elles peuvent utiliser l'azote inorganique, * elles n'ont pas besoin de Vitamine B,
* elles tolèrent un taux de CO2 élevé, * elles résistent à de fortes concentrations en sucres.
Dans 10 % des cas restants, il s'agit de Clostridium butyricum, le plus souvent responsable du bombage des boites
5. Le Contrôle Microbiologique proprement dit doit porter sur : * Les matières premières (eau, sirop de sucre, jus de fruits),
* La chaîne de fabrication (points critiques), * Les produits finis.
Il comporte :
* La recherche de micro-organismes capables d'altérer la santé publique, * La recherche de micro-organismes capables d'altérer la qualité hygiénique du
produit ainsi que ses caractères organoleptiques. Dans le cas des jus de fruits conditionnés en Tetra pack, le Contrôle
microbiologique des produits finis consiste en : • Un test de Stabilité,
• Une prise de pH, • Un test de Stérilité.
En Conclusion,
• Les jus de fruits sont des boissons rafraîchissantes très sélectives de par leurs caractéristiques "physico-chimiques", généralement ils ne posent pas de problème d'ordre sanitaire ou hygiénique mais uniquement des problèmes de
conservation.
• Elles s'altèrent rarement sous l'action des levures ou de bactéries lactiques, deux groupes bien adaptés aux conditions sélectives du milieu.
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