laporan kinetika pertumbuhan bakteri & jamur
Post on 08-Apr-2016
804 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
LABORATORIUM MIKROBIOLOGISEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2012 / 2013
MODUL : Kinetika Pertumbuhan Bakteri & Jamur
PEMBIMBING : Dr. Ir. Bintang IM, MT
oleh :
Kelompok 4
Achmad Faisal 121424002
Andri Rismantara 121424009
Annisa Trisakti 121424010
Apit Rian Saputra 121424011
Datin Nurina Fajrin 121424012
Kelas 1A-TKPB
PROGRAM STUDI D4 TEKNIK KIMIA PRODUKSI BERSIH
JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI BANDUNG
2013
Tanggal Praktikum : 6 dan 13 Maret 2013
Tanggal Pengumupulan : 27 Maret 2013
(Laporan)
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ditumbuhkan dalam media yang mengandung nutrient essensial
kemudian ditempatkan pada kondisi lingkungan seperti suhu dan pH yang tepat akan segera
berkembang biak. Pertumbuhan mikroba dapat diamati dari kenaikan konsentrasi mikroba.
Melalui serangkaian proses enzimatis, mikroba melakukan biosintesis molekul-molekul
penyusun sel dan menggandakan selnya. Kecepatan pertumbuhan mikroba merupakan
respon terhadap substrat (media pertumbuhan) yang disediakan dan kondisi lingkungannya.
1.2 Tujuan Percobaan
Setelah melakukan percobaan ini diharapkan mahasiswa mampu :
Menguasai tahapan-tahapan pengembangbiakan Bakteri & Jamur.
Menguasai dan terampil membuat media padat, inokulum/starter, dan media
pertumbuhan Bakteri & Jamur.
Menguasai dan terampil memilih metode yang tepat untuk menetukan konsentrasi
biomassa Bakteri & Jamur.
Memahai pola pertumbuhan Bakteri & Jamur melalui grafik konsentrasi mikroba (X)
terhadap waktu (t).
Menguasai dan dapat menetukan fasa-fasa pertumbuhan Bakteri & Jamur.
Dapat menghitung dan mengevaluasi nilai laju pertumbuhan spesifik (µ) Bakteri &
Jamur.
II. LANDASAN TEORI
2.1 Kinetika Pertumbuhan Mikroba
Pertumbuhan merupakan faktor yang sangat penting bagi suatu makhluk hidup. Pada
dasarnya pertumbuhan yaitu penambahan massa, ukuran, dan jumlah sel. Pada
mikroorganisme pertumbuhan sel dapat berubah langsung menjadi pertumbuhan populasi,
jumlah sel bertambah sangat cepat dengan waktu yang cepat pula. Mikroorganisme dapat
tumbuh dibawah pengaruh fisik, kimia, dan kondisi nutrient. Pada nutrient yang cocok
mikroorganisme menguraikan nutrient dari media dan mengubahnya dalam komposisi-
komposisi biologi. Sebagian dari nutrient-nutrient digunakan untuk memproduksi energi dan
sebagian lagi digunakan untuk biosintesis dan pembentukkan produk. Pertambahan massa
sel seiring dengan waktu dapat digambarkan sebagai berikut:
Substrat + Sel/mikroorganisme Mikroorganisme + Produk
Pertumbuhan mikroorganisme merupakan contoh yang baik pada suatu reaksi autokatalis.
Pertumbuan mikrobial biasanya dicirikan dengan waktu yang dibutuhkan untuk
menggandakan massa atau jumlah sel. Waktu ganda massa dapat berbeda dengan waktu
ganda sel, karena massa sel dapat meningkat tanpa peningkatan jumlah sel. Laju
pertumbuhan ditunjukkan langsung oleh konsentrasi sel dan penambahan jumlah sel
(biomassa) yang merupakan keluaran yang normal dari reaksi tersebut. Namun demikian,
bila pada suatu lingkungan tertentu interval antara massa sel atau penggandaan jumlah
konstan dengan waktu, maka organisme itu tumbuh pada kecepatan eksponensial. Laju
pertumbuhan mikroorganisme dicirikan dengan laju pertumbuhan spesifik (specific growth
rate) dinyatakan sebagai berikut:
dCxdT = µ Cx
dimana:Cx = Konsentrasi sel dalam gram/liter
t = waktu
µ = laju pertumbuhan spesifik dalam jam-1
Dengan membuat grafik In Cx terhadap t, maka didapat tg α = µ
Metode-metode yang digunakan untuk evaluasi populasi mikroorganisme yaitu:
a. Metode langsung : (menggunakan mikroskop) perhitungan jumlah sel, dan
countingchamber, selain itu dengan penetapan bahan kering seluler.
b. Metode tidak langsung : turbidimetri, spektrofotometri, dan pengenceran.
Metode-metode tersebut digunakan untuk memantau dan mengkaji fenomena pertumbuhan
mikroorganisme. Untuk lebih jelasnya dapat diamati dengan kurva pertumbuhan yaitu
sebagai berikut :
KURVA PERTUMBUHAN MIKROORGANISME
2.2 Fase-fase pada Kinetika Pertumbuhan
i. Fase Lag
Fase awal adalah fase sejak inokulasi sel pada medium dan merupakan suatu periode
adaptasi.Pada fasa ini sebagian besar mikroba menyesuaikan diri (adaptasi) dengan
lingkungan barunya dan belum mengadakan perbanyakan sel, bahkan sebagian selnya
mati, hanya sel yang kuat saja yang bertahan hidup.Dan sintesis enzim sudah terjadi.
Selama fase ini massa sel dapat berubah tanpa adanya suatu perubahan jumlah sel. Dapat
juga terjadi fase awal yang palsu bilamana inokulum yang diberikan terlalu sedikit atau
mempunyai viabilitas yang rendah. Suatu saat bila perubahan-perubahan telah terjadi,
maka sel-sel bergerak kearah fase tumbuh. Fase ini biasanya merupakan fase
eksponensial atau fase logaritmik. Ciri daripada fasa ini adalah Tidak ada pertumbuhan
populasi karena sel mengalami perubahan komposisi kimiawi dan ukuran serta
bertambahnya substansi intraseluler sehingga siap untuk membelah diri.
Faktor penentu fase lag:
a. Medium dan lingkungan pertumbuhan; jika medium sama dengan medium
sebelumnya, waktu adaptasi pendek atau tidak ada, jika sangat berbeda pelu waktu
untuk sintesis enzim yang dibutuhkan untuk metabolisme (pembentukan enzim
induktif).
b. Kondisi starter/inokulum
o Jumlah inokulum; jumlah sel awal yang semakin tinggi mempercepat fase
adaptasi
o Germinasi spora; bila mikroba yang ditanam pada medium ada dalam bentuk
spora dan bukan sel vegetatif maka bila ia ditanam dalam medium dengan
kondisi lingkngan yang baik , ia akan berubah menjadi bentuk sel vegetatif dan
ini memerlukan sedikit waktu
o Mutan yag baru terbentuk perlu waktu untuk adaptasi dengan lingkngan yang
baru.
ii. Fase Petumbuhan Dipercepat (Decelerated Growth Phase)
Pada fasa ini mikroba telah dapat menyesuaikan diri dengan lingkungannya, sel
mulai membelah diri dengan kecepatan rendah, ukuran sel dapat mencapai maksimum
serta mulai adanya aktivitas metabolisme.
iii. Fasa Eksponensial (Exponential/ Logarithmic Growth Phase)
Pada fasa ini pembelahan mikroba sangat cepat dan konstan mengikuti kurva
logaritmik. Dalam kondisi kultur yang optimum, sel mikroba mengalami reaksi
metabolisme yang maksimum. Selama fase logaritma, konsentrasi nutrient esensial ada
dalam keadaan cukup jenuh untuk menunjang reaksi-reaksi metabolisme utama dari
pertumbuhan. Pada saat ini paling sensitif terhadap lingkungan
Fase logaritmik dicirikan oleh suatu garis lurus pada plot semilog antara In x
melawan waktu. Periode ini adalah keadaan pertumbuhan yang seimbang atau mantap,
dengan laju pertumbuhan spesifik. µ konstan dan selnya membelah diri dengan laju yang
konstan, massa menjadi dua kali lipat, keadaan pertumbuhan seimbang.
Kekhususan fase logaritmik
Bila populasi sel yang sedang mengalami fasa ini dipindahkan ke dalam medium
baru dengan komposisi nutrient dan kondisi lingkungan yang sama maka di dalam
medium baru populasi sel ini akan langsung mengalami fasa logaritma tanpa
mengawali pertumbuhan dengan fasa pertumbuhan awal/pertumbuhan dipercepat.
Ditinjau dari sel bakteri secara individual, pada fase ini ukuran sel minimum dengan
dinding sel yang tipis, karena sel membelah diri dengan sangat aktif, sintesa
makrmolekul dari komponen sel berlomba dengan waktu.
iv. Fasa Pertumbuhan Diperlambat (Negative Decelerated Growth Phase)
Pada fasa ini laju pertumbuhan diperlambat, karena nutrisi dalam medium sudah
sangat berkurang, dan adanya hasil-hasil metabolisme yan mungkin beracun atau
menhambat pertumbuhan mikroba. Pada fase ini pertumbuhan sel tidak stabil, api jumlah
populasi masih naik karena jumla sel yang tumbuh masih lebih banyak daripada jumlah
sel yang mati.
v. Fasa Stationer (Stationary Phase)
Pada fasa ini kecepatan pertumbuhan adalah nol. Jumlah sel baru sebagai hasil
reproduksi, seimbang dengan jumlah sel yang mati.Ini menyebabkan grafiknya linier dan
sejajar dengan absisnya.Reproduksi sel masih terjadi selama fasa ini menggunakan
cadangan makanan yang ada dalam protoplast sebagai building blocks pembangun sel
yang baru.Karena kekurangan nutrisi, sel kemungkinan mempunyai komposisi yang
berbeda dengan sel yang tumbuh pada fasa logaritmik.Pada fasa ini lebih tahan terhadap
keadaan ekstrim, seperti panas, dingin, radiasi, dan bahan kimia.Muncul modifikasi
struktur biokimiawi sel.
Bila dilanjutkan, beberapa kejadian masih mungkin timbul meskipun pertumbuhan
telah terhenti, metabolisme dan akumulasi produk masih terjadi di dalam sel atau di
dalam cairan. Massa sel total dapat tetap konstan, tetapi jumlah sel hidup cenderung
menurun. Pada saat ketahanan hidup menurun, lisis sel mungkin terjadi dan massa sel
akan menurun
Lisis sel akan menyebabkan terjadinya suatu medium yang kompleks dari produk-
produk hasil lisis, oleh karena itu suatu pertumbuhan yang sekunder, disebut pertumuhan
kriptik akan erjadi. Sering juga terjadi metabolik sekunder yang kurang penting terbentuk
oleh enzim-enzim yang sebelumnya tidak terdapat atau tidak berfungsi dalam sel. Selain
itu terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel dan kandungan nutrien mulai
habis, akibatnya terjadi kompetisi nutrisi sehingga beberapa sel mati dan lainnya tetap
tumbuh sehingga jumlah sel menjadi konstan.
vi. Fasa Kematian Dipercepat
Pada fasa ini jumlah kematian sel mulai dipercepat.
vii. Fasa Kematian (Death Pahse)
Pada fasa ini jumlah sel yang hidup makin lama makin menurun, sedangkan jumlah
kematian (mortalitas) sel semakin banyak.Kematian ini desebabkan oleh kondisi
lingkungan yang makin memburuk, terutama oleh makin banyaknya akumulasi hasil
metabolisme yang toksik terhadap sel (metabolit sekunder). Pada fase ini nutrisi dalam
medium sudah habis, energi cadangan dalam sel habis. Sel menjadi mati akibat
penumpukan racun dan habisnya nutrisi, menyebabkan jumlah sel yang mati lebih banyak
sehingga mengalami penurunan jumlah sel secara eksponensial.Lamanya fasa ini
tergantung pada species dari mikrobanya dan kondisi lingkungannya sendiri.
b. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba
Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang
penting untuk diketahui.Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi
pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan mikroba. Berikut ini faktor-
faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba:
a) Suplai Nutrisi
Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai
sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon,
nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya.
Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi
pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian.Kondisi
tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber
nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat tumbuh berkembang di
lingkungan seperti ini.Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih
dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba
agar pertumbuhannya terkendali.
b) Suhu/Temperatur
Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi dan pertumbuhan
mikroorganisme.Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan:
1. Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat.
Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolism akan menurun dan
pertumbuhan diperlambat.
2. Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan terhenti,
kompenen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel menjadi mati.
Berdasarkan hal di atas, maka suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan
mikroorganisme digolongkan menjadi tiga,yaitu:
a. Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka
pertumbuhan terhenti.
b. Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan
optimum (disebut juga suhu inkubasi)
c. Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada diatasnya maka pertumbuhan
tidak terjadi. Sehubungan dengan penggolongan suhu di atas, maka mikroba
digolongkan menjadi:
Tabel 1 :Penggolongan Bakteri menurut suhu
Kelompok Suhu Minimum Suhu Optimum Suhu Maksimum
Psikrofil - 15o C. 10o C. 20o C.
Psikrotrof - 1o C. 25o C. 35o C.
Mesofil 5 – 10o C. 30 – 37o C. 40o C.
Thermofil 40o C. 45 – 55o C. 60 – 80o C.
Thermotrof 15o C. 42 – 46o C. 50o C.
Berdasarkan ketahanan panas, mikroba dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu
a. Peka terhadap panas, apabila semua sel rusak apabila dipanaskan pada suhu 60oC
selama 10-20 menit.
b. Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan suhu 100oC selama 10 menit untuk
mematikan sel.
c. Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih dari 60oC selama 10-20 menit tapi
kurang dari 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel.
c) Keasamanatau Kebasaan (pH)
Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang
berbeda-beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran pH 8,0–8,0 dan
nilai pH di luar kisaran 2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.
d) Ketersediaan Oksigen
Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan
oksigen. Mikroorganisme dalam hal ini digolongkan menjadi:
Aerobik : hanya dapat tumbuh apabila ada oksigen bebas.
Anaerob : hanya dapat tumbuh apabila tidak ada oksigen bebas.
Anaerob fakultatif : dapat tumbuh baik dengan atau tanpa oksigen bebas.
Mikroaerofilik : dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah kecil.
e) Kadar Air
Air sangat diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba, air tidak hanya
komponen utama dari pada plasma sel mikroba, namun air penting bagi pelarutan
makanan sebelum makanan tersebut dapat diserap oleh sel. Selain itu juga kekurangan
air dapat menyebabkan kekeringan sel sehingga dapat mematikan mikroba
f) Cahaya
Kebanyakan mikroba dapat dirusak oleh cahaya tak langsung dari matahari dan dalam
waktu beberapa jam saja dapat dapat dimatikan oleh cahaya yang langsung
mengenainya. Sinar violet, ultraviolet, dan biru sangat kuat untuk mematikan
pertumbuhan mikroba.
g) Tekanan Osmawa
Sel-sel mikroba dibalut oleh suatu membran yang semifermiabel.Membran ini dapat
melewatkan air masuk ke dalam sel begitu pula sebaliknya membrane ini mampu
menahan zat-zat yang larut di dalam cairan dimana sel-sel itu berada.Untuk tidak masuk
ke dalam sel atau menahan zat terlarut dalam sitoplasma untuk keluar dari sel. Sel-sel
merupakan suatu unit osmosis yang kecil yang responsive terhadap perubahan-
perubahan pada cairan dalam lingkungan.
2.4. Bakteri E-Coli
E-coli berfungsi membusukkan sisa-sisa makanan yang melewati saluran
usus besar manusia, memadatkannya hingga dikeluarkan dalam bentuk feses.
Bakteri E-coli dikenal sebagai pencemar perairan, yang harus dihilangkan bila
ingin air yang kita minum layak untuk dikonsumsi. E-coli juga dikenal sebagai
bakteri penyebab diare dan gangguan saluran pencernaan. Kendati demikian,
bakteri E-coli bisa juga memberi keuntungan bagi manusia dengan turut
berperan dalam memproduksi vitamin K. Keberadaan E-coli sebagai flora usus
malah menjadi penghalang tumbuhnya bakteri lain yang kemungkinan
berbahaya untuk tumbuh di dalam usus.
Bahkan beberapa tahun belakangan, lewat kemajuan ilmu mikrobiologi
dan rekayasa genetika, banyak potensi besar dari bakteri E-coli yang mulai
terungkap. Sebagian besar potensi tersebut sangat bermanfaat bagi kelangsungan
hidup umat manusia. Karena pertumbuhannya yang sangat cepat dan
penanganan yang sangat mudah, membuat E-coli menjadi bakteri pilihan untuk
proses rekayasa genetika. Keberadaan rekayasa genetika di seluruh dunia tidak
pernah terlepas dari E-coli, karena struktur DNA-nya yang sangat sederhana dan
mudah untuk dimodifikasi.
2.5. Jamur Rhizopus Orizae
Jamur Rhizopus oryzae merupakan jamur yang sering digunakan dalam
pembuatan tempe. Jamur Rhizopus oryzae aman dikonsumsi karena tidak
menghasilkan toksin dan mampu menghasilkan asam laktat. Jamur Rhizopus oryzae
mempunyai kemampuan mengurai lemak kompleks menjadi trigliserida dan asam
amino.
Klasifikasi Jamur : Kingdom : Fungi
Divisio : Zygomycota
Class : Zygomycetes
Ordo : Mucorales
Familia : Mucoraceae
Genus : Rhizopus
Species : Rhizopus sp.
III. PERCOBAAN
3.1. Bahan untuk Bakteri
Nutrient Konsentrasi
Sukrosa 10 gram
Pepton 5 gram
Beef Ekstrak 4 gram
Yeast Ekstrak 2 gram
KH2PO4 1 gram
MgSO4.7H2O 0,5 gram
Aquadest 500 ml
3.2. Bahan untuk Jamur
Nutrient Konsentrasi
Sukrosa 71 gram
(NH4)2CO3 3,5 gram
KH2PO4 0,7 gram
MgSO4.7H2O 0,5 gram
FeCl3 0,25 mg
ZnSO4 -
Aquadest 500 ml
3.3 Alat yang digunakan
Erlenmeyer 100 ml Spektronic 20
Corong gelas Kuvet Spektrofotometer
Neraca analitik Tabung reaksi steril
Pipet 5ml media cair dari media untuk inokulum, masukkan dalam tabung yg berisi kultur murni bakteri dan lepaskan bakteri pada agar miring hingga terlarut semua
Tuangkan ke Erlenmeyer yang berisi media untuk inokulum
Amati sampel sebanyak 10ml selama 3 jamInkubasi dalam Incubator shaker selama 12 jam pada suhu 37◦C, 150 rpm
Masukkan inokulum kedalam Erlenmeyer berisi media pertumbuhanInkubasi dalam Incubator shaker selama 3hari pada suhu 37◦C, 150 rpm
Buatlah kurva baku antaraberat sel kering (X) terhadap absorban (A) pada panjang gelombang 620 nm
Setiap sampel mulai t0 dst diukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm, kemudian plotkan pada kurva baku untuk mendapatkan konsentrasi biomassa (X)
Oven Pembakar spirtus
Sentrifuge Incubator Shaker
Tabung sentrufuge plastic 10 ml Jarum ose
Pipet steril 10 ml 24 buah
Erlenmeyer 1000 ml
3.4. Rancangan Percobaan
3.4.1 Bakteri :
a. Pembuatan Inokulum & media pertumbuhan
b. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan metoda optical density dengan menggunakan spektrofotometer
Cairkan media NA dan tuangkan dalam camen petri, biarkan beku
Lakukan pengenceran pada pengambilan sampel ke-13 dst, karena suspense bakteri sudah mulai pekatInkubasi selama 24 jam dan hitung jumlah koloni yang terbentuk (jumlah sel/ml)
Pipet 1ml sampel dan tuangkan keatas media padat, ratakan dengan sudip dgiralski
Pipet 5ml media cair dari media untuk inokulum, masukkan dalam tabung yg berisi kultur murni bakteri dan lepaskan bakteri pada agar miring hingga terlarut semua
Tuangkan ke Erlenmeyer yang berisi media untuk inokulum
Lakukan sampling selama 6 jamInkubasi dalam Incubator shaker selama 16 jam pada suhu 37◦C, 150 rpm
Pipet 7ml inokulum dan masukkan ke erlenmeyer 100 ml yang berisi media pertumbuhan 50 ml. lakukan untuk semua Erlenmeyer media pertumbuhan. Setiap Erlenmeyer mewakili satu interval waktu. Inkubasi dalam Incubator shaker selama 3hari pada suhu 37◦C, 150 rpm
c. Pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan metoda plating koloni
3.4.2 Jamur :
a. Pembuatan inokulum dan media pertumbuhan
Beri nomor setiap kertas saring kosong Timbang setiap kertas saring kosong catat beratnya
Timbang sampai beratnya konstan
Tuangkan 10 ml sample hingga semua miselia tersaring
Keringkan dalam oven suhu 60◦C selama 36 jam
Berat biomassa = (Berat kertas+Biomassa) – (Berat kertas saring kosong)
b. Pembuatan kurva pertumbuhan dengan metoda berat sel kering
IV. Data PengamatanJamur
Waktu Berat kosong Berat keringT0 0,61T1 0,3881 0,49T24 0,4213 0,5738T45 0,4638 0,5676T49 0,4291 0,5333
Bakteri
Waktu Absorbansi
DAFTAR PUSTAKA
http://putrarajawali76.blogspot.com/2012/12/kinetika-pertumbuhan-jamur.html
http://trussty-jasmine.blogspot.com/2013/02/penemu-bakteri-escherichia-coli.html#axzz2OPwyU1ji
http://putupermana.blogspot.com/2012/03/rhizopus-oryzae-materi-kuliah-semester.html
Djumali M & Ani Suryani, “Teknologi Bioproses”, Penebar Swadaya, 1994.
MW. Emmanuela, dkk. “Buku petunjuk Praktikum Dasar Bioproses”, Jurusan Teknik kimia, Politeknik negeri Bandung.
Shuler Michael L, Fikret Kargi, Bioprocess Engineering Basic Concepts, Hall International Inc, New Jersey, 1992.
top related