investigación en biomedicina: pirazinamidasa de mycobacterium tuberculosis daniel rueda
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Curso Internacional de Ciencia y Tecnología
Curso de Ciencias Para Profesores Julio 2013
20 de Julio 2013
Universidad Ricardo Palma
Organizado por:
Científicos Peruanos Jóvenes en el Perú y el Extranjero
Centro de Preparación para la Ciencia y Tecnología
Universidad Ricardo Palma
http://escueladeciencias.hol.es
Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis
Msc. Daniel Rueda
Laboratorio de Bioinformática y Biología Molecular
LID - UPCH
Investigación en Biomedicina
• La Tuberculosis (TB) es una enfermedad que se transmite por el aire causada por Mycobacterium tuberculosis
• La Tuberculosis es la causante de la mas alta tasa de mortalidad a nivel muldial.
• El 80% de la tuberculosis es pulmonar
Tuberculosis
• Infected = 2 billion • Cases = 20 million • New cases = 8 million per year • Deaths = 2 million per year
Source: Organization, W.H., Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing. 2007.
Tuberculosis : Epidemiología Global
• Compuesto activo contra M. tuberculosis, M. africanum, M. microti
• Es una pro-droga convertida por la Pirazinamidasa (PZase) en su forma activa
La Pirazinamida : PZA
Formación de puentes disulfuro
Unión covalente
entre 2 aminoácidos
Puentes di-sulfuro entre cisteínas
de una misma proteína, o de
distintas proteínas
Complejos protéicos
(dímeros, trímeros,.. etc)
Electroforesis de proteínas La carga neta de una
proteina depende del pH Proteina
SDS : carga ”–”
Buffer Solución reductora (rompe puentes disulfuro)
Azul de bromofenol
PI -
+
Pirazinamidasa de M. tuberculosis
Gen pncA (561bp)
Pirazinamidasa (181aa)
Maquinaria celular
α4 β6α2 β4 α3 β5β1 α1 β2 β3
Pirazinamidasa recombinante
α4 β6α2 β4 α3 β5β1 α1 β2 β3
Gen pncA (561bp) + 15 pb
Pirazinamidasa (181aa)
Maquinaria celular
H-H-H-H-H-H
histidinas
Se inserta el gen de la proteína en un vector y se le agrega 6 H
Inserción en una bacteria E.coli
Clonación de una Proteina
(Pirazinamidasa)
Se crece la bacteria en grandes cantidades
La bacteria produce la proteina de interés en grandes cantidades
Pirazinamidasa: Expresión – Purificación
Cromatografía de Afinidad
Tubos 10 11 12 13 14 M 15 16
12% SDS-PAGE
bajo condiciones reductoras (betamercapto etanol)
31 kDa
21 kDa
12% SDS-PAGE
bajo condiciones NO reductoras
sin DTT - sin Betamercapto etanol
PZAsa
75
50
15
37
25
20
10
PZAsa
¿dimero?
PZAsa H37 Rv forma homo-multímeros
PZAasa: Homo - multímero
b₁₆⁺
1755.82874
b₁₅⁺
1656.75928
b₇⁺
734.36951
y₇⁺
791.44971
y₆⁺
654.39117
y₁₄⁺
1524.77612
y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺
319.19672
y₁₁⁺
1211.61267
b₅⁺
550.24878
y₁₃⁺
1411.69275
[M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H
1038.01343
500 1000 1500 2000
m/z
0
500
1000
1500
2000
2500
Inte
ns
ity [co
un
ts]
Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2 (2).raw #2967 RT: 64.13 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.51831 Da, MH+=2074.02934 Da, Match Tol.=0.8 Da
b₁₆⁺
1755.83252
b₁₅⁺
1656.76416
y₇⁺
791.45203
y₁₅²⁺
844.42505
y₆⁺
654.39282
y₁₄⁺
1524.78064
y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺
319.19763
y₁₁⁺
1211.61633
b₅⁺
550.25031
y₁₃⁺
1411.69629
[M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H
1038.01660
500 1000 1500 2000
m/z
0
200
400
600
800
1000
1200
Inte
ns
ity [co
un
ts]
Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2.raw #2332 RT: 54.41 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.51660 Da, MH+=2074.02593 Da, Match Tol.=0.8 Da
b₁₆⁺
1755.84265
b₁₅⁺
1656.77429
y₇⁺
791.45630
y₆⁺
654.39655
y₁₄⁺
1524.78882
y₆²⁺-H₂O, y₆²⁺-NH₃, y₃⁺
319.19934
y₁₂⁺
1340.66589
b₅⁺
550.25342
y₁₃⁺
1411.70398
[M+2H]²⁺-H, [M+2H]²⁺, [M+2H]²⁺+H
1037.52039
500 1000 1500 2000
m/z
0
100
200
300
400
500
600
700
Inte
ns
ity
[co
un
ts]
Extracted from: C:\Documents and Settings\LTQ XL\Desktop\Pirazymidase2 (1).raw #1355 RT: 36.64 FTMS, HCD, z=+2, Mono m/z=1037.52234 Da, MH+=2074.03740 Da, Match Tol.=0.8 Da
Purificación : Columna de
Exclusión Molecular
Purificación : Columna Niquel
Se midio la actividad de la PZAsa por el test de Wayne luego de 48 horas de incubación
PZAasa: Homo - multímero Los Complejos tienen actividad enzimática?
Pirazinamidasa recombinante
Cisteina138 – Cisteina184
Servidor HADDOCK - Predicción de los residuos de
interacción entre 2 monómeros de PZAsa
PZAsa 1 - PZAsa 2
Las energías mas bajas
de interacción se dan
entre C184 y C138
C14 - C72 - C138 - C184
residuo catalítico
residuo en la superficie
Al formarse los complejos se reduce la actividad de PZAsa
Modelo de formación de los complejos de PZAsa
Hipótesis
PZAsa activa
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