introducción a biologia molecular

Introducción a la biología molecular

Raul BlasFacultad de agronomia

Dpto. Fitotecnia

rblas@lamolina.edu.pe

Curso: Bioseguridad y Biotecnología Moderna

La tecnología es un proceso y un conjunto de conocimientos tanto como una colección de artefactos (Carlson, 2010)

Biología es tecnología. La biología es la tecnología más antigua. A lo largo de la historia de la vida en la Tierra, los organismos han hecho uso de unos a otros en formas sofisticadas (Carlson, 2010).

Interacción entre organismos constituye una economía natural global que mueve los recursos naturales a escalas desde molecular a macroscópica

Los seres humanos siempre han dependido explícitamente de esta economía biológica para proveerse de alimentos, oxigeno, y otros servicios. Hasta hace poco, nuestra economía industrial se basó principalmente en tecnologías no biológicas; la revolución industrial fue construida principalmente sobre el fuego, minerales y química. Ahora, nuestra economía parece estar cambiando rápidamente, y basados en la incorporación de nuevos organismos cuyos genomas han sido modificados a través de la aplicación del esfuerzo y el ingenio humano.

e.g. La biorremediación utilizado para limpiar los contaminantes (generados por otras tecnologías humana) a través de la selección de las plantas y los animales que se alimentan de materiales que se consideran en general como residuos o desperdicios.

formas de uso de la biología como tecnología

agricultura

mejoramiento genético

1828: Friedrich Wohler , produjo cristales de Urea

Nacio la quimica organica sintetica

1843-45: Hermann Kolbe, sintetizó acido acético a partir de sus elementos inorgánicos

http://syntheticbiology.org/ (MIT)

Biología Sintética (BS) es el diseño y construcción de nuevas partes biológicas, dispositivos y sistemas. el rediseño de sistemas biológicos naturales, ya existentes, para aplicaciones útiles.

BS se basa en trabajos recientes en la biología de sistemas que consiste en la modelación de sistemas biológicos, pero va más allá de la construcción y la estandarización de partes biológicas, que se unen para formar sistemas más complejos.

BS se basa en el desarrollo de las matemáticas, computación, bioquímica, etc.

La genética Molecular

La “molecularización” de la genética en los años 1950 cambió el estudio de las herencias en general.

Molecularización se refiere:

a la caracterización de los procesos biológicos a la escala de las proteinas, y ácidos nucleicos (ARN, y ADN);

en la identificación de las modalidades de bloqueo de los procesos biológicos elementales por las alteraciones de las macromoléculas.

El desarrollo de cristalografía de rayos X, y resonancia magnética molecular, en las décadas antes de 1950 abrió la venta al mundo molecular.

Experimento de Frederick Griffith, 1928

El principio de la transformacion era DNA

Que es el DNA?

Componentes fundamentales de los acidos nucleicos:

Componente acido: Fosfatos

Componente neutro: Azucares

Componente basico: Bases nitrogenadas

Adenina, Guanina, Citosina y Timina

Estructura del ADN

Nucleotidos unidos por enlaces fosfodiester

Pares de bases

DNA doble hebra

Célula

Cromosomas núcleo

Antiparalelismo de las dos hebras

Tamano de genomas y numero de genes en vegetales

Source : INRA (2003) ; Borém et al. (2003) ; Delseny, et al. (2004) ; Gibson & Muse (2004), pb = paire de bases, 1Mb = 106 pb

Espèce Taille physique de Génome (Mb)

Nombre chromosomes (n)

Nombre gènes

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Prunus persica (L.) Batsch Oryza sativa L. Eucalyptus grandis W. Hill ex- Maiden Brassica rapa L. Quercus robur L. Lycopersicon sculentum Mill. Solanum tuberosum L. Zea mays L. Lactuca sativa L. Pisum sativum L. Hordeum vulgare L. Triticum aestivum L. Tulipa fosteriana L.

150 300 450 600 650 900 980

1.540 2.500 2.730 5.000 5.200

16.000 30.000

5 8 12 11 10 12 12 12 10 9 7 7 21 12

25.500 40.000 25.000

50.000

50.000-75.000

Moyenne ~5.000 - 40.100

Tipo de secuencias

Número de copias por genoma

Que son?

Secuencias únicas

1 copia o unos pocos

Famila multigenicaGenes que codifican proteinas

Secuencias medianamente repetidas

1000 a 100000 copias

Genes que codifican para ARNr, ARNt, eventualmente de genes de protéinas

Secuencias altamente repetidas

100000 a 1000000 No son genes,Rol poco conocido

Tipos de secuencias del genoma nuclear

Genomas en los organismos

genoma es el conjunto de todas las secuencias de DNA de un individuo o de una especie.

Un gen es el conjunto de secuencias de DNA que incluye: Secuencias estructurales (intrones, exones) y Secuencias reguladoras, necesarias para codificar un producto genico, sea este un RNA maduro de cualquier tipo o una proteina funcional.

Que es un gen?

Gen

RNA

Proteina

Transmisión de la información genética

Secuencias reguladoras Exon1 Intron1 Exon3Exon2 Exon4Intron2 Intron3

Región reguladora Región estructural

Donde?

Cuando?

Que cantidad? Exon1 Intron1 Exon3Exon2 Exon4Intron2 Intron3

Pre-mRNA

Exon1 Exon3Exon2 Exon4 AAAAA

Proteína

Transcripción

Maduración de mRNA

Traducción

Corte y empalme de exones

…30% de genes

Código genético

El codigo genetico es el conjunto de pautas que rigen la transferencia de la informacion contenida en el mRNA (transcrito del DNA) para la sintesis de las proteinas

Es la correlacion entre dos lenguajes informativos:

la secuencia de nucleotidos en el mRNA (el lenguaje con 4 letras de los acidos nucleicos)

La secuencia de aminoacidos en el polipeptido (lenguaje con 20 letras de las proteinas)

Concretamente, el codigo genetico establece la correspondencia entre los 64 posibles tripletes de bases del mRNA y los 20 aa de las proteinas.

Modelos de representacion

Formato en tabla

Se han elaborado diversos modelos (tablas, esquemas, etc) para representar de forma clara y sencilla la correlacion existente entre codones del mRNA y aa del polipeptido traducido

En todos los modelos, la secuencia del triplete se refiere al codon del mRNA

Video mRNA-aa

Interaccion de los factores de transcripcion con la polimerasa

La flexibilidad del DNA permite la aproximacion fisica de los tres tipos de secuencias promotoras a pesar de su lejania en la secuencia lineal de DNA. De esta forma los factores de transcripcion unidos a las regiones basal, proximales, y distales pueden contactar entre si y con la RNA polimerasa II, por lo que participan en forma conjunta en el control del inicio de la transcripcion.

Genes constitutivos; aquellos que se expresan de una forma constante, a la misma velocidad en todo momento de la vida celular (~ genes domesticos o caseros(housekeeping genes)

Genes inducibles; estan reguladas en tiempo y espacio (~genes regulables o de expresion diferencial), los TFs que regulan estos genes no estan presentes en la celula de forma continua, sino que se sintetizan o se activan en momentos especificos o en tejidos particulares.

Herramientas básicas de biología Molecular

Enzimas de restricción

Ligación

PCR

Electroforesis

Hibridación

Southern Blot

Secuencias Palindromicas

Sequence is symmetrical

about the center point

G A A T T C

C T T A A G

Point of cleavage

Point of cleavage

5’

5’3’

3’

Enzimes de restriccion

Corte de DNA con EcoRI

Restriction enzymes

ATP

Mecanismos de Ligación

Mecanismo de ligacion

Electroforesis

Sonda (probe)

es un fragmento de DNA de longitud variable (~ 100-1000 bases longitud)

Es usado para detectar muestras de DNA o RNA (la presencia de secuencia de nucleotidos que son complementarios a la secuencia de la sonda)

La sonda de hibridizacion es marcado radiactivamente (communmente con 32P) o con marcdores inmunologicos como digoxigenin.

La sonda marcada es denaturada (por calentamiento) en simples hebras de DNA y hibridizada al DNA objetivo (target DNA) (Southern blotting) or RNA (northern blotting)

Se immobiliza sobre la membrana.

Secuencias de DNA complementrias a la sonda son detectadas por la visualizacion de la sonda a traves de la autoradiografia.

Hibridación

CGCAGATCTAATATATSonda DNA

Sonda MarcadaCGCAGATCTAATATAT

Hibridacion

CCTTCCGGAATTAGCGTCTAGATTATATACCAGAATAGGCTACGCAGATCTAATATAT

DNA Blanco

Gel despues de electroforesis

Detectado con sondas hibridadas

Southern Blot

Es el procedimiento por el cual se transfiere el DNA que ha sido digerido y corrido en un gel de agarosa (0,8%), hacia una matriz sólida tal como es una membrana de nylon.

El total de DNA que se digerió se corre en un gel de agarosa (0,8%).

El ADN se encuentra en forma de fragmentos de doble cadena que son muy cortos (100 pb) y otros muy grandes (15000 pb), por lo que el gel es sometido a determinadas soluciones para que los fragmentos puedan ser transferidos hacia la matriz sólida en forma de cadenas simples. (NaOH)

NaOH 0.4M

Capacidad de analisis de genoma completo

Sintesis de genes?

10.000 ans de processus de

domestication et d’agriculture

4. Era –”omica”Genomica

Proteomica

Metabolomica

DNA

RNAi, snRNA, miRNA

tRNA

rRNA

mRNA

Regulación/expresión génica

Transferencia

Ribosomas

Proteína metabolitos

Genoma ProteomaTranscriptoma Metaboloma

Fenotipo

InformacionBiologica

Genome

Genome

Genome

mRNAs 1

mRNAs 2

mRNAs 3

Proteome 1

Proteome 2

Proteome 3

Perspectivas-conclusiones

Animales y plantas se convierten en objetivo (blanco) como biorreactores naturales para producir nuevos productos, los que nunca fueron creados por mutagenesis, cruzamientos o seleccion

Esta nueva tecnologia facilita(rá) el desarrollo radical de nuevas terapias medicas,y sistemas de diagnostico.

Contribucion de la biotecnologia molecular:

Proporciona la posibilidad de diagnostico mas fino de las enfermedades y prevencion o cura de un amplio rango de enfermedades infecciosas y geneticas.

Incremento del rendimiento de los cultivos (resistencia a stres biotico y abiotico)

Desarrollo de micro-organismos que producen quimicos, antibioticos, polimeros, aminoacidos, enzimas y varios aditivos de los alimentos.

Desarrolla ganado y otros animales con determinada atributos geneticamente superiores.

Facilita la remocion de los contaminantes y material basura del ambiente (bioremediacion)

Tecnologia InvencionInicio de la produccion

Tiempo transcurrido para comercializacion

(anos)

Lapicero 1888 1938 50Television 1907 1936 29

Transgenicos 1983 1994 11

Dos aspectos de la biotecnologia pueden haber contribuido a la incertidumbre :

La velocidad con que fueron adoptadas en algunos sectores economicos y llegada asombrosa en el mercado

Reacciones (-) de la sociedad sobre biotecnologia

El periodo corto de tiempo probablemente no es suficiente para aprender y acostumbrarse a productos transgenicos

Capacidad de analisis de genomas

Sintesis de genes

Tomate silvestreTomate cultivada

10.000 años de procesos de

domesticacion y de agricultura

Hibridacion y seleccion

Ingenieria Genetica

OGM

1

3

2

Evolucion en la Produccion de

alimentos

4. Genómica

Para la ingeniería de sistemas biológicos, necesitaremos aprender considerablemente mas sobre la forma como las piezas biológicas trabajan juntas. Desafíos surgirán que no son obvias de la observación de todos los sistemas funcionales, pre-existentes. Con el tiempo, vamos a comprender y abordar los desafíos, el uso de la biología va a cambiar drásticamente en el proceso.

Conclusiones