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© Genetic ID (Europe) GmbH 2015
Donau Soja Kongress Berlin, 07.05.15
GVO Analyse-Methoden
Theorie und Praxis
© Genetic ID (Europe) GmbH 2014
Genetic ID (Europe) GmbH
• Gegründet im Jahr 2001
• Genetic ID NA das erste GVO-Testlabor in den USA
• ISO 17025 akkreditiert seit 2002
• Labore in den USA und Deutschland
• Global Laboratory Alliance Lizenznehmer auf 4 Kontinenten
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GVO:
Gentechnisch
Veränderter
Organismus
Definition GVO
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Gentechnische Modifikation
Bakterium
Virus
Pflanze
Tier
Transgene DNA
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Gentransfer in eine “normale” Zelle
GVO (Transgene) Pflanze
Normale Zelle
Transgene Zelle
Transgen
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Zwei Methoden des Gentransfers
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Herbizid-Resistenz (bakterielle Gene, Ackerschmalwand) Insekten-Resistenz (bakterielle Gene, z.b. Bacillus thurngienis) Virus Resistenz (virale Gene) Männliche Unfruchtbarkeit,Wiederherstellung der Fruchtbarkeit Verändertes metabolisches Profil: Fettsäureprofil, Amylopektingehalt (DNA aus Soja, Primel, roter Schimmelpilz, Kartoffel)
Gentechnische Modifikationen verleihen Pflanzen neuartige Eigenschaften
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Gentechnisch veränderte Pflanzen: Überblick
Soja Raps Mais Reis
Baumwolle Leinsamen Kartoffel Zuckerrübe
Kürbis/Zucchini Papaya Alfalfa/Luzerne
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Futtermittel-relevante GVOs
Soja
Raps Mais
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GVO- Nachweis
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Zwei Ansätze des GVO-Nachweises
Transgene Zelle
Gen
mRNA
Protein
Zellkern
Nachweis der eingefügten DNA
durch PCR
Nachweis der neuen Proteine durch
immunologische Methoden
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Proteinnachweis
Protein • Antikörper -basierte Tests detektieren das rekombinante Protein
• Strip Tests • ELISA
Vorteile: • Schnelle Methode, um nach GVOs vor Ort zu testen (Feld) • Geeignet für einen Initialscreen von Saatgut/Körnern Nachteile: • LOD oft zwischen 0.1 - 1% • Nicht verwendbar für prozessierte Produkte (z.B. Sojaschrot) • Es können Unterschiede im Gehalt der rekombinanten Proteine zwischen
verschiedenen Kultivaren und auch zwischen Geweben auftreten
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DNA • Polymerase Chain Reaction (PCR)-Test • Eine Technik zur billionen-fachen Amplifizierung eines spezifischen DNA-
Abschnitts Vorteile: • Hohe Sensitivität und Spezifität • Möglichkeit zum Nachweis aller GVOs • Ermöglicht eine Quantifizierung (für die Einhaltung der EU Verordnung
wichtig!) • Funktioniert sehr zuverlässig bei einem breiten Spektrum von Lebens-
und Futtermittelprodukten • Wird von fast allen Unternehmen in der EU verlangt Nachteile: • Muss in Spezial-Labors durchgeführt werden
DNA-Nachweis
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Zusammenfassung
Strip-Test • Schneller Screen vor Ort • Anwendbar bei Saatgut/Körnern/Blättern • Beispiel: Testen einer LKW-Ladung Sojabohnen vor der
Entladung / Schnelltest von Sojapflanzen auf dem Feld
PCR-Test • Hoch sensitiv und spezifisch • Für ein breites Spektrum von Produkten anwendbar • Weltweiter Industriestandard zur Verifizierung von Kontrakten
und Einhaltung von “Kennzeichnungs”-Verordnungen • Beispiel: Testen einer Schiffsladung Sojaschrot vor dem Export
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PCR: Grundlagen
Grundlagen der PCR • GVOs enthalten charakteristische, DNA Sequenzen • “Primer” (synthetische, kurze DNA Moleküle) werden zur Suche von GVO-Sequenzen benutzt • Exponentielle Amplifizierung der GVO-Sequenz
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Das Enzym Taq Polymerase katalysiert eine Reaktion, die Kopien der erkannten Sequenz produziert. Dies wird durch die Erkennung der angelagerten Primer ermöglicht, die als Schablonen für den neuen DNA-Strang dienen.
Synthesie einer DNA-kopie
Taq Polymerase
Transgene
PCR: Grundlagen
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PCR: Grundlagen Primer sind kurze synthetische DNA-Moleküle, die komplementär zur Ziel-Sequenz sind. Beispiel 1: Keine Primerbindung
Beispiel 2: Primerbindung
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Taq
Amplifizierung
(meistens 45 Zyklen)
Taq
Taq
Taq
Kettenreaktion, Kopien der Kopien werden synthetisiert
PCR Amplifizierung
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Anzahl der DNA Moleküle 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 1 000 000 1 000 000 000 1 000 000 000 000
Anzahl der PCR Zyklen 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40
PCR Amplifizierung
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Real Time PCR
• Basiert auf dem Nachweis und Quantifizierung einer fluoreszierenden Reporter Probe (ein zusätzlicher, mit einem fluoreszierenden Farbstoff markierter Primer)
• Signal nimmt direkt proportional mit der Menge des PCR-Produkts zu
• Durch den Einsatz der Probe wird die Sensitivität und Spezifität erhöht
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[Kopienzahl GVO-DNA (z.B. RUR)]
[Kopienzahl Spezies-DNA (z.B. Soja)] x 100% = % GVO
Relative Quantifizierung
Quantitative Real Time PCR
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GVO-Test Optionen
• Screening Test • Konstrukt-spezifischer Test
• Event-spezifischer Test
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Screening Test • “Breitband”Screen, um allg. zu bestimmen, ob irgendein GVO in der Probe
vorhanden sein könnte. Nachweis von typischen GVO-Elementen (Marker). • Beispiel: CaMV 35S Promotor und NOS Terminator
Promotor Soja Genom Soja Genom Charakterist. Gen
Terminator
Transgene DNA
NOS EPSPS 35S
RUR Soja
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Konstrukt-spezifische Tests
• Weist das merkmalsgebende Gen nach (z.B. Herbizidresistenz) • Beispiel: EPSPS
Promotor Soja Genom Soja Genom Charakterist. Gen
Terminator
Transgene DNA
NOS EPSPS 35S
RUR Soja
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Event-spezifischer Test
• Ermöglicht den 100% Nachweis eines GVO • Varietäten-spezifisch • Beispiel: Übergang zwischen Pflanzengenom und Transgen
Promotor Soja Genom Soja Genom Terminator
Transgene DNA
NOS EPSPS 35S
RUR Soja
Charakterist. Gen
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Qualitatives Screening - An-oder Abwesenheit von GVOs - Nachweisgrenze (LOD)= 0.01% - Geeignet wenn eine Ja/Nein Antwort ausreicht - Oft als Vorabscreen - kostengünstig
PCR Test-Optionen
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Quantitative Tests - Bestimmung des GVO-Gehalts (möglich bei ausreichender Menge an
Zielspezies-DNA) - Erforderlich für:
- Einhaltung der EU Verordnungen 1829/2003 und 1830/2003 - Verifizierung der Konformität mit Zertifizierungsprogrammen (z.B.
NON-GMO Standard) - Verifizierung von Positivauslobungen (z.B. “Ohne Gentechnik” in D,
“gentechnikfrei erzeugt” in A, “Donau Soja”)
PCR Test-Optionen
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GVO Teststrategien
Um den geeignetsten PCR-Test auszuwählen müssen einige Faktoren erwogen werden, wie:
• Ist ein qualitativer Test ausreichend? • Ist eine Quantifizierung notwendig? • Ist es wichtig alle kommerzialisierten GVOs zu detektieren? • Ist der Nachweis eines bestimmten GVOs
notwendig/ausreichend?
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Aktuell in Brasilien zugelassene GVO-Soja Varietäten
Handelsname Event-Name Gen Eigenschaft Hersteller
Roundup Ready® GTS 40-3-2 CP4 epsps Glyphosat-R. Monsanto
Intacta RR2 Pro Mon 89788 x
Mon87701 CP4 epsps,
cryIaC Glyphosat-/Insektenresistenz Monsanto
Liberty Link ® A2704-12 pat Glufosinat-R. Bayer
CropScience
BPS-CV127 Cultivance Csr1-2 Imidazolinon-R. BASF
Anmerkung: In Brasilien ist zur Zeit nur Roundup Ready® und Intacta kommerzialisiert, der Anbau der EU-zugelassenen Varietät Liberty Link und Cultivance erfolgt voraussichtlich 2015 oder später.
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Beispiel 1: Soja/Soja-haltige Mischfuttermittel
Handelsname Eventname Trait Zusätzliche genetische
Elemente
35SP NOST FMV
Roundup Ready® GTS 40-3-2 cp4 epsps √ √
Intacta RR2 Pro® Mon 89788 x Mon 87701
cp4 epsps cryIAc
√
Teststrategie (Mon40-3-2 und Mon89788) ist ausreichend, um alle kommerzialisierten Varietäten abzudecken. Die Menge Intacta wird in den kommenden Jahren zunehmen Anmerkung: Mon 87701 wird nicht als einzelnes Event vertrieben, sondern nur als Hybrid mit Mon89788
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Beispiel 2: Allgemeines Screening
Qualitative PCR Analyse
Test Beispielhaftes Testergebnis
Nachgewiesene GVO Events
35S Promoter Nicht nachgewiesen
Fast alle kommerzialisierte und EU nicht-zugelassene GVOs, z.B. GVO Reis, GVO-Leinsamen
NOS Terminator Nicht nachgewiesen
FMV Promoter Nicht nachgewiesen
z.B. Soja Mon89788, Zuckerrübe H7-1, Raps GT73
Geeignet für Lebensmittelprodukte, Getreide, Saaten, Einzelfuttermittel (z.B. Mais, Raps), Futtermittel ohne Soja (Kreuzkontamination)
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GVO-Testpaket Design
Zusammenfassung • Das angemessene GVO-Testpaket sollte sich nach verschiedenen
Faktoren richten: • EU und/oder nationale Verordnungen • Komerzielle Anforderungen • Kundenanforderungen • Sollte alle relevanten GVOs abdecken • Möglichst kosteneffizientes Design
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Weitere Faktoren
Beprobung
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Überlegungen zur Beprobung
• Probe sollte repräsentativ sein (Beprobung nach internationalen Richtlinien, wie z.B. GAFTA, EU VO 152/2009, EU Empfehlung 2004/787)
• Das analytische Ergebnis bezieht sich auf die Probe, nicht auf das Los
• Hauptursache für Schwankungen von Laborergebnissen
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vs.
Beprobungsstrategien: Schüttgüter
2.1 2004_787_EG
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Probenahmeintervall
VLOG Standard 13.02
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Leitfaden Futtermittelkontrolle (Deutschland)
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Grundsatz: Keine gv-Kennzeichnungspflicht im Mischfuttermittel, wenn keine der Einzelfuttermittel kennzeichnungspflichtig ist! D.h. bei Positivbefund (>0,9% GVO) eines soja-haltigen Misch- Futtermittels ist eine Nachbeprobung der Einzelfuttermittel ratsam, da evtl. doch nicht gekennzeichnet werden muss.
Leitfaden Futtermittelkontrolle
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Bis zu 5% botanisches Fremdmaterial im Einzelfutter-Mittel laut Futtermittelverordnung erlaubt. Bei botanischen Verunreinigungen mit GVO-haltigem Material wird laut Leitfaden GVO-Wert in Bezug auf das Gesamtfuttermittel berechnet.
Leitfaden Futtermittelkontrolle
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Leitfaden Futtermittelkontrolle
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...und das Berechnungsbeispiel
Leitfaden Futtermittelkontrolle
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www.genetic-id.de www.genetic-id.com
www.global-id-group.com
www.cert-id.eu www.cert-id.com www.cert-id.com.br
www.foodchainadvisors.eu www.foodchainid.com
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