francisco j. morales fernando correa v
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Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2, 2002
FITOPATOLOGÍA
COLOMBIANA
VOLUMEN 26 NÚMERO 2 DICIEMBRE 2002
Revista
“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA” ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LA ASOCIACIÓN
COLOMBIANA DE FITOPATOLOGÍA Y CIENCIAS
AFINES- ASCOLFI
ISSN 01120-0143
Licencia de Min. Gobierno No 001808, Cali, Apartado Aéreo
5004, Nit. : 891 –301.725-6
Sociedad sin ánimo de lucro, Personería Jurídica 1097 de
abril 1º de 1977
JUNTA DIRECTIVA 2002-2004
Principales Suplentes
Presidencia
Juan Carlos Angel S.. Bertha Lucia Castro
Vicepresidencia Benjamín Pineda L. José Hernández M.
Secretaría
Diego Chávez Mónica Betancourt V
Tesorería
Octavio Montoya Estrada Omar Guerrero.
Vocales Elizabeth Álvarez Edwin Arley Navia
Revisoría Fiscal
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Representantes Internacionales
Francisco J. Morales Fernando Correa V.
Gabriel Cadena
Editor
Benjamín Pineda L, Ing. Agr. MSc.
COMITÉ EDITORIAL
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Nelson Bravo O., Ing. Agr. MsC
José Hernández M. , Ing. Agr.
Octavio Montoya E.; Ing Agr.
Victor Manuel Pardo C. , Ing Agr.
Benjamín Pineda L. , Ing. Agr. MSc
Luz Edna Romero., Biológa
Francia Varón de A. Ing. Agr. MSc.
Jorge Ignacio Victoria K, Ing. Agr. Ph. D.
Charles Volcy, Ing. Agr. MSc.
Representante de publicidad:
Gabriel Robayo V., Ing Agr, M.Art
Esta publicación es enviada a las principales bibliotecas
agrícolas Nacionales e Internacionales y es abarcada por los
servicios compendiadores de “CAB International “ y “
BIOSIS”, entre otros
Fecha de impresión: Junio de 2003
Artículo Página
Combinaciones de genes en arroz para el desarrollo de
resistencia durable a Pyricularia grisea en Colombia
Fernando .J. Correa-V, D. Tharreau, César Martínez,
Michel. Vales, Fabio Escobar, Gustavo Prado
y Girlena Aricapa ................................................................................... 47
Evidencias del mildeo velloso (Peronosclerospora sorghi
(W. Weston & uppal) C. G. Shaw) en cultivos de maíz y sorgo
en Colombia
Carlos A. Huertas D., Greicy Sarria V. y Benjamín Pineda-L................. 55
Genética de la resistencia a pudrición causada por
Phythophthora tropicalis en dos poblaciones segregantes
de yuca (Manihot esculenta Crantz)
Elizabeth Álvarez, John Loke, Sandra Rivera y Germán Llano................ 61
Purificación del virus del síndrome de la hoja amarilla de
la caña de azúcar (Sugarcane Yellow Leaf luteovirus SCYLV)
y producción de antisuero.
Juan Carlos Ángel S., Mavir C. Avellaneda B.,Jorge I.
Victoria K., Mónica Betancourt V., Cristina Díaz-Granados,
José A. Arroyave P. y Mauricio Castaño J................................................. 68
Caracterización parcial de un potexvirus aislado de pitahaya
amarilla (Selenicereus megalanthus) afectada por mosaico en
Colombia
Helena Reichel, Rosalía Pérez y Ana Karine Martínez,
Raúl Sedano, Maritza Cuervo, José A. Arroyave
y Francisco J. Morales............................................................................... 73
Nuevos brotes de begomovirus en Colombia
Francisco J. Morales, Ana K. Martínez y Ana C. Velasco........................ 75
Enfermedades virales de la palma de aceite en el suroccidente
colombiano y sus agentes causales
Francisco J. Morales, Iván Lozano, José A. Arroyave,
Mauricio Castaño, Raul Sedano y Ana C. Velasco.................................. 81
Nematodos asociados a la granadilla Passiflora ligularis Juss
en el Valle del Cauca
Zulaima E. Vargas Z, Francia Varón de A. y
Eider D. Gómez ....................................................................................... 87
Nematodos asociados al tomate de árbol Solanum betaceum
en el Valle del Cauca
Sandra L. Lozada S., Francia Varón de A. y Eider D. Gómez................. 93
CONTENIDO
Fitopatología Colombiana /Volumen 26, 2002
i
POLÍTICA EDITORIAL FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA
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Nuestra carátula
Síntomas de mildeo velloso (P. sorghi) en maíz ICA V 109:
Inflorescencia masculina severamente afectada por filodia.
( Figura 1 b, página 58)
Fotografía C. A. Huertas D.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
COMBINACIONES DE GENES EN ARROZ PARA EL DESARROLLO DE RESISTENCIA
DURABLE A Pyricularia grisea EN COLOMBIA
Fernando J. Correa-Victoria1, Didier Tharreau2, César Martínez1, Michel. Vales1,2, Fabio Escobar1, Gustavo Prado1 y Girlena Aricapa1
1Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, AA 6713 Cali, Colombia, 2Centre de Coopération Internationale en Recherche
Agronomique pour le Développement, CIRAD-CA, 34032 Montpellier, France
RESUMEN
El añublo del arroz causado por Pyricularia grisea (Magnaporthe
grisea) es el principal limitante de la producción en Colombia. La
perdida de la resistencia ocurre en períodos de uno a tres años, con la
excepción de los cultivares Oryzica Llanos 5 liberado en 1989 y Fe-
dearroz 50 liberado en 1998. Con el objetivo de desarrollar cultivares
con resistencia durable al añublo hemos analizado la estructura genéti-
ca de poblaciones del patógeno utilizando técnicas moleculares como
MGR-DNA y rep-PCR “fingerprinting” y estudiamos la diversidad y
frecuencias de los genes de avirulencia/virulencia del hongo. P. grisea
en Colombia es principalmente clonal. Cada clon o linaje exhibe un
espectro de virulencia amplio. Sin embargo, algunos genes de resisten-
cia son efectivos contra todos los aislamientos de un linaje. Los genes
de avirulencia varían en frecuencia, sugiriendo que dichos genes de
avirulencia pueden estar asociados con la supervivencia y reproduc-
ción, y por lo tanto, los genes de resistencia correspondientes a dichos
genes de avirulencia serían más relevantes en el mejoramiento para
una resistencia durable. Nuestros estudios nos permiten identificar y
predecir la durabilidad de combinaciones de genes de resistencia
basados en las frecuencias de genes de avirulencia. Hemos identificado
los posibles genes de resistencia presentes en nuestras variedades de
arroz e iniciado un programa de retrocruzamiento para incorporar las
combinaciones de genes de resistencia deseadas en variedades de arroz
de América Latina, a través de una selección asistida por marcadores
moleculares, inoculaciones controladas con aislamientos del patógeno,
y evaluaciones de campo.
Palabras claves: Oryza sativa, añublo, enfermedades del arroz. fi-
tomejoramiento, resistencia
SUMMARY
Rice blast caused by Pyricularia grisea (Magnaporthe grisea) is the
main limiting factor of rice production in Colombia. Resistance break-
down occurs after one to three years of cultivar release, with the ex-
ception of the commercial cultivars Oryzica Llanos 5 released in 1989
and Fedearroz 50 released in 1998. With the objective of developing
rice cultivars with durable resistance to blast we have analyzed the
genetic structure of blast pathogen populations using techniques such
as MGR-DNA and rep-PCR fingerprinting and studied the diversity
and frequencies of avirulence/virulence genes in the fungus. P. grisea
in Colombia is mainly clonal. Each clone or lineage exhibits a broad
spectrum of virulence. However, some resistance genes are effective
against all isolates of a linage. Avirulence genes vary in frequency,
suggesting that these genes could be associated with pathogenic fit-
ness. Therefore, the resistance genes corresponding to those avirulence
genes would be more relevant in breeding for durable resistance. Our
studies are allowing us to identify and predict the durability of re-
sistance gene combinations based on the frequency of avirulence
genes. We have identified the possible resistance genes present in our
commercial rice cultivars and initiated a backcrossing program for
incorporating desired combinations of resistance genes in rice varieties
of Latin America through marker assisted selection, controlled inocu-
lations with pathogenic isolates, and field evaluations.
Keywords: rice, resistance, breeding, rice blight
INTRODUCCIÓN
El añublo del arroz, causado por Pyricularia
grisea Sacc., estado asexual de Magnaporthe
grisea (Hebert) Barr, es la enfermedad mas
ampliamente distribuida y dañina del arroz
cultivado, tanto en zonas tropicales como
templadas. El hongo ataca prácticamente
todas las partes de la planta, pero los daños
más frecuentes ocurren en las hojas y las
panículas.
Por muchos años, las investigaciones se
han concentrado en la identificación de razas
del patógeno y la incorporación de genes de
resistencia a dichas razas en los cultivares
comerciales. Sin embargo, la resistencia de
los cultivares en Colombia se ha perdido
después de su liberación en períodos de tan
solo uno a tres años (Correa-V y Martínez,
1994), con la excepción de los cultivares
comerciales Oryzica Llanos 5 liberado en
1989 y el cultivar Fedearroz 50 liberado en
1998 (Tabla 1).
Grandes esfuerzos se están haciendo en el
Centro Internacional de Agricultura Tropical,
CIAT, para entender la gran variabilidad
observada en este patógeno, la cual es consi-
derada como la principal causa de la perdida
de la resistencia de los cultivares liberados.
Un extenso estudio de la diversidad de P.
grisea en Colombia fue iniciado en el año
1990. Estos estudios han considerado tanto la
diversidad y frecuencia de los genes de aviru-
lencia así como el espectro de virulencia de
varias centenas de aislamientos del hongo
recolectados de diferentes cultivares de arroz.
Aislamientos del hongo han sido inoculados
en condiciones de invernadero sobre cultiva-
res de arroz con genes de resistencia conoci-
dos, cultivares de arroz liberados en Colom-
bia en un período de 30 años, fuentes de
resistencia durable, cultivares diferenciales
internacionales, y un conjunto de líneas iso-
génicas que contienen genes de resistencia
reportados en la literatura.
Dactiloscopia del ADN, utilizando técni-
cas moleculares de RFLP y PCR, han sido
usadas para determinar la estructura genética
de las mismas poblaciones del hongo analiza-
das por su virulencia. La complejidad del
patógeno ha sido de esta forma simplificada
en seis familias genéticas, denominadas SRL-
1 a SRL-6 (Levy et al, 1993) las cuales son
principalmente compatibles con arroz de
riego tipo indica, y un linaje genético deno-
minado A-7 compatible con arroz de secano
tipo japónico (Figura 1). Estudios sobre la
relación entre el espectro de virulencia y una
familia o linaje genético del patógeno, indi-
can que denominado A-7 compatible con
arroz de secano tipo japónico (Figura 1).
Estudios sobre la relación entre el espec-
tro de virulencia y una familia o linaje genéti-
co del patógeno, indican que lo más impor-
tante de esta interacción es que existen genes
de resistencia en el arroz, los cuales son
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 48
efectivos o controlan todos los aislamientos o
individuos de un mismo linaje.
De esta forma, el proyecto de Arroz de
CIAT como objetivo ha venido desarrollando
una estrategia de mejoramiento para el desa-
rrollo de resistencia durable al añublo del
arroz, la cual está basada en estudios sobre la
composición y frecuencia de los genes de
avirulencia del patógeno, la caracterización
de la estructura genética, la identificación e
incorporación en los cultivares de combina-
ciones de genes de resistencia efectivos con-
tra las poblaciones del hongo de cada familia
genética, y la evaluación continua y selección
de líneas del programa de mejoramiento bajo
una alta presión de la enfermedad y una alta
diversidad del patógeno (Correa-V y
Zeigler,1993a; 1993b; 1995).
Caracterización de la virulencia y estruc-
tura genética de Pyricularia grisea en Co-
lombia
El Proyecto de arroz del CIAT realiza sus
actividades de mejoramiento por resistencia a
P. grisea bajo condiciones de secano favore-
cido en la estación experimental “Santa Ro-
sa” de FEDEARROZ en el departamento del
Meta, Colombia, sitio de alta presión de la
enfermedad y diversidad del patógeno. Una
alta incidencia de la enfermedad es mantenida
en las parcelas de mejoramiento durante todo
el ciclo del cultivo mediante el uso de surcos
esparcidores, los cuales están compuestos por
una mezcla de cultivares comerciales suscep-
tibles a las diferentes familias genéticas del
hongo. Estos surcos son sembrados en forma
perpendicular a las líneas de arroz a ser eva-
luadas por su resistencia. Gran cantidad de
esporas del hongo son producidas sobre los
Tabla 1 Cultivares de arroz liberados en Colombia, fuentes de resistencia y año del rompimiento de la
resistencia a Pyricularia grisea
Cultivar
Fuente de Resistencia
Año de Libe-
ración
Rompimiento de la
Resistencia
Años de
Resistencia
Cica 4 Peta 1971 1972 1
Cica 6 IR-822-432 1974 1975 1
Cica 7 Colombia 1 1976 1978 2
Cica 9 C 46-15 1976 1977 1
Cica 8 Tetep 1978 1980 2
Metica 1 Colombia 1 1981 1982 1
Oryzica 1 C 46-15, Colombia 1,
Tetep
1982 1985 3
Oryzica 3 Colombia 1, Tetep 1984 1985 1
Línea 2 C 46-15, Colombia 1,
Tetep
1988 1989 1
Oryzica
Llanos 5
IR 36, 5685, Colombia
1, Cica 9
1989 ? > 10
Oryzica
Caribe 8
Tetep, IR 665, Colom-
bia 1, Cica 9
1993 1995 2
Fedearroz 50 IR 665, 5685, Colombia
1, Cica 9
1998 ? > 4
Figura 1. Huella del ADN (“fingerprinting”) de P. grisea determinado por Pot 2-PCR (George et al, 1997). Linajes genéticos SRL-1 a SRL-6 y Altillanura 7 (A-
7) de Colombia
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 49
surcos esparcidores siendo estas diseminadas
por el viento y el agua sobre las líneas de
mejoramiento, aumentando la probabilidad de
exposición de una línea al patógeno y redu-
ciendo la posibilidad de escape a la infección
(Figura 2).
Bajo estas condiciones de evaluación y
selección, se ha encontrado que la resistencia
seleccionada es más estable y duradera que
bajo condiciones de menor presión. Sin em-
bargo, la durabilidad de la resistencia depen-
de no solo de la planta, sino de la dinámica
del patógeno y sus cambios en la virulencia.
El establecimiento entonces de un sistema
para entender la variabilidad patogénica y su
dinámica es esencial para el desarrollo de una
estrategia de control de la enfermedad con
resistencia genética.
Estudios de poblaciones de P. grisea re-
colectadas durante 12 años en este sitio han
mostrado la existencia de mas de 50 razas del
hongo, presentando virulencia o compatibili-
dad con mas de 13 genes de resistencia. Bajo
condiciones de invernadero plántulas de arroz
de 21 días de edad son inoculadas en tres
replicaciones (10 plantas por repetición)
mediante la aspersión de una suspensión de
5x105 esporas/mL, incubadas por 15 días con
una alta humedad relativa, y evaluadas por el
tipo de lesión y porcentaje de área foliar
afectada. Estudios sobre frecuencias de viru-
lencia sobre 42 cultivares de arroz con dife-
rentes genes de resistencia estuvieron entre
0,0 y 0,86 (Correa-V y Zeigler, 1993 a). La
mayoría de los aislamientos presentan perdida
de un gran número de genes de avirulencia,
pero ningún aislamiento es virulento sobre
todos los genes de resistencia (Tabla 2) sugi-
riendo la necesidad de piramidar estos genes
para poder lograr resistencia efectiva contra
el patógeno (Correa et al, 1994).
El análisis molecular de estas poblacio-
nes del patógeno sugieren que este se repro-
duce principalmente de forma asexual, estan-
do agrupado en pocas familias genéticas.
La estructura genética es relativamente
simple a pesar de la gran diversidad observa-
da en la virulencia. La similitud genética de
los aislamientos dentro de un mismo linaje es
mayor al 90%, mientras que la similitud entre
aislamientos de diferentes linajes está entre
37 a 85% (Levy et al, 1993. El espectro de
virulencia de aislamientos dentro de cada
linaje es altamente similar, difiriendo en tan
solo unos pocos factores de virulencia. Aun-
que las familias genéticas del hongo compar-
ten un alto número de genes de avirulencia, se
ha detectado una alta interacción específica
entre algunos genes de avirulencia en el
patógeno y algunos genes de resistencia en la
planta, siendo esta interacción de mucha
importancia desde el punto de vista de mejo-
ramiento para el desarrollo de cultivares
resistentes (Tabla 2). Esta interacción especí-
fica es la base para la selección de progenito-
res que deben ser incluidos en un programa
de mejoramiento para resistencia al añublo
del arroz.
La caracterización de la estructura genéti-
ca o linajes, junto con el espectro de virulen-
cia y las frecuencias de los genes de avirulen-
cia en la población del patógeno deben enton-
ces proveer un estimativo más real de la
durabilidad de la resistencia que el estudio de
estos componentes por separado. En la Tabla
2 se observa que un gen de resistencia puede
ser atacado por aislamientos de diferentes
linajes genéticos como es el caso de los genes
Pi-t y Pi-ks. Por otro lado, ciertos genes de
resistencia son efectivos controlando todos
los patotipos de una misma familia genética o
de varias, aunque sean susceptibles a los
patotipos de otras familias. De esta forma, se
presentan cultivares con genes de resistencia
complementarios, los cuales en combinación
o después de acumularlos en un mismo culti-
var confieren resistencia a toda la población
del patógeno en estudio. Las líneas isogénicas
CT 13432-68, CT 13432-54 y CT 13432-55
que contienen los genes de resistencia Pi-1,
Pi-2 y Pi-33, respectivamente, tienen genes
de resistencia complementarios, los cuales en
combinación o piramidados en la línea isogé-
nica CT 13432-34 confieren resistencia con-
tra todos los aislamientos del patógeno perte-
necientes a las diferentes familias genéticas
del hongo encontradas en Colombia (Tabla
2).
La frecuencia de los diferentes genes de
virulencia y linajes genéticos depende de los
genes de resistencia utilizados en los cultiva-
res comerciales sembrados por el agricultor.
La frecuencia de los linajes genéticos cam-
bian entre años dependiendo del área sembra-
da con un cultivar y del espectro total de
virulencia de dicho linaje. En un estudio
sobre la frecuencia de compatibilidad de los
aislamientos mas virulentos de Colombia
sobre 201 cultivares de arroz de América
Latina (Correa-V, et al 2000), se observó que
la mayoría de los cultivares son susceptibles
al linaje SRL-6 (80,6%) seguido por el linaje
SRL-5 (68,7%). El patrón de compatibilidad
observado con los linajes SRL-6 y SRL-5
deben ser el resultado de una base genética
estrecha y similar presente en el germoplasma
que ha sido utilizado en América Latina para
el desarrollo de sus cultivares.
El linaje SRL-6 ha sido por muchos años
el mas frecuente en la población del hongo en
Colombia. Los linajes SRL-2 y SRL-4 han
aumentado en frecuencia ya que el área sem-
brada con cultivares susceptibles a estos
linajes ha aumentado en los últimos años.
Aislamientos de estos dos linajes exhiben
un amplio espectro de virulencia sobre los
cultivares de arroz de Colombia y líneas
isogénicas. La frecuencia de los linajes SRL-
1 y SRL-5 han disminuido en el tiempo ya
que los cultivares susceptibles a estos linajes
han casi desaparecido de los campos de los
agricultores. Estos dos linajes exhiben sin
embargo una alta compatibilidad con los
cultivares de arroz de América Latina. La
frecuencia de los linajes SRL-1 y SRL-3 ha
sido casi cero durante los últimos años debido
Figura 2. Estación experimental Santa Rosa para la evaluación de la resistencia a P. grisea utilizando la
metodología de esparcidores para la multiplicación y diseminación del patógeno manteniendo una alta
presión de la enfermedad
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 50
a la ausencia de cultivares susceptibles en
campos comerciales y al espectro de virulen-
cia estrecho exhibido por ellos sobre los
cultivares de Colombia.
Se ha observado también una ganancia en
virulencia (perdida de genes de avirulencia)
para la mayoría de los linajes mas predomi-
nantes como se observa en la subdivisión del
linaje SRL-6 en SRL-6B y el linaje SRL-4 en
la Tabla 2. La identificación temprana o antes
de que aumenten en frecuencia, de patotipos
con un amplio espectro de virulencia es de
uso practico para la identificación de genes de
resistencia que puedan ser usados en el even-
to que se pierda la resistencia de un cultivar
comercial.
En el CIAT los fitomejoradores han desa-
rrollado cultivares de arroz con resistencia
durable por mas 10 años tal como el cultivar
Oryzica Llanos 5 (Tabla 1) cuyos padres
exhiben susceptibilidad a los diferentes lina-
jes genéticos del patógeno (Figura 3). Nues-
tros estudios a partir de poblaciones del hon-
go recolectadas en campo a partir de cada uno
de los cinco progenitores demuestran que los
linajes que son aislados son específicos con
cada cultivar como se muestra en la Figura 3.
Inoculaciones bajo condiciones de inver-
nadero también demuestran que estos mismos
linajes son los que reinfectan al cultivar de
Tabla 2. Genes de avirulencia presentes en aislamientos de Pyricularia grisea de Colombia
Fuente
Gen Aislamiento/ Linaje Genético
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Resistencia L6B L6B L6 L4 L4 L4 L4 L2 L5
CT 13432-68 Pi-1 R R R R R R
CT 13432-54 Pi-2 R
CT 13432-55 Pi-33 R1 R R R R
C 104 PKT Pi-3 R
C 101 PKT Pi-4a R
C 105 TTP4 (L23) Pi-4b R
F 124-1 Pi-ta
F 128-1 Pi-ta2 R R R
F 80-1 Pi-k R R
F 98-7 Pi-km
F 129-1 Pi-kp R
F 145-2 Pi-b R R
Aichi Asahi Pi-a R
K 3 Pi-kh R R R R R R
K 59 Pi-t
Rico 1 Pi-ks
Norin 2 Pi-sh R R
Nato Pi- i
OU 244 Pi-z R R R R R
Toride Pi-zt R R R
CT 13432-34 Pi-1, Pi-2, Pi-33 R R R R R R R R R
1R = Reacción resistente o incompatible como resultado de la interacción entre un gen de avirulencia en el patógeno y un gen de resistencia en la planta.
Figura 3. Genealogía de la variedad Oryzica Llanos 5 con resistencia durable a P. grisea mostrando la reacción complementaria de la resistencia de los progenito-
res a diferentes linajes genéticos del patógeno
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 51
origen, y que cada progenitor presenta genes
de resistencia efectivos contra el resto de los
linajes del patógeno. Estos resultados sugie-
ren que estos padres contienen genes de
resistencia complementarios los cuales en
combinación confieren la resistencia durable
observada por mas de 10 años en este culti-
var. De acuerdo a Johnson (1984), resistencia
durable “es la resistencia que permanece
efectiva después de ser usada en grandes
extensiones por un período largo de tiempo
bajo condiciones ambientales favorables para
el desarrollo de la enfermedad”. El cultivar
Oryzica Llanos 5 ha cumplido con esta defi-
nición de durabilidad y es por esta razón que
es de nuestro interés determinar la composi-
ción genética del mismo para la identificación
de la combinación de genes que le confieren
su durabilidad.
Identificación y uso de combinaciones de
genes de resistencia a Pyricularia grisea
para el desarrollo de cultivares de arroz
con resistencia durable
Un total de 283 líneas recombinantes F7
originadas a partir del cruce entre las líneas
isogénicas C 101 LAC (genes de resistencia
Pi-1y Pi-33) x C 101 A51 (gen de resistencia
Pi-2) fueron desarrolladas para la identifica-
ción de microsatélites (McCouch et al, 2001)
asociados con estos tres genes de resistencia y
el desarrollo de líneas isogénicas con diferen-
tes combinaciones de dichos genes para
evaluar su resistencia a P. grisea tanto en
campo como en inoculaciones controladas.
Los resultados demuestran que la combina-
ción de los tres genes de resistencia Pi-1, Pi-2
y Pi-33 es la mas relevante para el mejora-
miento y desarrollo de cultivares con una
resistencia durable al patógeno.
La frecuencia de virulencia sobre cada
uno de los tres genes de resistencia es alta
dentro de algunos linajes genéticos pero
ningún aislamiento es compatible con los tres
genes (Tabla 2, Tabla 3). Hemos demostrado
tanto en inoculaciones de invernadero como
en evaluaciones de campo que la combina-
ción de los tres genes de resistencia (Pi-1 +
Pi-2 + Pi-33) en las líneas isogénicas CT
13432-34, CT 13432-107, CT 13432-189, y
CT 13432-246 (Tabla 2, Tabla 3, Figura 4)
confiere resistencia completa a las poblacio-
nes de P. grisea presentes en Colombia, las
cuales son compatibles con cualquiera de los
genes o la combinación de dos de ellos (Tabla
3, Figura 4).
De acuerdo a nuestros estudios, los genes
de avirulencia avr-Pi-1 y avr Pi-33 se en-
cuentran altamente conservados en la pobla-
ción del patógeno en Colombia, sugiriendo
que estos genes de avirulencia tienen una
menor frecuencia de mutación hacia virulen-
cia y probablemente son genes muy impor-
tantes en el “fitness” o sobrevivencia del
hongo función del correspondiente gen de
avirulencia para poder sobrepasar dicho gen
de resistencia. Por otro lado, el gen de aviru-
lencia avr Pi-2 está presente solo en el linaje
genético SRL-5, sugiriendo que este gen de
avirulencia tiene una mayor tasa de mutación
hacia virulencia y que el gen por si solo sería
muy poco durable. Esto se confirma en
nuestros resultados dado que la mayoría de
aislamientos en cuatro de los seis linajes
genéticos son compatibles con el gen de
resistencia Pi-2 (Tabla 2). Adicionalmente,
los genes de resistencia Pi-kh, Pi-sh, y Pi-z
pueden ser considerados de mucho uso po-
tencial (Tabla 2) ya que en combinación
también confieren resistencia a toda la pobla-
ción del hongo estudiada.
La interacción patógeno-planta en el
complejo arroz-pyricularia se ha demostrado
de acuerdo a la hipótesis del gen x gen (Flor,
1971), donde la resistencia resulta de la inter-
acción genética entre los genes de resistencia
en la planta y los genes de avirulencia en el
patógeno. Solo basta que se presente uno solo
de estos genes correspondientes en cada uno
de los organismos (planta y patógeno) para
que se manifieste la reacción resistente. La
mutación o perdida de uno de estos genes en
cualquiera de los dos organismos es determi-
nante para que la interacción deje de ser de
resistencia y se manifieste como susceptible.
Muchos genes de avirulencia pueden ser
factores de “fitness” altamente relacionados
con la capacidad de un organismo de sobrevi-
vir y reproducirse (Leach et al, 2001).
Se ha sugerido que los genes de avirulen-
cia de fácil capacidad de mutación en el
patógeno son probablemente menos críticos
sobre los procesos de “fitness” o capacidad de
reproducción y sobrevivencia que aquellos
que raramente mutan (Flor, 1971), y ha sido
indicado que el “fitness” de un patógeno es el
factor o fuerza principal en la evolución y
estabilidad de un patosistema en la agricultu-
ra (Van der Plank, 1968). De esta manera, se
considera que la calidad y durabilidad de un
gen de resistencia es una función directa de
los efectos impuestos al patógeno al perder la
Dos métodos han sido sugeridos para eva-
luar el efecto sobre el “fitness” impuesto por
la mutación de un gen de avirulencia sobre
las poblaciones del patógeno (Leach et al,
2001). Primero, determinar si hay una reduc-
ción de un gen de virulencia (gen de aviru-
Tabla 3. Reacción a Pyricularia grisea en hoja y cuello en líneas isogénicas con diferentes ccombina-
ciones de los genes de resistencia Pi-1, Pi-2 y Pi-33
Línea isogénica Gen Resistencia Añublo Hoja Añublo Cuello Inci-
dencia (%) BL41 BL51
CT 13432-95 Ninguno 9. 9 Muerte
CT 13432-110 Ninguno 9 9 Muerte
CT 13432-68 1 9 9 Muerte
CT 13432-54 2 9 9 Muerte
CT 13432-6 33 9 9 Muerte
CT 13432-230 1 + 2 9 9 Muerte
CT 13432-26 1 + 33 9 9 Muerte
CT 13432-193 2 + 33 8 5 15
CT 13432-34 1 + 2 + 33 2 2 0
CT 13432-107 1 + 2 + 33 2 1 0
CT 13432-189 1 + 2 + 33 2 1 0
CT 13432-246 1 + 2 + 33 2 1 0
1 Cuarta y quinta evaluaciones de añublo en la hoja (BL)
Figura 4 Resistencia completa a Pyricularia grisea de la línea isogénica CT 13432-34 conferida por la
combinación de los genes de resistencia Pi-1, Pi-2, Pi-33
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 52
lencia mutado) en ausencia del gen de resis-
tencia correspondiente en el campo. La hipó-
tesis es que si la mutación no confiere venta-
jas selectivas en el patógeno, entonces el gen
mutado desaparecerá de la población. Segun-
do, determinar directamente en el laboratorio
si la inactivación de un gen de avirulencia
conlleva un efecto directo sobre los compo-
nentes del “fitness” del patógeno. Estos estu-
dios requieren de una validación de los resul-
tados de laboratorio en el campo. Respuestas
positivas a estas dos preguntas pueden ser
consideradas como evidencia indicadoras de
que el efecto de los genes de avirulencia
sobre el patógeno puede ser usada como
indicador para predecir la durabilidad de un
gen o la combinación de varios genes de
resistencia. En otras palabras, aquellos genes
de resistencia que imponen al patógeno un
alto valor o efecto deletéreo al perder el gen
correspondiente de avirulencia para poder
adaptarse o romper la resistencia de dicho
gen, probablemente será un gen de resistencia
durable.
De esta forma, nuestros estudios han ve-
nido siendo encaminados hacia el desarrollo
de la capacidad para predecir la durabilidad
de los genes de resistencia con el objetivo de
utilizarlos eficientemente en nuestro progra-
ma de mejoramiento. Líneas isogénicas desa-
rrolladas en IRRI y CIAT con diferentes
genes de resistencia y combinaciones de ellos
han sido útiles para determinar la frecuencia
de los diferentes genotipos del hongo presen-
tes durante diferentes ciclos de cultivo tanto
en la estación experimental como en campos
comerciales. Aunque hay muchos casos que
demuestran que genes individuales de resis-
tencia pueden conferir una resistencia dura-
ble, nuestros estudios indican que este no es
el caso en el control de P. grisea en Colom-
bia. En la Tabla 3 podemos observar que para
los ocho genotipos posibles con la combina-
ción de tres genes de resistencia, el patógeno
presenta muy posiblemente siete genotipos,
excepto aquel que hubiera perdido la función
de los tres genes de avirulencia correspon-
dientes a los genes de resistencia Pi-1, Pi-2 y
Pi-33. Combinación única mostrando una
resistencia completa (Figura 4). Los resulta-
dos sugieren que el patógeno puede perder la
función de cualquiera de los genes de aviru-
lencia, o la combinación de dos de ellos, pero
no los tres genes (Tabla 2). Es posible que al
perder uno o dos de ellos, el otro gen de
avirulencia pueda todavía cumplir con todas
las necesidades metabólicas y de fitness en
general para asegurar la sobrevivencia del
hongo, la cual se vería posiblemente afectada
al perder los tres genes de avirulencia. En este
caso, es necesario que al pretender predecir la
durabilidad de la resistencia al utilizar estos
genes, sea necesario utilizar la combinación
de los tres genes y no uno o dos de los genes.
Es importante observar que aún en aisla-
mientos con un amplio espectro de virulencia
(perdida de muchos genes de avirulencia)
como es el caso del aislamiento 1 del linaje
indicado como L6B (SRL-6) en la Tabla 2,
este aislamiento ha perdido los genes de
avirulencia para los genes de resistencia Pi-1
y Pi-2, pero ha mantenido el gen de avirulen-
cia para Pi-33. Igualmente se observa para el
aislamiento 4 identificado con el linaje L4
(SRL-4), el cual ha perdido los genes de
avirulencia para Pi-2 y Pi-33, pero ha mante-
nido el gen de avirulencia avr-1, y el aisla-
miento 9 identificado con el linaje L5 (SRL-
5) perdiendo los genes de avirulencia avr-1 y
avr-33, pero ha mantenido avr-2. Por otro
lado, la combinación de los genes de resisten-
cia Pi-kh y Pi-z muestra igual exclusión y
resistencia a todos los linajes genéticos en
estudio (Tabla 2).
Las líneas isogénicas con diferentes genes
de resistencia son también útiles para identi-
ficar los posibles genes de avirulencia presen-
tes en diferentes aislamientos del patógeno,
los cuales pueden ser utilizados para predecir
cuales genes de resistencia pueden estar
presentes en un cultivar de arroz. La caracte-
rización de los genes de avirulencia en varios
centenares de aislamientos del hongo en
Colombia nos ha permitido inferir los posi-
bles genes de resistencia presentes en los
cultivares comerciales de arroz de Colombia
(Tabla 4) después de realizar inoculaciones
controladas en el invernadero con dichos
aislamientos.
Los cultivares Oryzica Llanos 5 y Fe-
dearroz 50 que han tenido una resistencia
durable (Tabla 1) presentan el mayor número
e iguales genes de resistencia (Tabla 4).
Estos dos cultivares parecen contener los
genes de resistencia Pi-2 y Pi-33 mas no el
gen Pi-1. La durabilidad de la resistencia en
estos cultivares se debe entonces a la acción
de los genes Pi-2 y Pi-33 junto con los otros
genes de acuerdo a la Tabla 2, y posiblemente
a la presencia de genes de resistencia no
conocidos.
Con el objetivo de predecir el posible
rompimiento de la resistencia durable exhibi-
da por los cultivares Oryzica Llanos 5 y
Fedearroz 50, para adelantar un programa de
mejoramiento que incorpore genes de resis-
tencia a los posibles linajes genéticos del
hongo que estén en proceso de evolución para
romper dicha resistencia, hemos venido
recolectando muestras de lesiones individua-
les en la hoja o en el cuello en estos dos
cultivares. Los resultados del análisis molecu-
lar de los aislamientos recolectados de estos
dos cultivares en los últimos años muestran
que mas del 90% pertenecen al linaje SRL-4
y el resto al linaje SRL-6. Estos aislamientos
no reinfectan a los dos cultivares en inocula-
ciones controladas de invernadero y no indu-
cen lesiones típicas de la enfermedad, y tan
solo los aislamientos del linaje SRL-4 indu-
cen ocasionalmente y bajo estrés nutricional
la formación de pequeñas lesiones sin esporu-
lación. Sin embargo, los resultados sugieren
que el linaje SRL-4 se encuentra en proceso
de evolución con mayores probabilidades de
romper la resistencia de los cultivares
Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50 que los
linajes SRL-6 y SRL-5, aunque el linaje SRL-
6 ha estado siempre en mayor frecuencia en
toda la población del hongo por muchos
años. Nuestra pregunta de porque el linaje
Tabla 4. Posibles genes de resistencia presentes en los cultivares comerciales de arroz de Colombia inferidos de inoculaciones con aislamientos de P. grisea que
poseen los correspondientes genes de avirulencia
Cultivar Arroz Gen de Resistencia
Pi-1 Pi-2 Pi-33 Pi-z Pi-zt Pi-ta2 Pi-sh Pi-kh Pi-k Pi-b
Oryzica 2 X1 X X X X X X
Oryzica 3 X X
Cica 8 X X X X
Cica 9 X X
IR 22 X X X
Linea 2 X
Oryzica Llanos 4 X X X
Oryzica Caribe 8 X X X
Oryzica Yacu 9 X
Oryzica Llanos 5 X X X X X X X X
Fedearroz 50 X X X X X X X X
1 X = Presencia del gen de resistencia
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 53
SRL-4 y no los otros dos se recuperan en
mayor frecuencia de los cultivares Oryzica
Llanos 5 y Fedearrroz 50 pudiendo llegar a
romper la resistencia de estos, se puede dedu-
cir de forma lógica de los datos presentados
en la Tabla 2, la cual muestra que en la evo-
lución mas avanzada del linaje SRL-4 mos-
trada en el aislamiento 4 de la misma tabla,
este aislamiento ha perdido todos los genes
de avirulencia hacia los genes de resistencia
presentes en Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50
de acuerdo a la Tabla 4. Este linaje no ha
perdido sin embargo el gen de avirulencia
hacia el gen de resistencia Pi-1, y no lo nece-
sita perder ya que el gen Pi-1 no esta presente
en ninguno de los dos cultivares (Tabla 4).
Por el contrario, los aislamientos que presen-
tan las mayores mutaciones dentro de los
linajes SRL-6 (aislamiento 1, Tabla 2) y
SRL-5 (aislamiento 9, Tabla 2), tendrían que
mutar los genes de avirulencia hacia los genes
de resistencia Pi-33 y Pi-2, respectivamente,
los cuales si estan presentes en los cultivares
Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50. Estos dos
linajes ya han perdido el gen de avirulencia
hacia Pi-1, y por lo tanto para romper la
resistencia de los dos
cultivares estarían perdiendo los tres genes de
avirulencia, avr-1, avr-2, y avr-33, lo cual de
acuerdo a nuestras discusiones anteriores
tendrían posiblemente un efecto deletéreo
sobre el patógeno. El linaje SRL-4 ha perdido
en los últimos años los genes de avirulencia
para los genes de resistencia Pi-ta2, Pi-k, y
Pi-b (Tabla 2), los cuales se encuentran pre-
sentes en dichos cultivares con resistencia
durable (Tabla 4). Este linaje no ha perdido el
gen de avirulencia hacia el gen Pi-kh, el cual
no se encuentra en los cultivares Oryzica
Llanos 5 y Fedearroz 50 y por lo tanto este
gen junto al gen Pi-1, podrían ser usados en
un programa de mejoramiento para ser incor-
porados en los dos cultivares complementan-
do así la resistencia y de alguna forma tratan-
do de ir delante de los procesos evolutivos del
patógeno que le permitan romper a nivel
comercial la resistencia durable. Los resulta-
dos también sugieren que estos cultivares
posiblemente presenten algún otro gen de
resistencia desconocido y que necesita ser
identificado, ya que todos los genes de resis-
tencia en Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50
presentados en la Tabla 4 son atacados por el
aislamiento 4 presentado en la Tabla 2. Dicho
estudio se encuentra en progreso actualmente
con el fin de elucidar e identificar a nivel
molecular todos los genes de resistencia
presentes en el cultivar Oryzica Llanos 5.
Con el objetivo de desarrollar cultivares
de arroz con resistencia durable a P. grisea
para otros países de América Latina, hemos
iniciado un programa de retrocruzamiento
para introducir los genes de resistencia Pi-1,
Pi-2, Pi-33 en 14 variedades comerciales de
arroz de la región (Tabla 5), las cuales toda-
vía juegan un papel importante en la econo-
mía de muchos agricultores a pesar de ser
susceptibles a la enfermedad.
El procedimiento de retrocruzamientos se
describe en la Figura 5 y la incorporación de
los tres genes de resistencia está siendo se-
guida mediante el uso de microsatelites
(McCouch et al, 2001), asociados con los
genes de resistencia, inoculaciones controla-
das en el invernadero con aislamientos apro-
piados que contengan los genes de avirulen-
cia respectivos, y la evaluación de la resisten-
cia en el campo bajo condiciones de alta
presión de la enfermedad y diversidad del
patógeno (Figura 2). Poblaciones y líneas
seleccionadas con los tres genes de resisten-
cia serán distribuidas a los diferentes países
de América Latina para la evaluación y selec-
ción de líneas que incorporen tanto la resis-
tencia como las otras características agronó-
micas deseadas.
CONCLUSIONES
La estructura genética de P. grisea en
Colombia está compuesta por pocas fa-
milias o linajes cuya frecuencia depende
de los genes de resistencia presentes en
las variedades cultivadas
Los estudios de frecuencias de genes de
avirulencia utilizando líneas isogénicas
con diferentes genes de resistencia son
útiles para la identificación de las com-
binaciones de genes de resistencia rele-
vantes para el control de P. grisea
P. grisea en Colombia presenta virulen-
cia a todos los genes de resistencia co-
nocidos. La resistencia durable al pató-
geno debe por lo tanto buscarse median-
te combinaciones de genes de resistencia
Basados en la contribución relativa de
los genes de avirulencia sobre el “fit-
ness” de P. grisea, genotipos de plantas
pueden ser diseñados y generados que
contengan las combinaciones mas efec-
tivas de genes de resistencia
Un patógeno como P. grisea el cual es
principalmente clonal, no parece ser ca-
paz de tolerar un aumento continuo de
mutaciones en sus genes de avirulencia
aún en el caso de que dichos genes con-
tribuyan con efectos pequeños en fitness
La combinación de los genes Pi-1, Pi-2,
y Pi-33 confiere resistencia a las pobla-
ciones de P. grisea en Colombia. El uso
de marcadores moleculares e inocula-
ciones controladas en invernadero son
muy útiles para la incorporación de los
genes de resistencia en poblaciones de
mejoramiento
Las poblaciones desarrolladas en pro-
gramas de mejoramiento con el fin de
acumular diferentes genes de resistencia
a P. grisea deben ser evaluadas y selec-
cionadas utilizando metodologías de
campo que ayuden a mantener una alta
presión de la enfermedad y diversidad
del patógeno
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Tabla 5. Variedades de arroz de América Latina
utilizadas en la incorporación de los genes de
resistencia Pi-1, Pi-2, y Pi-33 mediante retrocru-
zamientos y la ayuda de marcadores moleculares
e inoculaciones de Pyricularia grisea
Variedad País
Fedearroz 2000 Colombia
Colombia XX1 Colombia
Oryzica 1 Colombia
Fedearroz 50 Colombia
Epagri 108 Brasil (riego)
Irga 409 Brasil (riego)
Primavera Brasil (secano)
Bonanza Brasil (secano)
El Paso 144 Uruguay, Argentina
Cimarron Venezuela
Capirona Perú
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Figura 5. Programa de retrocruzamientos para la incorporación de los genes de resistencia a P. grisea Pi-1, Pi-2, y Pi-33 en variedades de arroz
de América Latina
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
EVIDENCIAS DEL MILDEO VELLOSO (Peronsclerospora sorghi (W. Weston &Uppal) C.G. Shaw)
EN CULTIVOS DE MAÍZ Y SORGO EN COLOMBIA
Carlos A. Huertas D1, Greicy Sarria V2 y Benjamín Pineda-L3
1 ICA, Sanidad Vegetal Palmira y Convenio ICA-CIAT, 2 ICA, Laboratorio de Sanidad Vegetal, Palmira,
3 Unidad de Recursos Genéticos, Laboratorio de Sanidad de Germoplasma, CIAT
RESUMEN
A comienzos de la década de los noventa en algunos cultivos de maíz
y sorgo de la costa atlántica colombiana se registró la presencia de
una enfermedad con características de mildeo velloso asociada a Pe-
ronosclerospora sorghi, adoptándose medidas tendientes a evitar su
diseminación y establecimiento; sin embargo recientemente se observó
de nuevo la enfermedad. En este caso se procedió a realizar un recono-
cimiento adicional para precisar su etiología. Se realizaron observa-
ciones “in situ” de la sintomatología y se recolectaron muestras para
análisis de laboratorio. Los síntomas observados estaban caracteriza-
dos por la presencia de crecimiento micelial de aspecto velloso en las
hojas, bandas cloróticas paralelas a las nervaduras, comenzando por la
base de la hoja, filodia de las inflorescencias y desgarramiento del
tejido foliar con la presencia de látigos en sorgo. Los análisis de labo-
ratorio de las muestras procedentes de Córdoba (Tierralta) mostraron
conidióforos ramificados de aproximadamente 305 μ con esterigmas
y conidias ovales a subesféricas con un rango de tamaños entre 25,6
x 20,48 - 25,6 x 23,4 µ, las cuales al germinar emitían un tubo germi-
nativo. En el caso de Sucre (Sincelejo) los conidióforos medían entre
270 y 340 µ, eran ramificados, poseían una célula basal de tipo bulbo-
so y una cicatriz o septa cerca a la base, las conidias eran redondea-
das con tamaños entre 12,2 y 21,95 μ (promedio de 15,8 μ) estaban
localizadas sobre esterigmas agudos y germinaban mediante emisión
de tubos germinativos. En las muestras recolectadas en el Valle del
Cauca (Rozo, Palmira) en sorgo forrajero (Sorghum spp.) se encon-
traron signos similares a los observados en maíz en Sucre y Córdoba,
incluyendo la detección de oosporas esféricas de doble pared y diáme-
tro entre 33,6μ y 43,2μ. Se concluye que la enfermedad presente en los
cultivos es el mildeo velloso, “downy mildew”, mildiu o mildeo del
maíz y el sorgo ocasionado por el hongo Peronsclerospora sorghi (W.
Weston & Uppal) C. G. Shaw.
Palabras claves: cuarentena, mildeos vellosos, diseminación, maíz,
sorgo, pasto Johnson
SUMMARY
In the early 1990s, some maize and sorghum plantings along the Co-
lombian Atlantic coast showed plants with characteristic mildew on
the leaves, which resembled symptoms caused by Peronosclerospora
sorghi. To avoid its dissemination, some regulations were implement-
ed. However, similar symptoms were recently found in the same areas,
making it necessary to initiate additional studies to determine the cor-
rect etiology of the problem. For this, various areas in the region were
surveyed and plants with symptoms were collected for laboratory
analysis. Tissue of infected leaves showed a white mycelial growth
with downy appearance, chlorotic stripes paralel to the midrib starting
at the basis of the leaves, phyllody in the tassel, and leaf-shredding
with leaves resembling a whip in sorghum. In the laboratory, samples
from Tierralta, Córdoba, showed conidiophores of approximately 305
µ, branched, with sterigmata bearing conidias ranging from 25.6 x
20.48µ – 25.6 x 23.4µ, which germinated through a germ tube. In
samples from Sincelejo, Sucre, conidiophores varied in length from
270-340 µ, with a swollen basal cell and a septum at its basis, with
conidia between 12.2-21.95 µ (aver. 15.8µ) over pointed sterigmata,
germinating through germ tubes. Samples collected at Rozo, Palmira,
Cauca valley, in forrage sorghum (Sorghum spp) symptoms similar to
those found at Sucre and Cordoba, including relatively spheric oo-
spores, with double wall measuring between 33.6-43.2 µ. Based on
this survey, it is concluded that the disease present in those crops is
sorghum downy mildew, caused by the fungus Peronosclerospora
sorghi (Weston & Uppal) Shaw.
Key words: Corn, sorghum, Johnson grass, downy mildew, quaran-
tine, dissemination.
INTRODUCCIÓN
El mildeo velloso, mildiu o “downy mildew”
del maíz y sorgo ocasionado por el hongo
Peronsclerospora sorghi (W. Weston &
Uppal) C.G. Shaw es una de las enfermeda-
des cuyo agente causal es considerado para
Colombia un patógeno exótico con estatus de
las plagas cuarentenarias categoría A1, por lo
tanto está sujeto a medidas regulatorias por
parte del ICA como responsable de la pre-
vención de riesgos fitosanitarios. Desde el
punto de vista de sanidad y de comercio in-
ternacional tiene serias implicaciones en la
comercialización de semillas y en el inter-
cambio seguro de germoplasma.
En la actualidad cuando en el país se está
fomentando el cultivo del maíz representa
una amenaza potencial por sus efectos detri-
mentales en la producción del cereal, sí no
son tenidas en cuenta las características gené-
ticas de los materiales de siembra. Existen
referencias en donde se menciona que esta
enfermedad puede ocasionar pérdidas consi-
derables en la producción cuando se utilizan
materiales susceptibles (Frederiksen et al,
1970; Malaguti et al, 1977).
Los mildeos vellosos o “downy mildews”
son un grupo de enfermedades que afectan
numerosos géneros y especies de gramíneas,
entre las cuales están incluídas el maíz, millo
y sorgo. Son ocasionadas por distintas espe-
cies de hongos del orden peronosporales,
familia peronosporaceae y se consideran de
importancia económica y cuarentenaria por
sus efectos negativos sobre la producción
(Frederiksen et al, 1970) y por las implica-
ciones en el movimiento de material de pro-
pagación (Comunidad Andina, 2003). En el caso específico del maíz se han re-
gistrado las especies Peronosclerospora
sorghi, Peronosclerospora maydis, Peronos-
clerospora philipinensis, Peronosclerospora
sacchari, Sclerospora graminícola, Sclerop-
hthora macrospora y Sclerophthora rayssiae
var zeae afectando el cultivo bajo diferentes
circunstancias (Smith y Renfro, 2.000 ; Fre-
deriksen y Renfro, 1977; Frederiksen et al,
1970).
La taxonomía y nomenclatura de Pero-
nosclerospora sorghi, parásito obligado que
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 56
pertenece a los Oomycetos, familia Peronos-
poraceae (Alexopoulus, 1966) ha sido some-
tida a cambios a través del tiempo por varios
taxónomos. Esta clasificación se inicia con
Saccardo en 1876, quien observó el hongo en
una muestra de Setaria verticillata, colectada
en la selva (Treviso) Italia y lo clasificó con
el nombre de Protomyces graminicola Sacc,
teniendo como base para su identificación la
presencia de la oospora (Shaw, 1970).
Posteriormente, Saccardo encontró en
1882 el estado imperfecto de éste hongo,
desarrollándose en Setaria viridis y lo reclasi-
ficó como Peronospora graminicola (Sacc.)
Sacc. (Shaw, 1970). Esta clasificación fue
revisada nuevamente por Schroeter en 1879,
quien propuso el nombre de Sclerospora
graminicola (Sacc). Schroet (Waterhouse,
1964). Después el patógeno fue estudiado por
Buttler en Sorghum vulgare (L) Moench y
Penisetum typhoideum L., en 1907 quien
observó que la fase oogonial presente en las
dos gramíneas eran similares, razón por la
cual lo asimiló como un patógeno común.
Sin embargo, en 1913 Kulkarmni, al realizar
estudios sobre el mildeo velloso en sorgo,
encontró las dos fases reproductivas del hon-
go: la oogonial y la conidial. Con relación a
la fase oogonial quedo impresionado por la
similitud que presentaba con la descrita pre-
viamente por Buttler, pero si encontró dife-
rencias en la fase conidial, éstas al germinar
emitían hifas y no zoosporas como era típico
en Sclerospora graminicola; con ésta y otras
característica, como la forma del conidióforo
y del esterigma, justificó ubicar éste patógeno
como una variedad de Sclerospora graminí-
cola (Sclerospora graminícola vr. andropo-
gonis-sorghi) (Weston y Uppal, 1932).
Esta clasificación fue revisada nuevamen-
te en 1932 por Weston y Uppal quienes pro-
pusieron incluír como especie sorghi al hon-
go que estaba causando mildeo velloso en
sorgo ubicándolo dentro del género Scleros-
pora. Para la propuesta tuvieron en cuenta
las diferencias de tipo estructural y fisiológi-
co que observaron, tales como la carencia de
papila de dehiscencia en la fase conidial,
germinación mediante emisión de un tubo
germinativo que luego se desarrollaba en
hifas; la forma típica del conidióforo, el cual
era erecto y constituido por un talo principal
que soportaba tres brazos aproximadamente
de igual tamaño y extensión, la presencia de
una célula basal en forma de bulbo separada
del talo principal por un tabique (Weston y
Uppal, 1932).
Con relación al rango de hospedantes y
restricción del parasitismo también se obtu-
vieron diferencias al inocular oosporas de
Sclerospora graminicola, Sclerospora sorghi
y Sclerospora noblei en diferentes hospede-
ros. Sclerospora sorghi solamente infectó a
Sorghum bicolor y Euchlaena mexicana y a
diferentes variedades del maíz, mientras que
Sclerospora graminícola infectó solamente a
Penisetum typhoideum, Setaria italica y Eu-
chlaena mexicana. Sclerospora noblei no
infectó a las especies de gramíneas mencio-
nadas anteriormente (Weston y Uppal, 1932).
Finalmente, Shaw (1978) propuso elevar a
Peronosclerospora como género y transfirió
a éste las especies que producían conidias y
estaban incluídas dentro del género Scleros-
pora así: Peronosclerospora dichanthiicola,
Peronosclerospora maydis, Peronosclerospo-
ra miscanthi, Peronosclerospora philipinen-
sis,Peronosclerospora sacchari Peronoscle-
rospora spontanea, Peronosclerospora
sorghi y Peronosclerospora westomii.
El ciclo de vida se inicia cuando las oos-
poras (inóculo primario) presentes en el suelo
infectan las plántulas a través de las raíces y
se inicia un proceso de infección sistémica
que invade los tejidos de la planta. En las
hojas se inicia la formación de conidióforos y
la producción de conidias. Las conidias
(inóculo secundario) son diseminadas por el
viento e inducen nuevas infecciones en plan-
tas jóvenes. Las oosporas se producen al final
del ciclo del cultivo cuando las bandas cloró-
ticas sobre las hojas cambian a color marrón,
se rompen los tejidos y éstas se liberan ca-
yendo al suelo (Bonde, 1982; Smith y Renfro,
2000).
P. sorghi se disemina principalmente por
las oosporas que contaminan las semillas o
los residuos de cosecha, por el viento, o en el
suelo de áreas infestadas, por conidias a cor-
tas distancias y por el micelio presente en las
semillas o en los tejidos de los hospedantes
(Frederiksen, 1980).
Las oosporas son estructuras de reposo
de paredes gruesas que se producen en sorgo
infectado sistemícamente y en menor pro-
porción en maíz; generalmente son viables
por lo menos por tres a 10 años bajo diversas
condiciones. Las oosporas infestan el suelo
como esporas libres y son diseminadas por el
viento, aun cuando no se tiene información
detallada al respecto (Frederiksen, 1980).
Las conidias son de muy corta duración
(pocas horas bajo condiciones ideales) y de
poca importancia en la dispersión del pató-
geno a gran escala, pero sí a cortas distancias
especialmente entre plantas o en hospedantes
susceptibles (Frederiksen, 1980).
En cuanto a la diseminación por semilla
se sabe que las plantas infectadas sistémica-
mente son estériles o producen muy pocas
semillas disminuyendo el riesgo de disemina-
ción por este método, sin embargo experi-
mentalmente se ha demostrado en sorgo que a
partir de semillas procedentes de plantas en-
fermas que aún conservan adheridas las glu-
mas se obtienen plántulas infectadas con mildeo. Cuando se remueven totalmente las
glumas no se presentan casos de infección
(Frederiksen, 1980; Bonde, 1982; Smith y
Renfro, 2000) mencionan que existe la posi-
bilidad de trasmisión por semilla por cuanto
el patógeno se localiza en el pericarpio y en
el escutelo, sin embargo considera que esto
puede ocurrir cuando se utilizan semillas
frescas o recién cosechadas. Otro método posible de diseminación es
por el micelio que se encuentra dentro de las
semillas, el cual ha sido observado en la re-
gión del embrión de semillas de sorgo, millo
y maíz aparentemente normales. Este método
de diseminación se menciona a menudo, pero
hay pocas evidencias de que esto ocurra, por
cuanto es difícil que el micelio sobreviva en
semillas con contenido de humedad por de-
bajo del 12% (De León, 2001; Bonde,1982).
Los agentes causales de los mildeos ve-
llosos en gramíneas son originarios del Asia,
desde donde se han diseminado a otros países
(Smith y Renfro, 2000) y al continente ame-
ricano, en donde se han registrado las espe-
cies Sclerospora graminícola, Peronoscle-
rospora sorghi (Sin. Sclerospora sorghi) y
Sclerophthora macrospora (Frederiksen y
Renfro, 1977). P. sorghi llegó a los Estados
Unidos, en el año 1962 y fue localizado en
diferentes sitios de Texas, Kansas Oklahoma,
Nuevo México, Arkansas, Luisiana y Georgia
afectando maíz y sorgo (Frederiksen et al,
1970). En Venezuela el mildeo fue registrado
por primera vez en el año de 1973, infectando
maíz, sorgo y falso Johnson. El agente causal
fue clasificado por Nass et al, (1976) como
Peronosclerospora maydis, sin embargo pa-
rece que hubo una confusión en la clasifica-
ción de la especie presente en Venezuela,
según registros anteriores de la enfermedad
(Malaguti et al, 1977) en donde se le atribuye
a Sclerospora sorghi (Syn Peronosclerospo-
ra sorghi).
En Colombia Scleropthora macrospora
fue registrado por primera vez por Granada y
Varón (1983) en un lote de maíz Pioneer
6816, localizado en la finca “La Lindosa” del
Municipio de Miranda (Cauca). Las plantas
afectadas presentaban filodia en la inflores-
cencia masculina por transformación de ésta
en una multitud de hojas pequeñas. En el
laboratorio observaron las oosporas del hon-
go y concluyeron que el microorganismo
presente era S. macrospora agente causal de
la punta loca o “crazy top”. Este diagnóstico
fue ratificado por Carlos De León del
Cimmyt en México.
En 1990 Osorio y Buriticá informaron
sobre la presencia del mildeo velloso en va-
riedades e híbridos de sorgo, localizados en
un foco en el Departamento de Córdoba y
siete en el Departamento de Cesar (Buriticá
et al, 1992; Arias et al, 1993), Buriticá y
colaboradores enviaron muestras a Richard
A. Fredericksen especialista en “ Downy
mildew” de la Universidad de Texas en Esta-
dos Unidos, quien corroboró en ellas la pre-
sencia de Peronosclerospora sorghi. Adicio-
nal a las observaciones iniciales Buriticá
encontró algunas plantas espontáneas de Pas-
to Johnson (Sorghum halepense (L) Pers) y
Sorghum durra (Orssk) Taof infectadas por
P. sorghi en la inmediaciones de los focos de
la enfermedad, constatando en el laboratorio
la presencia de conidias y oosporas (Buriticá,
1992).
Por otro lado, los funcionarios de Sani-
dad Vegetal del ICA revisaron e hicieron
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
57
seguimiento a través del tiempo de ésta pro-
blemática fitosanitaria y en el primer semes-
tre de 1992, encontraron tres plantas de sorgo
infectadas con mildeo velloso, localizadas en
el lote “El Pozón” Centro de Investigaciones
Motilonia del ICA en Codazzi (Arias et al
1993). En el segundo semestre de 1992, loca-
lizaron nuevamente tres plantas con la en-
fermedad en socas de la variedad Sinapur ZR
sembrada en la finca Barcelona del Municipio
de Curumaní, Departamento del Cesar. Se
dictaron medidas tendientes a erradicar los
focos y consideraron como comportamiento
monocíclico el desarrollo de la enfermedad.
(Arias et al, 1993). Las medidas adoptadas
consistieron en aplicar al lote el funguicida
metalaxyl, posteriormente glifosato y final-
mente la incorporación del material vegetal al
suelo mediante dos pases de rastra pesada a
30cm de profundidad. Con éste enfoque del
manejo del problema consideraron que era
suficiente para la no declaratoria del estable-
cimiento de ésta enfermedad.
Finalmente, Campo et al (1999) detecta-
ron nuevamente la enfermedad en maíz H-
663 de 20 días de sembrado, localizado en la
Vereda Gramalote del Municipio de Tierralta.
Igualmente, encontraron la enfermedad en
pasto Johnson. Para su identificación, tuvie-
ron en cuenta la descripción de síntomas típi-
cos caracterizados por la presencia de man-
chas cloróticas irregulares que se iniciaban
desde la base de las hojas, la excesiva elon-
gación de tallos y la presencia de hojas erec-
tas y delgadas, síntoma conocido como “caña
flecha; la presencia de oosporas de doble
pared dentro del tejido infectado y la produc-
ción de la fase conidial.
Ante la evidencia de Campo et al (1999)
acerca de la presencia de P. sorghi, un pató-
geno exótico con estatus cuarentenario tipo
A1 en Colombia, el Instituto Colombiano
Agropecuario (ICA) para los fines consi-
guientes, consideró conveniente verificar el
registro mediante la conformación de comi-
siones técnicas lideradas por el autor princi-
pal del presente documento, durante 1999,
2001 y 2002, con el fin de realizar un recono-
cimiento de la enfermedad en algunos de los
sitios en los departamentos de Sucre y Cór-
doba en donde se había observado ël distur-
bio en años anteriores el disturbio, incluyen-
do posteriormente el Valle del Cauca.
METODOLOGÍA Durante la ejecución del reconocimiento en
1999, 2001 y 2002, se practicaron in situ las
inspecciones visuales a los lotes afectados, se
describieron los síntomas y se recolectaron
muestras para la verificación de los signos de
la enfermedad en el laboratorio así:
Departamento de Córdoba
El 16 de julio de 1999, se visitó un lote de
una hectárea de maíz, sembrado con el híbri-
do de maíz C-343 de 60 días de edad, locali-
zado en la vereda Gramalote del municipio de
Tierralta, en donde se encontraron algunas
plantas con clorosis foliar en forma de ban-
das lineales que se extendían paralela a las
nervaduras desde la base hacia el ápice de las
hojas y una estas bandas se observó un hongo
blanco y una clorosis de forma irregular que
se extendía a partir de la base de la hoja, sín-
toma conocido como de “media hoja” (Figura
1a).
Se tomaron muestras para analizarlas en
laboratorio de la Facultad de Agronomía de la
Universidad de Córdoba mediante observa-
ciones al estereoscopio y el microscopio de
luz. Para determinar la presencia de oosporas
se decoloró el tejido con KOH al 5% y con
hipoclorito de sodio al 1%.
Departamento de Sucre
El 27 de julio de 2001 y Junio 12 de 2002 se
visitó una empresa comunitaria, localizada
en la vereda de Castañeda del municipio de
Sincelejo, la cual tenía varios lotes de maíz
sembrados con la variedad ICA V-109, en
diferentes estados de desarrollo.
Durante el recorrido al lote se observaron
plantas de maíz que presentaban a lo largo de
las hojas bajeras clorosis en forma de bandas
paralelas a las nervaduras y sobre estas ban-
das en algunas plantas se observaba el creci-
miento de un hongo de color blanco de cre-
cimiento algodonoso.
También, en algunas plantas se observa-
ron áreas cloróticas de forma irregular que se
desarrollaban a partir de la base de las hojas,
síntoma conocido como de “media hoja”.
También se encontraron alrededor del lote
plantas de pasto Johnson (Sorghum halepen-
se) con los mismos síntomas. En otros lotes
de maíz de la misma empresa comunitaria
aproximadamente 20% de las plantas, exhi-
bían las estructuras florales tanto masculinas
como femeninas completamente deformadas
y con presencia de filodia (Figura 1b). Estas
estructuras se examinaron mediante el desga-
rre de los tejidos para verificar si presentaban
masas negras de esporas de Sphaceloteca
reiliana, agente causal del carbón de las espi-
gas, enfermedad que suele confundirse con el
mildeo velloso del maíz, o en otros casos
estar asociada con ésta (Reyes et al, 1964).
Durante la segunda visita, en junio de
2002, en las observaciones realizadas se
comprobó la misma situación de la primer
visita en cuanto a la presencia del mildeo
velloso y su incidencia sobre la variedad ICA
V-109. Adicionalmente, se observó que la
variedad ICA V-305 sembrado por los agri-
cultores no presentaba la enfermedad, proba-
blemente por poseer resistencia al patógeno.
Las diez muestras de hojas de maíz colec-
tadas en el campo en el departamento de
Sucre con la sintomatología descrita ante-
riormente, se analizaron en el laboratorio de
Sanidad de Germoplasma (LSG) de la Unidad
de Recursos Genéticos en CIAT de acuerdo
con la metodología sugerida por De León
(datos no publicados). Para el caso, se lava-
ron las hojas con agua limpia y jabón, poste-
riormente se colocaron en posición vertical en
un balde plástico que contenía una lámina de
agua de 2-3cm para hidratarlas y obtener una
humedad relativa alta, luego se cubrieron con
una bolsa grande de plástico negro para darle
condiciones de oscuridad y se dejaron en un
cuarto a temperatura ambiente fresca (+ 24
ºC) durante 15 horas. Al final, bajo estas
condiciones se encontró que cuatro de las 10
hojas de la muestra manifestaban la presencia
abundante de un micelio blanquecino de as-
pecto velloso desarrollado en el envés de la
lámina foliar. Este crecimiento se observó en
un microscopio estereoscopio y con la ayuda
de un pincel de pelo de camello No. 6 se
montaron muestras del micelio y de las es-
tructuras sobre portaobjetos con gotas de azul
de algodón, para observarlas en un microsco-
pio de luz y tomar microfotografías de estas
estructuras.
Departamento del Valle
En el mes de marzo del 2003, se visitó en el
corregimiento de Rozo municipio de Palmira
un lote de producción de sorgo forrajero
(Sorghum spp). En la inspección del lote se
observaron plantas que presentaban bandas
amarillentas a blanquecinas siendo más visi-
bles en el haz delas hojas. Las bandas se ini-
ciaban desde la base y llegaban hasta el ápice
de la hoja, distribuyéndose en forma paralela
a la nervadura central (Figuras 1c, 1d). En
estados avanzados, estas bandas presentaban
un aspecto necrótico de color pardo. Las ho-
jas afectadas aparecían rasgadas desde el
ápice hacia la parte interna de la hoja mos-
trando apariencia de látigo (Figura 1 e). Por
el envés se encontró un micelio blanco, sien-
do más abundante en infecciones iniciales.
Las muestras recolectadas para analizarlas en
el Laboratorio de Diagnóstico Vegetal del
ICA Palmira, fueron colocadas en condicio-
nes de alta humedad y oscuridad para inducir
la esporulación del microorganismo. Poste-
riormente fueron analizadas microscópica-
mente para verificar la presencia de signos
del patógeno. De igual manera, se tomó tejido
afectado, especialmente en estados avanza-
dos, se decoloró con KOH al 5% y se lavó
con agua destilada para observarlo al mi-
croscopio y detectar la presencia de oospo-
ras.
RESULTADOS
Departamento de Córdoba
A partir de las muestras colectadas en el
municipio de Tierralta (Córdoba) en el labo-
ratorio de la Universidad de Córdoba se
montaron placas del tejido afectado, por el
sistema de impronta y toma directa de las
estructuras del hongo, las cuales fueron ob-
servadas a través del microscopio de luz y
preparadas para tomar fotomicrografías.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 58
En la muestra tomada bajo el sistema de
impronta, se observó una estructura en forma
de árbol, ramificada en la parte superior con
unas estructuras redondas y ovaladas (Figuras
2a, 2d).
En la toma directa de estructuras, se ob-
servó con nitidez la presencia de las estructu-
ras descritas por el sistema de improntas,
donde las estructuras redondas y ovaladas
correspondían a conidias de paredes delgadas
y sin papilas, que al germinar emitían un tubo
germinativo. Se midieron estas estructuras,
las cuales variaron en promedio entre 25,6 x
20, 48-23,4µ (Figura 2d). No se observaron
oosporas en el tejido enfermo.
Las características del hongo encontrado
eran muy similares a las del hongo Perons-
clerospora sorghi y los síntomas correspon-
dían a los de un típico mildeo velloso según
lo registrado en la literatura (Francis y Wi-
lliams, 1983; Smith y Renfro , 2000; Weston
y Uppal, 1932)
Departamento de Sucre
Las observaciones al estereoscopio de las
muestras de hojas infectadas colectadas en
Sincelejo permitieron constatar la presencia
de un hongo de color blanco con ramificacio-
nes aéreas que contenían unas estructuras
agrupadas y el desarrollo de estructuras indi-
viduales, erectas, que emergían de los esto-
mas. El análisis mediante el microscopio de
luz, permitió determinar que las placas prepa-
radas contenían estructuras características a
las desarrolladas por un hongo de la familia
Peronosporaceae, con conidióforos y conidias
(Figuras 2b, 2c, 2e). Los conidióforos con
una longitud que variaba entre 270 y 340µ,
eran hialinos, constituidos de una rama prin-
cipal, con tres ramificaciones en la parte su-
perior y cada ramificación terminaba en pun-
tas delgadas (esterigmas), donde se observa-
ban adheridas estructuras de aspecto globoso.
También presentaba una célula basal de tipo
bulboso y una cicatriz o septa cerca a la base
(Figuras 2b, 2c). Las estructuras globosas
eran esféricas, de paredes delgadas, lisas y sin
papilas, las cuales germinaban mediante la
emisión de un tubo germinativo (Figura 2e) y
correspondían a conidias y no a esporangios.
Al determinar el diámetro de estas estructuras
se encontró que oscilaba entre 12,2 y 21,95 μ
con un promedio de 15,8μ.
El análisis microscópico por decoloración
de tejidos permitió visualizar unas pocas
oosporas (Figura 1 f) más o menos esféricas
de paredes gruesas con dimensiones aproxi-
madas entre 27,3 μ y 39,4 μ (Víctor H. Caste-
llanos, informe de la comisión técnica, Julio
de 2002)
Las características del hongo encontrado
y la sintomatología también condujeron a la
conclusión de que se trataba, como en el caso
anterior, del mildeo vellosos ocasionado por
Peronsclerospora sorghi.
Departamento del Valle
Las muestras recolectadas en el corregimien-
to de Rozo (Palmira, Valle del Cauca) anali-
zadas microscópicamente mostraron la pre-
sencia de un hongo con conidióforos erectos,
gruesos y ramificadas en la parte superior
(Figuras 2g, 2h). Sobre los esterigmas se
observaron estructuras similares a conidias
redondas u ovaladas, las cuales en algunos
casos presentaron la emisión de un tubo ger-
minativo (Figura 2j). Las muestras de tejido
decoloradas con KOH al 5% al observarlas al
microscopio contenían oosporas más o menos
esféricas con doble pared y color marrón
rojizo, alineadas en forma de bandas interna-
mente en el tejido, sus dimensiones oscilaban
entre 33,6μ y 43,2μ (Figuras 2j, 2i).
DISCUSIÓN
La sintomatología observada consistente en la
presencia de crecimiento fungoso de aspecto
velloso en las hojas, filodia de las inflores-
cencias masculinas y femeninas, bandas clo-
róticas paralelas a las nervaduras de color
marrillo en los tejidos, desgarramiento del
tejido foliar con la presencia de látigos coin-
cide con la descrita para la enfermedad por
Francis y Williams (1983); Smith y Renfro
(2000); Weston y Uppal, (1932).
El tamaño y apariencia de las estructuras
del patógeno presentó variaciones menores en
tamaño entre los tres sitios objeto del estu-
dio, situación apenas normal por cuanto un
organismo suele presentar diferencias de
acuerdo a la localidad por efecto del me-
dioambiente, el genotipo del hospedante y
aún por las propiedades intrínsecas del pató-
geno. De todas maneras las características y
dimensiones determinadas para las estructu-
ras del hongo se localizaban dentro del rango
que caracteriza a P. sorghi, según las descrip-
ciones de Smith y Renfro, (2000), Francis y
Williams, (1983), Shaw (1978) y Weston y
Uppal (1932) resumidas a continuación:
Figura 1. Síntomas de mildeo velloso
(P. sorghi) en maíz ICA V 109 y sorgo
forrajero: a. Clorosis con bandas irregu-
lares localizadas en la base de una hoja
de maíz. b. Inflorescencia masculina
severamente afectada por filodia. c.
Planta de sorgo mostrando bandas cloró-
ticas paralelas a las nervaduras. Nótese
la necrosis del tejido foliar. d. Detalle de
los síntomas de mildeo en una hoja de
sorgo: nótense las bandas cloróticas y el
crecimiento del hongo de aspecto vello-
so en el envés. e. Hoja de sorgo con
necrosis (flecha blanca) y desgarramiento
de tejido con formación de “látigo”
(flecha magenta). Fotos C.A.Huertas D.
a b
c d
e
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
59
conidióforos hialinos de 180-300 µ de longi-
tud, usualmente dicotómicos ramificados de
dos a tres veces, septados cerca de su base;
las conidias ovales a casi esféricas de 14,4 –
27,3 x 15-28,9µ que germinan mediante un
tubo germinativo y oosporas de color ma-
rrón a subhialinas, esféricas con un diámetro
entre 25-42,9µ, que también emiten tubo
germinativo al momento de germinar.
Es de anotar que durante el estudio no
se encontraron oosporas en las muestras
obtenidas en los lotes de maíz en Tierralta,
pero éstas ya habían sido observadas por
Campo et al durante sus investigaciones en
1999, además se debe tener en cuenta que las
muestras correspondían a maíz y en esta plan-
ta generalmente se encuentran en menor pro-
porción (Frederiksen, 1980).
Para concluir, las observaciones de los
síntomas de la enfermedad presentes en los
cultivos de sorgo en los sitios visitados de
los departamentos de Córdoba, Sucre y Valle
del Cauca, y el análisis en el laboratorio de
las muestras recolectadas para verificar la
presencia de signos permitieron comprobar
que la enfermedad objeto del reconocimiento
correspondía al mildeo velloso, “downy mil-
dew”, mildiu o mildeo del maíz y el sorgo
ocasionado por el hongo Peronsclerospora
sorghi (W. Weston &Uppal) C. G. Shaw;
resultados que concuerdan con los registros
anteriores de otros investigadores quienes
determinaron la presencia del patógeno desde
1990 hasta el 2000 (Buriticá et al, 1992;
Arias et al, 1993; Campo et al, 1999; Huer-
tas,1999).
Respecto a la diseminación de la enfer-
medad desde el primer registro en 1990 hasta
el presente es necesario hacer algunos comen-
tarios que pueden ser de interés, particular-
mente si se quiere establecer un plan de ma-
nejo de la enfermedad en el país.
De acuerdo a la información consultada
(Arias et al, 1993) en los comienzos de la
decada de los noventa se dictaron medidas
tendientes a erradicar los focos de mildeo en
el departamento del Cesar, pero no se men-
ciona nada respecto a los que Buriticá et al
(1992) había registrado en el Departamento
de Córdoba. Esto explicaría la situación ac-
tual de esa región en donde aun está presente
la enfermedad.
Por otra parte las medidas para erradica-
ción de los focos, adoptadas con base en la
consideración de que la enfermedad era de
comportamiento monocíclico, y consistentes
en aplicar al lote metalaxyl, posteriormente
Glifosato y finalmente incorporación del
material vegetal al suelo mediante dos pases
de rastra pesada a 30cm de profundidad
(Arias et al, 1993), probablemente no surtie-
ron los efectos esperados. Es posible que aún
continúe presente la enfermedad en el depar-
tamento del Cesar, situación que debe com-
probarse, pues en el presente estudio no se
incluyó dicha región.
Adicionalmente, en la aplicación de las
medidas regulatorias no se menciona si se
aplicaron o no a los hospedantes del pató-
geno, y estos crecen en los bordes de los cul-
tivos, pasando en muchos casos desapercibi-
dos pero que son fuentes de inoculo perma-
nentes y muy importantes. Para el caso es
fundamental tener en cuenta que el patógeno
P. sorghi tiene hospedantes naturales como
el pasto Johnson (Sorghum halepense (L)
Pers) y Sorghum durra (Orssk) Taof, hallados
por Buriticá (1992) en las cercanías de los
g
e
a c b
d
i
h j
Figura 2. Estructuras microscópicas de Peronosclerospora sorghi detectadas en muestras de maíz y sorgo afecta-
das por mildeo velloso. a. Conidióforo en forma de árbol, ramificado en la parte superior con conidias redondas y
ovaladas encontrado en hojas de maíz (Tierralta, Códoba). b. Conidióforo con tres brazos, esterigmas y conidias,
observado en muestras de maíz ICA V 109 ( Sincelejo, Sucre). Nótese el tabique (flecha) y la célula basal. c.
Detalle del conidióforo b, nótese la terminación de los esterigmas. d. Conidias redondas y ovaladas encontrado en
hojas de maíz (Tierralta, Códoba). e. Conidias germinando mediante tubos germinativos obtenidas de muestras de
maíz ICA V 109 (Sincelejo, Sucre). f. Oosporas encontradas en tejidos de maíz en muestras de maíz ICA V 109.
nótese la doble pared (Sincelejo, Sucre). g. Parte apical de un conidióforo obtenido de muestras de Sorgo forrajero
(Rozo, Palmira, Valle), nótense algunas conidias germinadas. h. Parte inferior del conidióforo g . i. Oosporas en
tejido foliar de sorgo forrajero (Rozo, Palmira, Valle) distribuidas en bandas. j. Detalle de las oosporas i, nótese la
forma y la coloración característica. (Figuras a, b, i x 10X ; d 100X; c, e, g, h, j 40X )
Fotografías a, d O. Campo, Z Lozano, C. A. Huertas; b, c, e B. Pineda –L , C. A. Huertas; f V. C. Castellanos Convenio ICA Centro de
diagnóstico vegetal Unillanos- Facultad de Agronomía-Fitopatología); g.h.i,j F. Varón de A. , G. Sarria, C. A. Huertas D.
f
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 60
cultivos afectados.
El papel de las oosporas también es un
elemento importante al diseñar medidas de
control pues son estructuras de resistencia
que sobreviven de tres a diez años en el suelo.
Es muy posible, en el caso del Cesar, que al
enterrar los residuos de cosecha se les prote-
gió y cuando surgieron condiciones favora-
bles iniciaron nuevas infecciones en los culti-
vos, especialmente si se tiene en cuenta que
según Bonde, 1982; Smith y Renfro, 2000 el
ciclo de vida se inicia cuando las oosporas
presentes en el suelo infectan las plántulas a
través de las raíces y se inicia un proceso de
infección sistémica que invade los tejidos de
la planta.
Adicionalmente se sabe que el patógeno
es del tipo policíclico y que puede multipli-
carse rápidamente a través de conidias produ-
ciendo infecciones múltiples durante una
cosecha. Al quedar oosporas en el suelo
(inóculo primario) y presencia de hospederos
peremnes como el pasto Johnson y por las
características del patógeno se generan mu-
chos ciclos secundarios con la producción
constante de conidias que son diseminadas a
corta distancia por el viento, la enfermedad
se mantuvo en el tiempo. Por otra parte las
condiciones ambientales de las regiones (alta
humedad relativa cercana a saturación, tem-
peraturas frescas durante la noche) pudieron
favorecer el desarrollo y establecimiento de la
enfermedad, si se tienen en cuenta las obser-
vaciones de Bonde, (1982); Smith y Renfro,
(2000), pues las temperaturas entre 170C y
290C (óptimas entre 24-26 0 C ), saturación
atmosférica o agua libre y temperaturas mo-
deras entre 210C -250C, favorecen el desarro-
llo de la enfermedad. Por otra parte las oos-
poras caen al suelo cuando se rompe el tejido
(látigos) y pueden ser transportadas por el
agua de riego a distancias largas (Bonde,
1982)
La aparición de los focos de la enferme-
dad en Sucre y Valle del Cauca deberían ser
evaluados en cuanto a su origen, por cuanto
es posible que estén asociados al movimiento
de semillas sin el tratamiento adecuado.
Para el manejo adecuado de la problemá-
tica actual del mildeo velloso (Peronscleros-
pora sorghi (W. Weston & Uppal) C. G.
Shaw) en Colombia se recomienda diseñar un
plan de acción tendiente a frenar el avance de
la enfermedad a los cultivos de maíz y sorgo
establecidos en el país, con base en un reco-
nocimiento detallado de todas las zonas pro-
ductoras. En el reconocimiento se deben tener
en cuenta las malezas hospedantes del pató-
geno. También, como una medida preventiva
se debe recomendar el tratamiento de semillas
con productos específicos como el metalaxyl,
antes de la siembra. Se debe fomentar la
investigación y los planes de obtención y
utilización de genotipos con resistencia a la
enfermedad
Como quiera que aún la investigación
acerca del comportamiento del patógeno en
las condiciones de Colombia aún no se han
concluído es importante continuar con las
investigaciones acerca del comportamiento
del P. sorghi, particularmente en cuanto a la
patogenicidad en maíz y sorgo de las oospo-
ras producidas en Pasto Johnson (Sorghum
halepense ) u otros hospedantes. Además se
deben incluir estudios relacionados con la
presencia de otros agentes causales de mil-
deos en gramíneas que se pueden encontrar
en Colombia.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos
Carlos de León del CIMYT, a Carlos Kleffel,
Víctor Hugo Castellanos, Francia Varón de
Agudelo, Luis Enrique Guevara, P, Antonio
Madroñero del ICA, a Rodrigo Orlando
Campo y Zaida E. Lozano de la Universidad
de Córdoba; a José Luis Ramírez del LSG-
CIAT.
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2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
GENÉTICA DE LA RESISTENCIA A PUDRICIÓN CAUSADA POR
Phytophthora tropicalis EN DOS POBLACIONES SEGREGANTES DE
YUCA (Manihot esculenta Crantz)
Elizabeth Álvarez, John Loke, Sandra Rivera y Germán Llano
Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), AA 6713, Cali, Colombia
RESUMEN
Una de las principales herramientas para el manejo de pudriciones
radicales causadas por diversas especies de Phytophthora, es el uso de
resistencia varietal, para lo cual se hace necesario entender la
complejidad de la base genética de la yuca. Con este propósito, se
evaluó la resistencia de los padres y las progenies de las familias de
yuca K (M Nga 2 x CM 2177-2) y CM 9582 (M Bra 1045 x M Cr 81),
a Phytophthora tropicalis. Además de los parentales de cada familia,
se inocularon raíces frescas de 69 individuos de la familia K y 43 de la
familia CM 9582. Con la evaluación fenotípica y con base en el mapa
molecular de M Nga 2, madre de la familia K, se identificaron y
mapearon QTLs asociados a la resistencia a P. tropicalis, mediante
análisis de marcador simple. Los genotipos de yuca de la familia K,
evaluados durante los años 2000 y 2001 mostraron un porcentaje de
área de raíz afectada entre el 22% y 95%. La correlación entre las
evaluaciones de los años 2000 y 2001, fue –0.15. Los genotipos de
yuca de la familia CM 9582, mostraron un área afectada entre 70% y
90%. La distribución de la frecuencia de los genotipos de yuca de la
familia K de acuerdo al área de raíz afectada por P. tropicalis, corres-
ponde a una distribución normal, con un genotipo que presenta resis-
tencia moderada en los dos años de evaluación, 50 genotipos suscepti-
bles y 17 genotipos altamente susceptibles. Se definieron ocho QTLs,
dos de los cuales explicaron entre 8.6% y 9% de la varianza fenotípi-
ca. Se demostró que genes menores controlan la resistencia a P. tropi-
calis.
Palabras claves: yuca, raices, deterioro, pudriciones, genotipos, QTLs
SUMMARY
Varietal resistance is one of the main tools for managing root rots in
cassava, caused by different Phytophthora species, and it is therefore
necessary to understand the complexity of the genetic base of this
crop. The resistance of parents and progeny of cassava families K (M
Nga 2 x CM 2177-2) and CM 9582 (M Bra 1045 x M Cr 81) to Phy-
tophthora tropicalis was evaluated accordingly. Fresh roots of 69
individuals of family K and 43 of family CM 9582 were also inoculat-
ed, in addition to the parental materials of each family. Based on the
phenotypic evaluation and the molecular map of M Nga 2 (female
parent of family K), QTLs associated to the resistance to P. tropicalis
were identified and mapped, using simple marker analysis. Cassava
family K genotypes, evaluated during 2000 and 2001, showed a per-
centage of infected root area between 22% and 95%. The correlation
between the evaluations of 2000 and 2001 was -0.15. Cassava family
CM 9582 genotypes showed an infected area between 70% and 90%.
The distribution of frequency of cassava family K genotypes, based on
root area affected by P. tropicalis, corresponds to a normal distribu-
tion, with one genotype presenting moderate resistance in both years
of evaluation, 50 genotypes susceptible, and 17 genotypes highly
susceptible. Eight QTLs were defined, two of which accounted for
8.6% and 9% of phenotypic variance. Minor genes were found to
control resistance to P. tropicalis. Keywords: cassava, deterioration, root rots, genotypes, QTLs
INTRODUCCIÓN
Uno de los principales problemas en el culti-
vo de la yuca son las pudriciones radicales,
causadas por varias especies de Phytophtho-
ra. En Colombia se reportan pérdidas entre el
70 y el 80% de la producción y se estima una
reducción promedio de 7,5 Ton/ha, causada
por la enfermedad entre 1981 y 1995.
La enfermedad se encuentra distribuida en
muchas zonas productoras del mundo. En
Brasil se presenta Phytophthora drechsleri
Tucker (Figueiredo y Albuquerque, 1970), la
especie más severa que ataca yuca. En Co-
lombia se identificó Phytophthora tropicalis
(CIAT, 2000), Phytophthora drechsleri (Oli-
veros et al, 1974) y Phytophthora nicotianae
var. nicotianae (Soto et al, 1988; Lozano y
Loke , 1994). Otras especies reportadas como
patógenos de yuca en diferentes países son
Phytophthora erythroseptica (Fassi, 1957) y
Phytophthora cryptogea (CIAT, 1991), Phy-
tophthora meadii y Phytophthora. arecae
(Barragán et al, 1998).
El desarrollo de Phytophthora spp. se ve
favorecido por el uso de prácticas agronómi-
cas no adecuadas, de fungicidas inefectivos e
inadecuados, transporte de material afectado
a zonas libres del patógeno, como también
por la siembra en suelos compactos o muy
arcillosos (Takatsu y Fukuda, 1990).
Actualmente en CIAT, la selección para
resistencia a Phytophthora spp. se hace bajo
condiciones de invernadero, mediante inocu-
lación en brotes y raíces de yuca, de aisla-
mientos que han sido previamente caracteri-
zados mediante técnicas moleculares que
incluyen la digestión del amplificado de la
región ITS (“Internal Transcript Spacer”) o
del gen 5.8s ribosomal, con enzimas de res-
tricción, además de las pruebas de patogeni-
cidad respectivas.
Descifrar la complejidad de la resistencia
genética, es uno de los elementos claves de
fitomejoramiento, particularmente para en-
fermedades como las pudriciones radicales en
yuca; razón por la cual en este estudio se
pretendió evaluar los individuos de las fami-
lias K y CM 9582, por su reacción a pudri-
ción de raíces, para un mejor entendimiento
de la genética de la resistencia a Phytophtho-
ra tropicalis. El mejoramiento genético para
la resistencia de la enfermedad se puede
alcanzar más rápidamente y con eficacia,
apoyándose en el uso de marcadores molecu-
lares.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
En los años 2000 y 2001 se inocularon y
evaluaron raíces de yuca de 69 genotipos
pertenecientes a la familia K (M Nga 2 x CM
2177-2) procedentes de la subestación de
CIAT en Santander de Quilichao. Entre Julio
y Agosto del 2001 se evaluaron 43 genotipos
de yuca pertenecientes a la población CM
9582 (M Bra 1045 x M Cr 81), provenientes
de la granja de CENICAÑA (Centro Nacional
de Caña de Azúcar, Florida, Valle). También
se incluyeron en el estudio, un genotipo resis-
tente (M Bra 1045) y tres susceptibles (M Col
2066, CM 2177-2, M Nga 2) a P. tropicalis,
provenientes de la subestación de CIAT
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 62
(Centro Internacional de Agricultura Tropi-
cal) en Santander de Quilichao, Cauca (Tabla
1).
Las plantas de ambas poblaciones se co-
secharon a una edad de aproximadamente un
año. Las raíces se lavaron con agua potable y
detergente, luego se desinfestaron con hipo-
clorito al 1% durante 10 minutos y etanol al
30% durante 10 minutos. Posteriormente, se
secaron las raíces en papel toalla estéril. El
material vegetal desinfestado que no se ino-
culaba el mismo día del tratamiento, se alma-
cenó en un cuarto frío a 4C hasta que se
inocularon las raíces, máximo 24 horas des-
pués.
Patógeno
Se empleó como inóculo, el aislamiento 44
identificado mediante secuenciación de la
región ITS del ADN ribosomal, como P.
tropicalis (similar a P. capsici). Este aisla-
miento se obtuvo de yuca afectada por Pudri-
ción de Raíces en Barcelona (Quindío). El
inóculo se cultivó en agar avena (2% avena
Quaker®, 2% agar) preparado con Penicilina
900 mg/ml, Rifampicina 0,2 gr/ml y Ampici-
lina 750mg/ml. La incubación fue entre 20 y
26 C durante 4 días para la familia K y entre
6 y 7 días para CM 9582.
Inoculación
Dentro de una cámara de aislamiento, frente a
un mechero, se hizo una perforación en la
raíz mediante la extracción de un fragmento
de aproximadamente 15 mm de longitud con
un sacabocado de 8 mm de diámetro. Al
fondo de la perforación se depositó un disco
de crecimiento micelial con un sacabocado de
5 mm de diámetro, se cubrió luego el orificio
con el fragmento de raíz de yuca extraído y se
aseguró con cinta de enmascarar.
Cada genotipo fue inoculado con un con-
trol negativo, el cual consistió en inocular las
raíces con discos de medio de cultivo sin
crecimiento de P. tropicalis. Una vez inocu-
lada la raíz de la yuca se procedió a incubar-
las en una bolsa plástica, con una toalla de
papel estéril húmeda; las bolsas cerradas se
colocaron en bandejas plásticas, dejándose a
22C en oscuridad durante 7 días (familia K)
o 5 días (CM 9582).
Evaluación
Se realizó un corte transversal a cada raíz de
yuca donde se depositó el inóculo, se midió
largo y ancho de la lesión y largo y ancho del
corte de la raíz. También se midió la longitud
de la raíz y profundidad del inóculo en la
raíz; estos datos se registraron y se procesa-
ron mediante el programa Excel.
Análisis de datos
Para el análisis de la información se conside-
ró como unidad experimental una raíz y se
tuvieron en cuenta algunas consideraciones
así: para la familia K se excluyeron los geno-
tipos con menos de cinco (año 2000) o seis
(año 2001) raíces; se eliminaron las raíces de
genotipos con un diámetro promedio menor
de 3 cm; para las raíces con un daño mayor a
7 cm (2001) u 8 cm (2000) se consideró co-
mo área afectada 100% y los valores del
diámetro de raíces mayor a 7 cm (2001) u
8cm (2000) se consideraron de 7 u 8 cm,
respectivamente. En cuanto a CM 9582 se
excluyeron los genotipos con menos de cua-
tro repeticiones; se eliminaron las raíces de
genotipos con un diámetro promedio menor
de 3 cm; las raíces con un daño mayor a 6
cm se consideró el área afectada 100% y los
valores del diámetro de raíces mayor a 6 cm
se consideraron de 6 cm.
Análisis de QTLs
Para el análisis de QTL o de Loci controla-
dores de caracteres cuantitativos, las raíces de
92 genotipos de la familia de K fueron cose-
chadas en CIAT en 2000. Para el análisis de
QTL, se utilizó un mapa basado en la segre-
gación de marcadores moleculares en la po-
blación K. El mapa se basó en la segregación
de alelos de la madre (M Nga 2), correspon-
diendo a 192 marcadores de diferentes clases:
RFLP, ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD), isoenzimas, microsatélites, sitios
etiquetados por la expresión (ESTs) y genes
conocidos (Martin Fregene, comunicación
personal).
El análisis y mapeo se hizo utilizando el
programa programa Q-Gene 3.06V, en un
equipo McIntosh, por medio de una regresión
simple o análisis de un solo marcador (SPA),
donde la variable dependiente es la reacción
al patógeno y la variable independiente es el
número de alelos en el locus marcador, de-
pendiendo de la segregación del individuo.
Se definió asociación significativa entre
un marcador de ADN y resistencia de Phy-
tophthora, si la probabilidad de no presencia
de un QTL, era menor a 0,005 para reducir al
mínimo, la detección de positivos falsos. El
grado de la variación fenotípica explicada por
cada marcador fue obtenido del coeficiente de
la regresión (r2). Los valores totales r2 de
cada QTL eran computados como: (suma de
los cuadrados para cada suma de marcado-
res)/(total de cuadrados).
RESULTADOS
Con base en evaluaciones previas y observa-
ciones en campo, se definieron cuatro catego-
rías de resistencia: Resistente, con menos de
10% de área de raíz afectada; moderadamente
resistente, entre 10 %y 30%; susceptible,
entre 30 y 60% y altamente susceptible, para
más de 60% de raíz afectada.
Los genotipos de yuca de la familia K,
evaluados durante los años 2000 y 2001 mos-
traron un porcentaje de área de raíz afectada
continuo entre el 22% y 95% (Figura 1). Tres
genotipos (4,3%) de yuca con resistencia
moderada a P. tropicalis en el año 2000,
mostraron la tendencia a alta susceptibilidad
en el año 2001 y viceversa. Un genotipo
(K19) de yuca de resistencia moderada en el
año 2000, mostró el mismo grado de resisten-
cia en el año 2001, con un rango de 27,1 a
29,7% de área afectada (Tabla 2).
De los 10 genotipos de yuca de la familia
K que presentaron menor grado de susceptibi-
lidad a P. tropicalis, seis de estos (K19, K88,
K98, K69, K66 y K30) presentaban muy baja
resistencia moderada en el año 2000 y hacia
el año 2001 presentaron una resistencia mo-
derada más alta.
De los 10 genotipos de yuca de la familia
K que presentaron resistencia moderada a P.
tropicalis, cuatro (K81, K79, K110 y K114)
mostraron resistencia moderada en un por-
centaje más alto en el año 2000 que en el
2001. De los 10 genotipos de yuca de la fami-
lia K que presentaron alta susceptibilidad a P.
tropicalis en el año 2001, siete (K9, K57,
K148, K39, K35, K122 y K64) mostraron
menor susceptibilidad a P. tropicalis en el
año 2000 que en el 2001. De los 10 genotipos
de yuca de la familia K que presentaron alta
susceptibilidad al patógeno en el año 2001,
tres (K92, K145 y K6) mostraron mayor
susceptibilidad en el año 2000 que en el
2001.
Al realizar el análisis de los genotipos de
yuca de la familia K entre los años 2000 y
2001, se encontró que los 10 genotipos de
yuca con menor susceptibilidad presentada a
P. tropicalis fueron: K 19, K 110, K 88, K
98, K 69, K 114, K 79, K 66, K 30 y K 81,
mientras que los 10 genotipos de yuca de
mayor susceptibilidad a la enfermedad, fue-
ron: K9, K57, K92, K148, K39, K35, K6,
K122, K145 y K64. La correlación entre el
área afectada por el patógeno durante el año
de evaluación 1 y año 2, fue de –0.15 para la
familia K.
Los genotipos de yuca de la familia CM
9582 evaluados en el año 2001, mostraron un
área afectada entre 35,2 – 91,4%. Se encon-
traron pocos genotipos con resistencia mode-
Tabla 1. Parentales de las Familias K y CM
9582 de Manihot esculenta, utilizados en el
estudio para determinar la genética de la resiten-
cia a Phytophthora tropicalis
Parentales Origen Reacción a
P. tropicalis
Familia K
M Nga 2 (1) Nigeria,
Africa
Susceptible
CM2177-2 (1) Híbrido,
CIAT
Susceptible
CM 9582
M CR 81 (2) Costa
Rica
Resistente
M Bra 1045 (2) Brasil Resistente (1) Parentales de Familia K (2) Parentales de
Familia CM 9582
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
63
rada y ninguno con resistencia alta (Figura 2).
En el análisis realizado a la familia CM
9582 en el año 2001 se encontró que los 10
genotipos de yuca con mayor grado de resis-
tencia intermedia presentada al patógeno
fueron: 136, 148, 150, 133, 151, 121, 71, 115,
140 y 47. Los 10 genotipos de yuca con ma-
yor % de susceptibilidad presentada a P.
tropicalis fueron: 45, 42, 172, 153, 68, 62,
52, 163, 78 y 91.
En cada experimento se evaluaron dos va-
riedades testigos. M Col 2066, considerada
susceptible en el campo a Pudrición causada
por Phytophthora, consistentemente fue sus-
ceptible a P. tropicalis (86,2%, 78,3% y
70,9% área afectada respectivamente). La
variedad M Bra 1045, tolerante a la enferme-
dad en el campo, mostró 11,6% y 51,5% de
área afectada en los años 2000 y 2001 respec-
tivamente.
Las Figuras 3 y 4 muestran la distribución
de los individuos por grupo de acuerdo con el
grado de resistencia al patógeno. La distribu-
ción de la frecuencia de los genotipos de
yuca de la familia K de acuerdo al área de
raíz afectada por P. tropicalis, es una distri-
bución normal, con un genotipo que presenta
resistencia moderada en los dos años de eva-
luación, 50 genotipos susceptibles y 17 geno-
tipos altamente susceptibles (Figura 3).
En la distribución de la frecuencia de los
genotipos de yuca de la familia CM 9582 por
área afectada por PRP, se presenta una curva
ascendente con la mayoría de genotipos sus-
ceptibles; M Bra 1045 muestra un 56,3% de
área afectada (Figura 4).
La correlación entre longitud de raíz y
área afectada fue de –0.30 para la familia
CM 9582, indicando esto que entre más larga
sea la raíz de la yuca, menor es la cantidad de
enfermedad (Tabla 2).
La Tabla 3 muestra los resultados del
análisis de la regresión del marcador simple
del porcentaje del área infectada en las raíces
inoculadas en el laboratorio. Los marcadores
definieron ocho QTLs situados en los grupos
de ligamiento C, H, J, N, Q, y V. Los QTLs
explicaron entre 1,3 y el 9% de la varianza
fenotípica. Siendo el No. 7, el QTL más sig-
nificativo, situado en grupo de ligamiento V
del mapa.
DISCUSIÓN
Con el fin de avanzar en la investigación de
la base genética de resistencia de yuca a
pudrición de raíz causada por Phytophthora
tropicalis, se evaluó la reacción a éste pató-
geno, de las progenies de dos poblaciones: la
familia K y CM 9582.
Famila K
Una parte de los genotipos evaluados de la
familia K expresaron resistencia moderada a
P. tropicalis. Algunos genotipos de esta fami-
lia presentaron resistencia moderada en el año
2000 pero fueron susceptibles en el año 2001.
También ocurrió lo contrario: algunos geno-
tipos susceptibles en 2000 presentaron resis-
tencia moderada en 2001.
Este cambio probablemente pudo ocurrir
por la acción de factores tales como cambios
en las condiciones ambientales o en suelo por
la presencia de productos químicos utilizados
en la fertilización. Situación que sería similar
a lo los resultados de Lübberstedt et al (1998)
en un estudio con maíz, en donde factores
como los mencionados afectaron la resisten-
cia parcial a Puccinia sorghi y la expresión
de QTLs.
Tabla 2. Evaluación fenotípica de dos poblaciones segregantes para resistencia a Pudrición de Raíces
causada por Phytophthora tropicalis.
Población/Genotipo
Familia K
Área afectada (%) Población/
Genotipo
Area afectada (%)
Años
Promedio 2000 2001 Año 2001 CV (%)
CM 9582
Moderadamente resistente (10-
30%)
K 19 29,7 27,1 28,4 - - 21,3
Susceptible (30-60%):
K 110 34,2 42,1 38,2 136 35,2 57,3
K 88 54,4 26,0 40,2 148 49,6 25,6
K 98 54,8 28,8 41,8 150 54,9 20,5
K 69 44,2 41,8 43,0 - - 21,0
K 114 32,8 56,6 44,7 - - 16,5
K 79 36,3 53,6 44,9 - - 6,9
K 66 53,2 37,8 45,5 - - 6,2
K 30 55,9 35,8 45,9 - - 13,3
K 81 22,8 70,5 46,7 - - 14,7
Promedio 41,8 42,0 41,9
46,6
20,3
Correlación entre años -0,67
Altamente susceptible (>60%)
K 9 60,2 67,3 63,8 42 84,4 5,4
K 57 61,6 65,9 63,8 68 84,7 8,4
K 92 72,7 57,3 65,0 172 85,2 7,5
K 148 62,7 69,4 66,0 153 85,4 13,5
K 39 37,1 95,2 66,1 62 85,9 8,9
K 35 64,9 69,0 66,9 45 86,2 4,4
K 6 69,2 65,9 67,5 52 86,2 9,7
K 122 65,9 71,0 68,5 78 87,9 6,5
K 145 81,6 69,4 75,5 91 88,0 13,2
K 64 67,3 87,2 77,3 163 91,4 5,3
Promedio 64,3 71,7 68,0 86,5 8,3
Correlación entre años -0,66
General
Promedio 53,6 56,0 54,8 76,0
Correlación -0,15
Parentales
M Nga 2 66,3 56,7 61,5 M CR 81 -
CM 2177-2 69,6 83,9 76,7 M Bra 1045 46,1 19,6
Testigos
M Bra 1045 (resistente) 11,6 51,5 31,5
M Col 2066
(susceptible) 70,9 11,6
M Col 2066 (susceptible) 70,5 86,2 78,3
M Nga 2
(susceptible) 55,4 19,1
CM 2177-2
(susceptible) 68,3 7,4
El promedio de resistencia intermedia a P. tropicalis de los 10 genotipos de yuca de la familia K, fue mayor
que el promedio de resistencia de los 10 genotipos de la familia CM 9582. El promedio de susceptibilidad a
P. tropicalis de los 10 genotipos de yuca de la familia CM 9582, fue mayor que el promedio de susceptibi-
lidad de los 10 genotipos de la familia K
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 64
Otros factores pueden ser el monocultivo,
el ciclo vegetativo largo y la propagación
vegetativa sin un control de calidad de esta-
cas previa a la siembra, por cuanto puede
haber efecto de ellos en el desarrollo de raí-
ces.
Los cambios en las poblaciones de mi-
croorganismos benéficos o detrimentales, en
la rizosfera y raíces pueden afectar la resis-
tencia. Las condiciones del suelo permiten
que se multipliquen las bacterias, las cuales
crean un ambiente favorable para que algunos
microorganismos colonicen la raíz de yuca.
El uso de agua de riego rica en bacterias,
infectan la planta o el suelo y a su vez facilita
la entrada de microorganismos específicos.
La variabilidad en la expresión de resis-
tencia entre años puede indicar que dicha
familia presenta poligenes, de acuerdo con
Llano (2003). Generalmente el ambiente
influye en la expresión fenotípica generando
variación. Es importante anotar que ciertos
genotipos de la familia K con resistencia
intermedia en el año 2000, la siguen expre-
sando en el año 2001.
Ambos parentales de la familia K son
susceptibles a P. tropicalis, sin embargo un
grupo de genotipos de la famila K presenta
resistencia intermedia. Esto indica que los
parentales son heterocigotos y que ambos
tienen genes de resistencia. Fregene et al.
(1997) demostraron que la familia K es hete-
rocigota.
CM 9582
La familia CM 9582 se obtuvo por cruza-
miento de M Bra 1045 y M CR 81. En estu-
dios anteriores (Llano, 2003) M Bra 1045
mostró resistencia a P. tropicalis, pero en las
pruebas presentadas mostró variación de
resistente a susceptible entre los dos años de
evaluación. Una explicación puede ser que
por cambios de factores ambientales la expre-
sión cambió, como se explicó anteriormente.
Se puede deducir que la base genética de M
Bra 1045 es poligénica, también puede haber
efectos epistáticos en este cruce.
Las dos poblaciones
Al comparar la resistencia intermedia presen-
tada por las familias K y CM 9582, se en-
cuentra que esta familia presenta pocos geno-
tipos de yuca con resistencia intermedia a P.
tropicalis. La explicación a este comporta-
miento se puede encontrar en los cruces gené-
ticos de los parentales de las dos familias, los
cuales son diferentes. Se observó que los 10
genotipos más resistentes de la famila K
tienen mayor grado de resistencia que los 10
genotipos más resistentes de CM 9582.
Análisis de QTLs
Los resultados muestran que la resistencia a
la pudrición de la raíz causada por Phytop-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Genotipos
Are
a a
fecta
da
(%
)Año 2000 Año 2001 Promedio
Figura 1. Tendencia del porcentaje de área afectada por Phytophthora tropicalis en 69 individuos de la
familia K de yuca, durante evaluaciones en 2000 y 2001.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
Area afectada (%)
Frecu
encia
(%
)
% Familia K
Figura 3. Distribución de la frecuencia de los genotipos de la familia K según el porcentaje de área de
raíz afectada por P. tropicalis, evaluación de 2000 y 2001
Figura 2. Tendencia del porcentaje de área afectada por Phytophthora tropicalis en 43 individuos de la
familia de yuca CM 9582, en evaluación realizada en 2001.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Genotipos
Area
afe
cta
da
(%
)
CM 9582
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
65
hthora tropicalis es poligénica en la familia
de K.
La presencia de individuos más resisten-
tes que los dos padres y la detección de QTLs
asociados a los marcadores moleculares del
mapa derivado de la madre de la familia K,
muestra que alelos de resistencia que provie-
nen de ambos padres, contribuyen a la resis-
tencia en las progenies (segregación transgre-
siva). Tales características son bien conocidas
en especies heterocigotas y son útiles para
combinar factores genéticos de la resistencia
en el mismo cultivar (Jorge et el al. 2001).
CONCLUSIONES Y RECOMENDA-
CIONES
Las poblaciones mostraron diferencias en la
base genética de la resistencia a Phytophtho-
ra. Los niveles de resistencia observados no
son suficientemente altos para usar en pro-
gramas de mejoramiento, por esta razón será
conveniente identificar parentales y desarro-
llar nuevas poblaciones.
Se sugieren las siguientes recomendaciones:
Hacer el ligamiento de la expresión
fenotípica con marcadores moleculares.
Inocular cada raíz con un testigo nega-
tivo y el patógeno. En esta forma se re-
duce la probabilidad de evaluación de
positivos falsos.
Estudiar los factores que influyen en la
expresión de resistencia.
Evaluar raíces procedentes de distintas
localidades, por ejemplo de Quindío y
Cauca.
Estudiar la patogénesis de Phytophtho-
ra en raíces de yuca y los mecanismos
de resistencia.
AGRADECIMIENTOS
A Herney Rengifo, Juan Fernando Mejía y
Lina María Tabares, por su colaboración
durante las cosechas de yuca e inoculaciones.
A Martin Fregene y Jaime Marín para su
ayuda en el análisis de QTLs.
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en yuca (Manihot esculenta Crantz), y su
relación con la resistencia a tres especies
de Phytophthora. Tesis de Maestría en
Tabla 3. QTLs que explican los valores más altos de la varianza fenotípica para la resistencia en yuca,
según lo descrito por el porcentaje del área de la raíz infectada. Los valores en negrilla son significativos a
P = 0,05
Grupo de ligamiento
(Mapa Femenino)
Marcadores
(Posición en cM)a
Fb
Vc (%)
Pd
No. de
QTL
C (3) RGY172 0,029 5,4 <0,0500 1
H (8) SSRY178 0,315 1,3 <0,0500 2
J (10) CDY76 0,163 4,0 <0,0500 3
K2a 0,040 8,6 <0,0500 4
N (14) SSRY13 0,078 4,2 <0,0500 5
Q (17) SSRY911 0,047 5,7 <0,0500 6
V (22) NS911 0,007 9,0 0,0070 7
GY153 0,049 4,5 <0,0500 8 aDistancia del primer marcador observado. bEstadístico F del análisis de la variación. cPorcentaje de la
varianza fenotípica explicada (del coeficiente r2 de la regresión). d Probabilidad del estadístico F.
0
10
20
30
40
50
60
0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100
Área afectada (%)
Frecu
encia
(%
)
CM 9582
Figura 4. Distribución de la frecuencia de los genotipos de la familia CM 9582 según el porcentaje de área
de raíz afectada por P. tropicalis, evaluación de 2001
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 66
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2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
PURIFICACIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA HOJA AMARILLA DE LA CAÑA DE
AZÚCAR (Sugarcane Yellow Leaf luteovirus ScYLV) Y PRODUCCIÓN DE ANTISUERO*
Juan Carlos Angel Sánchez1, Mavir Carolina Avellaneda Barbosa1, Jorge Ignacio Victoria Kafure1, Mónica Betancourt Vásquez2, Cristina Díaz-
Granados3, José Alejandro Arroyave Posada4 y Mauricio Castaño Jaramillo4
1Centro de Investigación de la caña de Azúcar de Colombia CENICAÑA, jcangel@cenicana.org , 2Universidad de Caldas. Manizales
monbe@hotmail.com , 3Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, cristinad57@latinmail.com , 4Centro Internacional de Agricultura Tropical
CIAT Apartado Aéreo 6713 Cali
*Trabajo realizado con recursos del proyecto cofinanciado por COLCIENCIAS-CENICAÑA “Diagnóstico de enfermedades virales, endémicas y
exóticas de la caña de azúcar en Colombia. Código 2214-07.023-97. Galardonado con el Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón
Auspiciado por BAYER S.A. y Otorgado por ASCOLFI en el XXIII Congreso de la Asociación, Bogotá, Julio 3-6 de 2002
RESUMEN
Plantas de la variedad SP 71–6163 afectadas por el virus del síndrome
de la hoja amarilla de la caña de azúcar (ScYLV), se sembraron en
condiciones de invernadero para purificar el agente causal y producir
anticuerpos específicos. La metodología de purificación utilizada fue
la de Lockhart (1999) modificada, agregando la enzima Celluclast 1,5
L al 2% a la solución de extracción. Las preparaciones parcialmente
purificadas fueron evaluados por microscopía electrónica en el labora-
torio de la unidad de virología del CIAT para verificar la concentra-
ción de partículas virales. Una vez obtenida una alta concentración el
semipurificado se ultracentrifugó en un gradiente de densidad de
sucrosa de 10-40% para incrementar la pureza del virus. El purificado
obtenido se empleó como antígeno en la producción de inmunoglobu-
linas específicas inyectando conejos de la raza Nueva Zelandia durante
cuatro semanas en una concentración de 1mg ScYLV/ml, para luego
evaluar el antisuero mediante técnicas de microscopía electrónica y
TBIA. Se encontró una alta concentración de partículas virales en
semipurificados empleando Celluclast 1,5 L al 2%. La relación de
absorbancia A260/A280 fue de 1,49 y la concentración viral aproximada
de 1,87 mg/ml. El anticuerpo producido se utilizará en pruebas seroló-
gicas de ISEM y tissue-blot para el diagnóstico del ScYLV en la zona
azucarera del Valle del Cauca.
Palabras claves: caña de azúcar, síndrome de la hoja amarilla, anti-
suero.
SUMMARY
Plants of SP 71-6163 variety positive for the virus of the sugarcane
yellow leaf syndrome (ScYLV) were sowed under greenhouse condi-
tions to purify the causal agent and to produce specific antibodies. The
methodology used for purification was that of Lockhart (1999) modi-
fied by CENICAÑA, adding the Celluclast 1,5 L to 2% enzyme to the
extraction buffer. The purified of the obtained virus were evaluated by
electronic microscopy in the laboratory of the Virology Unit at CIAT
inn order to verify viral particles concentration. Once obtained a high
concentration of virus particles, the purified were put on a sucrose
gradient with density of 10-40 % to increase the purity of the virus
which was determined later in the spectrophotometer. The purified
obtained was used as antigen in the production of inmunoglobulin by
injecting New Zealand rabbits during four weeks by a concentration of
1mg ScYLV/ml. The antiserum was evaluated by ISEM and TBIA.
High concentration of virus particles was found by adding 2 % Cellu-
clast 1,5 L. The absorbance A260/A280 was of 1.49 and the approximate
viral concentration of 1.87 mg/ml. The antibody produced will be used
for serological tests of ISEM and TBIA in the diagnosis of the ScYLV
in the sugarcane area of the Cauca Valley.
Key words: Sugarcane, Yellow leaf syndrome, antibody
INTRODUCCIÓN
En la actualidad la región azucarera del Valle
del Cauca se enfrenta a una enfermedad de
origen viral potencialmente importante, el
síndrome de la hoja amarilla (ScYLV), el
cual está infectando vertiginosamente los
cultivos de caña de azúcar debido a la rápida
diseminación por vectores, su difícil detec-
ción en el campo por la variabilidad de su
infección y a la gran cantidad de variedades
susceptibles (Victoria et al,1998).
Entre 1990 y 1991 se observaron los pri-
meros síntomas de amarillamiento en las
plantas, en la parte sur del Brasil, específi-
camente en la zona productora de caña de
azúcar del estado de Sao Paulo (Lima et al,
1995, Vega et al, 1997). Para 1992 el sín-
drome de la hoja amarilla estaba presente en
la mayoría de cultivos de la variedad SP 71-
6163, de la zona de Sao Paulo la cual repre-
sentaba el 25% de la caña cultivada en esta
zona. En esta variedad se registraron síntomas
severos, indicando la alta sensibilidad de la
variedad al virus. Los síntomas en la variedad
SP 71-6163, no son visibles en hojas nuevas,
solamente hay evidencia de éste en las hojas
maduras. Los primeros síntomas se presentan
como un amarillamiento intenso de la nerva-
dura en las hojas viejas, se observa además,
una coloración rojiza en la superficie axial de
la nervadura. La decoloración subsiguiente se
esparce, desde de la punta hacia la base de la
hoja y se desarrolla eventualmente síntomas
de necrosis. Las raíces y los tallos se debilitan
en su crecimiento y la producción se reduce
significativamente (Vega et al, 1997).
La etiología del ScYLV, fue puesta en
duda por mucho tiempo. Factores abióticos
incluyendo compactación del suelo, desba-
lance nutricional, falta de agua y condiciones
climáticas adversas fueron sugeridos como
posibles causantes de la enfermedad. Sin
embargo, el patrón de los síntomas y su dis-
tribución en el campo sugerían que podría ser
debido a un agente biótico, opinión que fue
sustentada cuando se asociaron los síntomas
con presencia de partículas vírales en los
tejidos. En 1994 los síntomas fueron asocia-
dos con la presencia de un closterovirus por
medio de la prueba de de detección de dobles
cadenas de ARN (Borth et al, 1994). En 1997
Vega et al, encontraron partículas de luteovi-
rus en los tejidos del floema por medio de
pruebas citológicas y se acercaron a los pri-
meros estudios de purificación, basados en
las metodologías para el virus del enanismo
amarillo de la cebada (Barley Yellow Dwarf
luteovirus BYDV). Dos patógenos Sugarcane
Yellow Leaf Virus ScYLV ( Lockhart et al,
1995, Irey et al, 1996; Vega et al, 1997) y
Sugarcane Yellow Leaf Phytoplasma
(ScYLP) (Cronje et al, 1997) han sido regis-
trados y asociados a síntomas del síndrome
de la hoja amarilla de la caña de azúcar.
En el 2000 Scagliusi y Lockhart, ratifica-
ron los resultados de Vega et al., 1997, indi-
cando que la enfermedad era causada por un
luteovirus con partículas de 25 a 29 nm de
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 68
diámetro el cual denominaron como “Sugar-
cane Yellow Leaf Virus”. Sin embargo, utili-
zando los últimos sistemas de taxonomía se
clasificó nuevamente el agente causal como
un virus del género polerovirus, familia
luteoviridae. (Moonan y Mirkov, 1999).
El síndrome de la hoja amarilla se regis-
tró por primera vez en Colombia en mayo de
1998, en la variedad SP 71-6163 introducida
del Brasil en 1987 (Victoria et al, 1998;
Victoria et al, 1999). Esta enfermedad se
transmite al usar semilla vegetativa infectada
y por la acción vectora de los áfidos Mela-
naphis sacchari y Rhopalosiphum maidis
presentes en las zonas azucareras del país.
Entre octubre de 1998 y marzo de 1999, la
enfermedad se observó ampliamente distri-
buida en la región azucarera aunque con
mayor incidencia en la zona sur (Victoria et
al., 1998; Victoria et al., 1999). La incidencia
fue mayor en la variedad CC 85-96, seguida
por las variedades ICC 93-02, MZC 82-11,
CC 84-75 y PR 61-632, entre otras, produ-
ciendo efectos de disminución en la produc-
ción, especialmente en las variedades suscep-
tibles CC 84-75 y CC 85-96.
La enfermedad puede diagnosticarse por
diferentes técnicas serológicas entre ellas
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent
Assay), TBIA (Tissue-Blot ImmunoAssay),
DBIA (Dot-Blot ImmunoAssay) y por la
observación al microscopio electrónico de las
partículas vírales purificadas a partir de
tejido enfermo (Schenck y Lockhart, 1997;
Victoria et al, 1998; Scagliusi y Lockhart,
2000; Guzmán y Victoria, 2001). El proceso
de purificación para la producción del anti-
suero específico se ha dificultado debido a la
ubicación restringida del virus a los tejidos
del floema de la planta y a la baja concentra-
ción de partículas vírales en los tejidos, lo
que hace más difícil su extracción; además a
la ausencia de síntomas en plantas infectadas
debido a las diferencias de comportamiento
de las variedades de caña cultivadas y a la
carencia de hospedantes alternos de rápido
crecimiento (Lockhart et al, 1995; Vega et al,
1997; Scagliusi et al, 2000).
Actualmente en CENICAÑA la enferme-
dad del síndrome de la hoja amarilla de la
caña de azúcar se diagnostica con las pruebas
serológicas TBIA y DBIA utilizando antisue-
ros importados con la limitaciones que impli-
ca su adquisición. Para obviar estas dificul-
tades se planeo en esta investigación producir
localmente un antisuero especifico para el
diagnóstico del ScYLV, previa la purificación
del agente causal del síndrome de la hoja
amarilla (ScYLV).
MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio se realizó bajo condiciones de
invernadero en la estación experimental de
San Antonio de los Caballeros del Centro de
Investigación de la Caña de Azúcar de Co-
lombia CENICAÑA, localizada en el munici-
pio de Florida departamento del Valle del
Cauca, a una altura de 980 metros sobre el
nivel del mar, precipitación de 1140 mm/año,
temperatura promedia de 23,5 °C y humedad
relativa del 76%, y en los laboratorios de
fitopatología y virología de CENICAÑA y
CIAT respectivamente.
Para el proceso de purificación se utiliza-
ron plantas de la variedad SP 71-6163 afecta-
das por ScYLV previamente diagnosticadas
como positivas por TBIA para síndrome de la
hoja amarilla, las cuales se sembraron en
macetas plásticas (11x14x11 cm); se empleó
como substrato una mezcla de tierra y arena
zarandeada estériles en proporción 2:1 res-
pectivamente. El tratamiento que se dio al
material sembrado consistió en un riego
suministrado diariamente y fertilización
semanal.
Purificación del virus del síndrome de la
hoja amarilla (ScYLV)
Debido a que el proceso de purificación del
ScYLV ha presentado dificultades por su
restricción a los tejidos del floema y a la
variabilidad de la infección de acuerdo con la
variedad afectada, se probaron tres metodolo-
gías de purificación (Tabla 1):
Protocolo propuesto para purificación de
virus en general (Lockhart, 1999)
Protocolo para ScYLV (Scagliusi y Lo-
ckhart, 2000)
Protocolo modificado en CENICAÑA para
el ScYLV
En cada una de las metodologías se esta-
bleció un control estricto sobre los tiempos de
centrifugación, concentraciones y pH de los
tampones de extracción, esterilización de los
materiales, cantidad y forma de picado del
tejido. Todas las purificaciones realizadas en
las diversas pruebas fueron observadas al
microscopio electrónico en el laboratorio de
virología del CIAT para determinar la con-
centración de partículas vírales en ellas.
Una vez determinada la mejor metodolo-
gía en la que se obtuvieron semipurificados
limpios, sin daños de las partículas y una
aceptable concentración de ellas, se desarro-
llaron cambios para estandarizar el proceso y
mejorar los resultados del protocolo seleccio-
nado.
Edad fisiológica y tipo de tejido para la
purificación del virus
Con la metodología estandarizada, se rehicie-
ron varios ensayos para determinar la edad de
las plantas más adecuada para realizar el
proceso de purificación. Se seleccionaron
plantas en el campo, se marcaron varios
tallos por cepa y se colectó de cada tallo
seleccionado la hoja TVD (primera hoja con
cuello visible); a éstas se les realizó la prueba
de TBIA (Guzmán y Victoria, 2001). Los
tallos que resultaron positivos para la enfer-
medad fueron utilizados como semilla para
sembrar sus yemas en condiciones de inver-
nadero, se sembraron 50-100 plantas. Una
vez desarrolladas las plantas se tomaron 100
gramos de tejido para purificar el virus a
diferentes edad de las plantas: 15, 20, 30 y 60
días después de la siembra, las pruebas de 6 y
12 meses se desarrollaron con plantas enfer-
mas de campo. El material fue recolectado
tomando sólo la parte más joven de la planta,
(hojas del cogollo hasta la hoja TVD) pre-
sumiendo allí una alta concentración de virus.
También se realizaron pruebas para determi-
nar el tipo de tejido y el más adecuado para
realizar la purificación, tomando 100 g de
cada tipo de tejido de plantas que previamen-
te habían resultado positivas para ScYLV.
Los tipos de tejidos utilizados fueron: hojas
de cogollo, hoja TVD sin nervadura y hoja
TVD con nervadura, nervaduras de hoja TVD
y entrenudos de tallo.
Cuantificación de la concentración viral
Las preparaciones obtenidas en cada metodo-
logía probada se analizaron en la Unidad de
Virología del CIAT por medio de microsco-
pía electrónica evaluando concentración viral
(número de partículas por campo). A partir de
los semipurificados con presencia de una alta
concentración de partículas virales se selec-
cionaron las muestras aptas para ser someti-
das a un gradiente de densidad de sucrosa de
10-40 %, para de esta forma obtener un virus
más purificado. Posteriormente se analizó la
suspensión final del virus de la mejor meto-
dología diluida (1/100) en un espectrofotóme-
tro, dentro de un rango de longitud de onda
comprendida entre 220 y 320 nm (Rango luz
ultravioleta). La pureza y la concentración
(mg ScYLV por mL) se determinaron mi-
diendo la relación de absorbancia A260/A280 y
utilizando la fórmula: A260 x dilución / coefi-
ciente de extinción del virus.
Método de inmunización para obtener
antisuero
El método de inmunización utilizado consis-
tió en inyectar el purificado del virus de la
mejor metodología en los cojinetes de las
patas traseras de un conejo de la raza Nueva
Zelandia de 3 meses de edad. La inmuniza-
ción se basó en la aplicación de cuatro inyec-
ciones de 0,3 mL de la suspensión viral
(1mg/mL), los cuales previamente habían
sido mezclados con un volumen igual de
coadyuvante de Freund completo para la
primera inyección e incompleto para las
siguientes.
Las inyecciones se administraron con una
semana de intervalo. La sangre se comenzó a
colectar un mes después de la primera inyec-
ción y se continuó semanalmente hasta doce
semanas después, teniendo cuidado de privar-
lo de comida por lo menos 18 horas antes de
cada sangría. La sangre (5-10 mL) se colectó
de la oreja de los conejos inmunizados en
tubos de centrifuga y se llevó luego a un baño
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 69
maría a 37 °C durante 60 minutos, se centri-
fugó luego a 2750 r.p.m. durante 15 minutos,
se recolectó el sobrenadante y se sometió
nuevamente a centrifugación éste por cinco
minutos a 3500 r.p.m. para eliminar comple-
tamente los glóbulos rojos. Los antisueros
obtenidos de cada una de las sangrías se
marcaron y se transfirieron a tubos pequeños
(1mL) congelándose a –20 °C.
Preparación de Inmunoglobulina (IgG)
para el ScYLV
Con el fin de aumentar la especificidad del
antisuero obtenido en cada sangría, éste se
purificó precipitando las proteínas que aún
pudiera contener, utilizando la metodología
de Ball et al (1990). Esta consistió en adicio-
nar por cada ml de antisuero, 1 mL de agua
destilada estéril y 1,3 mL de sulfato de amo-
nio saturado pH 7,0-7,2, se agitó por 30
minutos y se refrigeró toda la noche, luego se
centrifugó a 8000 r.p.m. durante 10 minutos y
colectó el precipitado, éste se resuspendió en
1 ml con tampón fosfato salino PBS 0,01 M
conteniendo NaCl 0,15 M. Se repitió la pre-
cipitación de proteínas adicionando 1 mL de
agua destilada estéril y 1.02 ml de sulfato de
amonio saturado por ml de precipitado resus-
pendido, se agitó por 30 minutos y se centri-
fugó nuevamente a 8000 r.p.m. por 10 minu-
tos. El precipitado que contiene las Ig G
purificadas sé resuspendió en PBS con la
mitad del volumen original del antisuero y se
congeló a –20 ºC para emplearse posterior-
mente en las pruebas serológicas.
Pruebas serológicas con el antisuero de
ScYLV
El antisuero específico se usó en las pruebas
serológicas de TBIA (Guzmán y Victoria,
2001) e ISEM (Derrick, 1973). Para el caso
de TBIA se ensayaron diluciones de 1:5000,
1:6000, 1:7000, 1:8000 y 1:9000 de los anti-
sueros de cada una de las sangrías obtenidas,
como muestras positivas se utilizaron impre-
siones del tejido de la nervadura central de la
hoja TVD proveniente de la variedad SP 71-
6163 con ScYLV, las cuales se imprimieron
en membranas de nitrocelulosa. Se tomó
como testigo negativo, plantas sanas de la
variedad MZC 74-275. El proceso de diag-
nóstico que se siguió fue el de Shenck et al
(1997) y Guzmán y Victoria (2001).
Para la técnica de ISEM se tomó tejido
enfermo de hojas del cogollo de la variedad
SP 71-6163 con el cual se procedió a probar
diferentes variantes a saber: 1. Macerado de
tejido más Celluclast 15 L (1 hora) más anti-
suero puro. 2. Macerado de tejido sin Ce-
lluclast 1,5 L más antisuero puro. 3. Macera-
do de tejido sin Celluclast 1.5 L y sin antisue-
ro. 4. Macerado de tejido con Celluclast 1.5
L (1 hora) sin antisuero. 5. Semipurificado
más antisuero puro. 6. Semipurificado sin
antisuero.
El procedimiento para ISEM usado fue el
de Derrick (1973) teniendo en cuenta cada
una de las variaciones. Con esto se seleccionó
la mejor variante de captura de las partículas
vírales mediante la técnica de microscopía
electrónica, evaluando concentración viral (#
partículas por campo).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Metodologías para la purificación del virus
En la purificación del virus del síndrome de
la hoja amarilla de la caña de azúcar, utili-
zando la metodología general de virus pro-
puesta por Lockhart, 1999 (Tabla 1), la cual
se caracteriza por el empleo de bajos volúme-
nes de cloroformo y soluciones y sin el uso
del Celluclast 1.5 L (Novo Nordisk Bioche-
mich North America, Inc., Franklinton); la
concentración víral se vio reducida debido a
que el virus se encuentra restringido al tejido
Tabla 1. Comparación de los protocolos usados para la purificación del virus del síndrome de la hoja amarilla (ScYLV).
Protocolo general para purificación de virus
(Lockhart, 1999) Protocolo para ScYLV
(Scagliusi y Lockhart, 2000)
Protocolo para ScYLV
modificado CENICAÑA
1. Colectar 100 g de tejido enfermo y picar en
pequeños pedazos.
2. Adicionar 250 ml tampón fosfato 250 mM pH
6,0 más 0.5% de 2-mercaptoethanol
3. Homogenizar y filtrar a través de gasa.
4. Agregar 2,5 mL de tritón X-100 al 33% y
agitar por una hora.
5. Centrifugar de 10.000 a 12.500 r.p.m. por 10
minutos
6. Colectar el sobrenadante y colocarlo sobre 5
ml de un colchón de Sucrosa 30% en tampón
fosfato 100 mM, pH 7.0 y centrifugar a 42.000
r.p.m. por una hora.
7. Resuspender el precipitado en tampón fosfato
100 mM pH 7,0 y agregar un volumen igual de
cloroformo.
8. Centrifugar a 12.500 r.p.m. por 10 minutos.
9. Colectar el sobrenadante, que contendrá el
semipurificado parcial
10. Evaluar por microscopía electrónica
11. Colocar en gradiente de Cloruro de Cesio (10 –
30%) y centrifugar a 42.000 r.p.m. por 3 horas
12. Colectar la banda del virus purificado.
13. Evaluar al microscopio electrónico.
1. Colectar 100 grs. De tejido infectado, picar en
pequeños pedazos y congelar a – 90°C.
2. Moler o pulverizar con un moledor de café con
ayuda de hielo seco.
3. Mezclar con 3 volúmenes (v/V) (100g / 300 ml)
de tampón fosfato pH 6.0, 250 mM, contenien-
do 0.2% (v/V) de 2–mercaptoethanol, 2% (v/V)
de Celluclast 1.5 L (Novo Nordisk Biochemich
North America, Inc., Franklinton).
4. Agitar por 4 horas a temperatura ambiente.
5. Filtrar a través de gasa.
6. La fibra se re-extrae con 1 volumen de tampón
de extracción sin celluclast, 1,5 L.
7. Mezclar los filtrados y adicionar tritón X-100
con una concentración de 0,8% (v/V).
8. Agitar por toda la noche a 4°C.
9. Clarificar por extracción con un volumen igual
de cloroformo–n-butanol, (1:1 v/v), y centri-
fugar 10.000 r.p.m. por 15 minutos
10. Colectar la fase acuosa y concentrar el virus
adicionando 10% de PEG (PM 10.000) y 2%
(P/V) de NaCl.
11. Centrifugar a 10000 r.p.m. por 20 minutos.
12. Resuspender el precipitado en tampón fosfato
100 mM pH 7,0, conteniendo 0,65% (v/V) de
Tritón X–100.
13. Clarificar por centrifugación a 13000 r.p.m.por
15 minutos
14. Ultracentrifugar a 42000 r.p.m./90 minutos,
sobre un colchón de sucrosa al 30 % en tampón
fosfato pH 7,0.
15. Resuspender el precipitado en tampón fosfato
100 mM PH 7,0. y evalúa por Microscopía
electrónica.
1. Colectar 100 gramos de hojas enfermas, cortar-
las en pequeños pedazos, congelarlas con Ni-
trógeno líquido y pulverizarlas con hielo seco
en un moledor de café. Adicionar, Celluclast
1,5 L al 2 % (Novo Nordisk Biochemich North
America, Inc., Franklinton), solución fosfato
250 mM, pH 6,0 (2,5 volúmenes p/v) y 0,2%
de 2–Mercaptoethanol y dejar mezclando a
temperatura ambiente tres a cuatro horas
2. Homogenizar en licuadora.
3. Filtrar con una malla de 200 mesh de nylon.
4. Adicionar 2.5 ml de tritón X–100, al 33% y
agitar a 4°C por una hora.
5. Centrifugar a baja velocidad 10000 r.p.m. por
10 minutos.
6. Filtrar el sobrenadante a través de gasa.
7. Centrifugar a 42000 r.p.m. por una hora a 4°C
sobre un colchón de Sucrosa al 30% en tampón
fosfato 100 mM pH 7,0.
8. Resuspender el precipitado toda la noche en
100 mM pH 7,0
9. Clarificar con un volumen igual de cloroformo
(1:1) y agitar en vortex.
10. Centrifugar a baja velocidad (10000 r.p.m. por
10 minutos).
11. Recolectar el sobrenadante.
12. Centrifugar a 42000 por una hora con o sin
colchón de sucrosa al 30% .
13. Resuspender el precipitado en 100 mM de
tampón Fosfato pH 7,0 por toda la noche.
14. Centrifugar a 5.000 r.p.m. por 5 minutos y
recoger el sobrenadante.
15. Observar al microscopio electrónico.
16. Pasar por un gradiente de sucrosa del 10-40 %
si es necesario
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 70
del floema y se necesita de algún agente que
lo pueda liberar.
La otra metodología que se ensayó fue la
propuesta por Scagliusi y Lockhart (2000)
para purificación de ScYLV. El proceso
utiliza la enzima del Celluclast 1.5 L (2 %)
(Novo Nordisk Biochemich North America,
Inc., Franklinton) adicionado a la solución de
extracción, se observó una mayor concentra-
ción viral con relación al protocolo general
(Tabla 1) para purificación de virus (Lo-
ckhart, 1999), debido a que la enzima rompe
las paredes celulares dejando libre las partícu-
las vírales (Figura 1 A-D). Esta técnica utiliza
cantidades altas de cloroformo y butanol que
pueden resultar poco favorables para el virus
ya que lo puede degradar. A pesar de todo, la
concentración viral aun se mostró muy baja
para inmunizar los conejos y la adición de
productos como PEG al 10% y NaCl al 2%,
no produjeron incremento en la concentración
viral.
La metodología modificada por
CENICAÑA (Tabla 1) resultó ser la más
efectiva para la purificación del virus; en esta
técnica a la solución de extracción le fue
adicionado Celluclast 1.5 L al 2% (Novo
Nordisk Biochemich North America, Inc.,
Franklinton). La adición de esta enzima
celulolítica permitió el rompimiento de los
enlaces -glucosídicos de la celulosa de las
paredes de las células y de esta manera el
virus se liberó fácilmente de las células del
floema (Figura 1 A-C) y la concentración
viral aumentó en comparación con la metodo-
logía general propuesta por Lockhart (1999) y
la de Scagliusi y Lockhart, (2000) para
ScYLV. Además, la agitación a temperatura
ambiente durante 4 horas del tejido picado
con la solución de extracción y el Celluclast
1.5 L, promovió la disgregación del virus
antes de los procesos de limpieza (Figura 1-
D).
En la técnica modificada se encontró que
es necesario mantener el tejido en condicio-
nes controladas de frío utilizando nitrógeno
líquido, evitando así que el tejido se hume-
dezca para posteriormente triturar finamente
el tejido en un moledor de café con la ayuda
de hielo seco. Las centrifugaciones a baja
velocidad fueron uniformizadas a 10.000
r.p.m. por 10 minutos. La primera centrifuga-
ción a alta velocidad debe realizarse siempre
sobre un colchón de sucrosa al 30% para
disminuir el efecto de pérdida del virus (Ta-
bla 2). Es también necesario dejar el precipitado
en resuspensión por un tiempo mínimo de 12
horas para favorecer la disgregación del virus,
este tiempo no debe excederse porque pueden
presentarse contaminaciones por bacterias. El
uso de bajas concentraciones de cloroformo
incidió en que el virus no se degradara. Es
importante una última concentración del virus
a alta velocidad de centrifugación (42000
r.p.m. x 1 hora) con o sin colchón de sucrosa,
para obtener menores volúmenes de resus-
pensión y de esta forma tener una alta con-
centración del virus (Figura 1-D).
Edad fisiológica y tipo de tejido para
purificar el virus
Se encontró que las mejores muestras para
usar en la purificación del virus corresponden
a tejido joven (hojas de cogollo y hoja TVD)
de plantas entre 30 y 60 días que no hayan
recibido procesos de congelamiento, pues en
estas muestras se observó un promedio mayor
de partículas virales mediante microscopía
electrónica. Los materiales jóvenes presentan
también mayores ventajas para su manejo,
especialmente en el proceso de trituración.
Materiales de mayor edad, entre 6 y 12 meses
y tejido de nervaduras de hojas y entrenudos-
de tallo mostraron promedios bajos en con-
centración de partículas y además son difíci-
les de triturar.
CCuuaannttiiffiiccaacciióónn ddee llaa ccoonncceennttrraacciióónn viral
Las preparaciones del virus purificado de la
metodología modificada en Cenicaña tuvie-
ron una relación de absorbancia A260/A280 de
1,49 y su concentración fue de 1.87 mg
ScYLV/ml. La concentración del virus per-
mitió preparar las diferentes dosis que fueron
utilizadas en el proceso de inmunización y
producción del antisuero específico.
Método de inmunización para obtener
antisuero
Al finalizar la aplicación de las dosis y al
cumplirse la quinta semana se iniciaron las
sangrías del conejo realizándose doce en
total. Con cada sangría se obtuvo un antisuero
más específico, precipitando las proteínas que
aún pudiera contener, utilizando la metodolo-
gía de Ball et al (1990). El precipitado sé
resuspendió en PBS con la mitad del volumen
original del antisuero y se congeló para em-
Tabla 2. Evaluación de los antisueros de las diferentes sangrías para la detección del virus
del síndrome de la hoja amarilla ScYLV, mediante la técnica serológica TBIA.
Sangría
Dilución del antisuero
1:5000 1:6000 1:7000 1:8000 1:9000
1 y 2 - + + + -
3 + + + + -
4, 5 y 6 - + - - -
7, 8 y 9 - - - - -
10, 11 y 12 - - - - -
+: Detección positiva a la enfermedad -: Detección negativa a la enfermedad
C
B A
D
Figura 1. Corte de tejidos del floema. A-C. Partículas virales dentro de la célula D. Observación por mi-
croscopía electrónica del virus purificado siguiendo el protocolo general de purificación propuesta por
Lockhart 1999 con adición de Celluclast 1.5 L en el proceso de purificación.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 71
plearse en la realización de las pruebas sero-
lógicas.
Pruebas serológicas con el antisuero de
ScYLV
El antisuero de cada una de las sangrías se
evaluó por la técnica serológica de TBIA y se
observó una reacción positiva específica del
antisuero sobre el patógeno presente en las
nervaduras de las plantas enfermas, a partir
de la primera hasta la sexta sangría, siendo la
tercera sangría la demás alto titulo al poder
emplearse en un rango de dilución que va de
1:5000 a 1:8000 (Tabla 2).
La primera y segunda sangría también
mostraron resultados óptimos ya que respon-
dieron específicamente en las diluciones
realizadas entre 1:6000 a 1:8000. De igual
manera, de la cuarta a la sexta sangría res-
pondieron de manera específica solo en la
dilución 1:6000 (Tabla 2).
Las sangrías posteriores no mostraron
ninguna reacción positiva a las diferentes
diluciones de anticuerpos, lo cual puede ser
debido a que la concentración de anticuerpos
producidos por el conejo se disminuyó con el
paso del tiempo. En las impresiones de ner-
vaduras de plantas sanas no se observó nin-
guna reacción positiva en ninguna de las
diluciones de los antisueros utilizados.
Para la técnica de ISEM se utilizó el me-
jor antisuero que fue el de la tercera sangría.
Se observó que cuando se usa el Celluclast
1.5 L adicionado a la solución de macerado
de tejido y dejándolo por una hora y adicio-
nándole luego el antisuero específico se
detecta una captura de las partículas virales
con mayor especificidad que cuando se utiliza
solo el antisuero sin usar el celluclast en el
proceso de maceración (Tabla3).
Se observó además que el antisuero pre-
parado en este estudio actuó específicamente
mostrando una mayor captura de partículas
virales en los mismos semipurificados utili-
zados para la inmunización de los conejos de
este trabajo que cuando se observó el semipu-
rificado sin adicionarle el antisuero (Tabla 3,
Figura 2). En las variantes de macerado del
tejido con Celluclast 1.5 L y tejido macerado
sin Celluclast 1.5 L y sin utilizar el antisuero,
no hubo detección de partículas vírales (Tabla
3).
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
Se purificó el virus causante de la enfer-
medad del síndrome de la hoja amarilla
empleando la metodología modificada en
CENICAÑA, y al adicionar la enzima ce-
lulolítica Celluclast 1.5 L al 2 % (Novo
Nordisk Biochemich North America, Inc.,
Franklinton) a la solución de extracción
se aumentó considerablemente la concen-
tración de partículas virales.
El material óptimo para purificar el agen-
te causal del virus del síndrome de la hoja
amarilla debe ser tejido joven proveniente
de hojas de cogollo hasta la TVD sin congelar
y con edad de las plantas de 30 a 60 días,
donde se encontró una alta concentración de
partículas virales.
Se obtuvo un purificado con una relación
de absorbancia A260/A280 igual a 1.49 y
una concentración viral de 1.87 mg
ScYLV/mL.
Se obtuvo antisuero específico contra el
ScYLV para ser empleado en la técnica
serológica de TBIA en un titulo de
1:5000 a 1:8000.
El empleo del celluclast 1.5 L al 2 %
(Novo Nordisk Biochemich North Ame-
rica, Inc., Franklinton) en la técnica sero-
lógica ISEM, mostró beneficio en la cap-
tura de las partículas virales del ScYLV.
Por medio de ésta metodología se puede
seguir produciendo un antisuero específi-
co con un alto titulo para ser utilizado en
pruebas de diagnóstico de la enfermedad
en campos de caña de azúcar.
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cación para virus en general, del tipo ba-
Tabla 3. Comparación del uso del Celluclast 1.5 L y el antisuero específico en la captura de partículas
mediante la prueba serológica de ISEM.
Muestra Sin antisuero
Con antisuero
Tejido sin Celluclast - +
Tejido con Celluclast - ++
Semipurificado + +++
- = No partículas vírales (0), + = bajo númerpo de partículas vírales (1-2), ++ = Número moderado de
partículas vírales (5-10),+++ = Alto número de partículas vírales (>10)
A B
Figura 2. Captura específica de partículas virales extraídas de plantas de caña de azúcar afectadas por
ScYLV. A. Semipurificado sin antisuero. B. Semipurificado con antisuero.
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CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE UN POTEXVIRUS AISLADO DE PITAHAYA AMARILLA
(Selenicereus megalanthus) AFECTADA POR MOSAICO EN COLOMBIA
Helena Reichel 1, Rosalía Pérez2 y Ana Karine Martínez3, Raúl Sedano3, Maritza Cuervo3, José Alejandro Arroyave3 y Francisco José Morales3
1Laboratorio de Virología Vegetal, Programa Nacional de Recursos Genéticos Vegetales y Biotecnología Agrícola, Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria (CORPOICA), A. A. 240142 Las Palmas, Bogotá, Colombia; 2Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de
Bioquímica y Nutrición, Cr. 7 No. 40-62, Bogotá, Colombia; 3Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Unidad de Virología, A. A.
6713, Cali, Colombia.
RESUMEN
Observaciones al microscopio electrónico de extractos de plantas de
pitahaya amarilla (Selenicereus megalanthus) afectada por un mosaico
tenue, procedentes del municipio de Arbeláez, Cundinamarca, revela-
ron la presencia de partículas flexuosas de aspecto viral de aproxima-
damente 476 x 10 nm. Mediante IC-RT-PCR, se amplificó un frag-
mento de cerca de 370 pares de bases con una homología del 94% con
el gen de la cubierta proteica del Virus X del cactus (CVX). Este es el
primer reporte del CVX en pitahaya en Colombia.
Palabras claves: Virus X del cactus (CVX)
SUMMARY
Yellow pitahaya (Selenicereus megalanthus) plants showing mosaic
symptoms, from the locality of Arbeláez, Cundinamarca, Colombia,
were shown by electron microscopy to contain viral-like filamentous
particles of ca. 476 x 10 nm. IC-RT-PCR amplified a fragment of ca.
370 base pairs, showing a 94% amino acid homology to the coat pro-
tein of Cactus virus X (CVX). This is the first report of CVX infecting
yellow pitahaya in Colombia.
Keywords: Cactus virus X (CVX)
INTRODUCCIÓN
La pitahaya amarilla (Selenicereus megalant-
hus) es una especie de la familia Cactaceae,
aparentemente originaria del norte de Sur
América (Rodríguez et al. 1993; Becerra,
1994). Colombia es el mayor productor de
esta fruta en América Latina, principalmente
los Departamentos de Valle, Cauca, Cundi-
namarca, Tolima, y Boyacá (Holmes et al,
1995), Becerra, 1994). En 1990 existían
aproximadamente 400 hectáreas de pitahaya
amarilla para consumo interno y exportación,
principalmente hacia el Japón (Zenner de
Polanía, 1990). Desafortunadamente este
mercado fue cerrado en 1989 debido a la
presencia de la mosca de la fruta (Vidal y
Abello, 1998). Actualmente existen en Co-
lombia 180 hectáreas cultivadas de pitahaya
amarilla, y se han reiniciado las exportaciones
colombianas de pitahaya hacia el Japón,
Europa y Estados Unidos (Agricultura y
Ganadería, 2001).
Recientemente se observaron plantas de
pitahaya amarilla con síntomas de mosaico
tenue, cerca de plantaciones de Musa sp.
donde se realizaba una prospección por la
presencia de enfermedades virales. Teniendo
en cuenta la importancia de la pitahaya amari-
lla en Colombia, se procedió entonces a
determinar el agente causal del mosaico de la
pitahaya amarilla y su posible relación con
los virus aislados de Musa spp. en Colombia.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento y mantenimiento. Durante 1997
se observó un cultivo de pitahaya amarilla
afectado por un mosaico tenue (Figura 1A) en
la localidad de Arbeláez, Cundinamarca.
Materiales propagativos de estas plantas se
mantuvieron en condiciones de invernadero
en CORPOICA-Tibaitatá y posteriormente en
el Centro Internacional de Agricultura Tropi-
cal (CIAT), ubicado en Palmira, Valle.
Microscopía electrónica.
Se utilizó la técnica de maceración de tejido
foliar y teñido negativo con acetato de urani-
lo, pH 4,0 al 2%, para su observación poste-
rior en un microscopio electrónico (Hitachi
12 HU). Para estudios citológicos se produje-
ron secciones de tejido del tallo de una planta
de pitahaya con síntomas de la enfermedad,
utilizando un ultramicrótomo (Sorvall MT
6000). Las secciones se observaron con un
microscopio electrónico (JEOL JEM-1010).
Síntesis y clonaje de ADN complementario
(ADNc).
Se utilizó una sección del tallo de pitahaya
con síntomas de mosaico como fuente de
material para el presente estudio. Para ampli-
ficar parte del gene de la cubierta proteica
(CP) y la región viral 3’ no codificante, cono-
cida en inglés como ‘untranslated region’
(UTR), se utilizó el método de immuno-
captura y transcripción reversa mediante la
reacción en cadena de la polymerasa (IC-RT-
PCR) según Sharman et al. (2000). La sínte-
sis del ADNc a partir del ARN viral se realizó
mediante el uso de 200 Unidades de trans-
criptasa reversa Super Script II (GIBCO,
BRL) en presencia de 10 pmoles del iniciador
degenerado Poty 1 (5´-GGATCCCGGGTTT
TTTTTTTTTTTTTTV-3´) para el extremo
poliadenilado de ARN, 30 pmoles del inicia-
dor degenerado DCCP (5’-TATGCNGCNTT
YGAYTTCTTRGAYG-3’),2mM de MgCl2,
0,2 mM de dNTPs (Invitrogen, CA,USA), y 1
Unidad de polimerasa Taq (Ampli Taq DNA
polymerase, Perkin Elmer). La PCR se reali-
zó en un termociclador PTC-100 TM Pro-
grammable Thermal Controller (MJ Re-
search, Inc.,USA), con el siguiente programa:
94 C/1 min; 94 C/20 s.; 56 C/1 min.;
72C/1 min; por 35 ciclos y un ciclo final de
72C/3 min.
El producto de la PCR se purificó usando
el Kit ‘Magic PCR System’ siguiendo las
instrucciones del productor (Promega, WI,
USA) y posteriormente fue clonado en la
cepa de DH5 de E. coli utilizando como
vector el plásmido pCR® 2.1 del Kit TA
Cloning (Invitrogen), según las instrucciones
del fabricante. Las colonias de E. coli fueron
establecidas en el medio selectivo LB-agar
con ampicilina, X-GAL, y el inductor IPTG
para seleccionar los clones recombinantes. El
ADN plasmídico se purificó usando el Kit
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 74
“WizardTM Plus Miniprep DNA Purification
Systems” (Promega) y se observo en un gel
de agarosa usando bromuro de etidio.
Análisis de secuencia. Se utilizó un se-
cuenciador automático ABI Prism 377 (Per-
kin-Elmer). Las reacciones de secuenciación
se hicieron con el juego de reacción de se-
cuencias con terminadores “Big-Dye” de ABI
prism y el iniciador M13. Las secuencias
obtenidas se analizaron utilizando el progra-
ma BLAST de la base de datos del GenBank.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Microscopía electrónica.
Los tallos sintomáticos de pitahaya contenían
partículas filamentosas con un diámetro de
aproximadamente 10 nm y una longitud de
476 nm (Figura 1 B). En las células infecta-
das se observaron haces de partículas fila-
mentosas en el citoplasma. La morfología y
citopatología (Figura 1C) de estas partículas
observadas son similares a las descritas para
especies del género Potexvirus (Francki et al.,
1985; Brunt et al, 1990).
Análisis moleculares.
Se amplificó un fragmento de ca. 370 pares
de bases, pb (Fig. 2). Tres clones obtenidos
de este fragmento se secuenciaron mediante
el iniciador M13. El fragmento secuenciado
tiene una homología del 94% con la proteína
de la cubierta del Virus X del cactus (CVX),
perteneciente al género de los Potexvirus
(GenBank AF308158).
Estos resultados demuestran que el CVX
se encuentra en Colombia infectando plantas
de pitahaya amarilla. Este virus se puede
diseminar mediante la propagación vegetati-
va, al sembrar estacas de pitahaya provenien-
tes de plantas infectadas, así como por con-
taminación mecánica. Como medida de con-
trol se recomienda utilizar material de siem-
bra certificado, libre del CVX.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue financiada en parte por
la Corporación Colombiana de Investigación
Agropecuaria (CORPOICA), el Centro Inter-
nacional de Agricultura Tropical (CIAT), por
el Fondo Nacional de Fomento Hortifrutícola
(ASHOFRUCOL) y por la Dra. Margarita
Perea (Universidad Nacional de Colombia).
Agradecemos al Sr R. Zerda (Fundación
Santa Fé de Bogotá) por su colaboración en
EM; Sra Clemencia de La Rotta (MIP,
CORPOICA) por las muestras de pitahaya
utilizadas en este estudio; y Sr. Antonio Rios
(Produmedios) por su colaboración en foto-
grafía.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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exportaciones colombianas de pitahaya.
En: Periódico del Sector Agropecuario.
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Becerra, L. A. 1994. El cultivo de la pitaya
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rio, Vol. XXIV, No.1, pp5-8.
Figura 1. A. Síntomas de mosaico sistémico en tallo de pitahaya amarilla procedente de la localidad de
Arbeláez,Cundinamarca. B. Partículas del Virus X del cactus (CVX) observadas en extractos de tallos de
pitahaya amarilla de Arbeláez, Cundinamarca. C. Citopatología de células infectadas por CVX. Inclusiones
fibrilares (V)
B C
V
V
V
A
1 2
Figura 2. Carril 1= Producto amplificado por IC-
RT-PCR, de una muestra de pitahaya infectada por
el Cactus virus X; carril 2= Marcador de peso
molecular 1 Kb DNA Ladder (GIBCO, BRL).
506
396
pb
1636
1018
2036
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
NUEVOS BROTES DE BEGOMOVIRUS EN COLOMBIA
Francisco J. Morales, Ana K. Martínez, y Ana C. Velasco
Unidad de Virología, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), A.A. 6713, Cali, Colombia;
Correo electrónico f.morales@cgiar.org
RESUMEN
Se han presentado brotes de enfermedades virales antes desconocidas
en habichuela y en tomate en varios municipios del Valle del Cauca.
Las habichuelas presentan un arrugamiento foliar severo y amarilla-
miento moderado, mientras que el tomate muestra síntomas moderados
de mosaico y deformación foliar. También se observó una nueva
enfermedad viral en tomate en el municipio de Fusagasugá, Cundina-
marca. Las plantas afectadas muestran un mosaico amarillo y defor-
mación foliar. Pruebas serológicas y de amplificación de ácidos nu-
cléicos revelaron la presencia de geminivirus transmitidos por la mos-
ca blanca Bemisia tabaci (begomovirus). Secuencias parciales de
clones seleccionados de los fragmentos amplificados por PCR, mostra-
ron la presencia de dos especies nuevas de begomovirus en habichuela
(Virus del arrugamiento foliar del frijol), y en tomate (Virus del mo-
saico suave del tomate) en el Valle del Cauca. Las secuencias obteni-
das de la muestra de tomate de Fusagasugá, demuestra que el begomo-
virus detectado es el Virus del mosaico amarillo del tomate, original-
mente descrito en Venezuela. En algunas de las muestras de tomate,
también se encontraron potyvirus y un cucumovirus. Se discute la
naturaleza de estos brotes de begomovirus y se hacen recomendacio-
nes para su control a corto y largo plazo.
Palabras claves: Geminivirus, leguminosas, habichuela, tomate,
hortalizas
SUMMARY
Previously unknown viral diseases have been observed in past months
in different regions of the Cauca Valley, Colombia, affecting snap
bean and tomato plantings, The affected snap bean plants show severe
leaf malformation (crumpling) and mild variegation. The diseased
tomato plants show moderate degrees of mosaic and leaf malfor-
mation. Some tomato samples were obtained in Fusagasuga, Cundi-
namarca, central Colombia. These samples showed foliar yellowing
and moderate leaf malformation. Serological tests and PCR amplifica-
tion of viral nucleic acids using begomovirus-specific primers, re-
vealed the presence of two new begomovirus species in snap bean
(Bean leaf crumple virus) and tomato (Tomato mild mosaic virus). The
tomato samples from central Colombia contained a known be-
gomovirus species (Tomato yellow mosaic virus) originally described
from Venezuela; and some samples also contained aphid-borne po-
tyviruses. The unexpected outbreak of these whitefly-borne be-
gomoviruses is discussed here with a view to adopting effective virus
control measures.
Keywords: Geminivirus, legumes, greenbeans, tomato, vegetables
INTRODUCCIÓN Es posible que los geminivirus transmitidos
por la mosca blanca Bemisia tabaci Genn.
(begomovirus) hayan existido en Colombia
por más de un siglo, pero es a partir de la
década de los 1970s cuando aparece un in-
forme (Galvez et al, 1975) sobre enfermeda-
des causadas por estos virus en una especie
cultivada (frijol común). Este informe coinci-
de con epidémias causadas por diversos
begomovirus en cultivos como algodón,
tomate y frijol en Brasil, Venezuela, México,
El Salvador, Cuba y Puerto Rico (Morales y
Anderson, 2001) para citar solo algunos de
los países más afectados por estas nuevas
plagas.
En las últimas décadas, los begomovirus
se han convertido en el principal problema de
producción de cultivos como el frijol, tomate,
pimentón, chile, tabaco y varias cucurbitá-
ceas, en agro-ecosistemas localizados entre el
nivel del mar y los 1.000 metros de altura
sobre el nivel del mar (msnm), especialmente
donde el clima es cálido y con períodos
secos definidos, lo cual favorece la reproduc-
ción de B. tabaci.
En Colombia, a pesar de que se han regis-
trado en años recientes brotes en cultivos
como melón y badea, en el norte del país
(Atlántico y Córdoba, respectivamente);
tabaco en Huila; y frijol y soya en el Valle del
Cauca (Morales et al, 2000), los begomovirus
no se han convertido en problemas endémicos
Esta situación podría explicarse por la locali-
zación geográfica ecuatorial y andina del
país, las cuales condicionan una adecuada
distribución de lluvias durante el año, y pisos
térmicos con temperaturas promedio inferio-
res a las requeridas por la mosca blanca B.
tabaci. Sin embargo, existen varias regiones,
como la Costa Atlántica, donde existen culti-
vos susceptibles (e.g., melón y tomate), tem-
peraturas cálidas, y períodos prolongados de
sequía, donde B. tabaci existe como plaga
pero no como vector de begomovirus.
En esta investigación informamos sobre
nuevos brotes de begomovirus en zonas
agrícolas andinas, y discutimos los factores
ambientales que podrían estar condicionando
el resurgimiento de estos virus en mayor
escala.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras procesadas en esta investigación
consistieron en plantas de diversas varieda-
des e híbridos de tomate (Lycopersicon escu-
lentum Mill.) afectadas por un mosaico y
deformación foliar moderados (Figura 1a)
procedentes de Buga, Guacarí, Robledo,
Roldanillo, Rozo, Toro, Tuluá y Vijes. Algu-
nas plantas con síntomas avanzados de la
enfermedad, presentaban amarillamiento
foliar. En el caso de la habichuela (Phaseolus
vulgaris L.), las muestras recolectadas en
diferentes lotes de los municipios de Bugala-
grande, Pradera, Rozo y Roldanillo, Valle del
Cauca, consistían en hojas con un arruga-
miento severo (Figura 1b) y variegación
moderada (Figura 1d).
Posteriormente llegó una muestra de to-
mate procedente de Fusagasugá, Cundina-
marca, con síntomas de mosaico amarillo y
deformación foliar (Figura 1c).
Las muestras de tomate y habichuela del
Valle del Cauca fueron recolectadas por el
Ing. Agrónomo José Miguel Pacheco, el
autor principal, y personal del laboratorio de
entomología de frijol del CIAT, coordinado
por el Dr. Cesar Cardona. Las muestras de
tomate de Fusagasugá fueron enviadas por el
Ing. Orlando Arguello. La incidencia de estas
enfermedades en el campo era superior al
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 1 76
80%.
Serología
Las muestras foliares se procesaron mediante
maceración en una solución salina de tampón
fosfato (PBS) según el método de ELISA por
captura de anticuerpo. Para este ensayo, se
seleccionó el anticuerpo monoclonal 3F7 de
amplio espectro, el cual detecta todos los
begomovirus originarios del Nuevo Mundo
(Cancino et al, 1995). También se usaron
anticuerpos monoclonales contra potyvirus
(AGDIA, Inc.USA) y cucumovirus (produci-
do en el CIAT) utilizando la técnica de
ELISA-indirecta (Voller et al, 1979). En el
caso de una muestra de tomate de Fusagasu-
gá, se realizó una prueba serológica a los
frutos. El lector de ELISA se calibró a una
densidad óptica (DO) de 405 nm.
Amplificación, clonación y secuenciación
parcial del AND viral
Para todas las muestras se hizo extracción del
ADN total según el método de Gilbertson et
al (1991). Para la amplificación por PCR de
secuencias seleccionadas del genoma de los
begomovirus, se utilizó el par de primers
PAR1C 715 y PAL1V 1978 (Rojas y Gilber-
tson, 1993), los cuales amplifican un frag-
mento de aproximadamente 1500 pb. La
mezcla de reacción para la amplificación se
hizo a un volumen final de 25 µL con las
Figura 1. Síntomas de begomovirus en tomate y habichuela , además de
otros disturbios en tomate:
a Síntomas de mosaico y deformación foliar moderados observados en una
planta de tomate procedente de Guacarí, Valle del Cauca.
b. Arrugamiento foliar severo en una planta de habichuela observada en el
municipio de Rozo, Valle del Cauca.
c. Amarillamiento y deformación foliar observados en una planta de tomate
procedente de Fusagasugá, Cundinamarca
d.Variegación moderada (derecha) observada en una planta de habichuela
observada en el municipio de Rozo, Valle del Cauca. Arrugamiento foliar
severo ( Izquierda)
e. Maduración irregular del tomate (‘arco iris’) causada por la alimentación
de la mosca blanca Bemisia tabaci, biotipo B.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 1 77
siguientes concentraciones finales de los
reactivos: Tampón 1X, MgCl2 1,5 mM,
dNTPs (total) 0,2 mM, cebadores 0,2 µM, 0,2
µL de taq polimerasa y 5µL de ADN concen-
trado. Para todas las pruebas de amplificación
se incluyó un control positivo de begomovi-
rus y un control negativo donde el ADN era
reemplazado por agua estéril.
El programa de amplificación consiste de
un ciclo inicial de denaturación a 94 C por 1
min, 29 ciclos de “annealing” a 52 C por
1:30 min, extensión a 72 C por 1 min, dena-
turación a 94 C por 30 s, “annealing” a 52
C por 1 min y extensión a 72 C por 1min.; y
finalmente una extensión de 5 min a 72 C.
Los fragmentos amplificados del ADN
viral se clonaron utilizando el Kit de “T.A.
Cloning de Invitrogen”. Se utilizó para cada
reacción 1µL de una solución tampón, el
Vector 2µL, T4 DNA ligasa y se variaron las
cantidades de ADN y agua estéril según la
concentración del fragmento amplificado.
Previo montaje de la ligación, el producto de
amplificación se purificó con el Kit Wizard
PCR preps (Promega). La ligación se hizo a
14 C durante toda la noche y se almacenó a -
20 C hasta el momento de la transformación.
La transformación se hizo por choque térmico
con células competentes DH5, elaboradas
en el laboratorio. En este proceso, las células
se incubaron inicialmente en hielo por 30 min
y luego 45 s en un baño María a 42 C. Pasa-
do este proceso, las células transformadas son
recuperadas adicionándoles medio SOC y
agitando a 37 C por una hora.
Posteriormente las células son plateadas
en cajas con medio selectivo de LB agar más
ampicilina, X-gal e IPTG. Las cajas selladas
se incubaron durante toda la noche a 37 C.
Las colonias blancas resultantes fueron
evaluadas por PCR para determinar si estas
contenían el inserto del tamaño esperado. La
amplificación se hizo según las siguientes
condiciones para un volumen final de 50 µL:
tampón 1X, MgCl2 1,5mM, dNTPs (total)
0,05 µM, primers M13 y T7 0,1µM, taq
polimerasa 0,2µM y agua bidestilada estéril.
El programa de amplificación consta de los
siguientes ciclos: denaturación inicial a 94 C
por 3 min; denaturación a 94 C 30 s, “annea-
ling” a 55 C 30 s, extensión a 72 C 2 min,
29 veces; extensión final a 72 C por 5 min.
Las colonias que tenían el inserto del tamaño
esperado, se pusieron a crecer a 37 C toda la
noche en medio LB líquido con ampicilina
para posteriormente poder purificar el ADN
plasmídico con la ayuda del Kit Wizard plus
Minipreps (Promega). Los plásmidos obteni-
dos fueron secuenciados automáticamente
primero con uno de los dos primers M13 o T7
para comprobar si los clones obtenidos eran
reales. La autenticidad del clon se verifica,
una vez editada la secuencia con el programa
SEQUENCHER 4.0, comparado, por medio
del algoritmo de BLAST, la secuencia obte-
nida con las secuencias ya introducidas en el
banco de genes. Los clones que resultaron
reales se secuenciaron con el primer comple-
mentario correspondiente.
RESULTADOS
Las muestras de tomate procedentes de los
municipios de Buga, Guacarí, Roldanillo,
Rozo y Vijes en el Valle del Cauca, reaccio-
naron positivamente (DO405nm 0,11-0,56)
en pruebas de ELISA con el monoclonal de
amplio espectro para detectar begomovirus.
Los valores para el control negativo (tomate
libre de virus) variaron entre DO405nm de
0,004 a 0,01.
Las muestras de tomate procedentes de
Fusagasugá, Cundinamarca, también reac-
cionaron positivamente al mismo antisuero
(DO405nm 0,12-0,56). Algunas de las mues-
tras de tomate de Roldanillo y Rozo, reaccio-
naron positivamente (DO405nm 0,16-2,68)
con el monoclonal para potyvirus. El control
negativo tuvo una lectura DO405nm de 0,02.
Las muestras de tomate de Fusagasugá reac-
cionaron fuertemente al monoclonal de
potyvirus (DO405nm >2,0). El control nega-
tivo mostró una lectura DO405nm de 0,01.
En la muestra de esta localidad donde se
examinaron frutos de tomate, las lecturas
DO405 nm para potyvirus fueron positivas (>
3,0), pero negativas para begomovirus a pesar
de que los frutos pertenecían a una planta
sero-positiva por los dos tipos de virus. Solo
una muestra de tomate procedente de Vijes
(Valle), resultó positiva (DO405nm 0,3) para
cucumovirus (el control negativo presentó
una DO405nm de 0,02).
En el caso de habichuela, las muestras de
Pradera, Roldanillo y Rozo (Valle) reacciona-
ron positivamente (DO405nm 0,28-0,74) con
el antisuero monoclonal para begomovirus.
Ninguna de las muestras de habichuela reac-
cionó en estos ensayos contra los antisueros
para potyvirus o cucumovirus.
Las pruebas de PCR para begomovirus
resultaron en la amplificación de un fragmen-
to esperado de aproximadamente 1500 pb
(Figura 2), tanto para las muestras sero-
positivas de tomate como de habichuela. La
secuenciación de un clon de 550 bases obte-
nido del fragmento amplificado de una mues-
tra de tomate enfermo procedente de Guacarí,
Valle, demostró una identidad a nivel de
nucleótidos del 85% con el gen de la proteína
putativa de la replicasa (AL1) del Virus del
mosaico enano del frijol (BDMV). El porcen-
taje de identidad a nivel de aminoácidos
subió a 87% para la misma región del virus
de tomate y del BDMV. En el caso de la
muestra de tomate procedente de Fusagasugá,
se secuenció un clon de 500 bases, el cual
mostró una identidad en la secuencia de
nucleótidos del 91% con parte del gen de la
cápside del Virus del mosaico amarillo del
tomate (ToYMV). La identidad a nivel de
aminoácidos aumentó a 95% para este clon en
relación al ToYMV.
La secuenciación de un clon de 627 bases
obtenido del fragmento amplificado para el
begomovirus detectado en una muestra de
habichuela procedente de Rozo, Valle, mostró
una identidad a nivel de nucleótidos del 85%
con la cápside del Virus del mosaico dorado
amarillo del frijol (BGYMV). Este porcentaje
de identidad descendió al 71% cuando la
comparación con el BGYMV se hizo a nivel
de aminoácidos.
DISCUSIÓN
Esta investigación demuestra que los bego-
movirus pueden cobrar una mayor importan-
cia socioeconómica en Colombia. Los brotes
descritos aquí ocurren a menos de tres años
de aparecer un informe preliminar sobre la
diseminación de estos patógenos en diferen-
tes departamentos del país (Morales et al,
2000). La alta incidencia de estos virus en las
plantaciones de tomate y habichuela visitadas
en el Valle del Cauca, pone de manifiesto el
gran potencial epidemiológico que estos virus
han demostrado poseer en otras regiones
tropicales y subtropicales del mundo. La
ocurrencia de epidemias de begomovirus en
el Valle del Cauca está estrechamente rela-
cionada con la aparición del biotipo B de B.
tabaci en esta región a finales de la década de
los 1990s (Quintero et al, 1998). Este biotipo
es más agresivo que el biotipo original, en
términos del número de especies vegetales
atacadas y su mayor capacidad reproductiva y
de daño directo (Perring, 1995).
Adicionalmente, se viene presentando en
los últimos años en el Valle del Cauca y otras
regiones agrícolas del país, incluyendo Fusa-
gasugá, una tendencia al incremento de los
períodos de sequía, acompañados por mayo-
res temperaturas diurnas. Estos factores cli-
2036
Figura 2. Gel de agarosa 1,2 % mostrando ampli-
ficación para Geminivirus con primers específicos
PAR1C715 y PAL1V1978. a. Marcador de peso
1Kb1Kb ADN Ladder ( GIBCO, BRL). b. Tomate
empire. c. Habichuela d. Control positivo (Alysi-
carpus rugosus) y e. Control de reacción. Los
fragmentos amplificados por PCR tienen un
tamaño aproximado de 1500 pb en tomate y
habichuela
a b c d e
pb
1018
506
1636
3054
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 1 78
máticos son importantes debido a que favore-
cen la reproducción de la mosca blanca B.
tabaci.
En condiciones climáticas normales, en el
Valle del Cauca y Fusagasugá (>1000
msnm), predomina la especie de mosca blan-
ca Trialeurodes vaporariorum (Quintero et
al, 2001), la cual no transmite begomovirus.
Evidencia directa de la presencia del biotipo
B de B. tabaci en el Valle del Cauca, es el
daño fisiológico conocido vulgarmente como
‘arco iris’ (maduración irregular) del tomate,
el cual va en incremento desde hace un año
en este valle (Figura 1e). Este daño al fruto
del tomate es causado por la alimentación del
biotipo B de B. tabaci en tomate (Maynard y
Cantliffe, 1989) y no por efecto de virus
transmitidos por mosca blanca.
Los ataques del biotipo B en el Valle del
Cauca, también se han manifestado en el
cultivo de la habichuela en años recientes.
Estos nuevos problemas han obligado a los
agricultores a usar más pesticidas para prote-
ger los cultivos susceptibles. Desafortunada-
mente, el uso intensivo de insecticidas es otro
de los factores que más agrava el problema de
mosca blanca, ya que elimina el control bio-
lógico natural y crea rápidamente resistencia
a los agroquímicos en la mosca blanca
(Prabhaker et al, 1985).
El frijol común, ya sea para consumo
como grano seco o habichuela, es muy sus-
ceptible a virus transmitidos por mosca blan-
ca (Morales y Anderson, 2001). En Colombia
y específicamente en el Valle del Cauca, se
conocía ya la presencia de los begomovirus
del mosaico enano (BDMV) y del mosaico
dorado amarillo (BGYMV) del frijol (Mora-
les et al, 1990; Morales et al, 2000). Sin
embargo, se encontró aquí un begomovirus
relacionado al BDMV infectando tomate, lo
cual no es del todo sorprendente, ya que el
BDMV proviene de malezas (malváceas)
hospederas de varios begomovirus pertene-
cientes al grupo del Virus del mosaico del
abutilón (AbMV), capaces de infectar diver-
sas especies vegetales. De hecho, el BDMV
es estrechamente relacionado a un begomovi-
rus que ataca el tomate en la Florida, Estados
Unidos: el Virus del moteado del tomate
(Gilbertson et al, 1993). Otros begomovirus
del tomate relacionados al BDMV, son el
Virus del tomate de la Habana, descrito en
Cuba (Martínez et al, 1998) y el Virus del
achinamiento del tomate (TLCrV) de México
(Brown et al, 2000). Sin embargo, la secuen-
cia parcial obtenida en esta investigación
sugiere que el begomovirus encontrado en el
Valle del Cauca es una nueva especie, a la
que tentativamente damos el nombre de Virus
del mosaico suave del tomate (Tomato mild
mosaic virus). Este es el primer begomovirus
descrito en tomate en Colombia.
Por el contrario, el begomovirus encon-
trado en Fusagasugá, Cundinamarca, es una
especie conocida, originalmente descrita en
Venezuela (Debrot et al, 1963). Este virus ha
sido ampliamente diseminado en la región del
Caribe, posiblemente, mediante el tráfico de
material vegetativo infectado. La presencia de
este virus en Fusagasugá sugiere también que
ha ocurrido tráfico de plántulas de tomate
infectadas entre Venezuela y Colombia. Lo
que es más sorprendente, es que este virus se
haya diseminado en el municipio de Fusa-
gasugá, dado que las condiciones climáticas
allí, son más propicias para Trialeurodes
vaporariorum que para B. tabaci. Según
informes del IDEAM (www.ideam.gov.co),
el municipio de Fusagasugá ha sufrido condi-
ciones de sequía desde finales del año pasado,
lo que explicaría la mayor presencia de B.
tabaci en esa región del país. Los potyvirus
encontrados en las muestras de tomate proce-
dentes de Fusagasugá, sugieren que las con-
diciones secas han favorecido también el
desarrollo de poblaciones de áfidos vectores
de estos virus.
El begomovirus aislado de habichuela en
el Valle del Cauca está relacionado estrecha-
mente con el Virus del mosaico dorado ama-
rillo del frijol (BGYMV), pero parece ser una
nueva especie. Estos dos virus también se
diferencian por los síntomas que causan en
frijol. Como su nombre lo indica, el BGYMV
induce generalmente un amarillamiento nota-
ble en las hojas de las plantas de frijol, mien-
tras que el nuevo begomovirus descrito aqui
induce un arrugamiento foliar severo, con
poco amarillamiento. Mientras se caracteriza
este virus más a fondo, lo llamaremos tentati-
vamente el Virus del arrugamiento foliar del
frijol (Bean leaf crumple virus).
La emergencia de begomovirus capaces de
infectar tomate en Colombia es de gran im-
portancia económica, dado el gran potencial
patogénico de estos virus y la falta de varie-
dades o híbridos resistentes en la América
Latina. La única esperanza para su manejo a
mediano plazo, es que las condiciones climá-
ticas se normalicen y las poblaciones de B.
tabaci en el Valle y Cundinamarca vuelvan a
los niveles bajos que tenían. De persistir esta
plaga, se deben proteger los semilleros de
tomate con malla contra la mosca blanca, así
como el cultivo hasta la etapa de formación
de frutos mediante el uso de insecticidas
sistémicos aprobados para este cultivo. El uso
de insecticidas de contacto cuando se observa
la mosca blanca en el tomate, no contribuye
al control de virus transmitidos por mosca
blanca.
A pesar de que existen fuentes de resis-
tencia a begomovirus en frijol común, estas
no han sido suficientemente usadas para
mejorar variedades de habichuela como la
que los productores del Valle están cultivan-
do actualmente. Se requiere entonces iniciar
un programa de mejoramiento genético rápi-
damente. A corto plazo, el uso de insecticidas
sistémicos al momento de la siembra, y evitar
sembrar en meses secos, ayudaría a reducir la
incidencia y daño causado por estos virus en
habichuela.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo financiero del
Departamento para el Desarrollo Internacio-
nal del Reino Unido (DFID) en esta investi-
gación que hace parte del Proyecto Tropical
de Mosca Blanca.
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2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 1 80
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
ENFERMEDADES VIRALES DE LA PALMA DE ACEITE EN EL SUROCCIDENTE
COLOMBIANO Y SUS AGENTES CAUSALES
Francisco J. Morales, Iván Lozano, José A. Arroyave, Mauricio Castaño, Raúl Sedano y Ana C. Velasco
Unidad de Virología, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), A.A. 6713, Cali, Colombia;
Correo electrónico: f.morales@cgiar.org
RESUMEN
En 1998 se inició una investigación para determinar la etiología de
dos enfermedades de aparente naturaleza viral, que afectan el cultivo
de la palma africana de aceite en el suroccidente colombiano. La pre-
sencia de la ‘mancha anular’ se registró por primera vez en 1985, en el
municipio de Tumaco, Nariño. Esta enfermedad afecta palmas jóve-
nes en los primeros 1-3 años de vida. Las plantas afectadas mueren
rápidamente debido a una necrosis sistémica. Esta enfermedad se
asoció consistentemente a la presencia de un virus filamentoso de
aproximadamente 800 nm de longitud y 15 nm de diámetro, con un
genoma sencillo compuesto por una molécula de ARN de aproxima-
damente 8.000 nucleótidos. La caracterización molecular parcial del
virus mostró identidades del 51-67% en la secuencia de aminoácidos
con respecto al ORF 1 de dos especies tentativas del género Foveavi-
rus: el Cherry green ringspot mottle virus y el Cherry necrotic rusty
mottle virus. También se observaron identidades de secuencia de
aminoácidos del 40-62% para la misma región, entre el virus de la
palma africana de aceite y los foveavirus Apple stem pitting virus y
Rupestris stem pitting-associated virus. La segunda enfermedad viral,
el ‘anillo clorótico’, no es letal, pero las plantas sintomáticas son
destruidas por los agricultores. Esta enfermedad se observó en 1996 en
el municipio de Tumaco, afectando también palmas jóvenes. El ‘anillo
clorótico’ es causado por un virus filamentoso de aproximadamente
750 nm de longitud y 15 nm de diámetro, el cual induce inclusiones
cilíndricas en el citoplasma de las células infectadas. El virus se
transmitió mecánicamente a especies de gramíneas (maíz, caña de
azúcar, sorgo y braquiaria). Secuencias parciales del genoma viral
demostraron homologías del 90.8-95% con cepas del Sugarcane mo-
saic virus. Se discuten aquí algunas estrategias de control.
Palabras claves: Elaeis guineensis, Virus del mosaico de la
caña de azúcar, foveavirus
ABSTRACT
An investigation was initiated in 1998, to elucidate the etiology of two
diseases of apparent viral nature in the southwestern African oil palm
production region of Colombia. The ‘ring spot’ disease was first ob-
served in 1985, in the municipality of Tumaco, Nariño, causing a
lethal disease of young (1-3 year-old) palms. Electron microscopy of
diseased foliar tissue extracts revealed the presence of filamentous
virus-like particles, ca. 800 nm in length. Double-stranded RNA ex-
tractions made from diseased palms, led to the cloning and partial
sequencing of viral genome fragments showing amino acid sequence
identities of 51-67% with the corresponding genes of the tentative
foveavirus species Cherry green ringspot mottle virus and Cherry
necrotic rusty mottle virus. Lower but consistent amino acid sequence
identities (40-62%) were observed in comparisons with two recog-
nized foveaviruses: Apple stem pitting virus and Rupestris stem pit-
ting-associated virus. The second disease, ‘chlorotic ring’, was first
observed in 1996, also affecting young African oil palms in Tumaco.
This disease is not lethal, but growers eliminate affected palms any-
way. The disease is caused by a different filamentous virus ca. 750 nm
in length. The virus was characterized as a species of the genus Po-
tyvirus, namely a strain of Sugarcane mosaic virus. Possible virus
transmission mechanisms and disease management practices are dis-
cussed here.
Key words: Elaeis guineensis, Sugarcane mosaic virus, foveavirus
INTRODUCCIÓN
Colombia es el principal productor de palma
de aceite africana (Elaeis guineensis Jacq.) en
las Américas, con un área estimada en 1999
de 150.399 hectáreas distribuidas en diferen-
tes zonas del país (Fedepalma, 2000). En la
zona occidental se cultivan unas 20,970
hectáreas de palma dentro del municipio de
Tumaco, Nariño. Este municipio es importan-
te no solo por contribuir un 14,0% de la
producción total nacional de aceite de palma
crudo, sino también desde el punto de vista
socio-económico, ya que en el se encuentra la
mayor concentración (85%) de pequeños
productores de palma de aceite en el país.
Uno de los principales retos de los palmi-
cultores colombianos han sido el de aumentar
la productividad del cultivo y reducir los
costos de producción, con el fin de competir
favorablemente en el mercado interno y
externo. Entre los factores que más han inci-
dido negativamente en la productividad del
cultivo, están la incidencia de plagas y en-
fermedades. En el caso específico de la zona
suroccidental, existen enfermedades descono-
cidas en otras zonas productoras de palma de
aceite del país. En 1985, se registró la enfer-
medad conocida como ‘mancha anular’ en el
municipio de Tumaco (Jiménez y Peña,
1988). Esta enfermedad se observó por pri-
mera vez en 1969 (Arévalo, 1988; Renard y
Quillet, 1984), en la región amazónica (Toca-
che) del Perú. En 1974, la enfermedad se
detectó en la región noroccidental del Ecua-
dor, donde se le llamó ‘amarillamiento letal’
y ‘moteado del cogollo’ (Dzido et al, 1978;
Chávez, 1988). Las pérdidas de palmas jóve-
nes en el Ecuador alcanzaron niveles de
incidencia superiores a los 90% en algunas
plantaciones. En Tumaco, la ‘mancha anular
apareció hacia 1988 (Jiménez, 1988). La
incidencia de la ‘mancha anular’ ha fluctuado
entre el 2 y 45%, pero en los últimos años
han ocurrido brotes de mayor gravedad en
algunas plantaciones (Morales, 1998). Por lo
general, la ‘mancha anular’ es una enferme-
dad letal que afecta palmas jóvenes en etapa
de vivero y en los dos primeros años después
de la siembra definitiva en plantaciones co-
merciales.
Los síntomas iniciales de la enfermedad
se manifiestan como una clorosis y amarilla-
miento de las hojas más jóvenes de la planta
(Figura 1a), algunas de las cuales presentan
un moteado en los folíolos y en la base del
raquis (Figura 1b). La hoja flecha puede o no
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 82
presentar necrosis sistémica (Figura 1c). La
muerte de las palmas afectadas ocurre por la
necrosis del meristemo o punto de crecimien-
to. Al cortar el estípite longitudinalmente, se
observa la necrosis violácea del sistema
vascular (Figura 1d).
En 1995, se observó una enfermedad
diferente a la ‘mancha anular’ en viveros de
palma de aceite en el occidente del Ecuador, a
la cual se denominó ‘anillo clorótico’ (Chin-
chilla et al., 1995; Rivera et al., 1996). En
1996, se observó una enfermedad similar en
el municipio de Tumaco (Morales, 1999). El
síntoma más característico del “anillo cloróti-
co”, es la presencia de anillos en las hojas de
palmas jóvenes (Figura 1e), así como diver-
sos tipos de variegación en las hojas de las
palmas afectadas (Figura 1 f, g) y en la parte
inferior del raquis (menos frecuente que en el
caso de la ‘mancha anular’). A diferencia de
la ‘mancha anular’, el ‘anillo clorótico’ no
mata las palmas de aceite afectadas, pero los
agricultores eliminan las palmas enfermas
como una medida sanitaria.
El objetivo de estas investigaciones fue el
de identificar los agentes causales de estas
enfermedades de la palma de aceite en el
municipio de Tumaco, con el fin de diseñar
medidas de control y así evitar mayores
pérdidas de producción y su diseminación a
otras zonas productoras de aceite de palma en
el país.
MATERIALES Y MÉTODOS
Las muestras fueron recolectadas en el muni-
cipio de Tumaco por el autor principal o por
personal del Centro Colombiano de Investi-
gación de Palma de Aceite (CENIPALMA) y
de algunas plantaciones comerciales. La
mayor parte del tejido afectado y sano utili-
zado provino de hojas flecha de palmas de
aceite africanas de uno a dos años de edad.
Los tallos de todas las palmas afectadas por
‘mancha anular’, seleccionadas para esta
investigación, se cortaron en secciones para
confirmar la presencia de la necrosis violácea
asociada con esta enfermedad. El tejido
seleccionado se procesó fresco o fue conser-
vado a – 80°C hasta el momento de utilizarse.
Se analizó también una muestra foliar obteni-
da de una palma silvestre del género Bactris
(tentativamente identificada como B. setulo-
sa) que presentaba síntomas de amarillamien-
to foliar similares a los descritos para la
‘mancha anular’ de la palma de aceite africa-
na. Asimismo se incluyeron en todas las
pruebas muestras de palmas de aceite africa-
nas libres de síntomas.
Pruebas de patogenicidad
Las inoculaciones mecánicas se hicieron
utilizando extractos obtenidos de tejido de
hoja flecha afectada por mancha anular,
diluido 1:4 ó 1:10 (peso/volumen) en agua
destilada estéril o tampón preparado a una
concentración de 0,5 ó 0,1 M de fosfato de
potasio, pH 7,5, con 0,5 g de sulfito de sodio
y 1 mM dietil-ditiocarbamato de sodio
(DIECA).
Las siguientes especies y variedades: Che-
nopodium album, C. amaranticolor, C. qui-
noa, C. murale, Elaeis guineensis, Nicotiana
benthamiana, N. tabacum cv ‘Samsum,
Sorghum bicolor cv’. Rio, y Zea mays, se
inocularon en el caso de la ‘mancha anular’.
El rango de hospederos del agente causal del
‘anillo clorótico’ se estableció usando las
siguientes especies y variedades: Avena
sativa cv. Clintland, Brachiaria brizantha
CIAT 26646, Chenopodium amaranticolor,
C. murale, C. quinoa, Cucumis sativus, Datu-
ra stramonium, Elaeis guineensis, Glycine
max cv. Mandarin y Clark, Nicotiana bent-
hamiana, N. tabacum cv. Samsun, Panicum
maximum CIAT 673, 6172 y 6299, Sorghum
bicolor cvs Atlas, Rio, Texas 2786 y Trudex,
Phaseolus vulgaris cv. Bountiful, Sacharum
officinarum CP-57-603, S. halepense, Vigna
unguiculata cv. Blackeye, y Zea mays cv.
Sikuanis. En todas las pruebas se inoculó un
promedio de cinco plantas por especie o
variedad.
Microscopía electrónica
Para la observación directa de muestras en un
microscopio de transmisión JEOL JEM-1010,
extractos de tejido de palmas de aceite enfer-
mas y sanas se tiñeron negativamente en
acetato de uranilo al 2%, pH 3,7. Para los
estudios de citopatología, se seleccionó tejido
foliar de palmas de aceite enfermas y sanas y
se procedió según la técnica descrita ante-
riormente (Morales et al., 1990). Los cortes
ultra-finos se obtuvieron con una cuchilla de
diamante empleando un ultra-microtomo MT
6000 Sorval.
Electroforesis
Se extrajeron ARNs de doble cadena (dc) de
plantas de palma de aceite sanas y afectadas
por la ‘mancha anular’ y el ‘anillo clorótico’,
de acuerdo al procedimiento de Dodds y Bar-
Joseph (1993). Se estimaron los pesos apro-
ximados del ARNdc usando un patrón de
ADN (1 Kb) (Gibco BRL). La muestra de
Bactris sp. se procesó siguiendo el mismo
procedimiento.
Extracción de ácidos nucléicos, síntesis de
ADNc, clonación y secuenciación
Las técnicas de extracción, síntesis de ADN
complementario y clonación utilizadas en
estas investigaciones, han sido publicadas en
detalle (Morales et al., 2002 a, b). La secuen-
ciación se llevó a cabo con un secuenciador
automático de ADN ABI PRISM 377 (Perkin
Elmer). Las secuencias obtenidas se analiza-
ron empleando el programa BLAST del
Centro Nacional de Información, Instituto
Nacional de Salud, Bethesda, MD, USA).
RESULTADOS
La observación directa al microscopio elec-
trónico de extractos foliares de palmas afec-
tadas por ‘mancha anular’, reveló consisten-
temente (aunque en baja concentración) la
presencia de partículas filamentosas de apro-
ximadamente 800 nm de longitud y 15 nm de
diámetro (Figure 2a). Partículas similares de
aproximadamente 750 nm de longitud y 15
nm de diámetro, se observaron en todas las
muestras foliares tomadas de palmas jóvenes
afectadas por ‘anillo clorótico’ (Figure 2b).
También se observaron partículas filamento-
sas (v) dispersas en el citoplasma de células
de hoja de palmas de aceite afectadas por
‘mancha anular’ (Figura 2c). La citopatología
practicada a las plantas afectadas por ‘anillo
clorótico’, reveló la presencia de ‘agregados
laminares’ (al), a menudo asociados a partícu-
las (v) virales (Figure 2d), característicos de
especies de potyvirus, sub-división II (pre-
sencia de inclusiones cilíndricas y agregados
laminares). No se observaron partículas fila-
mentosas en extractos de tejido o secciones
de tejido de varias palmas de aceite africanas
asintomáticas, utilizadas como controles
libres de virus.
Ninguna de las especies vegetales inocu-
ladas mecánicamente con extractos de palmas
afectadas por ‘mancha anular’, desarrolló
síntomas o mostró al microscopio electrónico
la presencia de partículas similares a virus.
Las plantas de palma de aceite inoculadas se
mantuvieron bajo observación durante un
año, pero ninguna de las 10 plántulas inocu-
ladas por métodos estándar o inyección,
expresó síntomas.
De los 24 genotipos inoculados con extrac-
tos de palmas afectadas por ‘anillo clorótico’,
solo cuatro especies de gramíneas: B. bri-
zantha (braquiaria), S. officinarum (caña de
azúcar), S. bicolor (sorgo) cvs. Rio y Trudex,
y Z. mays (maíz), desarrollaron síntomas de
mosaico y mostraron partículas virales en
exámenes de microscopía electrónica. Even-
tualmente se logró transmitir el virus de sorgo
a palma de aceite africana, por medios mecá-
nicos.
La extracción y electroforesis del RNAcd
de palmas de aceite africanas afectadas por la
‘mancha anular’ reveló la presencia de una
banda predominante (Figura 3) de aproxima-
damente 8.034 pares de bases (pb), y ocasio-
nalmente dos bandas menores de aproxima-
damente 7.171 y 5.854 pb, probablemente
sub-productos de la molécula predominante.
La muestra de hoja de la palma sintomática
de Bactris sp. produjo un patrón de banda
similar, con una especie de ARN predomi-
nante de aproximadamente 8.135 pb.
En el caso del anillo clorótico, solo se ob-
servó una banda de aproximadamente 10.000
pb (Figura 3). Extractos de tejido de palma
afectada por ‘anillo clorótico’ reaccionaron
en pruebas serológicas (ELISA) con el mono-
clonal comercial específico para detectar
potyvirus.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 83
Figura 1. Síntomas de enfermedades virales en palma de aceite africana:
“Mancha anular”
a. Clorosis y amarillamiento en hoja joven.
b. Variegación en los folíolos y base del raquis de hojas jóvenes
c. Pudrición de la hoja flecha .
d. Necrosis violácea en el interior del estípite de palmas jóvenes con síntomas
avanzados
““Anillo clorótico”
e. Síntomas foliares característicos, nótese la presencia de anillos cloróticos
f. Rayado
g. Manchas aceitosas asociadas
a b
c d
e f
g
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 84
En el caso de la ‘mancha anular’, se se-
cuenciaron veinticinco clones, lo cual produjo
dos conjuntos de secuencias solapadas de un
solo clon. El primer conjunto de 15 clones
produjo una secuencia continua de 3.491 pb.
Este fragmento tenía una identidad de se-
cuencia de aminoácidos (aa) del 51% con la
correspondiente al ORF 1 próximo del extre-
mo 5’ del Cherry green ringspot mottle virus
(CGRMV) y Cherry necrotic rusty mottle
virus (CNRMV). El CGRMV es una especie
tentativa del género Foveavirus (Regenmortel
et al., 2000) y el CNRMV está estrechamente
relacionado con el CGRMV (Rott y Jelk-
mann, 2001). La similitud de secuencia de aa
para esta región ORF 1 del virus de la palma
de aceite africana fue del 70 y 69% compara-
da con el CGRMV y el CNRMV, respecti-
vamente. Similitudes del 62 y 61% se obtu-
vieron en comparaciones con las secuencias-
de aa correspondientes a la ORF 1 próxima
del Apple stem pitting virus (ASPV) y el
Rupestris stem pitting associated virus
(RSPaV), las dos especies reconocidas del
actual género Foveavirus (Regenmortel et al,
2000). El segundo conjunto de nueve clones
solapados con una secuencia continua de
1.667 pb mostró identidades de secuencia de
aa de 67% con la región ORF 1 3’ terminal
del CGRMV y CNRMV. La similitud de
secuencia de aa para esta región fue del 78%
con estos dos foveavirus tentativos.
Dos de los sub-clones obtenidos de palmas
afectadas por ‘anillo clorótico’, correspondían
a fragmentos de la proteína de la inclusión
nuclear (NIb) del genoma de los potyvirus.
Un análisis comparativo de la secuencia de aa
de estos fragmentos revelaron homologías del
77% y 70% con regiones correspondientes
del Virus del mosaico de la caña de azúcar
(SCMV) cepas A (GenBank Acc.U84579) y
Bulgaria (GenBank Acc. AJ001691), respec-
tivamente. La alineación óptima de 232 nu-
cleótidos pertenecientes a la región no tradu-
cida del extremo 3’ (UTR), mostró una ho-
mología del 90% a nivel de nucleótidos, con
la cepa MDB del SCMV (GenBank Acc.
D00949). La secuencia parcial de un pequeño
fragmento de 44 nucleótidos perteneciente a
la cápside del virus, mostró homologías
mayores del 95% con el SCMV-MDB y
otras cepas del SCMV.
Figura 2 Partículas virales y cortes ultrafinos de tejidos de palma de aceite africana: a. Partículas filamentosas características de los virus de la ‘mancha anu-
lar’(barra c.a. 100 nm). b. Partículas filamentosas características de los virus del ‘anillo clorótico’(barra c.a. 100 nm). c. Partículas filamentosas (v) observadas en el
citoplasma de células de hoja de palma de aceite africana afectada por ‘mancha anular’(barra c.a. 150 nm). d. Agregados laminares (al) y partículas virales (v) en el
citoplasma de células foliares de palma de aceite africana infectada por el potyvirus causal del ‘anillo clorótico (barra c.a. 500 nm’).
a b
c d
al
v
v
v
Figura 3. Patrones electroforéticos de ARN de
doble cadena de extractos de palma de aceite
africana y marcadores 1Kb ADN Ladder ( GIBCO,
BRL). a,b,f marcadores. c. Hoja flecha de planta
sana. d. Extracto de hoja flecha afectada por ‘anillo
clorótico’(banda de 10.000pb, triángulo) e. Extrac-
to de hoja flecha afectada por ‘mancha anular’.
a e f d c b
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 85
DISCUSIÓN
Se demostró en esta investigación que la
‘mancha anular’ de la palma de aceite africa-
na en Colombia está asociada con un virus
filamentoso relacionado con especies recono-
cidas y tentativas del género Foveavirus
(Zhang et al., 1998; Regenmortel y colabora-
dores, 2000; Rott y Jelkmann, 2001). Sin
embargo, es posible que este género de virus
pueda ser reorganizado taxonómicamente en
un futuro próximo, debido a las evidentes
diferencias genéticas que existen entre las
diversas especies de virus que lo integran
están asociadas a este género actualmente.
Una característica importante del virus de la
palma de aceite africana, denominado en lo
sucesivo Virus de la mancha anular de la
palma de aceite africana (AOPRV), es su
rápida diseminación durante ciertos años y
épocas del año. Este patrón epidemiológico
es interesante, considerando que los foveavi-
rus no tienen vectores biológicos conocidos
(Regenmortel et al, 2000) y la palma de aceite
africana no requiere tratamientos culturales
de ninguna clase, tales como injertos o podas,
durante los primeros tres años de edad. Ba-
sados en la observación que la enfermedad de
la mancha anular de la palma de aceite afri-
cana se difunde más rápidamente durante
épocas de precipitación relativamente baja,
no puede descartarse en este momento la
posible existencia de un vector artrópodo.
También se debe tener en cuenta la posibili-
dad de que otros géneros de palmas nativos
actúen como reservorios del virus. En todo
caso, se recomienda no efectuar ningún tipo
de poda en palmas jóvenes menores de tres
años, y no hacer aplicaciones de insecticidas
en las plantaciones establecidas. Como medi-
da preventiva, se puede proteger las plántulas
durante el primer año con un insecticida
sistémico.
En relación a la segunda enfermedad viral
de la palma de aceite africana en Colombia,
esta investigación ha demostrado que el
‘anillo clorótico’ en el suroccidente de Co-
lombia, es causado por una cepa del Virus del
mosaico de la caña de azúcar (SCMV). Vale
la pena destacar la existencia de potyvirus
también pertenecientes a la subdivisión II en
otras especies de palmas, tales como la palma
real cubana (Thomas et al, 1993) y la palma
de abanico mejicana en Australia y los Esta-
dos Unidos (Mayhew y Tidweel, 1978),
respectivamente. El potyvirus de palma de
aceite descrito en la India (Solomon y Babu,
1998), induce inclusiones citoplasmáticas
diferentes (ringletes y rollos) característicos
de la subdivisión I de los potyvirus (Edward-
son y Christie, 1991). Las inclusiones cito-
plasmáticas observadas en palma de aceite
africana en el Ecuador (Chinchilla et al,
1995) son similares a las descritas en este
trabajo. La identificación de una cepa del
SCMV como el agente causal del ‘anillo
clorótico’ de la palma de aceite africana, está
de acuerdo al rango de patogenicidad obser-
vado en esta investigación. Este hecho, sin
embargo, dificulta el control del virus debido
al gran número de gramíneas hospederas que
posee el SCMV, y a las diversas especies de
áfidos que transmiten estos virus de manera
no-persistente (Persley, 1996). En el caso del
‘anillo clorótico’, parece no existir un proce-
so de transmisión biológica eficiente entre las
gramíneas huéspedes del virus y la palma de
aceite africana, ya que la incidencia de esta
enfermedad en el municipio de Tumaco se
mantiene baja. De todas formas se recomien-
da mantener los alrededores de los cultivos de
palma libres de gramíneas silvestres o culti-
vadas. La recomendación actual de reempla-
zar gramíneas por leguminosas en las planta-
ciones de palma de aceite africana como
cobertura vegetal, ayudaría al control del
‘anillo clorótico’. El control químico de
potyvirus no es aconsejable, ya que los insec-
ticidas no pueden prevenir la transmisión de
estos virus.
Estas investigaciones demuestran que
existen dos enfermedades virales de la palma
de aceite africana en el suroccidente de Co-
lombia. A pesar de que la ‘mancha anular’ es
una enfermedad letal y el ‘anillo clorótico’ no
lo es, la incidencia de cualquiera de estas dos
enfermedades obliga a la eliminación de las
palmas jóvenes infectadas. Esperamos que
estas investigaciones faciliten el diagnóstico
de estas dos enfermedades de la palma de
aceite, para que se puedan adoptar las medi-
das adecuadas de control.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación fue posible gracias al
apoyo logístico y financiero del Centro Co-
lombiano de Investigación de la Palma de
Aceite (CENIPALMA) y del CIAT. Se
reconoce especialmente el apoyo administra-
tivo de su Director, Dr. Pedro León Gomez, y
la ayuda logística del Dr. Hugo Calvache y de
los ingenieros agrónomos de CENIPALMA,
CORPOICA y empresas palmeras del muni-
cipio de Tumaco, cuya ayuda facilitó el desa-
rrollo de estas investigaciones.
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2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
NEMATODOS ASOCIADOS A LA GRANADILLA Passiflora ligularis Juss
EN EL VALLE DEL CAUCA*
Zulaima E. Vargas Z1, Francia Varón de A2 y Eider D. Gómez1
1Universidad Nacional, Sede Palmira, PBX 2717000.N. 2ICA, Palmira, Fax 2733949.
*Proyecto cofinanciado por FONTAGRO
RESUMEN
La granadilla (Passiflora ligularis Juss) es una de las especies de
pasifloras cultivadas en Colombia con mayor potencial de exportación
y de gran aceptación en el mercado nacional, lo que ha motivado el
incremento en el área sembrada en diferentes regiones del Valle del
Cauca, en donde se siembra para rotar o intercalar con cultivos como
café, lulo, tomate de árbol entre otros. Teniendo en cuenta la suscepti-
bilidad de estos cultivos a nematodos, especialmente a Meloidogyne, y
los pocos estudios que existen sobre estos microorganismos en este
cultivo, se planteó un reconocimiento de nematodos fitoparásitos
asociados al cultivo de la granadilla en el Valle del Cauca. Para tal fin
se visitaron fincas ubicadas en las principales zonas productoras de
granadilla en el Valle del Cauca. Se realizó un muestreo recorriendo el
lote en zig –zag, y colectando suelo y raíces en 20 a 30 plantas por
hectárea. Durante el reconocimiento se identificaron asociados a la
granadilla los géneros Meloidogyne, Helicotylenchus, Pratylenchus,
Trichodorus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus, Criconemella, Ho-
plotylus y Rotylenchulus, siendo los de mayor frecuencia y distribu-
ción Meloidogyne con 64 y 61 por ciento en suelo y raíces, Helicoty-
lenchus y Pratylenchus con 45 y 46 y de 21 y 26 por ciento, respecti-
vamente. Además, identificaron nematodos no fitoparásitos de las
familias Rhabditidae Aphelenchidae, Dorylaimidae y Mononchidae.
Meloidogyne fue el nematodo de mayor importancia en granadilla por
su frecuencia y amplia distribución, encontrándose la mayor infesta-
ción en los municipios de Versalles, Roldanillo, Trujillo y Ginebra.
Mediante las pruebas de parasitismo se demostró que Meloidogyne
induce pobre desarrollo aéreo y radical reduciendo de 28 a 64 por
ciento el peso seco aéreo y de 31 a 81 por ciento el peso seco de
raíces, el índice de nudosidad alcanzó un grado de severidad de cinco
confirmando de esta forma la susceptibilidad de la granadilla a este
nematodo. Cuando estaban presentes Meloidogyne, Helicotylenchus y
Pratylenchus el daño fue mayor. Las especies Meloidogyne incógnita,
M. javanica y M. hapla se encontraron asociadas con cultivos de
granadilla.
Palabras claves: Reconocimiento, granadilla, Meloidogyne spp, ne-
matodos.
SUMMARY
The passionflower (Passiflora ligularis Juss) is one of the cultivated
species in Colombia with great implicit potential of exportation, and
great acceptance in the national market, the one which has motivated
the increments in the area sowed in several regions of the Cauca Val-
ley, in where is used as a rotation crop with coffee, tomato or other
kind of crops. Keeping in mind the susceptibility of these crops to
nematodes, especially to Meloidogyne, and the few studies about this
wireworms affecting passionflower crop, a survey of phytoparasitic
nematodes was planned. In order to obtain the information were visit-
ed the principal passionflower producing zones at the Cauca Valley. It
was carried out a sampling in some farms. Samples of roots and soil
were collected in 20 to 30 plants for hectare. Results of the survey
showed that Meloidogyne, Helicotylenchus, Pratylenchus, Trichodo-
rus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus, Criconemella, Hoplotylus and
Rotylenchulus, were the genera of nematodes frequently registered.
Meloidogyne was present in 64% of soil samples, and in 61% root
ones; Helicotylenchus in 45% of soil samples and in 46% root ones,
and finally Pratylenchus in of 21 of soil samples and in 26 % of root
samples. Also, it was recorded non-phytoparastic nematodes of the
families Rhabditidae Aphelenchidae, Dorylaimidae and Mononchidae.
Meloidogyne was the nematode of great importance in passionflower
crops at Cauca Valley for it frequency and wide distribution, recording
high infestations in the municipalities of Versalles, Roldanillo, Trujillo
and Ginebra. Using parasitism tests it was demonstrated that
Meloidogyne induces poor development in the aerial part of the plant
and also reduces the root system. It was detected reduction in the
foliage dry weight ranged between 28 - 64 % and reduction in the root
dry weight ranged between 31 - 81 percent. The knot index reached a
grade of severity of five confirming the susceptibility of the P. ligu-
laris to this nematode in this way. When Meloidogyne was present
with Helicotylenchus and Pratylenchus the damage was high. The
species Meloidogyne incognita, M. javanica and M. hapla were asso-
ciated with P. ligularis crops at Cauca Valley.
Key words: tropical fruits, plant diseases, survey
INTRODUCCIÓN
La granadilla es una de las especies de pasi-
floras con mayor potencial de exportación; es
originaria de la América Tropical, especial-
mente del centro y sur de América en parti-
cular de Colombia. Se cultiva en Caldas,
Tolima, Huila, Cundinamarca, Boyacá, Cau-
ca, Nariño, Risaralda, Quindío,Valle y Antio-
quia principalmente (Saldarriaga,1998).
Hasta hace poco el municipio de Urrao,
Antioquia, era considerado como el mayor
productor de granadilla, pero debido al ata-
que de la secadera Nectria haematococca y
el nematodo del nudo radical Meloidogyne
spp., el área sembrada se disminuyó conside-
rablemente (Tamayo y Varón, 1992).
Los nematodos fitoparásitos representan
uno de los problemas sanitarios de mayor
importancia debido a que reducen el sistema
de raíces, inhiben la toma normal de nutrien-
tes, y reducen la capacidad productiva de las
plantas, además, de relacionarse con otros
complejos patológicos como hongos y bacte-
rias, de difícil manejo (Sánchez y otros,
1992).
El nematodo del nudo radical Me-
loidogyne sp, es el de mayor importancia en
el mundo por su distribución, su rango de
hospederos y por su capacidad de multiplica-
ción y adaptación a diferentes pisos térmicos,
suelos y ambientes (Varón de A, 1995).
En cultivos de granadilla, se han encon-
trado con mayor frecuencia Pratylenchus,
Helicotylenchus, y Meloidogyne, prevale-
ciendo por su amplia diseminación M. in-
cognita y M. javanica (Tamayo y Varón,
1992). Adicionalmente se ha encontrado
interacción Meloidogyne - Fusarium que
reduce el desarrollo y crecimiento de las
plantas de granadilla (Múnera, 2000).
Garcés y Saldarriaga, (1993), registran a
Meloidogyne spp. y Helicotylenchus asocia-
dos al cultivo de la granadilla en la zona de
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 88
Urrao (Antioquia), causando el primero aga-
llas o nudosidades en su sistema radical.
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
88
Múnera y Navarro, (2001) y Tamayo
(2001), registran a Meloidogyne incognita
como el causante de la reducción de los pa-
rámetros de crecimiento y desarrollo de la
granadilla entre 29 y 73%, presentando esta
especie distribución muy amplia en todas las
zonas productoras del país.
Debido a la importancia del cultivo de la
granadilla como renglón de exportación, el
incremento repentino en el área de siembra en
el Valle del Cauca, la susceptibilidad a nema-
todos de los cultivos con los que se intercala
o se rota como café, banano, tomate de árbol
entre otros y los altos costos de producción
se decidió realizar el presente trabajo, para
conocer los nematodos asociados al cultivo y
determinar el efecto de Meloidogyne sobre el
desarrollo de plantas jóvenes
MATERIALES Y MÉTODOS
Fase de Campo
Se seleccionaron las fincas más representati-
vas de las zonas productoras de granadilla en
el Valle del Cauca, y algunas de Quindío y
Risaralda, teniendo en cuenta el área sembra-
da, la edad del cultivo y el impacto social.
El muestreo se realizó con un barreno sa-
cabocado o con machete, buscando llegar al
área de mayor concentración de raíces, reali-
zando un recorrido al azar en zig-zag, y eva-
luando de 20 a 30 plantas por hectárea. (Va-
rón y Castillo, 2001).
Se diligenció un formulario con informa-
ción concerniente a localización, ubicación,
edad del cultivo, altura, prácticas y productos
aplicados, mediante entrevista con el agricul-
tor o administrador de la finca.
Las muestras se trasladaron al laboratorio
de Diagnóstico Vegetal del ICA Palmira, para
su inmediato proceso, en su defecto se con-
servaron refrigeradas a 100 C.
Fase de Laboratorio
Para la extracción de nematodos de suelo se
tomaron 100 cc y se empleó el método de
suspensión-filtración y decantación (Varón de
A. y Castillo, 2001).
Para el caso de las raíces, se tomó todo el
material vegetal colectado en la muestra, se
lavó, se registró su peso. Se colocó en la
licuadora, y se licuó en forma fraccionada por
espacio de 15 a 20 segundos. Una vez desin-
tegrado el tejido vegetal se depositó en los
tamices y platos de decantación durante 72
horas. (Varón y Castillo, 2001).
Se procedió a identificar y cuantificar las
poblaciones con base en la clave taxonómica
de Mai et al (1975). La población se expresó
con con base en 100 cc de suelo y un gramo
de raíces frescas.
Los resultados obtenidos durante el reco-
nocimiento se analizaron con base en los
porcentajes de frecuencia, las poblaciones
máximas y promedias de cada género y los
valores de prominencia. El valor de promi-
nencia se obtuvo multiplicando la densidad
absoluta o población promedia por la raíz
cuadrada de la frecuencia absoluta (Volcy,
1998).
Fase de invernadero
Se seleccionaron tres poblaciones correspon-
dientes a la mezcla de suelo procedente de las
veredas de Bolívar, Trujillo y Versalles.
Para la multiplicación de cada población
se tomó el suelo de cada municipio, y se
colocó en materos adicionando suelo autocla-
vado para completar volumen. En cada mate-
ro se sembraron dos semillas de granadilla y
dos de tomate variedad “Rutgers” el cual es
altamente susceptible a todas las poblaciones
de género Meloidogyne, a los sesenta días se
realizó la extracción de huevos con hipoclori-
to de sodio para proceder a la inoculación
(Varón y Riedel, 1982).
Pruebas de parasitismo
Se sembraron semillas de granadilla en mate-
ros con suelo autoclavado y suelo natural-
mente infestado de cada municipio y se man-
tuvieron las plantas bajo condiciones de
invernadero hasta el momento de la inocula-
ción. La inoculación se realizó cuando las
plantas alcanzaron de dos a tres hojas verda-
deras, abriendo tres orificios equidistantes en
la zona de mayor concentración de raíces
donde se depositó la suspensión que contenía
los huevos. De cada población se utilizaron
dos densidades (5.000 y 10.000 huevos por
planta), se usaron seis plantas por tratamiento
y seis como testigo absoluto. Como testigo
relativo se utilizó suelo colectado en el cam-
po de los diferentes municipios previamente
cuantificada la población presente antes de la
siembra.
Con el fin de evaluar el efecto parasítico
del nematodo sobre las plantas, noventa días
después de la inoculación, se levantaron las
plántulas, cuantificando el número total de
agallas, número de nematodos por 100 cc de
suelo, número de huevos y número de nema-
todos por gramo de raíces secas. También se
determinó peso fresco y seco del follaje y de
raíces, altura y número de hojas.
El índice de nudosidad se determinó se-
gún el número de agallas y / o masa de hue-
vos por planta con base en la escala propuesta
por Taylor y Sasser (1978). El porcentaje de
reducción de cada parámetro de crecimiento
permitió medir el efecto de Meloidogyne
sobre las plántulas evaluadas, este se obtuvo
utilizando la relación entre la diferencia de las
plántulas testigo y las inoculadas versus el
testigo expresado en porcentaje (Villota y
Varón, 1995).
La unidad experimental se representó por
un matero y su respectiva planta, se usó un
diseño completamente al azar con seis repeti-
ciones y seis testigos, los cuales se distribuye-
ron sobre una mesa del invernadero del C.I.
en Palmira. Se realizó un análisis de varianza
a las variables con las siguientes fuentes de
variación tratamiento, error y total y grados 9,
50 y 59 grados de libertad respectivamente.
Con el fin de comparar los promedios ob-
tenidos se hizo la prueba de diferencia míni-
ma significativa (DMS).
Al presentarse muerte prematura de plan-
tas los datos obtenidos se transformaron con
base en la ecuación:
Parámetro = 0,5Parámetro
Identificación de las Especies
La identificación de las especies se hizo con
base en el patrón perineal que provee las
características de cada especie de Me-
loidogyne (Villota y Varón de A, 1995).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Se tomaron muestras en 10 municipios de los
cuales siete pertenecían al Valle del Cauca,
una a Risaralda y dos al Quindío, alcanzando
una cobertura de 170 hectáreas e igual núme-
ro de muestras para suelo y raíces (Tabla 1).
Se visitaron 44 fincas productoras de gra-
nadilla en diferentes estados de desarrollo
como plántula, poda, producción y cosecha.
Se observaron síntomas del ataque de nema-
todos caracterizados por achaparramiento,
zonas cloróticas, pobre desarrollo tanto aéreo
como radical, además de la presencia de
agallas o nudosidades en raíces, coincidiendo
estos síntomas con los registrados por Nava-
rro (1989) en cultivos de granadilla en Urrao,
Antioquia. La presencia de agallas confirmó
el ataque de Meloidogyne; en infección avan-
zada se observó pudrición radical posible-
mente causada por organismos fungosos.
Se identificaron nueve géneros de nema-
todos fitoparásitos asociados a la granadilla
en las 31 veredas visitadas (Tabla, 2).
Los géneros de mayor importancia de
acuerdo con el porcentaje de frecuencia du-
rante el muestreo en suelo y raíces fueron:
Meloidogyne con 64 y 61 por ciento, Heli-
cotylenchus con 45 y 46 por ciento, Pratylen-
chus con 21 y 26 por ciento respectivamente
(Tabla, 2).
Garcés y Saldarriaga (1993), registran a
Meloidogyne spp. y Helicotylenchus sp.
como los géneros más importantes asociados
al cultivo de la granadilla en la zona de Urrao
(Antioquia), además Bernal (1991) cita a
Meloidogyne sp. como el responsable de
producir nudosidades en el sistema radical de
la granadilla, así mismo a Helicotylenchus y
Pratylenchus como los géneros de importan-
cia en este cultivo.
Con menor frecuencia se identificaron
Trichodorus, Tylenchorhynchus, Paratylen-
chus, Criconemella, Hoplotylus y Rotylenchu-
lus los cuales se registraron en porcentajes
muy bajos (Tabla 2).
Tanto en suelo como en raíces Me-
loidogyne sp. presentó las mayores poblacio-
nes alcanzando 750 individuos por 100 cc de
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 89
suelo y 255 por un gramo de raíces frescas.
Le sigue en importancia Helicotylenchus y
Pratylenchus con 650 y 224 individuos por
100 cc de suelo y 58 y 62 individuos por
gramo de raíces frescas (Tabla 3).
Vale la pena destacar la presencia de Tri-
chodorus el cual se encontró en poblaciones
potencialmente altas. Los demás géneros
presentaron poblaciones máximas y prome-
dias más bajas como es el caso de Tylenchor-
hynchus, Paratylenchus, Criconemella y
Hoplotylus (Tabla 3).
Los demás géneros encontrados pueden
estar asociados con la granadilla en el área
del Valle del Cauca o con cultivos como
plátano, banano, lulo, mora y hortalizas entre
otros, con los cuales la granadilla se siembra
intercalada.
Volcy (1998) registra géneros como Tri-
chodorus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus
y Rotylenchulus asociados a plátano y café,
cultivos que en la mayoría de las fincas esta-
ban presentes o habían sido reemplazados por
granadilla.
Acompañando a esta nematofauna se
identificaron nematodos de los grupos Rhab-
ditidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y
Mononchidae con porcentajes de frecuencia
que van de 26 a 81 por ciento para suelo y 15
a 87 por ciento para raíces (Tabla 4 ).
Los nematodos no fitoparásitos, de vida
libre, depredadores o nematófagos como se
les ha calificado según sus hábitos alimenti-
cios se cuantificaron e identificaron por la
importancia agrícola que estos representan,
puesto que además de jugar un papel impor-
tante en el manejo de nematodos actuando
como biocontroladores de poblaciones fito-
parásitas, algunas especies del grupo Rhabdi-
tidae se asocian con la degradación de la
materia orgánica del suelo, contribuyendo de
esta manera al equilibrio biológico del medio
ambiente (Cepeda, 1996).
Tylenchus sp. se encontró en este estudio
asociado con suelo y raíces en porcentajes de
14 y 11 por ciento respectivamente. Este es
un nematodo de actividad parasítica descono-
cida (Tabla 4).
Meloidogyne presentó en todos los muni-
cipios el más alto valor de prominencia tanto
en suelo como en raíces con valores que van
desde 280 hasta 2118 en suelo y desde 34
hasta 280 en raíces (Tabla 5).
Según Volcy (1998) si un nematodo pre-
senta un valor de prominencia alto es consi-
derado una plaga común e importante en el
cultivo. Refleja en cierto modo la susceptibi-
lidad del cultivo al nematodo en cuestión, por
tanto Meloidogyne se considera el nematodo
de mayor importancia económica en el culti-
vo de la granadilla.
Con base en los valores (Tabla 5) cuanti-
ficados se podría afirmar que en el Valle del
Cauca los municipios de Versalles, Roldani-
llo, Trujillo y Ginebra presentan las zonas de
mayor infestación de Meloidogyne, represen
tando de esta manera un limitante más, tanto
para el cultivo de la granadilla como para
otros cultivos susceptibles.
Helicotylenchus alcanzó un valor de
prominencia de 1403 en Apia, 850 en El
Águila, 750 en Bolívar, lo que indica nueva-
mente que este nematodo representa un pro-
blema potencial al cultivo en algunas locali-
dades.
En suelo y raíces Pratylenchus registró
los valores de prominencia más altos (564 –
190), en Versalles y en Roldanillo (Tabla 5).
Las poblaciones de Helicotylenchus y
Pratylenchus representan al igual que Me-
loidogyne una amenaza desde el punto de
vista sanitario para los cultivos de la región.
Merece destacar los valores de prominen-
cia altos encontrados para estos tres géneros
en Apia y Génova lo cual se puede explicar
si se tiene en cuenta que éstas regiones son
productoras de granadilla desde hace más de
10 años además de que son monocultivos.
Las poblaciones de nematodos se ven in-
fluenciadas por diferentes factores relaciona-
dos con la actividad del cultivo, especialmen-
te en la actividad radical y los métodos de
control.
Con base en las encuestas realizadas se
encontró que en el 43 por ciento de las fincas
se realizaban prácticas culturales y/o biológi-
cas como rotación de cultivos, control de
arvenses, abonos orgánicos o biopreparados
de extractos vegetales para el manejo de los
nematodos, y en el 57 por ciento restante el
control de nematodos se llevaba a cabo con
productos químicos, los cuales son cataloga-
dos de moderada a altamente tóxicos y en la
mayoría de los casos de uso indiscriminado.
Al analizar las poblaciones de nematodos
con base en la edad de los cultivos se observa
que tanto en suelo como en raíces existen
picos máximos y picos mínimos y que en
situaciones normales se esperaría que estos
picos aumenten a medida que la planta se
desarrolla hasta un nivel tal que causa un
daño al sistema radical, iniciando el deterioro
del mismo o deteniendo la actividad radical,
en esta etapa los picos poblacionales comien-
zan a descender (Figura 1 y 2).
Tabla 1. Municipios visitados durante el reconocimiento de nematodos en granadilla (2000 – 2001)
Dpto. Municipio No. Veredas No. Fincas No. Muestras No. Has
Valle Bolívar 7 11 44 44
Valle El Dovio 2 4 14 14
Valle Ginebra 1 1 1 1
Valle Roldanillo 5 6 20 20
Valle Trujillo 3 5 26 27
Valle Versalles 6 7 33 33
Valle El Aguila 2 4 15 15
Risaralda Apia 3 4 8 8
Quindío Circasia 1 1 6 6
Quindío Génova 1 1 3 3
Total 31 44 170 170
Tabla 2. Porcentaje de frecuencia de nematodos
fitoparásitos asociados al cultivo de la granadilla
Género Suelo* Raíces*
Meloidogyne 64 61
Helicotylenchus 45 46
Pratylenchus 21 26
Trichodorus 10 5
Tylenchorhynchus 6 6
Paratylenchus 2 2
Criconemella 2 -
Hoplotylus 0,6 -
Rotylenchulus - 0,6
*170 muestras de suelo y raíces. – sin nemato-
dos.
Tabla 3. Población máxima y promedia de nematodos fitoparásitos en el cultivo de la granadilla
Género
No. Nematodos
Suelo* Raíces**
Máxima Promedio Máxima Promedio
Meloidogyne 750 77 255 23
Helicotylenchus 650 99 58 13
Pratylenchus 224 58 62 14
Trichodorus 280 65 28 13
Tylenchorhynchus 100 50 19 7
Paratylenchus 108 64 29 13
Criconemella 52 47 - -
Hoplotylus 31 31 - -
Rotylenchulus - - 8 8
*100 cc de suelo ** Un gramo de raíces frescas - Sin nematodos.
Tabla 4. Porcentaje de frecuencia de nematodos
no fitoparásitos asociados con el cultivo de la
granadilla
Género Suelo* Raíces**
Rhabditidae 81 87
Aphelenchidae 55 67
Dorylaimidae 32 26
Mononchidae 22 15
Tylenchus sp. 14 11
* 100 cc de suelo ** Un gramo de raíces secas
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
90
Los nematodos estuvieron presentes des-
de las primeras etapas del cultivo (0-6 meses)
encontrándose desde 350 a 650 indivi-
duos/100 cc de suelo, posiblemente porque
existía una fuente de inóculo previa en los
cultivos anteriores o asociados o porque el
material de propagación estaba infectado
desde el vivero. Como es sabido la mayor
fuente de diseminación de los nematodos
ocurre en el material de propagación y se
debe principalmente a la utilización de suelo
contaminado el cual no es seleccionado ni
tratado al momento de establecer el vivero
(Varón, 1994).
Las poblaciones mas altas en suelo se
presentaron en los cultivos con edades com-
prendidas entre 18 y 24 meses (750 indivi-
duos/100 cc de suelo). En esta etapa existe la
mayor actividad radical, hay producción
abundante de raicillas que son las preferidas
por los nematodos (Figura 2).
En los cultivos con más de 24 meses de
edad las poblaciones comienzan a descender
(450 individuos/ 100 cc de suelo) debido a
que en esta etapa las raíces se lignifican,
comienza la senescencia de la planta por lo
cual hay pocas raicillas aptas para la alimen-
tación y multiplicación de los nematodos.
Además de la edad del cultivo las pobla-
ciones de nematodos pueden estar influencia-
das por factores bióticos representados en la
microflora y microfauna que interactúan
permanentemente con ellos.
Las poblaciones no fitoparásitas entre las
que se encuentran los nematodos depredado-
res se mantuvieron relativamente estables en
todas las etapas de desarrollo del cultivo con
208-210 individuos/100cc de suelo, incre-
mentándose entre los 18 a 24 meses (322
individuos/100cc de suelo), edad donde el
cultivo generalmente comienza a perder
raíces y está provisto de cobertura, la cual
incorporada al suelo, aumenta la actividad
microbiana, como los hongos y los depreda-
dores de nematodos (Cepeda, 1996).
En cuanto a la población presente en
raíces varió de 44 a 88 individuos/g de raíces
frescas, incrementándose paulatinamente a
medida que la planta se desarrolla y alcanzó
su máxima población entre los 12 a 18 meses
de edad (255 individuos/ g de raíces frescas).
La población descendió en la etapa final 50-
58 individuos/g de raíces frescas. Esta situa-
ción es común observarla en cultivos peren-
nes cuando son atacados por nematodos
endoparásitos como es el caso de Meloidogy-
ne y Pratylenchus presentes durante el reco-
nocimiento (Figura 2).
Las poblaciones de nematodos no fitopa-
rásitos fueron relativamente bajas, compara-
das con las poblaciones de nematodos fitopa-
rásitos (62 individuos/1g raíces frescas)
mostrando una mayor población en las edades
de 6 a 12 meses.
La población de Meloidogyne en raíces
estuvo influenciada por la edad del cultivo,
observándose una población promedia de 88
individuos/1g de raíces frescas durante los
primeros meses de establecimiento, incre-
mentándose entre los 6 a 12 meses de edad,
periodos donde se ha logrado establecer. Una
vez establecida la población se aumenta
teniendo en cuenta su rápida reproducción y
la alta susceptibilidad del cultivo a este nema-
todo (Cepeda, 1996). Durante las etapas mas
avanzadas se observó disminución de las
poblaciones, esto puede deberse a lignifi-
cación de los tejidos, pocas raicillas, dete-
rioro radical, motivo por el cual los nema-
todos migran para buscar alimento en otras
plantas e iniciar su colonización y poste-
rior desarrollo (Taylor y Sasser, 1978).
Tabla 5. Valor de prominencia en suelo y raíces de los nematodos asociados con granadilla en los muni-
cipios muestreados durante 2000 – 2001.
Muestreo Municipio Géneros
Meloidogyne Helicotylenchus Pratylenchus
Suelo Apia 2118 1403 580
Bolivar 946 765 165
Circasia 230 0 0
El Aguila 1670 850 79
El Dovio 1230 624 308
Génova 860 600 300
Ginebra 1680 0 0
Roldanilo 1825 90 139
Trujillo 1734 821 192
Versalles 1168 513 564
Raíces Apia 99 78 43
Bolivar 141 123 62
Circasia 34 35 16
El Águila 116 31 0
El Dovio 176 118 66
Génova 100 40 17
Ginebra 200 0 0
Roldanillo 137 105 190
Trujillo 230 87 65
Versalles 280 60 39
P.V = P.P F%
Figura 2. Población de Nematodos de raíces y la edad del cultivo
0
50
100
150
200
250
300
No
de n
emat
odos
1g
de r
aíce
s
fres
cas
Máximo Promedio Máximo Promedio Fitoparásitos No Fitoparásitos
0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24
Figura 1. Población de Nematodos en suelo y la dad del Cultivo
0
100
200
300
400
500
600
700
800
No
de
nem
ato
do
s en
10
0cc
de
suel
o
Máximo Promedio Máximo Promedio Fitoparásitos No Fitoparásitos
0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 91
En suelo las poblaciones de Meloidogyne
durante las edades de 0 a 18 meses fueron de
300–375 individuos/100cc de suelo y se
mantuvieron estables durante todas las etapas,
debido a que los huevos eclosionan dando
origen a estados juveniles infectivos los
cuales buscan raíces para alimentarse y desa-
rrollarse (Taylor y Sasser, 1978). Se observó
aumento de la población en cultivos con
edades comprendidas entre 18 y 24 meses
alcanzando población de 750 individuos/100
cc de suelo (Figura 3).
En cultivos con más de 24 meses se ob-
servó disminución de la población (450 indi-
viduos/100cc de suelo),sin embargo la pobla-
ción cuantificada es suficiente para infectar
nuevas plantas, originando nuevas generacio-
nes de juveniles infectivos (Taylor y Sasser,
1978).
Pruebas de parasitismo
Las plantas inoculadas presentaron en el
sistema radical los síntomas característicos
del ataque de Meloidogyne, como son agallas
o nudosidades, clorosis foliar y pobre desa-
rrollo radical y foliar, además, en algunas
plántulas se observó un avanzado deterioro de
raíces, que contribuyó a la muerte de algunas
plantas.
En las raíces de todas las plántulas inocu-
ladas se cuantificaron más de 100 agallas lo
que corresponde a un índice de 5 en la escala
de Taylor y Sasser (1978) y un índice de
reproducción superior a uno confirmando la
susceptibilidad de la granadilla a las pobla-
ciones inoculadas. Según Volcy (1998), en
las raíces afectadas por Meloidogyne, se
desarrolla hipertrofia e hiperplasia, siendo
esto un sobrecrecimiento de los tejidos pa-
renquimáticos, acompañado del engrosamien-
to de la raíz para finalmente formar las aga-
llas o nudosidades.
El efecto de Meloidogyne estuvo directa-
mente relacionado con la densidad de huevos
inoculada. La población de 5.000 huevos
indujo reducción del sistema radical en valo-
res 31 y 57 por ciento y la de 10.000 entre 75
y 80 por ciento (Tabla 6).
El peso seco del la parte aérea se redujo
en 55 y 64 por ciento con respecto al testigo
en las plantas inoculadas con 10000 indivi-
duos.
Además de la presencia de agallas las
plantas mostraron enanismo, clorosis y amari-
llamiento de hojas con defoliación prematura
Taylor y Sasser, 1978) indican que las plantas
atacadas por Meloidogyne son más pequeñas
y su sistema radical se deforma.
De las plantas inoculadas se recuperaron
más de 5.000 individuos por gramo de raíces
secas, y hasta 718 individuos por 100cc de
suelo capaces de invadir nuevas raicillas.
Cuando se usó el suelo naturalmente in-
festado las plantas murieron prematuramen-
te, posiblemente debido a la población alta, a
la presencia de los otros géneros, Helicoty-
lenchus y Pratylenchus o a microorganismos
patógenos acompañantes. En el suelo naturalmente infestado se en-
contró Meloidogyne, Helicotylenchus y
Pratylechus, con poblaciones iniciales relati-
vamente bajas (Tabla 7).
Las plantas que lograron sobrevivir mos-
traron síntomas severos del ataque de Me-
loidogyne sp. La mezcla de Meloidogyne,
Helicotylenchus y Pratylenchus redujo el
sistema radical en porcentajes hasta del 88
por ciento y el peso aéreo del 62 por ciento
superior a la reducción inducida por Me-
loidogyne cuando fue inoculado solo esta
situación fue observada con alguna frecuencia
en las fincas visitadas donde se encontró
población alta de los tres nematodos predo-
minantes.
Las poblaciones recuperadas en suelo al
levantar las plantas fue más alta que la pobla-
ción inicial indicando nuevamente la suscep-
tibilidad de granadilla a estos nematodos
(Tabla 7). Además en raíces se alcanzó una
población de juveniles y huevos capaz de
causar infección severa en las plantas.
Identificación de especies
Se encontró en Bolívar como única especie a
Meloidogyne incognita, considerada como la
especie de mayor ocurrencia en granadilla. En
Trujillo se encontró además de M. incognita ,
a M. hapla, y en Versalles M. incognita y M.
javanica; Einsenback (1992) indica que es
común encontrar estas especies juntas, siendo
considerada M. javanica como la segunda
especies más común en el mundo.
Tamayo (2001) registró a M. incognita
como la especie más común causando infec-
ción en raíces de granadilla en los departa-
Tabla 6. Porcentaje de reducción en los parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de granadilla inocu-
ladas con diferentes poblaciones de Meloidogyne
Origen y Densidad de Población
Peso
seco
Parte
aérea
Peso
seco
raíces
Número
nematodos
suelo*
Número
nematodos
raíces*
Número
huevos
raíces*
Bolivar 5000
Bolivar 10000
Trujillo 5000
Trujillo 10000
Versalles 5000
Versalles 10000
Suelo Infestado naturalmente
Bolivar
Trujillo
Versalles
33,5
59,6
26,1
55,2
28,1
63,5
62,6
51.7
13,3
48,6
75,7
31,4
81,4
57,1
77,1
41,4
88,6
10,0
452
650
461
672
485
718
315
118
230
3375
4230
3312
4310
3000
4663
555
305
330
1170139
1906250
722916
2147500
562500
1921875
743750
1540625
812500
* 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas.
Tabla 7. Población inicial y población final de nematodos en suelo infestado naturalmente
Género Bolivar* Trujillo* Versalles*
Pi Pf Pi Pf Pi Pf
Meloidogyne 244 315 121 118 193 230
Helicotylenchus 113 130 105 95 98 120
Pratylenchus 20 25 22 26 84 75
*100cc de suelo
Figura 3. Población de Meloidogyne sp., y la edad del cultivo en suelo y raíces
0
100
200
300
400
500
600
700
800
No
de
Nem
atod
os
10
0cc
de
suel
o/1
g d
e ra
íces
0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24
Edad
(meses)
Máximo suelo Máximo raíces
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
92
mentos de Antioquia, Quindío y Valle del
Cauca, lo cual concuerda con estos resulta-
dos.
CONCLUSIONES
Durante el reconocimiento se identifica-
ron cinco géneros, asociados con el culti-
vo de la granadilla, siendo los de mayor
frecuencia el nematodo del nudo radical
Meloidogyne sp., el nematodo espiral
Helicotylenchus sp. y el nematodo de la
lesión Pratylenchus sp.
Meloidogyne sp por su distribución y
valor de prominencia se considera como
el nematodo de mayor importancia en el
Valle del Cauca, con mayor infestación
en Versalles, Roldanillo, Trujillo y Gine-
bra.
Como acompañantes se identificaron
nematodos no fitoparásitos pertenecientes
a las familias Rhabditidae, Aphelenchi-
dae, Dorylaimidae y Mononchidae.
Las poblaciones más altas de Meloidogy-
ne coinciden con la edad de 12 a 18 me-
ses, época en la cual se presenta la mayor
actividad radical de la planta.
Las especies del género Meloidogyne
asociadas a granadilla fueron M incogni-
ta, M. hapla y M. javanica.
Meloidogyne sp. afectó el normal desarro-
llo de la granadilla causando reducción
foliar y radical, lo que demuestra la gran
susceptibilidad del cultivo a este nemato-
do.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento al
ICA, FONTAGRO, IICA – PROCIANDINO,
UMATA del Valle del Cauca, Risaralda y
Quindío y demás personas e Instituciones que
colaboraron en el desarrollo del trabajo.
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en plantas. Universidad Nacional de Co-
lombia Tomo II. Medellín. 182p
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2
NEMATODOS ASOCIADOS AL TOMATE DE ARBOL Solanum betaceum
EN EL VALLE DEL CAUCA*
Sandra L. Lozada S1, Francia Varón de A.2 y Eider D. Gómez1
1Universidad Nacional, Sede Palmira. PBX 2717000, 2 ICA Palmira, Fax 2733949.
*Proyecto cofinanciado por FONTAGRO.
RESUMEN
El cultivo del tomate de árbol ha adquirido gran importancia en el país
por su potencial para la exportación como fruta fresca, así como su uso
en procesos agroindustriales para la preparación de jaleas, dulces,
mermeladas, y otros productos, y a la vez como generador de recur-
sos económicos para el agricultor. Teniendo en cuenta que los cultivos
de rotación y los que se intercalan con el tomate de árbol son suscepti-
bles a nematodos, se planteó este trabajo para conocer los nematodos
asociados y medir el efecto de Meloidogyne sp., en el desarrollo de las
plantas. El reconocimiento se hizo en fincas productoras de tomate de
árbol. Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Diagnóstico
Vegetal, ICA-Palmira. Para medir el efecto de Meloidogyne se realiza-
ron pruebas de parasitismo, inoculando plantas de tomate de árbol,
con 6000 huevos. Se tomaron 125 muestras de suelo y raíces, en 46
fincas ubicadas en 10 municipios del Valle del Cauca y uno en Risa-
ralda, abarcando 125 hectáreas. Se observaron agallas o nudosidades,
inducidas por Meloidogyne y pobre desarrollo foliar y radical. Se
identificaron cinco géneros de nematodos fitoparásitos, siendo los de
mayor frecuencia y distribución Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp.,
y Pratylenchus sp., los cuales se encontraron en el 86, 18 y 17 % de
las muestras analizadas. Se encontraron además nematodos no fitopa-
rásitos de las familias Rhabditidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y
Mononchidae. Se estableció que el nematodo más importante y más
ampliamente distribuido fue Meloidogyne, cuyas poblaciones máximas
para suelo se presentaron en los municipios de El Dovio, Roldanillo,
Trujillo, Ginebra y Versalles, con 1958, 1216, 1088, 700 y 609 indivi-
duos/100 cc de suelo. En raíces se presentó alta población en los mu-
nicipios de Ginebra, Trujillo y Versalles, con máximas de 453, 384 y
145 nematodos/g de raíces frescas, respectivamente. Meloidogyne
presentó mayor población en los 12 primeros meses del establecimien-
to del cultivo. El efecto parasítico de Meloidogyne se expresó en un
menor desarrollo aéreo y radical de las plantas inoculadas, con reduc-
ción en altura superior al 45%, en el peso seco del follaje mayor al
47% y en raíces hasta del 59% para peso seco, indicando la suscepti-
bilidad de esta especie a Meloidogyne. Se encontraron las especies M.
incógnita y M. arenaria asociadas al tomate de árbol.
Palabras claves: Reconocimiento, frutales, nematodos, Colombia.
SUMMARY The cultivation of Solanum betaceum has acquired great importance
in the country for their fresh fruit export potential , as well as their use
in processed foods as jellies, candies, marmalades, and other products ,
and it at the same time as a source of farmer incomes for their suste-
nance. Keeping in mind that the rotation crops using in intercropping
with S. betaceum are susceptible to nematodes, this work was planned
in order to know the nematode associated with this crops and measure
the effect of Meloidogyne sp., on the plant growth. The survey was
realized in farms planted with S. betaceum. The samples were pro-
cessed in the Diagnosis Laboratory of “ Sanidad Vegetal”, ICA-
Palmira. In order to measure the effect of Meloidogyne parasitism tests
was realized inoculating plants of S. betaceum, with 6000 eggs. 125
samples of soil and roots were taken in 46 farms located in 10 munici-
palities of the Cauca Valley and one in Risaralda. Root-knot, poor
development of roots and foliage induced by Meloidogyne were ob-
served. Five genera of phytoparasitic nematodes were identified, being
Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., and Pratylenchus sp. the genera
of major frequency, presents in 86%, 18%, 17% of the analyzed sam-
ples, respectively. Nematodes non-phytoparasitic of the Rhabditidae
families, Aphelenchidae, Dorylaimidae and Mononchidae also were
detected. It settled down that the most important nematode and more
thoroughly distributed it was Meloidogyne, whose maximal popula-
tions in soil were detected in the municipalities of The Dovio, Rol-
danillo, Trujillo, Ginebra and Versalles, with 1958, 1216, 1088, 700
609 nematodes / 100 cc of soil. In root samples high population was
detected in the municipalities of Ginebra, Trujillo and Versalles, with
maxims of 453, 384, 145 nematodes/g of fresh roots, respectively.
Meloidogyne showed high population in the 12 first months of the crop
development. The parasitic effect of Meloidogyne was expressed as
poor growth of the foliage and root systems of the inoculated plants,
with reduction in height over 45%, in foliage dry weight over 47%
and in roots until of the 59% for dry weight, indicating the susceptibil-
ity of this species to Meloidogyne. M. incógnita y M. arenaria were
the species associated with S. betaceum crops.
Keywords: survey, fruits, Colombia
INTRODUCCIÓN
El tomate de árbol en la actualidad se explota
comercialmente en las zonas andinas de clima
frío moderado en Antioquia, Boyacá, Caldas,
Cauca, Cundinamarca, Nariño y Valle del
Cauca (Saldarriaga et al , 1997).
Participa con el 5,3% del total de la pro-
ducción frutícola nacional ocupando el sépti-
mo lugar después de los cítricos, la piña, el
aguacate, la papaya, la guayaba y el mango;
ocupa el cuarto lugar en la canasta de frutas
de los hogares colombianos (CCI, 2000).
En el Valle del Cauca, se producen 443
hectáreas, distribuidas en Pradera, Versalles,
Roldanillo, Bolivar, Tulúa, El Dovio, Gine-
bra, Buga (URPA-Valle, 2001). Debido al
aumento de área sembrada y a la explotación
intensiva del cultivo, se presentan plagas,
enfermedades y nematodos que limitan la
producción y causan pérdidas, siendo moti-
vo de preocupación para muchos agricultores
(Varón de A, 1995)
Se han encontrado varios géneros de ne-
matodos asociados con tomate de árbol,
siendo el nematodo de la nudosidad radical,
Meloidogyne spp. el más importante. Las
especies de Meloidogyne que mayor daño
producen a los cultivos de tomate de árbol en
todas las zonas productoras son M. incognita,
M. javanica y M. hapla. (Saldarriaga et al,
1997).
Otros géneros encontrados en el cultivo
son: Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp.,
Tylenchorhynchus spp. y Trichodorus sp.
(Toro-L,1991).
Teniendo en cuenta que los cultivos de
rotación y los que se intercalan con el tomate
de árbol son susceptibles a nematodos espe-
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 94
cialmente a Meloidogyne sp., y que hasta el
momento en el Valle del Cauca no existe un
trabajo dirigido a identificar la nematofauna
asociada al tomate de árbol y su importancia
en la producción, se planteo esta investiga-
ción para conocer los nematodos asociados al
cultivo y determinar el efecto de Meloidogy-
ne spp. en el desarrollo vegetativo de plantas
jóvenes.
MATERIALES Y MÉTODOS
Fase de campo
Se seleccionaron las fincas más representati-
vas de las diferentes zonas productoras de
tomate de árbol en el departamento del Valle
del Cauca, teniendo en cuenta el área sem-
brada y la edad del cultivo.
Las muestras se colectaron utilizando un
machete o barreno sacabocado, el cual se
introdujo en tres sitios equidistantes alrededor
de la planta en la zona de mayor concentra-
ción de raíces. Por cada hectárea de tomaron
10 submuestras tanto de suelo como de raí-
ces, recorriendo el lote en zig-zag. Se diligen-
ció con ayuda del agricultor o administrador
de la finca, un formulario que contenía los
datos relativos a localización, a la edad del
cultivo, al terreno, síntomas, prácticas y
productos aplicados, o al clima.
Fase de laboratorio.
Las muestras se llevaron al laboratorio de
Nematología del ICA - Palmira donde se
procesaron inmediatamente y en caso contra-
rio, se conservaron en la nevera a 10°C, hasta
su procesamiento y posterior análisis.
En el proceso de extracción de los nema-
todos del suelo y raíces se utilizó el método
de Cobb modificado, bajo principios de
filtración-decantación y el de trituración-
decantación, para luego hacer la identifica-
ción y cuantificación correspondiente en cada
una de las muestras colectadas. La cantidad
total de nematodos se expresó con base en
100 c.c. de suelo y un gramo de raíces frescas
(Varón y Castillo, 2001).
Los huevos de Meloidogyne sp. se obtu-
vieron de raíces infectadas de tomate de mesa
variedad Rutgers, siguiendo las recomenda-
ciones de Taylor y Sasser (1983).
Análisis de datos
Los resultados obtenidos durante el recono-
cimiento se analizaron con base en las tablas
de frecuencia, de poblaciones máximas y
promedias de cada género y los valores de
densidad absoluta de los géneros de nemato-
dos asociados al cultivo.
El Porcentaje de frecuencia se calculó
dividiendo el número de muestras con nema-
todos por el número de muestras totales,
multiplicando el resultado por cien.
La Densidad Absoluta es el promedio
aritmético de nematodos por muestra de 100
cc de suelo. indica el grado de infestación de
un suelo y se obtiene dividiendo la suma de
los registros de población de cada muestra
por el número total de muestras analizadas
(Volcy, 1998).
Fase de Invernadero
Como fuente de inóculo se utilizó suelo con
alto grado de infestación de nematodos,
proveniente de las diferentes fincas de tres
veredas visitadas durante el reconocimiento:
Betania (Bolivar), Guayabal (Versalles) y San
Isidro (Trujillo), más suelo autoclavado, para
completar el volumen del matero (1 Kg) en el
cual se sembraron semillas de tomate de mesa
variedad Rutgers, altamente susceptible al
ataque de especies de Meloidogyne.
Para las pruebas de parasitismo se toma-
ron semillas de tomate de árbol, se sembraron
en materos que contenían aproximadamente
un kilogramo de suelo autoclavado. Las
plantas se mantuvieron bajo condiciones de
invernadero hasta el momento de la inocula-
ción. A los dos meses se inocularon 6000
huevos por planta, abriendo tres orificios
equidistantes en el área de mayor concentra-
ción de raíces. Como testigo se usaron plantas
inoculadas con agua destilada estéril.
Parámetros de evaluación
Con el fin de evaluar el efecto parasítico del
nematodo, se midió durante tres meses la
altura de las plantas, iniciando al momento
de la inoculación. Al levantar las plantas se
determinó peso seco y fresco del follaje y de
raíces, población total de nematodos tanto en
suelo como en raíces y se estableció el índice
de nudosidad, determinado con base en la
escala de Taylor y Sasser (1983 y el índice
de reproducción determinado por la relación
entre la población final de huevos y la canti-
dad inicial (6000 huevos/planta) inoculada, el
cual se utilizó para conocer el grado de resis-
tencia. Para medir igualmente el grado de
daño se utilizó la escala de Canto Sáenz que
involucra el índice de nudosidad y el índice
de reproducción (Villota y Varón de Agude-
lo, 1995).
El porcentaje de reducción de cada pará-
metro de crecimiento permitió medir el efecto
de Meloidogyne sobre las plántulas evalua-
das; éste se obtuvo utilizando la relación entre
la diferencia del valor registrado en las plán-
tulas testigo y el valor de las inoculadas
versus el valor del testigo, expresado en
porcentaje.
Se usó un diseño completamente al azar
con cuatro tratamientos y ocho repeticiones
por tratamiento. La unidad experimental fue
una planta y los tratamientos el origen de los
nematodos (tres veredas: Betania (Bolivar),
Guayabal (Versalles) y San Isidro (Trujillo) y
un testigo absoluto.
Se realizó un análisis de varianza con las
variables: altura, peso aéreo y de raíces (fres-
co y seco) con los correspondientes fuentes
de variación y grados de libertad.
Con el fin de comparar los promedios ob-
tenidos se utilizó la prueba de Duncan.
Identificación de especies de Meloidogyne
spp.
La identificación de las especies se realizó
con el patrón perineal mediante comparación
con claves (Taylor y Sasser, 1983; Eisenback,
1981 et al).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El reconocimiento se realizó en 47 fincas
ubicadas en 11 municipios productores de
tomate de árbol: 10 pertenecientes al Valle
del Cauca y uno a Risaralda, abarcando 125
hectáreas y colectando igual número de
muestras para suelo y raíces (Tabla 1).
Se identificaron cinco géneros asociados
al cultivo del tomate de árbol, presentando
mayor frecuencia y distribución el nematodo
del nudo radical Meloidogyne spp. , el cual se
encontró en el 81 y 86 por ciento de las mues-
tras de suelo y raíces analizadas (Tabla 2).
El nematodo del nudo radical Me-
loidogyne spp., es quizá el factor más limitan-
te en la producción del tomate de árbol, debi-
do principalmente a que se siembra en suelos
que han sido cultivados previamente con
hortalizas, café, plátano, lulo y otras solaná-
ceas que son susceptibles a este género (Tis-
nés et al, 1981)
Los nematodos formadores de agallas del
género Meloidogyne spp. son los que mayor
Tabla 1. Municipios visitados durante el reconocimiento de nematodos en tomate de árbol (2000 – 2001)
Municipio No. Veredas No. fincas Area
(Has)
Muestras
Suelo Raices
Versalles
Apia
Trujillo
Bolivar
Buga
El Dovio
Ginebra
Guacari
Roldanillo
Pradera
El Cerrito
2
1
3
3
2
2
4
1
1
1
1
2
1
4
6
12
3
8
2
3
5
1
17
1
17
22
20
12
14
4
7
10
1
17
1
17
22
20
12
14
4
7
10
1
17
1
17
22
20
12
14
4
7
10
1
Total 21 47 125 125 125
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 95
daño causan al tomate de árbol en todas las
zonas productoras, ya que al causar agallas
impiden la absorción eficiente de los nutrien-
tes, e inducen muerte de las plántulas por la
invasión de otros microorganismos secunda-
rios o patógenos.
Su presencia pasa muchas veces inadver-
tida en la planta que establece su parasitismo,
porque los síntomas aéreos pueden ser con-
fundidos con deficiencias nutricionales.
Meloidogyne aumenta la susceptibilidad del
tomate de árbol a algunos problemas patoló-
gicos como es el caso de la bacteria Pseudo-
monas solanacearum agente causal de la
dormidera o marchitez (Saldarriaga et al,
1997; Suárez y Rosales, 2001).
Le sigue en importancia Helicotylenchus
sp., el cual se encontró en el 18 y 5 por ciento
de las muestras de suelo y raíces, respectiva-
mente (Tabla 2).
Con menor frecuencia se encontró el ne-
matodo de las lesiones Pratylenchus sp. (10
por ciento para suelo y 17 por ciento para
raíces). Con baja frecuencia se encontró
Trichodorus sp. y Tylenchorhynchus sp.
Se encontraron nematodos no fitoparási-
tos de los grupos Rhabditidae, Dorylaimidae,
Aphelenchidae, y Mononchidae con porcenta-
je de frecuencia de 99, 58, 49 y 29 por ciento
para suelo, respectivamente y 98, 34, 85 y 7
por ciento para raíces (Tabla 3).
Estos nematodos se encuentran princi-
palmente en ambientes que son ricos en
materia orgánica en descomposición, partici-
pando del proceso de desintegración de restos
como saprófitos, lo cual estimula la multipli-
cación de nematodos depredadores, hongos
capturadores de nematodos y otros enemigos
naturales que ayudan a mantener un equili-
brio biológico en el medio (Volcy, 1998). En
la familia Mononchidae se encuentra la ma-
yoría de los nematodos depredadores de
nematodos, ácaros, colémbolos, entre otros.
También se encontraron individuos del
género Tylenchus con porcentaje de fre-
cuencia de 47 y 32 por ciento para suelo y
raíces, respectivamente (Tabla 3). Estos son
nematodos sin actividad parasítica definida
y con frecuencia se encuentran en suelo y
tejidos de plantas sanas y enfermas.
Al analizar la población de nematodos pre-
sente en suelo y raíces se observó que Me-
loidogyne alcanzó las poblaciones más altas
con máximas en suelo de 1958 y promedio de
183 individuos por 100 cc de suelo. En raíces
la población máxima alcanzó 453 individuos
por gramo de raíces frescas y promedia de 35
(Tabla 4).
Estas poblaciones indican la alta suscep-
tibilidad del tomate de árbol al nematodo del
nudo radical, el cual es considerado agresivo,
capaz de causar daño en cultivos susceptibles
como tomate, lechuga, apio, fresa y otros, en
umbrales de 10 juveniles/100 cc de suelo
(Volcy, 1998).
Las poblaciones encontradas para Heli-
cotylenchus y Pratylenchus en raíz, alcanzan
máximas de 16 y 26 individuos por gramo de
raíces frescas, respectivamente (Tabla 4).
Aunque la literatura registra estos géne-
ros asociados al tomate de árbol, su impor-
tancia no ha sido evaluada, hasta el momento
no se registran estudios que permitan compa-
rar las poblaciones para saber si son bajas o
altas o si pueden estar en un umbral económi-
co.
Al analizar el número de nematodos por
municipio, se encontró la máxima población
de Meloidogyne en El Dovio, con 1958 indi-
viduos/100 cc de suelo. Se ha demostrado que
al final del ciclo de algunos cultivos, se au-
menta la proporción de nematodos en el
suelo, especialmente machos y juveniles del
segundo estado (J2 ). Esto indica que los
nematodos abandonan la raíz y migran al
suelo antes del agotamiento de los recursos y
aunque se desconocen las razones de este
comportamiento, investigaciones previas han
demostrado que el bajo nivel de nitrógeno, las
altas temperaturas y los cortos fotoperíodos
son factores que pueden incidir sobre esta
migración, además de otros factores ambien-
tales (Volcy, 1981; Volcy, 1998). De la
misma manera
Otros municipios que presentaron altas
poblaciones de Meloidogyne en suelo fueron
Roldanillo, Trujillo, Ginebra y Versalles con
1216, 1088, 700 y 609 individuos/100 cc de
suelo, respectivamente. En los municipios
como El Dovio, Roldanillo, Trujillo y Gine-
bra, donde se registran las máximas pobla-
ciones, los cultivos anteriores a éste eran
granadilla; plátano y café, y pasto; mora y
lulo, respectivamente. En ninguno de los lotes
sembrados con tomate de árbol de estos
municipios se había sembrado previamente
este cultivo, lo que indica la presencia de un
inóculo previo capaz de infectar a estas plan-
taciones o plantas de vivero infestadas.
Densidad absoluta
La densidad de población de un nematodo
dañino antes de plantar es, por lo menos, un
buen indicio del daño que se puede esperar
del cultivo
Se encontró que Meloidogyne es el nema-
todo que registra los valores más altos de
densidad absoluta en los municipios mues-
treados, siendo el municipio de El Dovio el
que presenta el mayor grado de infestación
con 375 nematodos/100 cc de suelo; le siguen
los municipios de Roldanillo, Apia, Trujillo,
Ginebra, Bolivar y Versalles con valores de
densidad absoluta de 278, 269, 233, 175, 110
y 108 (Tabla 5).
Cabe anotar que los suelos de la mayoría
de las fincas muestreadas son de textura
liviana y que Meloidogyne tiene preferencia
por estos suelos, donde tiende a ser más
agresivo y provoca mayores daños aún con
densidades de población relativamente bajas
(Volcy, 1998).
Los nematodos del género Helicotylen-
chus y Pratylenchus se presentaron con den-
sidades de población bajas con relación a
Meloidogyne.
Tabla 2. Frecuencia de géneros de nematodos
fitoparásitos asociados a cultivos de tomate de
árbol expresada en porcentaje, según las muestras
analizadas.
Genero Frecuencia (%)*
Suelo1 Raiz2
Meloidogyne
Helicotylenchus
Pratylenchus
Trichodorus
Tylenchorhynchus
81
18
10
4
1
86
5
17
0
0
* 125 muestras de suelo y raíces 1 100 c c de
suelo 21 gramo de raíces frescas
Tabla 3. Frecuencia de géneros de nematodos
no fitoparásitos asociados a cultivos de tomate de
árbol, expresada en porcentaje, según lasw
muestras analizadas .
Genero % Frecuencia ( %)*
Suelo1 Raiz1
Rhabditidae
Dorylaimidae
Aphelenchidae
Mononchidae
Tylenchus
99
58
49
29
47
98
34
85
7
32
* 125 muestras de suelo y raíces 1 100 c c de
suelo 21 gramo de raíces frescas
Tabla 4. Niveles de Población de géneros de nematodos fitoparásitos asociados al cultivo de tomate de
árbol
Género Suelo* Raiz*
Máximo Promedio Máximo Promedio
Meloidogyne
Helicotylenchus
Pratylenchus
Trichodorus
Tylenchorhynchus
1958
117
58
34
26
183
29
5
25
26
453
16
26
0
0
35
19
9
0
0
* No. de nematodos en 100 cc de suelo y un gramo de raíces frescas
Tabla 5. Densidad absoluta de nematodos en los
municipios muestreados
Mu
nic
ipio
Melo
idogyn
e
Heli
coty
len
ch
us
Pra
tyle
nch
us
Versalles
Bolivar
El Dovio
Trujillo
Roldanillo
Ginebra
Pradera
Buga
El Cerrito
Guacarí
Apia
108
110
375
233 278
175
83
12
27
3
269
9
5
2
0 4
5
0
11
14
15
0
5
4
0
2 4
0
1
1
27
0
0
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 96
0
500
1000
1500
2000
2500
Máx
imo
Pro
medio
Máx
imo
Pro
medio
Máx
imo
Pro
medio
Máx
imo
Pro
medio
Máx
imo
Pro
medio
0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24
Edad en mesesN
úm
ero
de
nem
ato
dos Fitoparásitos No Fitoparásitos
Figura 1. Nivel de población de nematodos maximo y promedio en suelo y su relación con la
edad del cultivo
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900M
áxim
o
Pro
med
io
Máx
imo
Pro
med
io
Máx
imo
Pro
med
io
Máx
imo
Pro
med
io
Máx
imo
Pro
med
io
0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24
Edad en meses
Núm
ero
de n
emat
odo
s
Fito parás ito s No Fito parás ito s
Figura 2. Población máxima y promedia de nematodos en raíces y su relación con la edad del
cultivo
0
500
1000
1500
2000
2500
Núm
ero
de
nem
ato
do
s
Suelo 1079 209 1958 193 484 128 700 123 77 26
Raíz 64 15 384 31 117 24 453 42 32 6
Máxima PromedioMáxima PromedioMáxima PromedioMáxima PromedioMáxima Promedio
0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24
Figura 3. Población máxima y promedia de Meloidogyne y su relación con la edad del cultivo
En cultivos perennes la edad y fenología
del cultivo así como la actividad radical de
las plantas juegan un papel muy importante
en los cambios poblacionales de los nemato-
dos a través del tiempo.
La dinámica poblacional de nematodos
tiene un período en que la población aumenta
debido a la mayor disponibilidad de alimento
(raicillas) y periodos de disminución. En
condiciones normales se espera que los má-
ximos y mínimos sean cada vez más altos en
las primeras etapas de desarrollo del cultivo y
comiencen a bajar a medida que comienza la
senescencia.
Relacionando la población de nematodos
y la edad del cultivo, se encontró que cultivos
entre los 6 y los 12 meses presentaron las
poblaciones máximas de nematodos fitopará-
sitos en suelo con 1958 nematodos/100 cc de
suelo (Figura 1).
Desde los primeros meses del cultivo se
observó una población alta con 1079 nemato-
dos fitoparásitos, esto puede deberse a que ya
existía una fuente de inóculo previa debido a
los cultivos anteriores o en asocio y/o interca-
lados como café, lulo, plátano, entre otros,
que en la mayoría de los casos son suscepti-
bles a los mismos géneros, o a que el material
de propagación estaba infectado desde la
etapa de vivero (Figura 1). A partir del año, la
población de nematodos fitoparásitos se
disminuye.
Esto se debe a que las poblaciones de
nematodos no permanecen estacionarias;
disminuyen cuando las condiciones existentes
no favorecen la reproducción, y aumentan
cuando existen raíces de plantas susceptibles
que brindan alimento y cuando la temperatu-
ra y la humedad del suelo favorecen su acti-
vidad (Taylor y Sasser, 1983).
En raíces se presentó un máximo de ne-
matodos fitoparásitos entre los 18 y 24 meses
y de 6 a 12 meses con máximas de 453 y 384
nematodos/ 1 g de raíces frescas, respectiva-
mente (Figura 2).
En general, las especies endoparásitas
aumentan con gran rapidez pocas semanas
después de haberse plantado el cultivo y la
población alcanza su máximo cuando el
crecimiento de la raíz es más activo (Taylor y
Sasser, 1983).
Una población máxima es afectada por
factores bióticos y abióticos y se reduce para
volver a iniciar el crecimiento formando una
curva con ascensos y descensos acorde con la
actividad radical que le brinda el alimento
necesario para la multiplicación y alimenta-
ción de las progenies subsiguientes.
Las poblaciones de nematodos no fitopa-
rásitas se mantuvieron relativamente altas
durante las etapas de desarrollo del cultivo,
alcanzando una población máxima entre los 6
y 12 meses para suelo (1890 nematodos/100
cc de suelo) (Figura 1), y entre los 12 y 18
meses para raíces (853 nematodos/g raíces
frescas) (Figura 2). La presencia de nemato-
dos no fitoparásitos sugiere que existe una
gran actividad microbiológica en los ecosis-
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 97
temas sembrados con tomate de árbol, posi-
blemente debido al alto contenido de materia
orgánica, o posible deterioro de raíces por la
alimentación de los nematodos fitoparásitos,
especialmente por Meloidogyne sp.
En suelo, las poblaciones más altas de
Meloidogyne se encontraron durante los
primeros doce meses del cultivo con 1079 –
1958 individuos/100 cc de suelo (Figura 3),
debido a que en esta etapa el crecimiento de
las raíces es más activo proporcionando el
alimento necesario para su multiplicación.
Este incremento también puede depender de
la densidad del nematodo en el suelo al mo-
mento de efectuarse la siembra.
A partir de los 12 meses la población
comienza a descender paulatinamente tanto
en suelo como en raíces. Esto supone la
existencia de un índice constante de repro-
ducción hasta que la densidad es tan alta que
la población se autorregula ya sea por falta de
alimento o por la presencia de enemigos
naturales o bien la capacidad nutricional de la
planta se convierte en un factor limitante, por
presentar tejidos lignificados, pocas raicillas
y/o deterioro radical.
Prueba de Parasitismo con Meloidogyne sp.
Las plantas inoculadas con Meloidogyne,
mostraron pobre desarrollo foliar y marcado
enanismo. En el sistema radical de las plan-
tas inoculadas se observaron agallas y nudo-
sidades, similares a los observados en plantas
adultas de las fincas donde se realizó el reco-
nocimiento.
El efecto parasítico del nematodo se mar-
có principalmente en el desarrollo foliar
notándose que la población inoculada ejerció
efecto depresivo en las plantas, en altura de
la planta y tamaño de hojas, las cuales fue-
ron más pequeñas y cloróticas además de un
pobre sistema radical, comparadas con el
testigo.
Las plantas presentaron reducción en su
crecimiento superior al 44% (Tabla 6). En
cuanto el desarrollo foliar se observó tallos
más delgados y hojas más pequeñas. Para el
peso fresco se registró reducción entre el 53
y 65% y entre el 47 y 66% para peso seco.
En raíz se presentó reducción entre 37 y 60
% para peso fresco y entre 29 y 59% para
peso seco (Tablas 6 y 7).
Todas las plantas inoculadas con Me-
loidogyne presentaron más de 100 agallas, lo
que indica un índice de nudosidad de 5 (Ta-
blas 6 y 7).
Tanto en suelo como raíces se pudo recu-
perar altas poblaciones de estados juveniles
de Meloidogyne lo que permite comprobar
que el nematodo fue capaz de infectar, esta-
blecerse y multiplicarse en este cultivo.
Además en raíces alcanzó una población
de juveniles y huevos, capaz de causar infec-
ción severa en las plantas. La población,
encontrada en suelo fue de 504, 610, 1432
individuos por 100 cc de suelo y en raíz 6342,
6375 y 9791 individuos por gramo de raíces
secas (Tablas 6 y 7)
El índice de reproducción fue superior a
uno en todas las poblaciones estudiadas.
Según Canto Sáenz una planta con un índice
de reproducción superior a uno y un índice de
nudosidad superior a dos indica que la espe-
cie es susceptible al ataque de Meloidogyne
(Villota y Varón, 1995)
Identificación de especies de Meloidogyne
Al establecer la comparación con patrones
perineales (Taylor y Sasser, 1983) se deter-
minó en la vereda Betania (Bolivar) una
población mixta conformada por M. incogni-
ta y M. arenaria; en las veredas de Guayabal
(Versalles) y San Isidro (Trujillo) se encontró
M. incógnita .
En tomate de árbol se han registrado las
especies de M. incognita, M. arenaria, M.
javanica y M. hapla como las que mayor
daño producen a estos cultivos en todas las
zonas productoras (Saldarriaga y otros1997).
De acuerdo con el reconocimiento se es-
tableció que el nematodo más importante y
ampliamente distribuido es Meloidogyne y
afecta significativamente el desarrollo de las
plántulas de tomate de árbol.
CONCLUSIONES
Durante el reconocimiento se identificaron
cinco géneros fitoparásitos, asociados con el
cultivo del tomate de árbol, siendo Me-
loidogyne el de mayor frecuencia y distribu-
ción en los municipios muestreados . El
Dovio, Trujillo, Roldanillo y Versalles,
registraron las máximas infestaciones en
suelo. Se identificaron nematodos no fitopa-
rásitos pertenecientes a las familias Rhabdi-
tidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y Mo-
nonchidae.
Meloidogyne presentó mayor población
en los 12 primeros meses del establecimiento
del cultivo, época en que la planta produce
mayor cantidad de raíces, de hormonas, la
primera floración y producción de frutos,
Tabla 7. Efecto de Meloidogyne sp sobre algunos parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de tomate
de árbol.
Parámetros
T1 T2
Sin Nematodos Población San Isidro
(Trujillo)
% de reducción
respecto al testigo
Incremento en altura
(cm)
17,141
8,28
51,70
Peso aéreo fresco (gr) 41,17 19,11 53,56
Peso aéreo seco (gr) 7,23 3,77 47,86
Peso raíz fresco (gr) 26,07 16,38 37,14
Peso raíz seco (gr) 2,96 2,08 29,78
No. De huevos 0 876.986
Población de nematodos
Suelo2 0 1432
Raíces2 0 9.791
Indice de nudosidad 0 5
Indice de reproducción 0 146,2
1Promedio de 7 repeticiones 2 No. de nematodos por 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas
Tabla 6. Efecto de Meloidogyne sp sobre algunos parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de tomate
de árbol.
Parámetros
T1 TT
Sin
Nematodos
Población
Betania
(Bolivar)
% de
reducción
respecto
al testigo
Población
Guayabal
(Versalles)
% de reducción
respecto al
testigo
2 T3
Incremento en altura (cm) 25,251 14,0 44,55 11,93 52,72
Peso aéreo fresco parte
aérea (g) 107,60 39,84 63,00 37,70 64,96
Peso aéreo seco (g) 13,59 5,54 59,24 4,57 66,36
Peso raíz fresco (g) 35,51 20,47 42,33 13,92 60,78
Peso raíz seco (g) 5,77 3,13 45,73 2,35 59,27
No. De huevos 0 255.649 338.777
Población de nematodos
Suelo2 0 504 610
Raíces2 0 6.342 6.375
Índice de nudosidad 0 5 5
Índice de reproducción 0 42,6 56,5 1Promedio de 7 repeticiones 2No. de nematodos por 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas
2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 98
factores que pueden incidir en las poblaciones
de los nematodos de la rizosfera, pues son
estimulados al tener una fuente constante de
alimento.
El efecto parasítico de Meloidogyne se
marcó principalmente en altura y un menor
desarrollo aéreo y radical de las plantas ino-
culadas comparadas con el testigo, lo que
indica que este nematodo puede incidir eco-
nómicamente en la producción de este culti-
vo, disminuyendo la productividad y por ende
el ingreso al agricultor.
Se encontraron M. incógnita y M. arena-
ria, en la vereda Betania (Bolívar); en Gua-
yabal (Versalles) y San Isidro (Trujillo) M.
incógnita.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento a
FONTAGRO, IICA – Prociandino, UMATA
del Valle del Cauca, Risaralda y Quindío y
demás personas e Instituciones que colabora-
ron en el desarrollo del trabajo.
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