ポスト抗体医薬：疾患関連タンパク質を ターゲット...

ポスト抗体医薬：疾患関連タンパク質を ターゲットトした分子標的ペプチド

の網羅的創出技術

大阪府立大学大学院理学系研究科・藤井 郁雄 21世紀科学研究機構ケミカルバイオロジー研究所・所長

標的タンパク質

タンパク質立体構造を取得

CC & HTS

立体構造をもとにした医薬品設計（SBDD）

作用物質の構造なし

ヒット化合物

ヒット化合物 Ｘ線結晶解析，NMR

タンパク質構造からファーマコフォアを取得

低分子ライブラリーの取得

長い時間がかかる

（4000円Ｘ320万種＝128億円）

タンパク質の 立体構造なし

•タンパク質の 立体構造なし

•作用物質の構造なし

作用物質構造を取得

立体構造規制ペプチド ヒット化合物

ペプチド・ライブラリー

・標的たんぱく質の立体構造がいらない：スピードアップ ・ライブラリー構築が容易：低コスト

（205 = 320万種類）

新手法

作用物質の構造からファーマコフォアを取得

高コスト

進化分子工学

立体構造規制ペプチドから低分子医薬へ： 新しい分子標的化合物の創出法

2008年の世界の医薬品売り上げ

順位 製品名 薬効 メーカー 分類 特許満了年

1 リピトール 高脂血症/スタチン ファイザー/アステラス 低分子 2011

2 プラビックス 抗血小板薬 サノフィ・A/BMS 低分子 2011

3 アトドベア/セレタイド 抗喘息薬 グラクソ・スミスクライン

/アルミラル 低分子 2010

4 リツキサン 非ホジキンリンパ腫 バイオジェン ・アイディ

ク/ロシュ モノクローナル抗体 2014

5 エンブレル 関節リウマチ/乾癬他 アムジェン/ワイス/ 武

田 抗体組み替えタンパク

製剤 2009

6 レミケード 関節リウマチ/クローン

病他 J&J(セントコア)/SP/田

辺三菱 モノクローナル抗体 2014

7 ディオバン 降圧剤/ARB ノバルティス/イプセン 低分子 2012

8 ネクシアム 抗潰瘍剤/PPI アストラゼネカ 低分子 2014

9 エポジェン 腎性貧血 アムジェン/J &J/ キリ

ン タンパク製剤 2004

10 アバスチン 抗がん剤/結腸・乳が

ん ジェネンテック/ロシュ モノクローナル抗体 -

11 ハーセプチン 抗がん剤/HER2乳がん ジェネンテック/ロシュ/

中外 モノクローナル抗体 2013

12 ジプレキサ 統合失調症薬 イーライリリー 低分子 2011

13 セロクエル 統合失調症薬 アストラゼネカ/アステ

ラス 低分子 2011

14 シングレア/キプレス 抗喘息/気管支喘息 メルク/キョーリン 低分子 2012

15 ヒュミラ 関節リウマチ/乾癬他 アボット/エーザイ モノクローナル抗体 -

抗体医薬品の台頭とその問題点

巨大タンパク質(MW:150 kD)

多数のジスルフィド結合による

構造形成

抗原性：ヒト化が必要

細胞膜を透過しない

動物細胞による生産が必要

特許の高い壁

問題点

抗体 150 kD

乳がんの手術後再発予防の治療費: 従来の化学療法剤による治療では50～60万円程度のところ、トラスツズマブ（ハーセプチン®）は300万円を超える。

Beyond Antibodies: 抗体から次世代抗体へ

抗体様分子標的ペプチドの創出

マイクロ抗体

ペプチド(MW:3-5 kD)

非抗原性：ヒト化が不必要

細胞膜透過性：細胞内タン

パク質が分子標的になる

化学合成が可能

コストが安い

特許の縛りがない

抗体 150 kD

ファーマコフォアの立体構造情報

低分子リード化合物 の設計と合成

バーチャル・ スクリーニング

立体構造規制ペプチド・ライブラリーの開発

作用ペプチド

研究戦略

コンビバイオによる ハイスループット・

スクリーニング

ファージ表層提示ライブラリー・スクリーニング

320万種類（205）の分子ライブラリーを１晩で調製することが可能

アンタゴニスト・アゴニスト

蛍光

大腸菌

増幅

選別

洗い出し

再感染

標的タンパク質 ペプチド・ライブラリー

マイクロ抗体

helix-loop-helix

ペプチドの分子設計

α-ヘリックス構造を有するペプチド・ライブラリーの分子設計

へリックス・ループ・へリックス構造

■35 アミノ酸から構成される。

■N-末端 a-へリックス、グリシン・ループ、C-末端

a-へリックス の３部分から構成される。

■ロイシン側鎖の疎水相互作用により２つのへリック

スが会合し安定化する。

■グルタミン酸側鎖とリジン側鎖の静電相互作用に

より２つのへリックスが会合し安定化する。

サイトカイン（a-ヘリックス含有たんぱく質）

IL-6, G-CSF: 関節炎治療薬

IL-4, IL-5:抗アレルギー薬、抗喘息薬

N C

G7

K22

X25 L12

L10

L6

L3

L23

L26

L30

L33

E9

A12

A8

A1 E2

K29

X24 A11

A4 A5

X31

X28

X32

A35

ライブラリー領域

構造支持領域

CD spectra of peptides

N-terminal segment C-terminal segment

α-ヘッリクス構造ペプチドの分子設計： ヘリックス・ル－プ・ヘリックス構造の安定性

A peptide library was displayed on gVIII coat protein of phage by a modification of the pComb8 system

α-ヘッリクス構造ペプチドのファージ・ディスプレイ・ライブラリ－

Library size: 1.8 x 106

Cell membrane

Cytoplasm

Cytokine Receptor Homologous Region

Ig-like

BN

FNIII-like

BC

Crystal structure of a complex of the receptor BNBC domain (CRH) with G-CSF

G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor ) 顆粒球コロニー刺激因子 白血球の１種である好中球の分化・増殖を誘導する糖タンパク質。分子量約1.8-2.2万で、ヒトで174アミノ酸から構成される。骨髄移植時の好中球の増加促進剤や抗ガン剤の副作用である好中球減少症の治療薬として使用されている。

G-CSF 受容体に対する親和性ペプチドの創出

1

2

3

4

G-CSF 受容体結合ペプチドの立体構造と受容体結合活性の相関

AELHALEHELAALEG(7)KLAALKAKLAALKAY

AELHALEHELAALEG(7)KLSDLKLKLPELKAY

AELHALEHELAALEG(7)KLSDLKLKLAELKAY

AELAALEAELAALEG(7)KLSDLKLKLAELKAY

peptide sequence Kd (µM)

scaffold 1

28

150 >1000

pep 2

pep 4

pep 5 3.8

G-CSFR分子標的ペプチドの特異性

N C

G7

K22

M25 L12

L10

L6

L3

L23

L26

L30

L33

E9

A12

A8

A1 E2

K29

A24 A11

A4 A5

R35

A31

L28

E32

P8-2KA

Kd = 214 nM % helix = 34 %

Y 0

40

80

120

G-CSFR

Human IgG

Peptide = 500 nM (BiaCore T-100)

SPR spectra

高い特異性：ヒトIgG-Fc, IL-4受容体,I L-5受容体, VEGFには全く結合しない。

時間（t）

分子標的ペプチドの最適化： BIACOREを用いたG-CSF受容体結合性ペプチドの熱力学解析

P8-2KA P8-2KA-S (Disulfide) P8-2KA-S (Thioether)

peptide conc.12.5 nM. temp.: 10 - 37 ℃

A Y C C

A Y C

S HN

O

Kd = 214 nM % helix = 34 %

Kd = 3 nM % helix =59 %

Kd = 4 nM % helix = 41 %

次世代抗体としての可能性

安定性？

非抗原性？

helix-loop-helix マイクロ抗体

次世代抗体としての可能性

バイオアッセイ：細胞増殖阻害試験

Peptides IC50

P8-2KA 50 μM P8-2KA-S 75 nM チオエーテル化P8-2KA-S 90 nM

チオエーテル化P8-2KA-S

P8-2KA

P8-2KA-S

細胞増殖阻害試験 NFS60細胞 : 4×104 G-CSF : 200pM

OD

570

ペプチド濃度（μM）

A Y C

S HN

O チオエーテル化

P8-2KA-S

A Y C C

P8-2KA-S P8-2KA

Kd = 214 nM IC50 = 50 µM

Kd = 3 nM IC50 = 75 nM

X 71

X 666

P8-2KA P8-2KA-S

血清中安定性試験

安定性試験 マウス血清中

peptides half life

P8-2KA 6.3 hour P8-2KA-S 5.25 day チオエーテル化P8-2KA-S 15.25 day

P8-2KA C末 0.5hour

半減期

チオエーテル化P8-2KA-S

P8-2KA

P8-2KA-S

P8-2KA C末

残存

ペプ

チド

量(%

)

時間（分） A Y C

S HN

O チオエーテル化

P8-2KA-S

A Y C C

P8-2KA-S P8-2KA

あああああああああああ

2 weeks

2 weeks 1 week

Titer

7/27 8/10 8/24 8/31

Balb/c mouse immunizatio

n immunizatio

n immunization

microAb

(50 µg/mouse) (1)

+ adjuvant*

microAb

(2)

KLH + adjuvant*

(3)

*Adjuvant: AbISCOTM (12 µg / mouse)

0

0 . 2

0 . 4

0 . 6

0 . 8

1

1 . 2

1 02 1 03 1 04 1 05

OD

49

0

d i l u t i o n s

microAb

microAb + adjuvant*

microAb-KLH + adjuvant*

Titration Curve

次世代抗体としての可能性: 非抗原性

proliferation Survival Permeability

Functions Migration Invasion

Lymphangio-genesis

angiogenesis Lymphangiogenesis Tumor growth

分子標的：血管内皮細胞増殖因子 Vascular endothelial growth factor (VEGF) VEGFは、脈管形成および血管新生に関与する一群の糖タンパク。VEGFは主に血管内皮細胞表面にある血管内皮細胞増殖因子受容体(VEGFR) にリガンドとして結合し、細胞分裂や遊走、分化を刺激したり、微小血管の血管透過性を亢進させる。正常な体の血管新生に関わる他、腫瘍の血管形成や転移など、悪性化の過程にも関与している。

抗VEGFマイクロ抗体の結合活性

KD : 3 nM Trx-49 KD : 300 nM Trx-42

Ｃompetitive binding assay with Trx-42 (VEGF 25 nM) for VEGFR-2

0 nM

1400 nM

700 nM 350 nM 175 nM 87 nM

VEGF 25 nM

thioredoxin-fused peptide

A C C

A

thioredoxin

細胞増殖阻害活性 ヒト臍帯静脈内皮細胞（Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells : HUVEC）

(Ala mutant) (anti-TNF α pep.)

立体構造規制ペプチドライブラリー ファージ表層提示法，酵母表層提示法

N C

G7

K22

X25 L12

L10

L6

L3

L23

L26

L30

L33

E9

A12

A8

A1 E2

K29

X24 A11

A4 A5 X3

1

X28

X32

A35

N C

K22

L12

L10

L6

L3

L23

L26

L30

L33

E9

A12

A8

A1 E2

K29

A24

A11

A4 A5 A3

1

A35

X16

X17

X20

X18

X19

A25

A32

A28

N C

K22

X25 L12

L10

L6

L3

L23

L26

L30

L33

E9

A12

A8

A1 E2

K29

X24 A11

A4 A5 X3

1

X28

X32

A35

X16

X17

X20

X18

X19

α−helical Loop α−helical-Loop

抗G-CSF受容体・マイクロ抗体（抗リューマチ薬） 抗ヒトIgG-Fc・マイクロ抗体（免疫不全治療，抗体精製） 抗TNF-α・マイクロ抗体（抗リューマチ薬） 抗血管内皮細胞増殖i因子（VEGF）・マイクロ抗体（抗がん薬） 抗キナーゼ・マイクロ抗体（抗がん薬：オーロラA, B） 抗hDM2・マイクロ抗体（抗がん薬：p53類似ペプチド）

タンパク質−タンパク質相互作用阻害

次世代抗体としての可能性

表層提示ライブラリーによるスクリーニングシステムの開発

安定性：マウス血清中 半減期 15.25日 抗原性：なし 細胞膜透過性：あり

酵母表層提示ライブラリーの構築: 2 X 106

次世代抗体医薬：立体構造規制ペプチド・ライブラリーによる 分子標的ペプチド（マイクロ抗体）の開発

本シーズの応用

次世代抗体医薬 診断薬 タンパク質アフィニティー担体

本技術に関する知的財産権

１）特願２０１０－１０５５８１ 「環境ペプチド」 ２）特願２０１２－１３９２４３ 「抗腫瘍ペプチド化合物」 ３）特願２０１２－１９０５５１ 「VEGF結合性ペプチド」 出願人 ：大阪府立大学 代表発明者 ： 藤井郁雄

お問い合わせ先

公立大学大阪府立大学

地域連携研究機構

産学官研究連携推進センター

知的財産マネジメントオフィス

菅谷 正

ＴＥＬ：072-254-9317

ＦＡＸ：072-254-9849

e-mail：cts24606@osakafu-u.ac.jp