expressão gênica através de ensaios com pcr quantitativo em tempo real fernando colbari do amaral

Expressão gênica através de ensaios com Expressão gênica através de ensaios com PCR Quantitativo em Tempo RealPCR Quantitativo em Tempo Real

Fernando Colbari do Amaral

Expressão

Expressão gênica

Estudos de Expressão GênicaEstudos de Expressão Gênica

Comparação de diferentes sistemas gênicosCélula normal vs tumor

Comparação da expressão gênica em diferentes tecidos

Função gênica específica

Comparação da expressão gênica em diferentes populações (cultura de células)(cultura de células)

Controle vs tratado

IsolamentoIsolamento

Extração de RNA total

mRNA´smRNA´s

Genes diferentes

Quantificação da expressão gênicaQuantificação da expressão gênica

Reação em Cadeia da Polimerase

RT-PCR semi-quantitativa

PCR em Tempo Real

Métodos de quantificação da Métodos de quantificação da expressão gênicaexpressão gênica

Primers/Sondas3´5´

DNA dupla fita

5´3´

dNTP

Taq DNA Polimerase

PCRPCR

Síntese de cDNASíntese de cDNA

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

5´ 3´

3´ 5´

Desnaturação

Anelamento

Extensão

PCR – 1° cicloPCR – 1° ciclo

AmplificaçãoAmplificação

Diluição seriada do cDNA

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 etc...

RT-PCR semi-quantitativaRT-PCR semi-quantitativa

cDNA em concentrações decrescentescDNA em concentrações decrescentes

1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:8 1:16 1:32 1:64 1:128

Amplificação na maior diluição corresponde a umamaior quantidade de cópias do gene na amostra

1:8 1:16 1:32 1:64 1:1281:8 1:16 1:32 1:64 1:128

PCR-quantitativoPCR-quantitativo

Método usado para medir a quantidade inicialinicial de ácidos nucléicos (DNA-RNA) que será amplificada por PCR – Sistema FluorescenteSistema Fluorescente

Validação da expressão gênica globalValidação da expressão gênica global

Microarray

SAGE

PCR-quantitativo - EficiênciaPCR-quantitativo - Eficiência

Preparo da reação (pipetas calibradas)

Qualidade do template (molde)

Desenho dos primers (dimers)

Condições de termociclagem

Concentração dos reagentes (MgCl2)

Tamanho do amplicon (50-150 bp)

CaracterísticasCaracterísticas

Fonte de excitação: Lâmpada de Tungstênio

“Sistema aberto” que permite uso de outros fluoróforos, desde que tenham compatível com os filtros disponíveis

Metodologia de aquecimento e resfriamento de bloco (desnaturação, anelamento e extensão)

Filtros

Sistema de detecçãoSistema de detecção

SYBRSYBR®® Green Green

Intercalante de DNA dupla fita

Fluoróforo em suspensão

Inespecífico

Curva de dissociação ou melting

Não permite multiplex

Curva de dissociação Curva de dissociação

• Obrigatória a realização quando utilizar o SYBR® Green – Inespecífico• Permite verificar se há um ou mais produtos de PCR presentes em cada reação• Realizada ao término da termociclagem

Sistema TaqManSistema TaqMan®®

Baseia-se na atividade 5’- 3’ exonuclease

Trabalha com sondas que contém fluoróforos

Específico

Permite Multiplex

Não necessita curva de dissociação

Sonda:

Quencher e Reporter na mesma molécula: transferência de energia

R Q5’ 3’

R Q5’ 3’

R

Q

Q

Q

R

R

Características da sondaCaracterísticas da sonda

Localiza-se de 1 a 5 pb do primer

Tm deve ser ~10°C maior Tm dos primers

A primeira base não pode ser G (Quencher)

Não pode ter mais G do que C e não deve ter 4 bases consecutivas iguais

Pode ter Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (Minor Groove Binder)

Condições de AmplificaçãoCondições de Amplificação

Condições Universais para desenho dos oligos:- Amplicon de 50 a 100 pb- Conteúdo de GC- Primers com Tm= 60°C e Sonda com Tm= 70°C

Condições Universais de Termociclagem:

Anelamentoe

Extensão

Desnaturação

Ativação da AmpliTaq GoldUracil-N-Glicosilase

TerminologiaTerminologia

Fase onde a intensidade de sinal de produtoamplificado ainda não ultrapassa a intensidadeda fluorescência encontrada no meio.

Baseline

TerminologiaTerminologia

ThresholdNível de fluorescência onde a reação édetectada durante a fase exponencial; linha decomparação entre as amostras

TerminologiaTerminologia

Cycle Threshold (CT)Ciclo (ponto no tempo) onde a reação cruzao limiar de detecção (Threshold)

TerminologiaTerminologia

Rn

Sinal do Reporter dividido pelo sinal de referência passiva(sinal do ROX). Normalização empregada para corrigirerros de pipetagem

Tipos de QuantificaçãoTipos de Quantificação

Expressão variável em diferentes tecidos ou diferentes fases do desenvolvimento

Músculo Pele Neurônio

+ + + + +

+ + +

+ + + +

Tipos de quantificaçãoTipos de quantificação

Quantificação AbsolutaDeterminação do número exato de moléculas.

Obtêm-se valores numéricos com alguma unidade, como número de cópias ou nanogramas de DNA.

Quantificação RelativaAnálise comparativa do ácido nucléico alvo com o do controle interno ou do calibrador

São comparados os Cts de cada amostra e os resultados representam ordensde grandeza (p.e: 5x mais ou menos expressão de um determinado gene).

Controle endógenoControle endógeno

Expressão constitutiva (GAPDH, β-actina, 18S)

Corrigir variações de eficiência da transcrição reversa

Corrigir a presença de inibidores

Corrigir diferenças na quantificação de RNA

Corrigir degradação de material (RNA)

Normalização dos resultados

Controle Endógeno ideal

Um bom normalizador é aquele cuja expressão gênica não tenha variação entre os tecidos submetidos a análise

Expressão em A = Expressão em B

Expressão no Tratado

Expressão no Controle= ~1

Quantificação absolutaQuantificação absoluta

Necessita de uma curva padrão

Quantificação absolutaQuantificação absoluta

Cálculos com curva Standard

C-myc GAPDH C-mycN C-mycN

Tissue ng Total RNA ng Total RNA Normalização

GAPDH

Relação cérebro

Cérebro 0.039 ± 0.004 0.54 ± 0.034 0.07 ± 0.008 1.0 ± 0.12

Rim 0.41 ± 0.016 1.02 ± 0.052 0.40 ± 0.025 5.5 ± 0.35

Fígado 0.70 ± 0.036 0.28 ± 0.013 2.49 ± 0.173 34.2 ± 2.37

Pulmão 0.93 ± 0.044 0.81 ± 0.041 1.15 ± 0.079 15.7 ± 1.09

C-mycGAPDH C-mycN

_______________________________________________

C-myc Calibrador

Quantificação relativaQuantificação relativa

Cálculos sem curva StandardC-myc GAPDH Ct Ct 2^-Ct

Tissue Average Ct Average Ct C-myc-GAPDH

Ct-Ct Brain

Rel. to Brain

Cérebro 30.49 ± 0.15 23.63 ± 0.09 6.86 ± 0.17 0.00 ± 0.17 1.0 ± 0.11

Rim 27.03 ± 0.06 22.66 ± 0.08 4.37 ± 0.10 -2.50 ± 0.10 5.6 ± 0.32

Fígado 26.25 ± 0.07 24.60 ± 0.07 1.65 ± 0.10 -5.21 ± 0.10 37.0 ± 2.52

Pulmão 25.83 ± 0.07 23.01 ± 0.07 2.81 ± 0.10 -4.05 ± 0.10 16.5 ± 1.10

Ct= Ct (alvo)- Ct (controle endógeno)

Ct= Ct (sample)- Ct (calibrador)

Quantidade Relativa = 2 -Ct

Ensaios customizadosEnsaios customizados

Primers e sondas no mesmo tubo. Elimina o passo de balancear as concentrações.

Foco em resultados: elimina tarefas manuais de desenho de primers/sondas

Elimina a necessidade de testar e otimizar ensaios no laboratório

Já vem nas condições universais de construção de primers e termociclagem

Custom TaqMan® Gene Expression

- Pesquisador envia a sequência e a empresa padroniza o ensaio, dispensando todas as validações o gasto de tempo e reagentes com padronizações.

TaqMan® Gene Expression Assays

- Kit pronto disponível (genes conhecidos)

TaqMan® Endogenous Control

- Kit pronto disponível

Considerações finaisConsiderações finais

Custo-benefício

Conhecimentos específicos

Validação de resultados

Interpretação estatística