escuela de biologÍa del medio ambiente
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UNIVERSIDAD DEL AZUAY
FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA
ESCUELA DE BIOLOGÍA DEL MEDIO AMBIENTE
EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE NEMATODOS
ENTOMOPATOGÉNICOS DEL GÉNERO Diplogaster SOBRE Permnotrypes vorax Hustache (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)
TRABAJO DE GRADUACIÓN PRESENTADO COMO EXIGENCIA PARCIAL
PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO
AUTOR:
PEDRO ASTUDILLO WEBSTER
DIRECTOR:
ING. WALTER LARRIVA CORONEL
DICIEMBRE 2005
ii
DEDICATORIA
A mis padres Marcelo y Celia, mi hermano Rafael por su empuje, a mis abuelos Rafico y
Aidita por sus ánimos, a mis tíos Pedro, Luca, Pili, Kiki, Cata, Ñaño por sus esfuerzos.
Este proyecto de tesis no hubiera sido posible sin el apoyo incondicional de toda mi
familia, para ellos este trabajo.
iii
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en las
personas de Walter Larriva y Catalina Bravo por la supervisión del trabajo en el
laboratorio, el desarrollo del pie de cría se llevó a cabo con la colaboración de Hernán
Lucero. Valoro la experiencia en el manejo de nematodos entomopatogénicos y el apoyo
técnico de Hernán Yumbla. Consideraciones a mis compañeros Danilo Mejía, Rommel
Macancela, Sebastián Vasco y Luis Muñoz por su colaboración en campo.
iv
TABLA DE CONTENIDOS
DEDICATORIA..................................................................................................................ii
AGRADECIMIENTOS......................................................................................................iii
TABLA DE CONTENIDOS..............................................................................................iv
LISTA DE FIGURAS........................................................................................................vi
LISTA DE TABLAS.........................................................................................................vii
RESUMEN.......................................................................................................................viii
ABSTRACT.......................................................................................................................ix
INTRODUCCIÓN..............................................................................................................1
Objetivos............................................................................................................................3
CAPÍTULO I
METODOLOGÍA..............................................................................................................4
1.1 Sitio de Estudio...............................................................................................4
1.2 Obtención de Premnotrypes vorax.................................................................4 1.3 Obtención de Diplogaster sp..........................................................................4
1.3.1 Producción de Madres..............................................................................4
1.3.2 Preparación del Medio de Cultivo............................................................5
1.3.3 Multiplicación de Diplogaster sp.............................................................5 1.4 Levantamiento de Datos.................................................................................5
1.4.1 Primer ensayo: Determinación de la dosis letal media (DL50)..................5
1.4.2 Establecimiento de las dosis para la inoculación......................................5
1.4.3 Segundo ensayo: Evaluación de Diplogaster sp frente a dos agentes de control................................................................................................................6
1.4.4 Análisis Estadísticos.................................................................................7
CAPÍTULO II
RESULTADOS..................................................................................................................8
2.1 Primer Ensayo..............................................................................................8
2.2 Segundo Ensayo...........................................................................................10
v
CAPÍTULO III
DISCUSIONES.................................................................................................................12
3.1 Infección de Premnotrypes vorax...................................................................12 3.2 Eficiencia de Diplogaster sp en el laboratorio................................................13 3.3 Diplogaster sp frente a agentes químicos y biológicos de control..................15
CONCLUSIÓN..................................................................................................................17
BILIOGRAFÍA..................................................................................................................18
ANEXOS............................................................................................................................21
Anexo 1. Cuadro de cálculo para el establecimiento de dosis..............................21
Anexo 2. Cuadro resumen de la mortalidad en el primer ensayo.........................22
Anexo 3. Cuadro resumen de la mortalidad en el segundo ensayo.......................23
Anexo 4. Análisis de significancia del primer ensayo (TUKEY
0.05)......................................................................................................................24
Anexo 5. Análisis de significancia del segundo ensayo (TUKEY
0.05)......................................................................................................................25
Anexo 6. Análisis de regresión para la dosis letal media (PROBIT –
REGRESIÓN NACH FINNEY............................................................................26
Anexo 7. Trampa cebo para la recolección de Premnotrypes vorax....................27 Anexo 8. Premnotrypes vorax parasitado por Diplogaster sp..............................28 Anexo 9. Trampa White para la recolección de Diplogaster sp...........................29 Anexo 10. Diplogaster sp recuperado en la Trampa White.................................30
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de la mortalidad de P. vorax en los tratamientos...........................8 Figura 2. Variación de la mortalidad de P. vorax por período de tiempo..........................10 Figura 3. Capacidad de control de P. vorax.......................................................................11
vii
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por Diplogaster sp....................................................................................................................9 Tabla 2. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por insecticidas..11
viii
RESUMEN
Es importante brindar una alternativa responsable al control de P. vorax en el laboratorio, para esto se recolectaron individuos adultos de P. vorax en el campo. Se inocularon dosis inundativas de nematodos entomopatogénicos del género Diplogaster sp sobre cinco individuos de P. vorax en cajas petri. Se determinó DL50 y la dosis más eficiente, para ser
evaluadas frente a insecticidas. En todos los tratamientos Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax. La DL50 es de 350 nematodos por adulto de P. vorax, la dosis más eficiente fue de 500 nematodos por adulto de P. vorax. Los insecticidas fueron más eficientes al causar la muerte de P. vorax que Diplogaster sp. Se discute la capacidad de infección y eficiencia de Diplogaster sp para el control de P. vorax en el laboratorio.
ix
ABSTRACT
A nonpesticide alternative to control P. Vorax is crucial. In order to test the ability of the nematode Diplogaster in controlling the P. Vorax pest, a breeding stock population of P. Vorax was obtained by collecting adult in the field. The most effective and lethal dose Diplogaster sp medium lethal dose and the most effective dose were determined by flooding dosages for five adult samples of P. Vorax placed on petri dishes. Pest control of the medium lethal dose and the most effective dose were compared to pesticide and
control groups, each treatment with five repetitions. In all treatments, Diplogaster sp distroyed P. Vorax.. The medium lethal dose was 350 nematodes per adult of P. Vorax and the most effective dose was 500 nematodes per adult of P. Vorax. However, the pesticide was more lethal in destroying P. Vorax than Diplogaster sp.
1
EVALUACIÓN DE LABORATORIO DE NEMATODOS ENTOMOPATOGÉNICOS
DEL GÉNERO Diplogaster SOBRE Permnotrypes vorax Hustache (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE)
INTRODUCCIÓN
Biocontrol con nematodos entomopatogénicos
La llegada de la revolución verde trajo impactos negativos a los ecosistemas mundiales y,
como consecuencia de aquello los plaguicidas desplazaron al control biológico. Sin
embargo, los muchos efectos adversos de los plaguicidas y el fracaso en el control de
muchas plagas ha provocado que el control biológico tenga un rol importante en la
agricultura actual. La agricultura en el neo trópico se caracteriza por fincas pequeñas de
subsistencia, diversidad de cultivos y plagas, en donde, se presentan problemas de
contaminación con plaguicidas, principalmente sobre el suelo, agua y la población
humana. Actualmente se reconoce al control biológico como una de las áreas principales
de investigación y es un componente importante en las iniciativas de agricultura
responsable de varias instituciones y organizaciones de la región andina (Cruz 1996).
Los nematodos entomopatogénicos son conocidos desde el siglo XVII, pero es desde
1930 que se los considera como una herramienta para el control de plagas en los cultivos
(Smart 1995). El énfasis sobre el control biológico de insectos pestes tiene como
consecuencia un incremento en el uso de nematodos como agentes de biocontrol (Nickle
et al 1988). Algunos nematodos juegan un papel importante en el control de poblaciones
de insectos y, ahora son, agentes decisivos en el control dirigido de plagas específicas de
insectos (Poinar 1999). Muchos nematodos atacan especies especificas, evitando de esta
manera el daño a demás organismos y bajo condiciones naturales no afecta a los
vertebrados, aunque existen otros grupos que prefieren un rango de hospederos y la
mortalidad de algunos artrópodos puede ocurrir (Bathon 1996). Los nematodos
entomopategénicos también pueden eliminar insectos pestes en sus diferentes estados y
estadíos, facilitando de esta manera el trabajo en el control de plagas en el campo (Fuxa
1987). Es importante mantener claro el concepto que solo la población de plagas es la que
se necesita eliminar, por lo que el uso de insecticidas elimina un porcentaje alto de la
Astudillo Webster, Pedro Evaluaciòn de Laboratorio de Nematodos Entomopatogènicos del gènero Diplogaster sobre Premnotrypes vorax Hustache (Coleoptera: Curculionidae) Ing. Walter Larriva Coronel 06/12/2005
2
comunidad de insectos presentes en los cultivos y, su persistencia en el ambiente puede
llegar a unos pocos días hasta algunos años, esto ocasiona contaminación al medio natural
(Larriva et al 1987).
Se ha descubierto que el uso de nematodos entomopatogénicos resulta una interesante
alternativa al control con pesticidas realizado en los cultivos. Esta oportunidad ha
permitido obtener un excelente control en las poblaciones de insectos perjudiciales de
permanencia en el suelo y de hábito rizófago. (Kaya y Gaugler 1993).
Diplogaster sp como nematodo entomopatogenico
Como los demás grupos de patógenos, los nematodos se dividen en dos categorías. La
primera llamada de “daño – rápido” (quickdamage) y la segunda nombrada “patógenos
lentos” (slow pathogens). El primero incluye nematodos que producen toxinas inyectando
al hospedero una bacteria, aunque algunos pueden matar directa o indirectamente, ésta
bacteria ocasiona una septicemia al hospedero, este deja de alimentarse alrededor de 24
horas y pocos días después muere (Fuxa 1987). Esta bacteria por lo general es del género Xenorhabdus o Photorhabdus (Kaya y Gaugler 1993). Diplogaster no lleva consigo estas
bacterias, que causan la muerte violenta del hospedero por septicemia. Se trata de un
género de nematodo cuya acción entomopatogénica está limitada a invadir aquellos
insectos débiles o con heridas, sobre todo cuando este se encuentra en el suelo (Larriva et
al 2004).
Generalidades de Premnotrypes vorax
El gorgojo de los andes (Premnotrypes vorax) destaca por su predominancia y amplia distribución en el área andina, desde los 2700 hasta 4000 m s.n.m. Esta plaga ocasiona
graves daños a los tubérculos en el campo que pueden llegar, en algunos casos, al 100%
de la cosecha (Alcázar 2000, Gallegos 1997). Las larvas barrenan los tubérculos
ocasionando en algunos casos pérdidas cercanas al 100% (Smith 1992). Los adultos se
desarrollan en el suelo del cultivo y se alimentan del follaje, dejando característicos cortes
en forma de medialuna en los bordes de la hoja de papa (Gallegos et al 1997).
Astudillo Webster
3
El adulto es un insecto de mide aproximadamente 7 mm de largo y 4 mm ancho. El
cuerpo es gris, aunque puede tomar la tonalidad del suelo, haciendo difícil su detección.
La cara presenta una tonalidad amarillenta y termina en un pico. La hembra es
ligeramente más grande que el macho, de aspecto redondeado y con una línea amarilla a
lo largo de la parte superior del abdomen. El macho es más pequeño, alargado y no
presenta la línea amarilla de la hembra. Hembra y macho no pueden volar porque sus alas
anteriores están soldadas entre sí, y las posteriores son atrofiadas. Sin embargo son muy
hábiles para caminar (Gallegos et al 1997)
La característica de dureza de los adultos de P. vorax hace que sea una plaga resistente al ataque de predadores y parásitos en general (Alcázar 2000) dificultando el ingreso de
nematodos entomopatogénicos (Mannion y Jansson 1992), por esta razón es muy
abundante en las zonas de producción de papa en el Ecuador (Gallegos et al 1997).
Esta particularidad hace de P. vorax un insecto “difícil” de parasitar y, al ser Diplogaster sp un nematodo con escasa información de su capacitad patogénica, se pretende conocer el alcance de este nematodo para controlar plagas, mediante el desempeño en la
mortalidad de P. vorax en el laboratorio.
Objetivos
Conocer la eficiencia de Diplogaster sp para controlar a Premnotrypes vorax en el laboratorio.
Establecer una dosis letal media (DL50) de Diplogaster sp para el control Premnotrypes vorax en el laboratorio
Determinar la dosis más eficiente de Diplogaster sp para el control Premnotrypes vorax en el laboratorio
Evaluar el control de Diplogaster sp frente a dos agentes de control en el laboratorio
Astudillo Webster
4
CAPÍTULO I
METODOLOGÍA
1.1. Sitio de Estudio
El proyecto se desarrolló en los laboratorios del Instituto Nacional Autónomo de
Investigaciones Agropecuarias (INIAP) ubicado en la localidad de Bullcay, cantón
Gualaceo provincia del Azuay.
1.2. Obtención de Premnotrypes vorax
Se necesitaron 325 individuos adultos, los cuales, fueron recolectados a través de trampas
“cebo”. La trampa puede medir 40 x 40 cm y consiste de tallo y hojas de papa, que son
cubiertas con un cartón, previo a su colocación el suelo tiene que estar apisonado para
facilitar la ubicación de la plaga (Gallegos et al 1997). Después de tres días, la trampa es
retirada y revisada. Se ubicaron 25 trampas en 1000 m 2 en parcelas cosechadas de papa,
en la localidad de San Antonio, cantón Cañar provincia del mismo nombre. La parcela
está ubicada a 3200 m s.n.m. de coordenadas UTM 17 9713986 S 731884 E. P. vorax fue adaptado a las condiciones de temperatura del laboratorio entre 15 – 17°C con abundante
alimento, durante tres semanas, al final de este período se realizó el ensayo con los
individuos sobrevivientes.
1.3. Obtención de Diplogaster sp
1.3.1. Producción de Madres
Se procedió a inocular en larvas de Spodoptera sp (Noctuidae: Lepidoptera) 1000 nematodos larva –1 , las larvas fueron obtenidas de un excedente de pie de cría de
investigaciones desarrolladas en el INIAP. Se observó diariamente las larvas hasta su
muerte por parasitismo, se esperó cinco días hasta que las madres empiecen a salir del
hospedero y se inoculó la larva en medio de cultivo. Se requirieron aproximadamente 70
larvas.
Astudillo Webster
5
1.3.2. Preparación del medio de cultivo
Se necesitó 500 cc de agua destilada calentada a 80°C en un termociclador, se esperó que
las paredes del vaso de precipitación se empañen y el agua alcance la temperatura
deseada, se adicionó 5 g de Agar agar y la barra magnética para ciclar, se mantuvo
durante 5 minutos hasta lograr eliminar la turbidez. En una cubeta se adjuntó 100 g de
alimento de perro y la mezcla del agua y el agar, se bate hasta obtener una sustancia
homogénea. La mezcla es colocada en cajas petri de 15 cm de diámetro, se divide todo el
medio por partes iguales. Las cajas petri con medio de cultivo fueron esterilizadas a
través del autoclave a 120 atmósferas de presión durante 20 minutos (Larriva et al 2004).
1.3.3 Multiplicación de Diplogaster
En cajas petri con medio de cultivo se inoculó la mitad de larva infestada con madres,
este proceso se lo realizó en una cámara de flujo. Todos los medios inoculados fueron
colocados en la estufa a 23°C, luego de 10 días se procedió a lavar los medios con agua
destilada. El agua obtenida es filtrada a través de tres tamaños de ojo de malla: 0.928 mm,
0.038 mm y 0.027 mm este último contiene los infectivos juveniles. Los nematodos son
ubicados en botellas de cultivo de tejido, con 80 cc de agua destilada para dejarlos en
suspensión.
1.4. Levantamiento de datos
1.4.1. Pr imer ensayo: Determinación de la dosis letal media (DL50)
Se realizaron nueve tratamientos, cada tratamiento es una dosis inundativa de Diplogaster sp inoculada sobre cinco individuos adultos de P. vorax, las dosis fueron de: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 nematodos adulto –1 (2500, 2250, 2000, 1750, 1500,
1250, 1000, 750, 500 nematodos por caja petri) suspendidos en 3 ml de agua destilada,
cada tratamiento tuvo cinco repeticiones, los nematodos utilizados fueron infectivos
juveniles. Las inoculaciones se realizaron en cajas petri de 9 cm de diámetro, en la base
fueron colocados dos hojas de papel filtro para mantener la humedad. Todos los
tratamientos fueron ubicados en gavetas oscuras a una temperatura entre 15 – 17°C.
Astudillo Webster
6
Después de la inoculación se realizaron lecturas diarias durante 20 días, y se separaron a
los individuos muertos, uno a uno en trampas White, que consiste en una caja petri de 9
cm de diámetro, en la base de la misma, se pone la tapa de una caja petri de 5 cm de
diámetro cubierta con papel filtro de 7 cm de diámetro, se vierte de 15 a 20 ml de agua
destilada (Larriva et al 2004), las trampas permanecieron en la estufa a 23°C por siete
días, después de este período, con un estereomicroscopio, se revisó el estado de la plaga y
el contenido del agua de la trampa, en busca de nematodos para saber si es que el
individuo murió por parasitismo o no.
Se contaron los individuos muertos, y se los separaron entre los parasitados y los que no,
fue anotado el número de replica al que pertenecían y el número del día en que murieron.
1.4.2. Establecimiento de las dosis par a la inoculación
Las botellas de cultivo de tejido que contienen en suspensión infectivos juveniles, fueron
vertidas en una caja magenta, con una micropipeta de 0.01 ml se tomaron cinco muestras,
a través del estereomicroscopio se contó el número de nematodos en cada muestra, se
obtuvo un promedio que fue extrapolado a un mililitro, se relacionó la dosis requerida con
la cantidad de nematodos por mililitro de agua y se obtuvo la cantidad necesaria por
unidad experimental, cinco veces este valor y se conoce el total por tratamiento. El
establecimiento de las dosis, las lecturas de las muestras obtenidas con la micropipeta, el
tamaño de la unidad experimental y los cálculos utilizados se describen en el Anexo 1.
1.4.3. Segundo ensayo: Evaluación de Diplogaster sp frente a dos agentes de control.
Se desarrollaron cinco tratamientos, cada uno con cinco repeticiones y cada unidad
experimental con cinco individuos adultos de P. vorax. El primer tratamiento es DL50 de Diplogaster sp suspendidos en 3 ml de agua destilada. El segundo es la dosis de Diplogaster sp de mayor eficiencia suspendida en 3 ml de agua destilada. El tercero un Biocida conformado por un extracto de Ají y Ajo en los siguientes porcentajes: Ají 10%,
Ajo 10% y Solventes Orgánicos 80% se utilizó la dosis comercial (sugerida por el
fabricante) de 10 ml de extracto en 1000 ml de agua destilada, fueron inoculados 3 ml de
Astudillo Webster
7
solución. El cuarto tratamiento es un insecticida químico convencional de sello azul,
moderadamente toxico (Larriva et al 1999) de nombre comercial VEXTER, de
ingrediente activo Clorpyrifos (órgano difosfato pyridine), se inocularon dosis
comerciales de 400 ml de insecticida en 200 000 ml de agua destilada (Edifarm 2002),
fueron inoculados 3 ml de solución. El último tratamiento, el testigo, fue inoculado 3 ml
de agua destilada. Se realizaron lecturas diarias durante 8 días de los tratamiento tres,
cuatro y cinco. Se consideró que los tratamientos uno y dos no se debían repetir, ya que
las condiciones del primero y segundo ensayo eran las mismas. El ensayo fue ubicado en
gavetas oscuras entre 15 – 17 °C de temperatura.
1.4.4. Análisis Estadísticos
En el primer ensayo los tratamientos fueron evaluados con un análisis de regresión
(PROBIT – REGRESSION NACH FINNEY) para conocer la dosis letal media, también
las dosis se evaluaron con un análisis de varianza (ANOVA) y análisis de significancia
(TUKEY, alfa 0.05) para determinar cual es la dosis más eficiente. El diseño es de
bloques completamente al azar.
En el segundo ensayo los tratamientos fueron evaluados con análisis de varianza
(ANOVA) y un análisis de significancia (TUKEY, alfa 0.05), para evaluar la eficiencia
de control de Diplogaster sp. El diseño es de bloques completamente al azar.
Astudillo Webster
8
CAPÍTULO II
RESULTADOS
2.1. Pr imer Ensayo
En todos los tratamientos Diplogaster sp ocasionó la muerte de P. vorax (Tabla 1), Según Tukey hay dos grupos de dosis que no difieren significativamente dentro de si (F = 6.95;
P < 0.05) en el primero, las dosis de 300 y 350 nematodos por adulto muestran 11
individuos parasitados (44%) cada una y, las dosis 150 y 200 nematodos por adulto
presentan 3 individuos parasitados (12%) y 4 individuos parasitados (16%)
respectivamente, el resto de tratamientos si varían significativamente entre si. El análisis
de significancia muestra que la dosis más eficiente es 500 nematodos adulto 1 con 19
individuos parasitados (76%) y, la dosis con menor mortalidad es 100 nematodos adulto 1
con 2 individuos parasitados (8%). Los tratamientos tienen un promedio 38.2% de
individuos parasitados y la mortalidad aumenta mientras la dosis de Diplogaster sp incrementa (Fig. 1).
DL50
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
100 150 200 250 300 350 400 450 500
Dosis (nematodos por P. vorax )
Mortalid
ad (%
)
Figura 1. Distr ibución de la mor talidad de P. vorax en los tr atamientos.
Astudillo Webster
9
El análisis de regresión Probit señala que la DL50 es 355,34 nematodos por adulto (P =
0.7968), siendo la dosis de 350 nematodos por adulto la más próxima y su diferencia es
pequeña, es considerada como la dosis letal media (Fig. 1).
Hasta 15 días después de la inoculación Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax. En todos los tratamientos, en los primeros ocho días se encuentra el mayor número de
individuos muertos, con un porcentaje promedio de 87,62%. Las dosis de 250, 150 y 100
nematodos por adulto, alcanzaron el 100% de su respectiva mortalidad al cabo de ocho
días (Tabla 1).
Tabla 1. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por Diplogaster sp
Nematodos por
P. vorax Días después de la inoculación
Total de individuos parasitados
en el tr atamiento
2 4 8 15 100 0% 0% 100% 100% 2 150 33,30% 33,30% 100% 100% 3 200 25% 75% 75% 100% 4 250 33,30% 66,70% 100% 100% 9 300 9.10 % 54,50% 90,90% 100% 11 350 36,40% 36,40% 81,80% 100% 11 400 41,70% 58,30% 83,30% 100% 12 450 13,30% 33,30% 73,30% 100% 15 500 63,16% 73,68% 84,21% 100% 19
La tabla muestra el porcentaje de mortalidad que alcanza cada tratamiento en función del tiempo. El porcentaje es relativo para el total de individuos parasitados en cada tratamiento.
En todos los tratamientos las dosis fluctúan cada día, no existe un patrón definido. Las
dosis 250, 300, 350, 400, 450, 500 nematodos por gorgojo en los primeros días muestran
buena cantidad de individuos parasitados, sin embargo después del día cuatro el número
de gorgojos muertos disminuye a excepción de las dosis 350 y 450. Las dosis más bajas,
tienen efecto entre el cuarto y octavo día después de la inoculación (Fig. 2).
Astudillo Webster
10
Figura 2. Var iación de la mor talidad de P. vorax por per íodo de tiempo
2.2 Segundo Ensayo
Los resultados de las dosis de 350 nematodos adulto 1 (DL50) y la dosis de 500 nematodos
adulto 1 (más eficiente) fueron evaluadas frente a dos insecticidas. El primero, Clorpyrifos
(VEXTER) ocasionó la muerte de todos los individuos de P. vorax. El segundo, Biocida (Extracto Ají y Ajo) también causó la muerte de todos los individuos de P. vorax. Clorpyrifos provocó la muerte violenta de todos los gorgojos hasta las 24 horas después
de la inoculación y el Biocida eliminó a todos los individuos de P. vorax en ocho días después de la inoculación (Tabla 2).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
100 150 200 250 300 350 400 450 500
Dosis (nematodos por P. vorax )
Individuos M
uertos
DIA4 DIA8 DIA12 DIA16
Astudillo Webster
11
Tabla 2. Cambios temporales en la mortalidad de P. vorax ocasionada por
insecticidas
Tratamientos Días después de la inoculación Total de individuos eliminados
1 2 4 8 15 Clorpyr ifos 100% 100% 100% 100% 100% 25 Biocida 48% 48% 96% 100% 100% 25
La dosis más efectiva de Diplogaster sp (500 nematodos por gorgojo) tuvo efecto hasta 11 días después de la inoculación parasitando a 19 individuos adultos de P. vorax de 25 y, la DL50 de Diplogaster sp (350 nematodos por gorgojo) tuvo efecto hasta 12 días después de la inoculación parasitando a 11 individuos adultos de P. vorax de 25. Según Tukey (0.05) no existe diferencia significativa entre los insecticidas siendo estos más efectivos
en el control de P. vorax. Las dosis con nematodos si difieren significativamente con todos los tratamientos (P < 0.05; F = 59.47) (Fig. 3).
Figura 3. Capacidad de control de P. vorax Los tratamientos Clorpyrifos y Biocida no difieren significativamente según TUKEY (0.05)
25(100%) 25(100%)
19(76%)
11(44%)
0 0
5
10
15
20
25
30
Clorpy
rifos
Biocida
500 (ne
matodo
s por ad
ulto)
350 (ne
matodo
s por ad
ulto)
Control
Tratamientos
Individu
os M
uertos
Astudillo Webster
12
CAPÍTULO III
DISCUSIONES
3.1 Infección de Premnotrypes vorax
A diferencia de los géneros de nematodos entomopatogénicos Steinernema y Heterorhabditidis que son conocidos por muertes más violentas (Kaya y Gaugler 1993), Diplogaster es un género que invade numerosamente al hospedero y, se aprovecha de insectos débiles o heridos (Larriva et al 2004). Al obtener el pie de cría de P. vorax de recolecciones de campo, la población del insecto plaga es muy variable y se puede
encontrar individuos enfermos, aunque este sesgo se lo corrigió con un período de
seguridad de tres semanas de adaptación a las condiciones del laboratorio, es probable
que los ensayos se hayan desarrollado con una pequeña cantidad de P. vorax que no estuvieron en las mejores condiciones, y en esos individuos Diplogaster sp tuvo facilidad de infección.
Las técnicas de defensa de los insectos al ataque de nematodos entomopatogénicos son un
factor muy importante que limita el control biológico, la encapsulación y melanización
dificulta el ingreso al hospedero (Poinar 1999). P. vorax se caracteriza por no dejar expuesto ningún segmento abdominal y presentar un cuerpo blindado (Smith 1992), en
general los coleópteros no tienen segmentos delgados de su cutícula, dificultando el
ingreso de los nematodos (Gaugler 1988), pero en las lecturas diarias se pudo observar
que Diplogaster sp, indistintamente del estado de salud de la plaga, ingresaban mediante dos vías: 1) Por la boca, es frecuente observar un constante movimiento de los palpos del
insecto que en pequeños intervalos la boca queda abierta, esto es aprovechado por el
nematodo para ingresar al hospedero. 2) Por el ano, al ser una población aleatoria el
número de machos y hembras no es regular y, es muy común observar la copula en las
cajas petri, los nematodos ingresan en el instante que se despliegan los aparatos genitales.
Astudillo Webster
13
Estas dos vías son muy comunes para el ingreso de nematodos entomopatogénicos
(Gaugler 1988, Kaya y Gaugler 1993), pero en especies de coleóptero estos orificios
naturales no se encuentran totalmente disponibles (Gaugler 1993), sin embargo Diplogaster sp presenta una ventaja, al ser un nematodo que actúa con una invasión masiva al hospedero (Larriva et al 2004), fue más fácil encontrar intervalos en el que la
boca y el ano quedan descubiertos en el cuerpo de P. vorax.
3.2 Eficiencia de Diplogaster sp en el laborator io
Todos los tratamientos ocasionaron la muerte de Premnotrypes vorax, pero la mortalidad no se pudo incrementar, ya que no se podía producir, en 3 ml de agua, dosis más altas en
suspensión. Las dosis reales por cada caja petri, desde la mayor hasta la menor van de la
siguiente manera: 2500, 2250, 2000, 1750, 1500, 1250, 1000, 750, 500 nematodos por
caja petri, se observó que más de 2500 nematodos en 3 ml de agua es difícil alcanzar,
para subir las dosis se necesita más volumen de agua, e inocular sobre los 3 ml representa
demasiada humedad y, los gorgojos empiezan suspenderse, el exceso de humedad afecta
a la supervivencia de P. vorax (Fernández 1997). Sin embargo se realizó un tratamiento
de 1000 nematodos por P. vorax (5000 nematodos por caja petri), el cual quedó excluido de los resultados por la alta mortalidad de Diplogaster sp, este tratamiento causó la muerte del 56% de gorgojos. La mortalidad de nematodos es alta cuando se inocula sobre
los 4000 nematodos por caja petri, el espacio disponible se limita en dos dimensiones
(largo y ancho) al inocular dosis altas, los nematodos se acumulan uno encima de otro,
limitando su espacio de acción y, causando de esta manera su muerte (Wang et al 2002),
es necesario realizar ensayos con nematodos entomopatogénicos en laboratorio, sobre
insectos poco susceptibles como especies de coleóptero, ya que, demuestran la capacidad
del nematodo para el control de la plaga y, su perspectiva para el control en el campo
(Wilson et al 1999).
Astudillo Webster
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Los nematodos dejan de ser eficientes para el control de plagas en el campo después de
varias semanas de no encontrar hospedero (Smart 1995). En el laboratorio después de
ocho días de la inoculación, pierden gradualmente la capacidad de parasitar (Wang et al
2002). En estos ensayos Diplogaster sp produjo mayores resultados dentro de los primeros ocho días, después la infección fue esporádica hasta 15 días, luego la infección
es nula. Dentro de los primeros cuatro días después de la inoculación los nematodos
entomopatogénicos son muy virulentos, pueden alcanzar porcentajes altos de control de la
plaga, que dependen de la especie de hospedero y de factores físicos del suelo (McCoy et
al 1992, Shapiro y McCoy 2000). La virulencia de los infectivos juveniles de Diplogaster sp disminuye después de 48 horas de extraídos del medio de cultivo, se realizaron inoculaciones de prueba que demostraron mayor eficiencia de control con nematodos con
pocas horas de extraídos del medio de cultivo.
Inoculaciones de nematodos entomopatogénicos de los géneros Steinernema y Heterorhabditidis en adultos Cylas formicarius (Coleoptera: Apionidae) en cajas petri, señalan que no existe resultados significativos en la mortalidad de la plaga (< 6%)
después de 4 días de la inoculación, debido al cuerpo bien esclerotizado de los
coleópteros en general, que dificulta el ingreso del nematodo (Mannion y Jansson 1992),
las larvas son más susceptibles a los nematodos entomopatogénicos (García del Pino y
Morton 2005) y los esfuerzos para controlar la plaga se centran en los juveniles (McCoy
et al 2002). Diplogaster sp pudo alcanzar una mortalidad entre 76% y 8% bajo condiciones de temperatura favorables para la plaga (15 – 17°C), porque los nematodos
se los multiplico bajo condiciones estables de temperatura (23°C), pudiendo ser la
diferencia de temperatura un factor que afecta la mortalidad del nematodo, por que se
presentan mejores resultados de control en temperaturas que fluctúan entre 26 30°C
(Shapiro y McCoy 2000). El mecanismo de invasión masiva al hospedero de Diplogaster sp (Larriva et al 2004) es un factor determinante en la eficiencia del control de Premnotrypes vorax, pudiendo magnificarse con temperaturas favorables para el desarrollo del nematodo.
Astudillo Webster
15
3.3 Diplogaster sp frente a agentes químicos de control
Los pesticidas órgano fosforados, como el clorpyrifos, son recomendados para el control
de Premnotrypes vorax en el campo (Gallegos et al 1997), bajo condiciones controladas los pesticidas en general se vuelven muy efectivos (Oliveira y Rodríguez 2002). En los
ensayos este insecticida, logró eliminar el 100% de la población de la plaga. La gran
toxicidad de los órgano fosforados permite obtener buenos resultados en el control de
pestes, pero a grandes costos ambientales (Oliveira y Rodríguez 2002). Por el contrario
los insecticidas naturales no tienen niveles altos de toxicidad y son fácilmente
degradables y, pocas veces son considerados para controlar plagas en cultivos grandes por
su capacidad de control limitada, sin embargo presentan una buena solución en granjas
pequeñas (Oliveira y Rodríguez 2002). En los ensayos el biocida también pudo ocasionar
la muerte del 100% de individuos de P. vorax. Es difícil alcanzar el grado de control de un insecticida químico, con el uso exclusivo de nematodos entomopatogénicos, pero
como parte de un manejo integrado de plagas se puede obtener un buen control de pestes
en los cultivos (Fuxa 1987), también las técnicas preventivas y de monitoreo de P. vorax permiten reducir los niveles de daño a los cultivos de papa (Gallegos et al 1997).
Llegar a controlar el 76% de individuos adultos de P. vorax en cajas petri para Diplogaster sp es muy bueno, considerando que las experiencias con este nematodo se limitan a larvas de Spodoptera sp (Lepidoptera: Noctuidae) y los géneros Steinernema y Heterorhabditidis tardan menos de la mitad del tiempo que Diplogaster sp para controlar larvas de plagas susceptibles (Larriva et al 2004). La ventaja mayor que llevan los
tratamientos clorpyrifos y el biocida frente a este nematodo, es el tiempo en el que pudo
llegar a ocasionar la muerte de P. vorax, mientras el insecticida químico logró provocar la muerte en menos de 24 horas, el biocida en ocho días, Diplogaster sp lo hizo en 11 días.
Hay mucho que aprender acerca de la biología, ecología y las relaciones con los
hospederos (Wang 2002). Diplogaster sp no es un género de nematodo entomopatogenico con el que se puede conseguir muertes más eficientes, como lo son Steinernema y Heterorhabditidis (Larriva et al 2004), incluso algunas especies de este género fueron descritas como nematodos oportunistas que se aprovechan de los desperdicios del ganado
(Sudhaus y Klaus 1990). Pero esta especie en particular, con la que se trabajó, ha podido
alcanzar resultados positivos, que los géneros tradicionales de nematodos
Astudillo Webster
16
entomopatogénicos, en muchos de los casos, no han podido lograr con especies de
coleópteros y curculionidos adultos. Es importante determinar la capacidad de control
bajo condiciones semicontroladas y controladas, realizar ensayos en contenedores con
suelo y con fuentes permanentes de alimento (McCoy et al 2002), recrear las condiciones
del hábitat de la plaga (Shapiro y McCoy 2000), evaluar la eficiencia del nematodo
frente a factores físicos del suelo como estructura y composición que contribuyen a la
variación de la eficiencia en el campo (McCoy et al 2002) deberían ser la próximas
investigaciones. No se puede utilizar a nematodos entomopatogénicos como medida única
de control (Fuxa 1987) contar con el concurso de medidas preventivas y técnicas
culturales de control de plagas (Fernández 1996) así como dosis subletales de químicos
ligeramente tóxicos u otros patógenos, permitirían que las plagas se encuentren más
susceptibles al ataque de nematodos entomopatogénicos (Wang 2002).
Es importante determinar la biología Diplogaster sp, evaluar su persistencia mediante la capacidad de reciclar infectivos juveniles en el cuerpo del hospedero, ampliar los estudios
con otras especies de plagas en el laboratorio y en el campo, conocer los diferentes
factores que rigen su rendimiento como agente de control, al ser un género diferente a los
nematodos entomopatogénicos comunes, es muy probable que los factores que ocasionan
la variación de la eficiencia actúen de diferente modo y, es fundamental determinar a que
especie pertenece este género, para validar aún más futuros trabajos que se desarrollen.
Astudillo Webster
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CONCLUSIÓN
Diplogaster sp al ser un género de nematodo entomopatogénico que invade
numerosamente al hospedero tiene más oportunidades de ingresar que algunas especies de Steinernema y Heterorhabditidis. Este mecanismo permite al nematodo encontrar pequeños intervalos en el que los orificios naturales de Premnotrypes vorax quedan abiertos y causar la infección, a pesar de su cuerpo bien esclerotizado.
En todos los tratamientos Diplogaster sp causó la muerte de P. vorax, sin embargo no se aumentó la mortalidad de 76%, por que no se pudo suspender más de 2500 nematodos en
3 ml de agua. Dentro de los primero ocho días, en todos los tratamientos, se obtuvieron
resultados significativos, después la mortalidad fue esporádica hasta 15 días, luego es
nula.
La virulencia de los infectivos juveniles de Diplogaster sp disminuye después de 48 horas de extraídos del medio de cultivo, es importante realizar la inoculación con nematodos
recién extraídos.
Alcanzar una mortalidad máxima del 76% de P. vorax es un gran logro, ya que la experiencias de Diplogaster sp se limitan a larvas de Spodoptera sp y por otra parte, los géneros tradicionales de nematodos entomopatogénicos (Steinernema y Heterorhabditidis) han alcanzado, en muchos de los casos, mortalidades menores al 6% en pruebas de laboratorio sobre coleópteros adultos en general.
Es imposible competir con la capacidad de control de los insecticidas químicos con el uso
exclusivo de Diplogaster sp, sin embargo se puede lograr buenos resultados con un manejo integrado de plagas, que en todos sus componentes se desarrollen actividades
preventivas y de monitoreo, hay que recordar que el control de insectos plagas depende
básicamente del conocimiento profundo de los factores que causan o favorecen la
abundancia de las especies involucradas, la supresión de estos factores, cuando ello es
posible, es la primera medida de control a ser aplicada
Astudillo Webster
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BIBLIOGRAFÍA
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Astudillo Webster
21
ANEXOS
ANEXO 1
Cuadro de cálculo para el Establecimiento de las Dosis
TRATAMIENTOS T1 T2 T2 T2 T6 T2 T2 T2 T2 Dosis Individuo 500 450 400 350 300 250 200 150 100 # P. vorax 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Total P. vorax 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Dosis Tratamiento 2500 2250 2000 1750 1500 1250 1000 750 500
11 11 11 9 9 9 11 11 11 13 13 13 8 8 8 10 10 10 9 9 9 10 10 10 8 8 8 10 10 10 12 12 12 9 9 9
LECTURAS
9 9 9 11 11 11 13 13 13 SUMA 52 52 52 50 50 50 51 51 51 PROMEDIO 10,40 10,4 10,4 10 10 10 10,2 10,2 10,2 Cant. ml. 1040,00 1040 1040 1000 1000 1000 1020 1020 1020 Cant. Unid. Exp. 2,40 2,16 1,92 1,75 1,50 1,25 0,98 0,74 0,49 Cant. Trat 12,02 108,17 96,15 87,50 75,00 62,50 49,02 36,76 24,51
Dosis Individuo: El número de nematodos por cada individuo de P. vorax # P. vorax: Es el tamaño de la unidad experimental Total P. vorax: Es la sumatoria de todas las repeticiones Dosis Tratamiento: El total de nematodos utilizados en todas las repeticiones
Cant. ml: Es la aproximación del contenido de nematodos en un ml de agua
(PROMEDIO x 100)
Cant. Unid. Exp: Es la cantidad de agua con nematodos en ml utilizada por cada unidad
experimental (DOSIS TRATAMIENTO / Cant. ml)
Cant. Trat: Es la cantidad de agua con nematodos en ml utilizada en todas las
repeticiones (CANT. UNID. EXP x 5).
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ANEXO 2
Cuadro resumen de la mortalidad en el pr imer ensayo
Nematodos por
P. Vorax Repeticiones
Número total de individuos parasitados en el tr atamiento
1 2 3 4 5 100 0 0 1 0 1 2 150 1 0 1 1 0 3 200 0 2 1 1 0 4 250 3 2 2 1 1 9 300 2 2 3 3 1 11 350 1 3 1 3 3 11 400 4 3 3 1 1 12 450 4 2 4 3 2 15 500 5 4 3 3 4 19
Astudillo Webster
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ANEXO 3
Cuadro resumen de la mortalidad en el segundo ensayo
Tratamientos Repeticiones Número total de individuos
eliminados en el tr atamiento
1 2 3 4 5 Clorpyr ifos 5 5 5 5 5 25 Biocida 5 5 5 5 5 25 500
nematodos adulto 1
5 4 3 3 4 19
350 nematodos adulto 1
1 3 1 3 3 11
Control 0 0 0 0 0 0
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ANEXO 4
Análisis de significancia del pr imer ensayo (TUKEY 0.05)
TUKEY (HSD) PAIRWISE COMPARISONS OF MEANS OF MUERT BY TRAT
HOMOGENEOUS TRAT MEAN GROUPS
1 3.8000 I 2 2.8000 I I 3 2.4000 I I I 4 2.2000 I I I I 5 2.2000 I I I I 6 1.8000 .. I I I 7 0.8000 .... I I 8 0.6000 .... I I 9 0.4000 ...... I
THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
CRITICAL Q VALUE 4.662 REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 1.9779 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.6000
1 500 nematodos por P. vorax
2 450 nematodos por P. vorax
3 400 nematodos por P. vorax
4 350 nematodos por P. vorax
5 300 nematodos por P. vorax
6 250 nematodos por P. vorax
7 200 nematodos por P. vorax
8 150 nematodos por P. vorax
9 100 nematodos por P. vorax
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ANEXO 5
Análisis de significancia del segundo ensayo (TUKEY 0.05)
TUKEY (HSD) PAIRWISE COMPARISONS OF MEANS OF MUERTOS BY TRAT
HOMOGENEOUS TRAT MEAN GROUPS
1 5.0000 I 2 5.0000 I 4 3.8000 .. I 3 2.2000 .... I 5 0.0000 ...... I
THERE ARE 4 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER.
CRITICAL Q VALUE 4.232 REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 1.1667 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 0.3898
1 Clorpyrifos 2 Biocida 3 350 nematodos por P. vorax 4 500 nematodos por P. vorax 5 Control
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ANEXO 6
Análisis de regresión para la dosis letal media (PROBIT REGRESSION NACH
FINNEY)
ProbitRegression nach Finney
Konzen tr ation
Konzen tration (log)
n r (% ) r (cor r .)
Empi r ische Probit
Expec ted
Probit P z (y0) Wor king
Probit Weighting coefficient
Weight (nW)
x muertos Y (Y1) y nW 500,00 2,70 25 19 76,00 76,0% 5,71 5,5 0,6764 0,3593 5,69 0,5897 11,8 450,00 2,65 25 15 60,00 60,0% 5,25 5,3 0,6249 0,3792 5,25 0,6135 12,3 400,00 2,60 25 12 48,00 48,0% 4,95 5,2 0,5646 0,3937 4,95 0,6305 12,6 350,00 2,54 25 11 44,00 44,0% 4,85 5,0 0,4945 0,3989 4,85 0,6366 12,7 300,00 2,48 25 11 44,00 44,0% 4,85 4,8 0,4139 0,3896 4,85 0,6258 12,5 250,00 2,40 25 9 36,00 36,0% 4,64 4,5 0,3233 0,3591 4,64 0,5896 11,8 200,00 2,30 25 4 16,00 16,0% 4,01 4,2 0,2256 0,3004 4,03 0,5164 10,3 150,00 2,18 25 3 12,00 12,0% 3,83 3,9 0,1285 0,2098 3,83 0,3932 7,9 100,00 2,00 25 2 8,00 8,0% 3,59 3,3 0,0475 0,0990 3,66 0,2166 4,3
Steigung der Regression = Summe xy / Summe xx = 2,9908b +/ s = 1,1504 Ordinatenabschnitt = 2,6284 a Die korrigierte LogitRegression lautet y = 2,6284 + 2,9908 x Chi2 = 1,666317041 1,666 Prüfung auf Anpassung der kor rigierten ProbitRegression Die Anpassung der Geraden an die Beobachtungen ist gut p weil Chi2 = 1,6663 << Chi2(Tab:0,05) 9,49 0,7968 Schätzung des DL50Wer tes
DL50: 2,5506m Antilog: 355,34 +/ s = 31,6563584 (= S.E. L50)
DL50 (~ Konzentration) = 350 Schätzung der Standar tabweichung des L50Wer tes
sL50: 0,0387 s m Antilog: 1,0932 Schätzung der Standar tabweichung der Regressionssteigung b
sb2 = 1,3233 V(b) 10m 355,3354649
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ANEXO 7
Trampa cebo para la recolección de Premnotrypes vorax
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ANEXO 8
Premnotrypes vorax parasitado por Diplogaster sp
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ANEXO 9
Trampa White para la recolección de Diplogaster sp
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ANEXO 10
Diplogaster sp recuperada en la Trampa White
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