cinétique enzymatique equation de michaelis et menten

Cinétique enzymatique

Equation de Michaelis et Menten

Les trois phases d’une réaction enzymatique:

• ≤ msec: « phase initiale »

(formation du complexe ES)

• quelques minutes (heures):

« état stationnaire » ( [ES]

constant, vitesse constante )

• Après quelques heures:

« approche de l’équilibre »

(disparition progressive du

substrat, vitesse diminue)

Incubation longue (généralement quelques heures):

)(

][

t

P

Etat Stationnaire:

Incubation moyenne (généralement quelques minutes):

Pro

duit

Temps

On parle d’état stationnaire tant que la vitesse de la réaction reste constante.

[S]=1 mM

[S]=3 mM

[S]=10 mM

[S]=30 mM

A l’état stationnaire: lorsque la concentration du substrat, [S], augmente, la vitesse initiale de la réaction, v, augmente

hyperboliquement.

0 50 1000

50

100

[Substrat]

vit

esse

Interprétation???

Observations:

• Quelque soit la concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [E].

• A faible concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [S] . La loi d’action des masses nous apprend que si v=[E][S] c’est que la réaction passe par une étape:

E+S-- >P

• A forte concentration de S, la vitesse ne dépend plus de [S] mais reste proportionnelle à E

Hypothèse:

• La vitesse est en fait proportionnelle à [ES] ?

[E]+[S] [ES] [E]+[P]

E S ES E Pk cat

k 1

k 1

( )

d Pd t

k ES vcat

( )( )

[ ]

La loi d’action des masses prédit que:

Tant que [ES] reste constant, le produit apparaît à une vitesse constante: on parle alors “d’état stationnaire”

Méthode traditionnelle de calcul:

• On pose: 1. état stationnaire,

• 2. Conservation des masses:

( )[ ][ ] [ ] [ ]

( )

( )[ ]

( )

cat

cat

d ESk E S k ES k ES

d t

d Pk ES v

d t

-= - - =

= =

1 1 0

[ ] [ ] [ ]totE ES E+ =

]][[)][]([ 111 SEkkkSkES totcat

0][][])[]]([[)(

)(11 ESkESkESESk

td

ESdcattot

( )[ ][ ] [ ] [ ]

( ) cat

d ESk S E k ES k ES

d t -= - - =1 1 0

0][][]][[]][[ 111 ESkESkSESkSEk cattot

1

1

1

1

k

k

kkSk

SEkES

cat

tot

)][(

]][[][

11

1

11][

]][[][

kkkS

SEES

cat

tot

11][

]][[][

kkkS

SEkESkv

cat

totcatcat

1][

][

][

][ maxmax

M

M

M KS

KSV

KS

SV

[ ]catv k ES=

Méthode alternative:

[ ] [ ] [ ]{ }

[ ][ ] [ ]{ }max

totE E ES

SV

Ev

E

ES

= +

+=

[ ][ ]

[ ] cat tot

tot

k EE

ESv=

[ ][ ]

max

tot

ES

Ev

V=

[ ] [ ]Quelles sont les valeurs

relatives de et ?E ES

[ ]max

lorsque tout l'enzyme est occupé:

cat totV k E=

≤1

max

max

max

devient:

1

M

M

M

M

v VE

E S Kv V

E E S K

S

ES

ES

Kv V

S K

A l'état stationnaire,

donc

M

M

ES

E

S

S

EK

E S K

A l'équilibre: D

E SK

ES

(mais l'équilibre n'est pas atteint:

à l'état stationnaire, ES est consommé pour donner E+P!)

[ ][ ][ ] [ ] [ ]

[ ][ ] ( )[ ]

[ ][ ][ ]

( )

Reste à définir . A l'état stationnaire:M

M

k

k

k

k k

k

K

E S ES E P

d ESE S ES ES

dt

E S ES

k

k

k

E S

k

Kk

S

k

E

-

-

-

-

¾¾®+ ¾¾® +¬¾¾

= =

+

=+

- -

=

=

2

1

1

1 2

1 2

1

1

1

2

1

0

MKS

SVv

max

Représentation de Michaelis-Menten

Une autre façon de voir les choses:

Traditionnellement, on étudie les enzymes purs,

agissant sur des substrats purs, dans un tube à

essai.

On s’intéresse de plus en plus aux enzymes tels

qu’ils fonctionnent en cascade, « in vivo », et

non pas isolés dans un tube à essai.

On parle alors de « flux enzymatique »:

Le moindre étranglement entre deux « bassins » peut provoquer le débordementdes bassins en amont, l’interruption du flux en aval… Quelles sont les conséquences d’une modification de KM, d’une diminution de Vmax?

Imaginons la voie métabolique comme unCanal dont le flux est régulé par une série d’écluses:

Forme de l’ouverture de l’écluse?

Nous allons calculer la forme de l’écluse, tel que le flux de l’eau s’écoulant du bassin précédent se comporte comme le « flux enzymatique » à travers une réaction Michaelienne:

[ ]( )

[ ]( )

[ ]( )[ ]

La surface sous une fonction est donnée par son intégrale.

Si " " représente la forme de l' "écluse" qui permet

l'écoulement:

=

donc =

fct S

fct S v

vfct S

Sdd

ò

[ ][ ]

[ ][ ]( ) [ ]( )

[ ]( )

[ ]( ) [ ]( ) [ ]

[ ]( )

[ ]( )

[ ]( )

M

M

M

M

M

M

M

donc v

v

K S

K S

K S

K S

V

K S

K

K

S

V V S

V V V S

S

S

vS

VvS

dd

dd

dd

=

-=

-

+

+

+

=

=

+

+

+

2

max

max max

max max max

ma

2

2x

: si

1

[ ][ ]M

V SK S De o

mn

Num+

max est une équation de la forme

Num Num Denom DenomDenom

Numm

dDeno

æ ö -÷ç =÷ç ÷è ø 2

' '

u u v uvdv v

-æö÷ç =÷çè ø 2

' '

0 2 4 60

50

100

[Substrate] / KM

v (in

% o

f V

max

)

[Substrate] / KM

d (v

) /

d ([

S])

in %

of

(Vm

ax /

KM)

Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:

[ ]

La surface de l'ouverture représente la vitesse

de la réaction.

L'orifice devrait être plus large à la base puisque

la vitesse augmente (proportionnellement)

plus lorsque S est faible.

L'orifice devrai

[ ]max

t se "resserer" vers le haut:

lorsque S augmente, .v V®

• Surface = vitesse – Plus large en bas

(v ↑ si [S]↑)

– Étroit en haut (vVmax)

– Largeur maximale: en [S]0, dv/dSVmax/KM

– Largeur minimale:– en [S]∞, dv/dS0

Représentation de la “porte d’écluse”

[Substrate] / KM

d (v

) /

d ([

S])

in %

of

(Vm

ax /

KM)

“Enzyme lock” gate

[Sub

stra

te ]

Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:

[ ]

La surface de l'ouverture représente la vitesse

de la réaction.

L'orifice devrait être plus large à la base puisque

la vitesse augmente (proportionnellement)

plus lorsque S est faible.

L'orifice devrai

[ ]max

t se "resserer" vers le haut:

lorsque S augmente, .v V®

• Surface = vitesse – Plus large en bas

(v ↑ si [S]↑)

– Étroit en haut (vVmax)

– Largeur maximale: en [S]0, dv/dSVmax/KM

– Largeur minimale:– en [S]∞, dv/dS0

Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:

(Vmax/KM)

[S]↑

[ ]

v

S

**************

a2

m x

Surface sous la courbe = Flux

si courbe : M

M

v

S

V K

K S

[ ] ( )MM

vS

S KV

Kdd

= = maxen [ 4

] ,

maxen [ ] 0, ;

M

v

S

VS

K

Réactions en présence d’un mélange de plusieurs substrats

possibles:

Spécificité et KS

0 200 400 600 800 10000

200

400

600

800

1000

Vmax 100, Km 10, Ks 10Vmax 1000, Km 1000, Ks 1

Substrat

Vite

sse

S1 et S2 séparés:

P1

P2

Spécificité:

Supposons une enzyme capable d’agir sur deux substrats, S1 et S2: comment savoir quel est sur quel substrat elle agira « de préférence » si ils sont présents simultanément dans la cellule ou mélange réactionnel étudié?

1 enzyme, 2 substrats mélangés:

S1 ES1 + P1 E + E S2 ES2 + P2

([

?

]

]

?

)

([

?

)

ca

c

t

at

v k E

v k ES

v

S

v

=

=

=

1 11

1

2 22

2

KS:mesure de la spécificité d’une enzyme

KS=kcat/KM permet de quantifier la vitesse relative de la réaction d’intérêt lorsque l’enzyme est en présence de plusieurs substrats (« spécificité):

[ ]

[ ]Alors,

cat

SM

cat S

M

k E S

kv K SE SK

K SKvé ù é ùê úë û

é ùé ù ê úë=

û

ê ú

ê

=

ú

ë

ë û

û22 2 2

22

11

1 111

[ ][ ]et: cat cat S

M

E Sv k ES k K E S

K

é ùê úë ûé ù é ù= = =ê ú ê úë û ë û

2

2 2 2 2 2 22

[ ][ ]

Si cat cat S

M

E Sv k ES k K E S

K

é ùê úë ûé ù é ù= = =ê ú ê úë û ë û

1

1 1 1 1 1 11

1 1

2 2

v Sv S[

est constant si reste cons]

]

[tant!

« KS » et vitesse d’association E●S

[ ][ ]

[ ] [ ][ ] [ ][ ] [ ] [ ]

[ ][ ]

M

cattot S tot

M M

ass

ass S

V Sv

K S

V kv S E S K E S E E

K K

v k E S

k K

®

= ®+

= = » »

=

max

max

vitesse de réaction: en [S] 0,

( )

vitesse d'association E-S:

Donc, la constante apparente d'association, , est équivalente à

catass S

M

kk K

K= =

Autre signification de KS:

1

1

1 1 1

1

1 11

1

1

cat

cat c

cat cat catS

M cat cat

k kc

at

cat cat

at

S

k k kkK

K k k k k k

k k E S ES E P

k kK k

k

k

k kk k

- -

-

= = =+ +

+ ¾¾® ¾¾¾® +

= » =+

° °

-

( ) / ( )

enzyme "parfait" ( <<< ) :

( ) ( )

mesure le nombre de rencontres E-S :

à T normale (20-37 C), " 9 1 11

5 7 1 11

1 11

10

10 10

S

k M

k à M

K k M

- -

- -

- -

£

»

£ £ 9

petits substrats": sec

"Grands substrats" (protéines) : habituellement, sec

est donc toujours 10 sec

Limite maximum de KS ?

Modification de l’équilibre?

[ ][ ]

Les enzymes ne modifient pas l'équilibre entre [S] libre et [P] libre.

On peut donc écrire: à l'équilibre,

et eq

PK v v

S= =

r s

Equilibre: relations de Briggs-Haldane

[ ][ ]

Supposons la réaction

l'enzyme catalyse la transformation de A B,

et catalyse également la réaction inverse B A

Il se trouve devant deux "substrats": A et B; donc

A l'équilibre,

ASBS

A B

K Avv K B

v

®

®

=

ƒ

rs

r [ ][ ]

[ ][ ]

donc: ASBS

AS

eqBS

K Av

K B

B KK

A K

= =

= =

1s

L’équilibre ne peut être modifié par les enzymes.

La catalyse est donc toujours « aussi efficace » dans un sens que dans

l’autre?

Réactions à « sens unique »:

max maxPour que ,

alors que :

il suffit que

PS

eq SS

S PM M

V V

KK

K

K K

>>

= »

>>

1

uuuur suuuu

Exemple: SAM synthase

2 + puis

Le produit est inhibiteur:

lorsque SAM 0.03mM : voir graph

i iMet ATP H O PP P SAM

max

max

max max

,

à l'équilibre: 1

Pour que 10

Il faut que 10

M

M

SSSP PS

Met ATP SAMM M

K

V KKK

K V K

V V

K K

**************

<

*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<0 200 400 600 800 1000

0

5000

1 104

[ATP] (µM)

vite

sse

0 200 400 600 800 10000

5000

1 104

[Met] (µM)

vite

sse

Enzyme « idéale »?

k1 grand, k-1 petit, kcat grand :

Spécificité, efficacité?

Comment varie la vitesse de la réaction lorsque x augmente de …%?

Δ[S]

v

Δv

[S]

?

][][

SS

vv

Si [S] grand, v augmente moins vite que [S]. Pour exprimer cette relation: écrire

F Num x Denom xF xx Num Denomx

d d d d dd

æ ö÷ç= - ÷ç ÷çè ø

F x F NumF Fx F x Denomx

d dd d

= = =? avec

2

NumNum Denom NumDenomDenom

x Denom

d

d

æ öæ ö÷÷ç ç ÷÷ç ç ÷ç ÷ æ ö-è øç ÷ ÷ç ç=÷ ÷ç ç÷ ÷çè øç ÷ç ÷÷ç ÷çè ø

' '

2

Num DenomNumx F Denom x xxF x Num Denom Denom

d dd d dd

æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷ç ÷÷çè ø

[ ][ ]

[ ][ ]

[ ][ ]

[ ][ ]

( )

( / )( / )

/ /

( )

( )

cat

cat

cat

cat cat

cat

kk Sv

k k k S

N Dv N Dvk kk k

N k D kk

N D

k S Sk

kk S k k k S

k S

k k k S

dd

d d

d d d d

-

-

-

=+ +

=

æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø

æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø

= -+ +

1

1 1

1 1

1 1

1 11

11 1 1

1

1 1

1

Si k1 augmente de …%?

[ ]( )

( )cat

cat

v k kvk k k k Sk

d

d-

-

+=

+ +1

1 1 1

1

Evolution de la vitesse quand k1 augmente:

Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec k1,

d’autant plus que k1 petit.

0 50 1001

0

1

1

1k

kv

v

k1

[ ][ ]

[ ]

[ ]

( )

( / )( / )

/ /

( )

cat

cat

cat

cat

kk Sv

k k k S

N Dv N Dvk k

k k

N k D kk

N D

kk k k S

kk k k S

dd

d d

d d d d

-

- -

- -

- --

--

-

-

=+ +

=

æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø

æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø

=-+ +

1

1 1

1 1

1 1

1 11

11 1

1

1 1

10

Conclusion: la vitesse de la réaction diminue lorsque k-1 augmente, d’autant plus que k-1 grand.

lorsque k-1 augmente de …%?

vv

kk

d

d -

-

1

1

0 50 1001

0

1

[k-1]

[ ][ ]

[ ][ ] [ ]

[ ][ ]

[ ]

( )

( / )( / )

/ /

( )

( ) ( )

cat

cat

cat cat

cat cat

cat catcat

catcat cat

cat

cat cat

kk Sv

k k k S

N Dv N Dvk k

k k

N k D kk

N D

k Sk

kk S k k k S

k k Skk k k S k k k S

dd

d d

d d d d

-

-

-

- -

=+ +

=

æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø

æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø

+= - =

+ + + +

1

1 1

1

1 1 1

1 1

1 1 1 1

1

1

Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec kcat,

d’autant plus que kcatest petit.

lorsque kcat augmente de …%?

cat

catk

kv

v

0 50 1001

0

1

[kcat]

Pour résumer:

• La réaction sera d’autant plus rapide (à 1 concentration de substrat donnée) que:– k1, (reconnaissance enzyme-substrat), est

grand;

– kcat, (transformation de ES en E+P) est grand,

– k-1, (dissociation du substrat avant transformation), est faible.

Comment augmenter la spécificité de l’enzyme?

1. Vaut-il mieux que le ‘bon’ substrat ait un grand KS? Que le ‘mauvais’ substrat ait un faible KS? Ou les deux?

2. Comment faire? (Comment varie KS en fonction de k1, k-1 et kcat?)

Suffit-il d’augmenter KS pour le « bon » substrat?

Une enzyme sera considérée comme « spécifique » si elle agit sur un seul substrat, même en présence de nombreux autres composés très semblables.

Pour atteindre ce but, il ne suffit pas que la valeur du KS du « bon » substrat soit élevée:

Il faut que: [ ] [ ] pour tous les substrats

alternatifs présents dans le milieu réactionnel!

S SK S K S>>1 1 2 2

Comment varie KS lorsque k1 augmente de …%?

1

0

11

1

1

1

1

1

catcat

catS

S

cat

cat

M

catS

kkkk

kk

kk

KK

kk

kk

K

kK

La constante de spécificité augmente proportionnellement à k1.

k1 reflète le nombre de collisions « productives » entre enzyme et substrat: varie peu d’un composé à l’autre (sauf si ‘guidage’ par interactions ioniques)

S

S

cat

cat

KK

kk

k1

lorsque k-1 augmente de …%?

1

1

11 1 1

1

1

1

0 1

cat catS

M cat

S

S

cat cat

cat

k k kK

K k k

KK

kk k k k k

k

k

k k

KS diminue lorsque k-1 augmente, d’autant plus que k-1 est

grand.les substrats qui dissocient lentement du site actif avant transformation seront transformés de préférence. Importance d’interactions à courte distance.

0 50 1001

0

1

k-1 ou kcat

1

1

S

S

KK

kk

1

1

1

1 1

1

1

1

1

1

cat catS

M cat

S

Scat

cat cat cat

cat

cat

cat

cat

k k kK

K k k

KK k

kk k k k k

k

k

k k

k

k k

0 50 100

1

0

1

S

S

cat

cat

KK

kk

kcatKS augmente avec kcat, surtout si kcat faible

lorsque kcat augmente de …%?

Résumé: variation de KS

• KS est toujours proportionnel à k1.

• KS diminue si k-1 augmente, surtout si k-1 grand.

• KS augmente avec kcat surtout si kcat petit

Spécificité ou efficacité? En résumé:

•Si l’enzyme peut utiliser deux (ou plusieurs) substrats: pour

qu’il soit spécifique, il faut que KS = kcat/KM diffère le plus

possible d’un substrat à l’autre.

•La vitesse de la réaction et KS augmentent lorsque k1 augmente,

lorsque kcataugmente et lorsque k-1 diminue : le guidage

électronique et la rétention du substrat dans le site actif peuvent

augmenter à la fois la vitesse de réaction et sa spécificité.

Analyse cinétique: linéarisation

• Lineweaver-Burke,• Hanes ou Woolf,• Eadie - Hofstee,• Linéaire direct

Avantage: statistiquement correct (y varie, x constant)Inconvénient: non linéaire! Analyse difficile.

Michaelis Menten:

Double réciproque : Lineweaver-Burk (1934)

SV

K

Vv

m 111

maxmax

Très populaire: diminue souvent l’impression de dispersion des résultats.Problème: erreurs amplifiées à petit substrat donc grand 1/S (à droite du graphe).

Hanes, ou Woolf

[ ][ ]

[ ]

[ ][ ]

max max

max max

M

M

KS S

v V S V

S KS

v V V

æ öæö ÷ç÷ç ÷ç= +÷ ÷ç ç÷ç ÷è ø ÷çè ø

= +

1 1

1

Avantage: les erreurs sont « normalisées » et ≈ constantes.Inconvénient: toute erreur sur KM est reportée sur Vmax.

Eadie-Hofstee:

v

v/[S]

Vmax

Vmax/KM

Pente: -KM

[ ]max M

vv V K

S= -

Rare. Les erreurs sont « obliques », et amplifiées  à haut [S]!Avantage: très sensible à toute déviation de «Michaelis-Menten ».

Graphique direct linéaire(Eisenthal et Cornish-Bowden)

Principe: Chaque paire de valeurs v et [S] est

compatible avec une infinité de valeurs de KM

et Vmax, distribués sur une droite d’équation:

équivalente à: [ ]

[ ]

max

max avec ,

en

en ;

M

M

vV v K

S

y a bx y V x K

ay x S

b

x y a v

= +

= + = =

= =- =-

= = =

0

0

Application: tracer chacune de ces droites: leur intersection correspond à la seule valeur de KM et Vmax qui soit compatible avec tous les résultats.

v1v2

v3

S1 S2 S3

[S]

v

KM

Vmax

En réalité, pas intersection « unique » (erreurs exp.). Il faut chercher le centre de gravité de toutes les intersections…

Pas pour publication, (pas « joli »), mais pratique pour estimer Vmax, KM sur un coin de table de labo…

v

[S]

v1v2

v3

S1 S2 S3

v4

S4

Constantes:

Définitions et dimensions

KM

( )

APPROXIMATION GROSSIERE: l'équilibre n'est pas atteint! L'affinité

du substrat est surévaluée:

et

Donc:

D M

D M

kkK K

k k

K K

k--+

= =1

211

1

=

Parfois, pas toujours : inutile pour identifier le « vrai » substrat!

"La constante est une mesure de l'affinité (ou plutôt de la constante

de dissociation) de l'enzyme pour son substrat." : Vrai ou faux ?

MK

[ ]" " Vrai ou faux?MK S»

• KM = (k-1 + kcat )/ k1 :

– k1 : M-1sec-1

– k-1 : sec-1

– kcat : sec-1

• KM : (sec-1)/(M-1sec-1) = 1/M-1 = M

KM est une concentration (M ou mol/l)

Dimensions:

Vmax

• La vitesse maximum ou Vmax est une limite théorique,

jamais atteinte en pratique! (Il est impossible d’obtenir une concentration infinie en substrat!)

• On peut néanmoins utiliser cette limite pour estimer le nombre de molécules de substrat transformées par le complexe enzyme substrat en une seconde, minute, etc.

• Ce « turnover number » (débit) donne une idée de l’efficacité de la catalyse, surtout quand on le compare avec la réaction non catalysée…

v et Vmax : mol/sec ou mol/min

Quantité d’enzyme: vitesse, exprimée en « Unités » (µmol/min), ou en « katals » (mol/sec)

Quantité d’enzyme : dimensions

Quantité d’enzyme:Unités courantes

• Unité (U): quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 µmole de substrat

par minute dans les conditions standard (généralement à 25°C, dans les conditions

optimales de pH, et de force ionique, en présence des cofacteurs et coenzymes

nécessaires en quantité suffisante…).

Typiquement, de l’ordre de 0.1 – 100 μg d’enzyme pur, ou de l’ordre de 0.1 - 100 mg

pour les préparations industrielles d’enzyme.

Remarque: les conditions de mesure de l’activité doivent être clairement définies

par le fournisseur!

Unités « CGS » (internationales)

• katal (kat), quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 mole de substrat

par seconde dans les conditions standard.

(1 kat = 60 000 000 U ou quelques kilos d’enzyme pur; 60 U = 1µkat).

• (Problème: une mole = 180 g de glucose, quelques kilos de protéine…!)

KS

( )

La constante est une mesure de la constante apparente de

vitesse d'association du complexe enzyme-substrat:

S

catS

cat

K

kkK k

k k-

= £+1

11

• KS = k1kcat / (k-1 + kcat ) :

– k1 : M-1sec-1

– k-1 : sec-1

– kcat : sec-1

• KS : (M-1sec-1) (sec-1) / (sec-1) = M-1 sec-1

KS a les dimensions d’une constante de

vitesse d’association

Dimensions:

Un flux minimum peut être indispensable pour permettre la survie:

• Plutôt que de calculer la vitesse imposée par la [S], on devrait calculer la [S] nécessaire pour maintenir une certaine vitesse.

Survie impossible

Vitesse deproduction

[Substrat] nécessaire

1

][

:

][1

][][

][][

][

][

max

max

max

max

max

v

V

KS

donc

Sv

VK

SSv

VK

Sv

VSK

SK

SVv

M

M

M

M

M

Nécessité d’autres modèles:

• Enzymes allostériques: – Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au

substrat, ni au produit de la réactionExemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …

• Enzymes coopératives:– Courbe cinétique de forme « sigmoïde » (vitesse de réaction

proportionnelle à [S]n lorsque [S] est faible)

Remarque: la majorité des enzymes coopératives sont également régulées allostériquement, et beaucoup d’enzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au moins un substrat!

Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate transcarbamoylase bactérienne

0 20 400

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

0 5 100

0.5

1

[SUBSTRAT] (mM)

VIT

ES

SE

ZOOM:

+ATP

+CTP

Controle +ATP

+CTP

Controle

Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles;activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles

Aspartate Transcarbamoylase bactérienne

INACTIVE (T) ACTIVE (R)

Vue du haut: C

C

C

C

CR

R

RR

Vue de profil:

R

C

C

Forme de la courbe: justification?

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Conformation RConformation TEnzyme allostérique (2sites)

L’enzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R

0 0.2 0.4 0.6 0.8 10

0.5

1

[S]

[S]

vitesse

vitesse

T

R

T

R

AMP

Sucres (glycogène)

Enzyme allostérique de type « V »:la glycogène phosphorylase

Ser-PO4

Sites actifs

Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparement pas grande différence au niveau des vitesses?

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)

Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique:

{orifice large à la base, de plus en plus étroit car la vitesse augmente moins que [S] à toutes [S]}

{orifice étroit à la base, s’élargit (la vitesse augmente plus que [S] lorsque [S] est très faible), puis redevient très étroit (la vitesse augmente moins que [S] lorsque [S] est grand)}

0 0.1 0.2 0.30

0.1

0.2

0.3

Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)

[Substrat]

vite

sse

Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat:

Enzyme Michaelienne:v varie moins que S,pente max en [S]0

Enzyme coopérative:v varie plus que S

pente ≈ 0 en [S]0

Enzymes coopératives:

Modèle de Monod, Jacob et Changeux

Modèle de Koshland, Nemethy et Filmer

Monod, Jacob et Changeux:TR

SS

S S

SS

S S

nn

nn

n

n

T

R

cL

cLY

R

TL

K

Sc

K

S Si

)1()1(

)1()1( 11

Koshland, Nemethy et Filmer:

S

S

SS

S S

Equation encore plus complexe

(2 complexes ES2 différents)

La réalité: un mélange de ces deux modèles?

SS S

SS S

SS S

SS S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

S

R TTTTT

Régulation d’une enzyme coopérative par des régulateurs allostériques:

0 2 4 6 8 100

0.5

1

Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)Enzyme allostérique activé (T/R = 10)Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)

Inhibiteur stabilisant T

Activateur, stabilisant R

Régulation d’une enzyme coopérative et allostérique:

Inhibiteur stabilisant la conformation « T »