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155

Chapitre 3Les Enzymes

156

Médicaments ciblés sur des enzymes

157

Médicaments ciblés sur des enzymes

158

Plan– 3.1 Structures et propriétés des enzymes.

• 3.1.1 La catalyse enzymatique.– 3.1.1.1 Comparaison récepteurs-enzymes.– 3.1.1.2 La spécificité enzymatique.– 3.1.1.3 Caractéristiques de la catalyse enzymatique.

• 3.1.2 Le rôle des coenzymes.– 3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP).– 3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine.– 3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN).– 3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX.– 3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A.

• 3.1.3 Les substrats d’enzymes comme médicaments.

– 3.2 Inhibition et désactivation des enzymes.• 3.2.1 Définitions.

– 3.2.1.1 Déficience ou excès en un métabolite.– 3.2.1.2 Invasion par un organisme étranger.– 3.2.1.3 Reproduction anarchique des cellules.– 3.2.1.4 Le choix des enzymes cibles.

• 3.2.2 La résistance aux médicaments.• 3.2.3 Le synergisme.• 3.2.4 Classification des inhibiteurs d’enzymes

– 3.2.4.1 L’inhibition non covalente.– 3.2.4.2 L’inhibition covalente.

• 3.2.5 Inhibition non covalente.– 3.2.5.1 Inhibiteurs rapidement réversibles.– 3.2.5.2 Analogues d’états de transition et analogues multisubstrats.– 3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs à intéraction lente.

• 3.2.6 Inhibition covalente.– 3.2.6.1 Les marqueurs d’affinité.– 3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides.

159

3.1 Structures et propriétés des enzymes

a) Structure primaire

Dans chaque cellule : ~ 500 enzymes

160

3.1 Structures et propriétés des enzymes (suite 1)

b) Structure secondaire

161

3.1 Structures et propriétés des enzymes (suite 2)

c) Structure tertiaire d) Structure quaternaire

De 2 à 60 sous unités (le plus souvent de 2 à 8) conduisent àdes masses moléculaires allant de 35,000 à plusieurs 100,000.

162

3.1.1 La catalyse enzymatique

3.1.1.1 Comparaison récepteurs-enzymes

Récepteur Complexe

Réponse

+ Ligand Récepteur + Ligand

Enzyme Complexe+ Substrat

Complexe Enzyme + Produit

reconnaissancereconnaissance

reconnaissancereconnaissance

catalysecatalyse

163

3.1.1.2 La spécificité enzymatique

164

3.1.1.3 Caractéristiques de la catalyse enzymatique

H2O2 → H2O + 1/2 O2pas de catalyseur: ∆G≠ = 18 kcal/molplatine: ∆G≠ = 12 kcal/molperoxydase: ∆G≠ = 2 kcal/mol

165

Le site actif

166

Raisons de la catalyse

E S Ks

E.S

Kcat

E.P E P+ →

← →←

→← +

sans enzyme

avec enzyme +

énergie de liaison

avec enzyme +

énergie de liaison+

déstabilisation

167

Moyens de la catalyse

1) Approche des espèces réactives

2) Catalyse nucléophilique (covalente)

168

Moyens de la catalyse (suite)

3) Catalyse générale acido-basique

4) Catalyse électrostatique

5) Torsion du(es) substrat(s)

169

3.1.2 Le rôle des coenzymes

Site actif Site actif

fonctionnelfonctionnel

cofacteurcofacteur

enzyme inactiveenzyme inactive enzyme activeenzyme active

cofacteurscofacteurs

ions mions méétalliquestalliques(oligo(oligo--ééllééments)ments)

coenzymescoenzymes(petites mol(petites moléécules organiques)cules organiques)

liens non-covalents

liens covalents groupes prosthétiques

Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, Mo+, K+...

170

3.1.2 Le rôle des coenzymes (suite 1)

Source : vitamines

171

3.1.2 Le rôle des coenzymes (suite 2)

Autres sources

vitamine

172

3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP)

173

3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 1)

174

3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 2)

175

3.1.2.1 Le phosphate de pyridoxal (PLP) (suite 3)

176

3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine

177

3.1.2.2 L’acide tétrahydrofolique (THF) et les nucléotides à pyridine (suite)

178

3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN)

Les flavo-enzymes catalysent une grande variété de réactions d’oxydo-réduction et de mono-oxygénation car le tricycle iso-alloxazine très conjugué est un excellent accepteur d’électrons, qu’il peut prendre un électron à la fois ou deux d’un coup.

OPO3– :

flavine mono nucléotide (FMN)

179

3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN) (suite 1)

180

3.1.2.3 Les flavines (FAD et FMN) (suite 2)

La monoamine oxydase (MAO) est une flavo-enzyme qui est responsable du catabolisme de plusieurs neuro-transmetteurs comme la norépiné-phrine et la dopamine.

181

3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX

Le hème est une porphyrine contenant du Fe(III). On le retrouve dans les enzymes à cytochrome P-450 principalement dans le foie ou avec certaines flavo-enzymes elles dégradent les xénobiotiques.

182

3.1.2.4 Le hème ou protoporphyrine IX (suite)

Après réduction du Fe3+ en Fe2+ , il y a liaison d’oxygène et formation d’une espèce Fe4+ qui est responsable des réactions d’hydroxylation et d’époxydation de composés normalement peu oxydables.

183

3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A

Les enzymes qui dépendent de l’ATP servent au transfert de plusieurs substrats.

Un substrat nucléophile peut attaquer l’ATP

- au phosphore γγγγγγγγ pour transférer un groupe phosphoryle (cassure a),

- au phosphore ββββββββ pour transférer un groupe diphosphoryle (cassure b)

ou un groupe adénosine diphosphoryle (cassure c),

- au phosphore αααααααα pour transférer un groupe adénosine monophosphoryle (cassure d)

- ou à la position 55’’ pour transférer un groupe adénosyle (cassure e).

184

3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A (suite 1)

Dans le cas de la conversion des acides gras en leurs dérivés acylco-enzyme A, qui sont des substrats pour l’acyl- CoAdéhydrogénase, l’ATP est utilisé pour activer l’acide carboxylique sous forme d’ester d’adénosine monophosphate. Ce composé réactif réagit avec le thiol nucléophile du coenzyme A.

185

3.1.2.5 L’adénosine triphosphate et le coenzyme A (suite 2)

Les thio-esters du coenzyme A ont 3 fonctions principales pour différentes enzymes:

1) Les thio-esters sont très réactifs vis-à-vis des nucléophiles (réaction d’acylation).2) Ils sont importants pour le transport des molécules et leurs liaisons aux enzymes.3) Le proton en α devient plus acide donc plus facile à retirer.

186

3.1.3 Les substrats d’enzymes comme médicaments

Maladie de Parkinson : [dopamine]cerveau ↓

187

3.2 Inhibition et désactivation des enzymes

3.2.1 Définitions

MaladieMaladie

⇓⇓⇓⇓ou

⇑⇑⇑⇑en

[m

étab

olit

e]

invasion

par organ

isme étran

ger

reproduction anarchique des cellules

188

3.2.1.1 Déficience ou excès en un métabolite

3.2.1.2 Invasion par un organisme étranger

3.2.1.3 Reproduction anarchique des cellulesBiochimie n’est pas ≠≠≠≠Division cellulaire rapide ⇒⇒⇒⇒ Demande accrue en métabolites essentiels⇒⇒⇒⇒ inhiber les enzymes qui produisent les métabolites essentiels (antimétabolites)

Toxicité sélective (chimiothérapie)

Biochimie ≠≠≠≠ ⇒⇒⇒⇒ Possibilité d ’inhiber des enzymes spécifiques à l’envahisseur.

189

3.2.2 La résistance aux médicaments

1) Modification de l’absorption. La membrane plasmique peut ajuster sa charge nette.2) Surproduction de l’enzyme cible.3) Modification de l’enzyme cible. Il en résulte une moins bonne affinité pour le médicament.4) Surproduction d’une enzyme destructrice du médicament.5) Élimination d’une enzyme activant le médicament. Dans le cas ou le médicament est délivrésous une forme masquée (prodrogue), l’enzyme nécessaire pour l’activer cesse de fonctionner.6) Surproduction du substrat de l’enzyme cas des sulfamides.7) Nouveau chemin métabolique vers le produit de l’enzyme cible.

190

3.2.3 Le synergisme

1) Le médicament 2 inhibe une enzyme destructrice du médicament 1.2) Bloquage séquentiel. Dans le cas d’une inhibition compétitive du médicament 1, il est impossible de bloquer l’enzyme cible à 100%, le chemin métabolique n’est pas bloqué. En inhibant 2 enzymes consécutives de ce chemin, il devient possible

de l’inhiber totalement.3) Inhibition d’un autre chemin métabolique conduisant au même métabolite.4) Inhibition de l’enzyme cible par 2 médicaments. Une cellule sur 107 peut devenir résistante àun médicament; les chances d’en trouver qui résistent à 2 médicaments sont donc de 1 sur 1014.

L’antagonisme: 1+1=0.La sous additivité: 1+1<2.L’additivité: 1+1=2.Le synergisme: 1+1>2.Le synergisme: 1+1>2.

191

3.2.3 Le synergisme (suite)

l’association pyriméthamine-sulfadoxine présente une synergie antiparasitaire séquentielle qui permet la prise de doses efficaces moindres et diminue la toxicité pour l’hôte

ExemplesExemples

l’antituberculeux isoniazide qui inhibe la réplication du bacille de la tuberculose et le bactéricide rifampicine (inhibiteur de l’ARN-polymérase) sont utilisés additivement pour traiter la tuberculose

Inhibe l’ARN-polymérase

inhibe la réplication du bacille

Bloquage séquentiel

Bloquage additif

(antibactérien)

(tuberculose)

Même chemin métabolique

Deux chemins métaboliques différents

192

3.2.4 Classification des inhibiteurs d’enzymes

Non covalente

Réversible

Covalente

Irréversible (inactivation)

3.2.4.2 L’inhibition covalente

3.2.4.1 L’inhibition non covalente

193

métabolite important dans la division cellulaire

Les inhibiteurs rapidement réversibles sont des analogues de substrats, dans leurs états fondamentaux, dont les structures ont été modifiées afin d’interdire la réaction catalytique normale, ou du moins la ralentir, tout en préservant une bonne affinité pour l’enzyme.

Ce sont rarement des inhibiteurs puissants.

3.2.5 Inhibition non covalente3.2.5.1 Inhibiteurs rapidement réversibles

inhibiteur compétitif (Ki=19µM)

§ L’ornithine décarboxylase

194

prévient le catabolisme d’agents cytotoxiques

uridine ribose 1-phosphate uracile

5-fluoro-2’-désoxyuridine-5’-monophosphate (5-F-dUMP)

⇒ Synergie avec agents anticancéreux

§ L’uridine phosphorylase

195

Antibactérien

Affinité enzyme bactérienne

Affinité enzyme humaine

Bactérie seulement

= 10,000

§ La dihydroptéroate synthétase

§ La dihydrofolate réductase

ptéroyglutamatesynthétase

196

3.2.5 Inhibition non covalente (suite)

3.2.5.2 Analogues d’états de transition et analogues multisubstrats

Postulat de Hammond

Une enzyme, pour catalyser une réaction, doit avoir une meilleure affinité pour le substratdans l’état de transition (TS) que pour le substrat dans sont état fondamental.Après la formation de la combinaison de reconnaissance de Michaelis (E.S), l’enzymedéveloppe une affinité accrue, mais très transitoire pour le substrat lorsqu’il atteint l’état de transition. La stabilisation de TS par le site actif implique la mise en place de nouvelles liaisons (par exemple hydrogènes ou électrostatiques) qui n’existaient pas dans la combinaison E.S.

197

3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition

Des analogues glucidiques possédant en C-1 un carbone trigonal ou qui, de par leur charge positive, miment la déficience électronique de l’état de transition, sont de puissants inhibiteurs des glycosidases.

L’action catalytique de ces enzymes provient de leur possibilité de stabiliser des ions oxocarboniums.

sp3sp3 sp2sp2

cancer, infections virales, diabète (type II)…

Km des substrats pyranosidiques (1-3mM)

1-désoxynojirimycine (Ki=0.6nM) contre la sucrase

N-acétylglucosamine-lactone (Ki=0.5µM) contre la β-N-acétylglucosaminidase

§ Les glycosidases

198

3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 1)

sp3sp3sp2sp2

Des molécules qui miment les intermédiaires réactionnels tétraédriques sont des inhibiteurs très puissants des peptidases.

§ Les peptidases

199

§ Les peptidases (suite)

3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 2)

sp2sp2

sp2sp2

sp2sp2

sp3sp3

sp3sp3

sp3sp3

Chymotrypsine (Ki=0.16nM)

Chymotrypsine (Ki=10nM)

Élastase (Ki=0.8µM)

200

3.2.5.2.1 Analogues d’états de transition (suite 3)

Cytidine (Km=0.21mM)

Phosphopyrimidine nucléoside (Ki=0.9nM)

coformysine (Ki=0.2nM)

sp2sp2

sp2sp2

sp3sp3

sp3sp3

anticancereux

Adénosine (Km=31µM)

§ Les nucléosides désaminases

201

3.2.5.2.2 Analogues multisubstrats anticancereux

AdoDato (Ki=20nM)

Des enzymes importantes dans la biosynthèse des polyamines (la spermidineet la spermine sont nécessaires pour la synthèse des ADN) catalysent le transfert d’un reste aminopropyle à partir de S-adénosyl-L-méthionine décarboxylée (dcAdoMet).

L’analogue multi-substrat S-adénosyl-1,8-diamino-3-thiooctane (AdoDato) combine en une molécule des éléments structuraux de la putrescine et de la dcAdoMet, les deux substrats de la spermidine synthétase, en cours de réaction. Il possède pour le site actif de l’enzyme une meilleure affinité que chacun des substrats seul.

§ La spermidine synthétase

202

3.2.5.2.2 Analogues multisubstrats (suite 1) anticancereux

PALA (Ki=27nM)

Une inhibition efficace de cette enzyme peut entraîner l’arrêt de la croissance et de la division cellulaire, par déficit en nucléotides nécessaires à la synthèse d’ARN et d’ADN.

En amont de la voie de biosynthèse des pyrimidines (cytosine et thymine), l’aspartate transcarbamylasecatalyse le transfert d’un résidu carbamyle, à partir de carbamyle phosphate, sur la fonction amine de l’aspartate.

L-aspartate (Km=17mM)

§ L’aspartate transcarbamylase

Carbamyl-phosphate (Km=27µM)

203

3.2.5 Inhibition non covalente (suite)

3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente

Ki < 10–9M

Pour les inhibiteurs à haute affinité, les lois cinétiques classiques de Michaelis-Menten sont modifiées car la [inhibiteur libre] ≠ [inhibiteur total].

204

3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente (suite 1)

Pro

du

it f

orm

é

Temps (min)

avec inhibiteur classique

avec inhibiteur classique (liaison rapide)

avec inhibiteur

avec inhibiteur àà interaction lente

interaction lente

Progression d’une réaction enzymatique en fonction du temps

K+1 << 109 M–1 s–1

K+1 ~ 109 M–1 s–1 (vitesse de diffusion)

Inhibiteur à interaction lente: Phase transitoire de quelques minutes plutôt quedes millisecondes. Valeurs faibles pour K–1 (t½ > quelques secondes, mêmedes jours et des années).

205

3.2.5.3 Inhibiteurs à haute affinité et inhibiteurs àinteraction lente (suite 2)

Pro

du

it f

orm

é

Temps (min)avec inhibiteur classique

avec inhibiteur classique (liaison rapide)

avec inhibiteur

avec inhibiteur àà interaction lente

interaction lenteProgression d’une réaction enzymatique

en fonction du temps

Ki*< 10–9Mk6 << k5 ⇒ Ki* << Ki

Une première combinaison E.I se forme rapidement suivie d’une étape lente, conduisantà une combinaison plus affine E.I*. AvantageAvantage: : ↑↑↑↑↑↑↑↑ [[substratsubstrat] ] nn’’aa pas pas dd’’effeteffet..

206

biosynthèse des stérols

Ki* = 1.4 × 10 – 11 M

< 10–9 M

K +1 = 2.1 × 10 6 M – 1 min – 1

K – 1 = 3 × 10 – 5 min – 1

K+1 << 109 M–1 s–1

(vitesse de diffusion)

§ L’isopentenyl pyrophosphate isomérase

207

biosynthèse du cholestérol

Ki* = 0.24 × 10 – 9 M

< 10–9 M

K +1 = 2.7 × 10 7 M – 1 s – 1

K – 1 = 6.5 × 10 – 3 s – 1

K+1 << 109 M–1 s–1

(vitesse de diffusion)

⇒ inhibition presque irréversible

éétape limitante parmi 26tape limitante parmi 26

CompactineCompactine

§ L’hydroxyméthylglutaryl coenzyme A réductase

208

§ La dihydrofolate réductaseantibactérien

Ki* = 9 × 10 – 12 M

209

Téprotide: pGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro

§ L’enzyme de conversion de l’angiotensinerégulation de la

pression artérielle

210

régulation de la pression artérielle

Glycoprotéine liée à la membrane

Structure peu connue

Métalloprotéase (Zn) comparable à une autre protéase de structure connue: la carboxypeptidase A.

§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 1)

211

§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 2)

régulation de la pression artérielle

212

régulation de la pression artérielle

Ki* = 1.8 × 10 – 10 M

K +1 = 2 × 10 6 M – 1 s – 1

K – 1 = 3.6 × 10 – 4 s – 1

ÉÉnalaprilatenalaprilate

- démangeaisons - perte du goût

§ L’enzyme de conversion de l’angiotensine (suite 3)

213

3.2.6 Inhibition covalente2 types d2 types d’’inhibition covalente inhibition covalente

Marqueurs d’affinité Inhibiteurs suicides

E + I Ki

E.I Kinact

E - I

→←

→

Marqueurs d’affinité

actifs dès le départ.

Inhibiteurs suicides

inertes au départ.

214

3.2.6.1 Les marqueurs d’affinité

Les marqueurs d’affinité classiques sont pour la plupart, des analogues de substrats dans leurs états fondamentaux, modifiés pour accommoder des fonctions réactives (par exemple électrophiles) et qui présentent dans l’idéal une bonne affinité pour les sites de liaison d’enzymes cibles.

E + I Ki

E.I Kinact

E - I

→←

→

Étant donné que les marqueurs d’affinité ont des fonctions réactives, ils peuvent réagir avec des milliers de nucléophiles autre que ceux situés dans le site actif de l’enzyme cible.

Ce sont donc des drogues potentiellement toxiques (très utilisées en chimiothérapie du cancer).

Il est possible d’obtenir des drogues non toxiques en augmentant l’affinité pour le site actif cible (très petit Ki).

215

thiazolidine

β-lactamedihydrothiazine

§ La transpeptidase

216

§ La transpeptidase thiazolidine

β-lactamedihydrothiazine

PeptideStructure Structure du

PeptidoglycannePeptidoglycanne ou

MurMurééineine

Glycanne (glucides reliés par des liaisons β-1,4)

Glycanne (glucides reliés par des liaisons β-1,4)

217

§ La transpeptidase

(suite 1)-N

AG-N

AM-N

AG-

-Gly5-

218

§ La transpeptidase (suite 2)

mime D-Ala-D-Ala

Na-Nb : 3.3Å

Na-COO- : 5.4Å

Na-COO- : 5.7Å

agit comme un bouclier

219

Elle sont responsables des effets observés pendant les inflammations : rougeur de la peau, augmentation du flux sanguin et vasodilatation, mal de tête, douleurs vasculaires, augmentation de température.

§ La cyclooxygénase Les prostaglandines sont toujours relâchées quand les cellules sont endommagées et on les trouve en forte concentration dans le pus.

220

L’inhibition de la prostaglandine synthétase responsable de la formation de toutes les prostaglandines conduit donc à un effet anti-inflammatoire, analgésique,antipyrétique.

aspirineaspirine

§ La cyclooxygénase (fin)

En particulier les enzymes des plaquettes ne sont pas régénérées, leur inhibition est donc très effective.

221

3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides

Les inhibiteurs suicides sont des molécules stables qui ressemblent aux substrats (ce sont des pseudo-substrats) et qui possèdent une réactivité chimique latente Y (a).

Ils se lient au site actif de l’enzyme cible (b) et tout comme un substrat, subissent une transformation catalytique (c).

L’inhibiteur transformé va ensuite démasquer une fonction réactive qui devra réagir avec un résidu proximal du site actif de l’enzyme (d) en formant un lien covalent, le bloquant ainsi d’une manière permanente (e).

(b) (c)(a) (d) (e)

222

3.2.6.2 Les inhibiteurs suicides (suite)

Les inhibiteurs suicides ne s’attaquent qu’aux enzymes sachant les transformer; ils

sont donc bien plus sélectifs que les marqueurs d’affinités.

Leur absence de réactivitéchimique intrinsèque en fait des agents thérapeutiques de

choix

allopurinol

Lien non

covalent

223

anticancéreux,

antiparasitaire

Enzyme à phosphate de pyridoxal

Biosynthèse des polyamines

DFMO

§ L’ornithine décarboxylase

inhibiteur compétitif(Ki=19µM)

Ki=39µM,

inactive l’enzyme avec un T50 de 3.1 min (à saturation du site actif, il faut ~ 3 min pour inactiver 50% de l’activité enzymatique.

224

anti-épileptique

Enzyme à phosphate de pyridoxal

Km du GABA = 10-3 M

vigabatrine

Ki = 3.4 × 10-4 M

T50 = 3.3 min

§ La GABA transaminase

225

anticancéreux§ L’aromatase

226

convertit le dUMP (désoxyuridinemonophosphate) en dTMP (désoxythymidinemonophosphate) en présence de méthylène-tétrahydrofolate.

anticancéreux§ La 5-thymidilate synthétase

227

Synergie avec bactéricides β-lactames

Certaines lignées de bactéries sont devenues résistantes aux β-lactames par production de β-lactamases

§ La beta-lactamase

228

Synergie avec bactéricides β-lactames

L’acide clavulanique inhibe cette enzyme et présente un effet synergique important avec l’amoxycilline(augmentin)

amoxycilline (10mg/ml) après 1h à 37°C sur une souche résistante de E.coli.

amoxycilline (10mg/ml) + acide clavulanique(2.5mg/ml) après 1h à 37°C sur une souche résistante de E.coli.

§ La beta-lactamase (suite 1)

229

Synergie avec bactéricides β-lactames

1 sur 115

§ La beta-lactamase (suite 2)

Staphylocoque doré

230

Goutte

t½ = 5h

Mo (IV) —→ Mo (VI)

§ La xanthine oxydase