biologie moleculaire-2014 1 · 2014-01-25 · 70% par volume d’alcool isopropyl. ceci veut dire...
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Biologie Moleculaire-2014 1 http://mysite.science.uottawa.ca/jbasso/moleculaire/accueil.htm
Biologie Moleculaire-2014 2
DIRECTIVES GÉNÉRALES
1. La présence dans le laboratoire est obligatoire. S'il vous plaît, être à l'heure.
2. Des chaussures et vêtements appropriés doivent être portés en tout temps.
3. Laisser vos vêtements d'extérieur, sacs à dos, et toutes autres matières étrangères dans les
casiers à l'extérieur du laboratoire. Il est fortement recommandé que vous ayez un cadenas.
Nous ne somme pas responsable pour les objets perdus ou volés.
4. Porter une blouse de laboratoire et des gants en tout temps quand vous travaillez dans le
labo.
5. Enlever vos gants chaque fois que vous sortez du labo.
6. Enlever vos gants quand vous utilisez notre ou votre ordinateur.
7. Toujours placer les pipettes utilisées, les embouts, tubes de microcentrifuge et autres
matériaux dans les sacs biohazard fournis afin qu'ils puissent être éliminés de façon
appropriée. Ne pas jeter de déchets dans les sacs d'autoclaves.
8. Ne jamais se lécher les doigts, ou mettre vos doigts dans votre bouche.
9. Ne pas manger ou boire dans le laboratoire.
10. Pas de radios, lecteurs MP3, de lecteurs de CD dans le laboratoire.
11. Aucune utilisation des téléphones cellulaires ou des textos en laboratoire.
12. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout accident, même mineur.
13. Aviser l'A.E. ou un instructeur de tout bris ou malfonctionnement de l’équipement fourni.
Matériel que vous DEVEZ avoir pour travailler dans le laboratoire de microbiologie :
Une blouse de laboratoire
Un crayon-feutre à pointe fine permanent, de préférence noir, pour l'étiquetage.
Un cahier de notes pour enregistrer vos résultats. N'importe quel type est acceptable. Ne gaspillez
pas votre argent
Une clef A USB pour sauvegarder vos images
Une calculatrice. L’utilisation des calculatrice sur les cellulaire n’est pas permis.
Facultatif, mais fortement recommandé :
Aviser l'instructeur de tout problème médical de sorte que des accommodations appropriées
peuvent être prises. Par exemple, les allergies, le diabète, l'hypoglycémie, l'épilepsie, les blessures
apparentes, daltonisme, etc.
Aviser l'instructeur de tout besoin particulier dont vous pourriez avoir besoin de sorte que les
accommodations appropriées peuvent être prises. Par exemple, si vous écrivez vos examens avec
SASS.
Biologie Moleculaire-2014 3
Horaire Exercice 1 8 janv. Concentrations et Dilutions
Utilisation des micropipetteurs
Préparation d’un gel d’agarose
Électrophorèse sur gel d’agarose
Exercice 2 15 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; isolation d’ADN plasmidique
Enzymes de restrictions et l’électrophorèse sur gel d’agarose
Exercice 3 22 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
Exercice 4 29 janv. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ
Électrophorèse des amplicons de PCR
Purification des amplicons de PCR
Digestion des amplicons de PCR et du vecteur pUC19
Ligature des amplicons de LacZ
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
Exercice 5 5 févr. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ
Transformation des ligatures
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN (Dernière chance)
Projet III: Empreintes génomiques
Isolation d’ADN génomique humain des cellules de joues
Biologie Moleculaire-2014 4
MI-SESSION Samedi 8 févr.
Exercice 6 12 févr. Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ
Criblage par PCR des transformants
Analyse des produits du PCR de colonies
Repiquage sur X-Gal
Projet III: Empreintes génomiques
SEMAINE D’ÉTUDE 16-22 févr.
Exercice 7 26 fév. Projet IV : Contrôle transcriptionnel du gène Mel1
Isolation d’ARN de levures
Électrophorèse d’ARN
Transfert Northern
RT-PCR
Exercice 8 5 mars Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1
Hybridation Northern
Analyse des réactions de RT-PCR
Exercice 9 12 mars Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1
Immunodétection des membranes Northern
Projet V: Contrôle traductionnel de l'alpha galactosidase et de la bêta galactosidase
Essais des activités enzymatiques
EXAMEN FINAL PRATIQUE 19 mars
EXAMEN FINAL THÉORIQUE 26 mars
Biologie Moleculaire-2014 5
Exercice 1
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Concentrations et Dilutions
Utilisation des micropipetteurs
Préparation d’un gel d’agarose
Électrophorèse sur gel d’agarose
Biologie Moleculaire-2014 6
Introduction aux concentrations Une propriété très importante au sujet des solutions qui doit être adressée c’est la concentration.
En général, la concentration indique la quantité d’un soluté dans une quantité donnée d’une
solution. Pour travailler avec des concentrations vous devez tenir à l’esprit les distinctions entre le
soluté, le solvant et la solution.
Puisque différentes quantités de solutés peuvent être dissoutes dans une solution, la concentration
est une propriété variable. Nous avons donc besoin d’une façon numérique pour indiquer comment
concentrée est une solution. Une variété de différentes façons ont été développées pour calculer et
exprimer les concentrations des solutions.
Ceci peut être fait par pourcentage en utilisant des mesures du poids (masse) ou le volume ou les
deux. Alternativement, on peut aussi utiliser des mesures qui sont propres à la façon que les
composés chimiques réagissent entre eux (moles).
Dans les pages qui suivent, plusieurs types de concentrations seront présentés. Elles incluent le
pourcentage par volume, le pourcentage par poids, le pourcentage du poids/volume, la
molarité (l’utilisation principale des concentrations chimiques) et poids/volume.
Vous obtiendrez de l’expérience avec plusieurs des façons d’établir la concentration d’une solution.
Vous pouvez préparer une solution à partir des matières brutes et mesurer chacune des composantes
qui doivent être présentes dans la solution. Vous pouvez préparer une solution en diluant une
solution préexistante. Si une solution est colorée, vous pouvez déterminer sa concentration en
mesurant l’intensité de la couleur par colorimétrie.
POURCENTAGE
L’utilisation des pourcentages est une façon commune pour exprimer la concentration d’une
solution. C’est une approche simple qui indique la quantité d’un composé par 100. Les
pourcentages peuvent être calculés en utilisant les volumes ainsi que les poids, ou les deux. Une
façon, que vous connaissez, sans doute, d’exprimer les concentrations est le pourcentage par
volume. Une autre façon est le pourcentage par poids. Enfin, une autre façon est un hybride
appelé le pourcentage par poids/volume.
Le pourcentage par volume est habituellement utilisé quand la solution est préparée en
mélangeant deux liquides.
Par exemple, l’alcool à friction est habituellement
70% par volume d’alcool isopropyl. Ceci veut dire
que 100 mL de solution contient 70 mL d’alcool
isopropyl. Ceci veut aussi dire qu’un litre (ou 1000
mL) de cette solution contient 700 mL d’alcool
isopropyl et assez d’eau pour compléter le volume
à un total de 1 litre ou 1000 mL.
Pourcentage par volume = volume du soluté
volume de solution x 100
Biologie Moleculaire-2014 7
Le pourcentage par poids est une façon d’exprimer la concentration d’une solution comme le
poids du soluté/poids de la solution.
Pourcentage par poids = Poids du soluté
Poids de la solution x 100
À titre d’exemple, considérons une solution
de 12% NaCl par poids. Une telle solution
aurait 12 grammes de NaCl pour chaque 100
grammes de solution. Pour préparer une telle
solution, vous pourriez peser 12 grammes de
NaCl, et ensuite ajouter 88 grammes d’eau,
afin que la masse totale de la solution soit de
100 grammes. Puisque les masses sont
conservées, les masses des composantes de
la solution s’additionneront à la masse totale
de la solution.
12 % NaCl solution = 12 g NaCl
100 g solution
12 g NaCl
(12 g NaCl + 88 g eau) = 12% NaCl solution
Afin de calculer le pourcentage par poids ou le pourcentage par masse d’une solution, vous devez
diviser la masse du soluté par la masse de la solution (la somme combinée de la masse du soluté et
du solvant) et ensuite multipliée par 100 pour la changer en pourcentage.
Pourcentage par poids/volume
Une autre variante des concentrations par pourcentage est le pourcentage poids/volume ou le
pourcentage masse/volume. Cette variante mesure la quantité de soluté en grammes, mais mesure la
quantité de la solution en millilitres. Un exemple serait une solution de 5% NaCl (m/v). Elle
contient 5 g de NaCl pour chaque 100 mL de solution.
Pourcentage par volume = Poids du soluté (en g)
Volume de solution (en mL) x 100
Cette façon est la manière la plus couramment utilisée dans ce cours pour exprimer les solutions en
pourcentages.
Biologie Moleculaire-2014 8
MOLARITÉ
Une autre façon d’exprimer une concentration
s’appelle la molarité. La molarité c’est le nombre
de moles de soluté dissout dans un litre de
solution. Les unités sont donc moles par litre,
plus précisément, c’est les moles de soluté par
litre de solution.
molarité = moles de soluté
litre de solution
Plutôt d’écrire moles par litre, l’abréviation “M” est utilisée pour ces unités. Alors, quand vous
voyez la lettre M cela signifie molarité et représente moles par litre (pas seulement moles). Vous
devez faire très attention de distinguer entre moles et molarité. "Moles" est une mesure de la
quantité que vous avez d’une composante; "molarité" mesure la concentration de la composante.
Alors quand un problème vous est donné, qui stipule que la concentration d’une solution est 0.1 M,
ceci veut dire qu’elle possède 0.1 mole pour chaque litre de solution; cela ne veut pas dire que c’est
0.1 mole.
POIDS/VOLUME
Cette façon d’exprimer une concentration est très semblable à celle des pourcentages et représente
une des façons les plus populaires utilisées par les biologistes moléculaires. Contrairement au
pourcentage, la concentration est exprimée par quelconque volume l’utilisateur désire utiliser. Plus
communément, ces concentrations sont exprimées par une unité de mesure. Par exemple, par 1 mL
ou 1 µL ou 1L, etc. Essentiellement, ces expressions représentent la masse d’un soluté dans une
quantité donnée de la solution. Par exemple, une solution qui est à une concentration de 1mg/mL
contient 1mg de soluté dans 1 mL de solution.
LES RAPPORTS Toutes les façons décrites ci-dessus pour exprimer les concentrations se font en fonction du volume
de la solution qui est la somme du volume du soluté et du solvant. Une manière courante que
plusieurs microbiologistes et chimistes utilisent pour d’exprimer les concentrations est les rapports.
Dans ce cas-ci, la relation entre le soluté et le solvant est exprimée indépendamment de la solution.
Par exemple, nous pourrions dire que le rapport entre un soluté est un solvant est de 2 pour 1 avec la
notation 2 :1. Ceci indique que pour deux parties du soluté il y a une partie du solvant. Donc, trois
parties total de solution!
Biologie Moleculaire-2014 9
LES DILUTIONS ET L’UTILISATION DES MICROPIPETTEURS
Les dilutions : Savoir préparer des dilutions est essentiel pour la préparation de plusieurs réactifs, mélanges
réactionnels, et solutions utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire. Essentiellement, les
dilutions servent à réduire la concentration initiale du composé afin d’atteindre une nouvelle
concentration voulue. Les solutions préparées par l’entremise de dilutions peuvent être composées
d’un ou de plusieurs composés. Le nombre d’ingrédients dans la solution à être préparée
n’influence aucunement la formulation des dilutions. Un bref survol de la préparation des dilutions
est présenté ci-dessous. Assurez-vous de bien comprendre leurs préparations, car vous serez appelé
à les préparer tout au cours de la session ainsi que pour l’examen final.
La compréhension de la formulation des dilutions comporte trois concepts. La concentration, le
facteur de dilution, et la dilution.
Une concentration se définit comme la quantité d'un composé pour un volume total de solution.
Puisqu'une quantité peut être exprimée de plusieurs façons, les concentrations sont exprimées
comme l'unité de mesure de la quantité du composé/volume total et final.
E.x. Gram/Litre
Molécules/Litre
Moles/Litre
Etc.
Le facteur de dilution représente la multiple arithmétique par laquelle une concentration initiale
doit être divisée afin d'obtenir la concentration finale désirée. Par exemple, si une solution contient
30 grammes de caféine par 1L de solution et que vous désirez réduire la concentration de caféine à
0.3 Grammes/Litre vous devrez diviser la concentration initiale par 100, ce qui représente le facteur
de dilution. Vous pouvez utiliser la formule suivante afin de déterminer un facteur de dilution.
Le facteur de dilution = Concentration initiale ou Ce que j’ai
Concentration finale Ce que je désire
La dilution représente la fraction du composé étant examiné. Par exemple, dans le problème
précédent, une dilution de 1/100 a été effectuée. La dilution est exprimée comme une fraction de 1
sur le facteur de dilution. C.a.d. que la solution initiale est représentée comme une fraction de
l’original sur le total. Par exemple si vous avez déterminé qu’une dilution de 1/100 doit être
préparée, cela veut dire qu’un centième de la nouvelle solution doit être représenté par la solution
originale. Donc pour un volume total de disons 2mL, 0.02 mL doit être représenté par la solution
originale.
Biologie Moleculaire-2014 10
Préparer une solution qui requière la dilution de plus d’un ingrédient :
Le principe pour la formulation d’une solution qui nécessite la dilution de plus d’un composé est la
même que pour une solution avec seulement qu’une composante. La seule différence est le volume
de solvant qui doit être ajouté.
Disons par exemple que l’on désire préparer 10mL d’une solution de 0.1M à partir d’une solution
mère de 2M.
Pour calculer le facteur de dilution : Ce que j’ai = 2M = 20
Ce que je désire 0.1M
Donc la dilution requise est de 1/20 ce qui veut dire qu’un vingtième du total doit être représenté
par la solution originale.
Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la solution mère et compléter avec 9.5mL de
solvant.
Si la solution à préparer inclut une deuxième composante; disons que celle-ci doit être à une
concentration finale de 0.5 M et que la solution mère est de 3M.
Encore une fois pour calculer le facteur de dilution : Ce que j’ai = 3M = 6
Ce que je désire 0.5M
Donc la dilution requise est de 1/6. Ce qui veut dire qu’un sixième du total doit être représenté par
la solution originale.
Donc pour préparer 10mL on doit ajouter 0.5mL de la première solution, 1.7mL de la deuxième
solution et puis complété avec 7.8mL de solvant.
Si les explications ci-haut ne sont pas suffisantes, vous pouvez consulter le site web suivant :
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/HtmL/dilutions.html
Biologie Moleculaire-2013 11
Utilisation des micropipetteurs
Les micropipettes sont des outils indispensables dans les laboratoires de biologie moléculaire
modernes. Quelle est l’exactitude des vôtres? Quelles sont leurs précisions? Quelle est la
différence entre l’exactitude et la précision?
Dans le cas de l’exactitude, il s’agit de la performance comparativement à une valeur de référence.
Tandis que la précision est une indication, de la fiabilité ou la répétitivité est ne dépend pas
nécessairement d’une référence. Ces deux attributs sont indépendants l’un de l’autre. Il est possible
d’avoir un instrument qui est précisément inexact (ou exactement imprécis)!
Analogie d’une cible pour illustrer l’exactitude et la précision
Dans cet exemple, le centre de la cible représente la référence à laquelle l’exactitude est évaluée.
Afin d’évaluer de façon simultanée l’exactitude et la précision de vos pipettes vous devez faire des
mesures multiples afin de calculer le % d’erreur de la moyenne et l’écart type des mesures pour
chacune de pipettes.
Directives pour l’utilisation des micropipetteurs Gilson
Vous avez des micropipettes de trios grandeurs. La P-1000, la P-200 et la P-20. Le numéro du
modèle indique le volume maximal en microlitres. Initialement, vous devrez déterminer quelle
pipette utiliser sous des circonstances données. Par exemple, si vous devez transférer 0.18 mL vous
aurez probablement besoin de la P-200 puisque 0.18 mL = 180 µL car la P-200 fera la mesure de ce
volume avec une exactitude et une précision plus grande que ne le ferait la P-1000.
Règles:
Toujours utiliser un embout jetable. La P-20 et la P-200 utilisent les plus petits embouts et
la P-1000 utilise les plus gros.
Ne jamais aspirer du liquide dans le baril blanc de la pipette.
Ne jamais déposer la pipette quand il y a du fluide dans l’embout. Le fluide pourrait
accidentellement se retrouver dans le baril.
Ne jamais tourner le réglage de volume au-dessus ou en dessous de l’étendue prévue.
Afin de maximiser la précision, toujours utiliser la pipette de plus petit volume qui
correspond au volume total donné.
1. Régler le volume désiré:
Ajustez le volume à un réglage légèrement plus élevé que celui désiré, et ensuite
retournez-le à celui désiré.
2. Placer un embout:
Pousser l’embout fermement avec une motion de torsion. L’embout doit créer un
joint étanche avec le baril de la pipette.
Exact et précis Précis & inexact Imprécis & inexact
Biologie Moleculaire-2013 12
3. Peser le piston jusqu’au premier arrêt.
4. Introduire l’embout dans le liquide que vous désirez transférer. Pas trop loin, juste un peu
sous la surface.
5. Lentement, relâchez le piston.
6. Tout en retirant l’embout, toucher le côté de la paroi du tube afin de retirer l’excédent de
fluide de l’extérieur.
7. Afin de livrer, peser sur le piston jusqu’au premier arrêt, puis jusqu’au fond.
Ne jamais livrer de très petits volumes dans le vide. Toujours livrer dans un liquide
ou sur la paroi du tube, de telle façon à ce que la force d’adhésion va retirer le
liquide livré de l’embout.
8. Avec le piston, toujours complètement au fond, retirer l’embout du liquide.
RAPPELEZ-VOUS QUE VOS MICROPIPETTEURS SONT DES INSTRUMENTS
DISPENDIEUX!
EXERCICE DE DILUTIONS AVEC LES MICROPIPETTEURS
(CET EXERCICE DOIT ÊTRE FAIT PAR CHAQUE PERSONNE)
Nous avons inclus cet exercice afin que chacun se familiarise avec la préparation des dilutions,
l’utilisation du micropipetteur et des embouts. (TOUJOURS ÉTIQUETER VOS TUBES!!)
Matériaux:
Solution I (1% Composé “A” (m/v); P.M. 800g/mole)
Solution II (1.2M Composé “B” P.M. 60g/mole; Densité: 1.6g/mL)
Méthode:
1. Préparer 1mL de chacune des solutions suivantes des solutions mères ci-dessus.
a. Une solution de 1.5mM du composé “A”.
b. Une solution de 0.36% (m/v) du composé “B”.
c. Une solution de 6% (v/v) de la solution I.
d. Une solution qui contient 0.5mg du composé “A” et 0.1% (v/v) du composé “B”.
e. Une solution qui représente le rapport suivant : solution I : solution II : eau : 2 :1 :2
2. Transférer 100µL de chacune des solutions aux puits appropriés d’une plaque de 96 puits tel
qu’indiqué ci-dessous:
Plan de la plaque à 96 puits (une plaque/table)
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 1
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 3
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 1 Groupe 4
Soln. a Soln. b Soln. c Soln. d Soln. e Personne 2
Biologie Moleculaire-2013 13
Essai de protéines de Bio-Rad
Cette méthode qui est fondée sur la méthode de Bradford, est une procédure simple et précise pour
la détermination de la concentration de protéines solubilisées. Elle implique l’ajout d’un colorant
acide à la solution de protéine, après quoi des mesures au spectrophotomètre ou à l’aide d’un
lecteur de plaque à une longueur d’onde de 595 nm sont faites. Une comparaison à une courbe
étalon permet ensuite d’obtenir une mesure relative de la concentration de protéine.
Matériaux
Colorant
ASB 5mg/mL
ASB de concentration inconnue
Méthode : (Groupes de 2)
1. Préparer 200µL de chacune des solutions de référence protéiques de 0.0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 et
1.0mg/mL.
2. Préparer des échantillons de 1mL de la solution de protéine de concentration inconnue
(dilutions de 1/4 et 1/10).
3. Pipeter 10μL de chacune des solutions de référence et de l’échantillon inconnu dans des puits
indépendants de la plaque.
4. Ajouter 200μL du colorant dilué à chaque puits. Bien mélanger les échantillons et le colorant.
5. Incuber à la température de la pièce pour au moins 15 minutes.
6. Obtenir les lectures d’absorbances à 595 nm.
Plan de la plaque pour l’essai de Bradford
ND: échantillon non dilué
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB
Standard Personne 1
Personne 2 Groupe 1
0 ND 1/4 1/10 Inc.
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB
Standard Personne 1
Personne 2 Groupe 2
0 ND 1/4 1/10 Inc.
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB
Standard Personne 1
Personne 2 Groupe 3
0 ND 1/4 1/10 Inc.
0.0 0.05 0.1 0.2 0.4 1.0 ASB
Standard Personne 1
Personne 2 Groupe 4
0 ND 1/4 1/10 Inc.
Biologie Moleculaire-2013 14
Digestions par enzymes de restrictions Au milieu des années 1970, le domaine de la biologie moléculaire a connu une croissance
importante grâce à l’utilisation des endonucléases de restriction pour le clivage d’ADN à des sites
spécifiques. Il existe maintenant plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes disponibles
commercialement. Vous pouvez trouver de l’information détaillée sur plusieurs d’entre elles
(incluant celles que vous utiliserez dans ce cours) dans des catalogues de produits commerciaux.
Leurs spécificités les rendent particulièrement utile pour plusieurs tâches incluant entre autres la
cartographie de l’ADN, le clonage et le sous clonage de l’ADN, etc. Le but de ce premier
exercice est de faire des digestions simples de votre ADN afin de répondre aux questions
suivantes :
Quelles enzymes coupent dans l’insertion?
Quelles enzymes ne coupent pas dans l’insertion?
Quelle est la taille de l’insertion?
Quelles sont les positions possibles des différents sites de restrictions?
Le fragment d’ADN a été inséré dans quel site de restriction du SCM?
Pour de plus amples informations au sujet des enzymes de restrictions consultez le site Web
suivant : NOTEZ : VOUS ÊTES RESPONSABLE POUR CETTE INFORMATION!!
http://askabiologist.asu.edu/expstuff/mamajis/restriction/restriction.html
Électrophorèse sur gel d’agarose L’électrophorèse sur gel d’agarose implique la séparation de molécules d’ADN d’après leurs tailles
et leurs conformations. La migration électrophorétique d’un fragment d’ADN dans l’agarose est
inversement proportionnelle au logarithme de son poids moléculaire (ceci est vrai seulement pour
certaines gammes de taille sous des conditions définies). [Conseil! Quand vous estimez la taille de
fragments de restrictions, gardez à l’esprit la précision requise, spécifiquement le nombre de
chiffres significatifs! La concentration de l’agarose utilisée dépend de l’éventail des tailles étant
étudiées; pour la séparation d’ADN linéaires entre 0.5 kb et 10 kb, un gel d’agarose de 1% est
habituellement utilisé. Suite à l’électrophorèse, les gels sont visualisés sous des ultras violets et
photographiés avec une caméra numérique. L’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la
quantité (et la longueur) de l’ADN linéaire. Cette méthode peut être utilisée pour obtenir une
estimation de la quantité d’ADN dans les échantillons.
L’électrophorèse sur gel d’agarose utilise un courant à haute tension ce qui peut présenter un
danger. Le boîtier qui contient le gel est muni d’un mécanisme de connexion spécial pour des
raisons de sécurité. Les connexions doivent donc être retirées avant de pouvoir ouvrir le couvercle.
COUPEZ TOUJOURS L’ALIMENTATION AVANT DE DÉBRANCHER L’APPAREIL.
Le bromure d’éthidium, qui est utilisé comme colorant des gels d’agarose afin de pouvoir observer
l’ADN sous lumière UV, est un agent cancérigène potentiel. Toujours porter des gants pour
manipuler tout ce qui en contient. La source de lumière UV est aussi très dangereuse pour la peau et
surtout pour vos yeux, assurez-vous donc de bien vous protéger (gants, sarrau, masques) lorsque
vous observez vos gels d’agarose.
Biologie Moleculaire-2013 15
Chaque appareil a deux supports de gels et deux peignes (8-puits et 14-puits contenants environ
14μL et 6μL respectivement), donc lorsque vous faites migrer deux (ou plus) gels durant un après-
midi, les gels peuvent être coulés en séquence (en entreposant le premier, couvert d’une pellicule de
plastique, jusqu’à l’utilisation). Une autre méthode plus rapide (mais un peu plus risqué) est de
couler les deux gels en même temps. Un gel est coulé dans le boîtier et l’autre sur le comptoir avec
les bouts du support de gel collés avec un ruban. Le peigne doit être aligné perpendiculairement à la
direction de migration (en utilisant les barres rouges). Placez les gels hors de portée pour ne pas les
déranger lors de leur solidification.
Rappelez-vous que les gels à 8 puits contiennent à peu près deux fois plus d’ADN que les gels à 14
puits à cause de la taille de leurs puits. De plus, si vous utilisez des enzymes de restriction avec des
sites de reconnaissances de 4 pb plutôt que 6 pb, ou une combinaison d’enzymes de restrictions, on
s’attend à avoir plus de fragments (dont la coloration sera moins intense). Vous devriez alors
utiliser plus d’ADN (et peut-être une plus forte concentration d’agarose- ex. 1.5%, au lieu du 1%
standard) afin d’obtenir une meilleure résolution pour les fragments de faible masse moléculaire.
MÉTHODE: (Groupes de 2)
A. PRÉPARATION DU GEL D’AGAROSE (peigne à 8 puits)
Matériaux :
Agarose
10X TBE
1. Préparer dans votre cylindre gradué 200mL de tampon TBE à une concentration finale de 1X.
Assurez-vous de bien mélanger.
2. Mélanger la quantité appropriée d’agarose pour obtenir une concentration finale de 1.0% m/v
dans 25mL de tampon TBE de 1X.
3. Pour dissoudre l’agarose, chauffé au micro-ondes (25-45 secs.). Recouvrir le flacon d’une
pellicule de plastique afin de minimiser l’évaporation). Lorsque l’agarose sera complètement
dissout, laissez refroidir jusqu’à 50-60oC (à peu près 5 minutes).
4. Ajoutez 2 gouttes (avec le compte-goutte) d’une solution mère de bromure d’éthidium à
1mg/mL (ATTENTION! CANCÉRIGÈNE!) et bien mélanger.
5. Versez l’agarose dans le support à gel. Après avoir versé le gel, placer le peigne de 8 puits
(volume qui peut être accommodé est approx. 14µL) et enlever toutes les bulles d’airs (avec un
embout jaune de micropipetteur). Refermez le couvercle de l’appareil et laissez solidifier le gel
pour au moins 15-20 minutes.
6. Une fois le gel solidifié, retirez les joints noirs puis versez une quantité suffisante du tampon
TBE 1X dans l’appareil pour recouvrir le gel d’environ 0.5cm.
7. Enlevez lentement le peigne.
Biologie Moleculaire-2013 16
B. CONSEILS POUR VÉRIFIER L’OPÉRATION ADÉQUATE DE VOTRE GEL
8. Branchez les électrodes de façon à ce que la cathode (électrode négative) soit à l’extrémité qui
représente l’origine du gel. Les échantillons vont migrer au travers du gel vers l’anode
(électrode positive). (ATTENTION! HAUTE TENSION!).
9. Régler l’appareil pour ~ 100V. Allumez l’appareil. Vérifier que votre intensité est dans les
environs de 40-55 mA. Si cela n’est pas le cas, il y a un problème.
Problèmes possibles :
Le tampon de migration est à la mauvaise concentration
Le tampon dans le gel est à la mauvaise concentration
Vous avez oublié de mettre le tampon dans le gel
C. ANALYSE DES DIGESTIONS PAR ENZYMES DE RESTRICTIONS
10. Charger les échantillons d’ADN suivants. L’inconnu est un recombinant avec le vecteur pUC9:
a. Échelle de poids moléculaire de 1Kpb (2.5µL)
b. Plasmide recombinant pUC9 non digéré 5µL
c. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec BamHI, 5µL
d. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI, 5µL
e. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec HindIII, 5µL
f. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec EcoRI + HindIII, 5µL
g. Plasmide recombinant pUC9 digéré avec PstI, 5µL
h. Plasmide pUC9 digéré avec BamHI, 5µL
11. Faire la migration à 100V pour approx. 1-1.5 heures, puis demander à un aide enseignant de
faire la prise d’une photo.
Biologie Moleculaire-2013 17
Échelle de Tailles d’ADN
Masse d'ADN Paires de bases
(ng/5µL)
Gel d'agarose de 1% TAE
Biologie Moleculaire-2013 18
Biologie Moleculaire-2013 19
Exercice 2
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Isolation d’ADN plasmidique
Enzymes de restrictions et électrophorèse sur gel d’agarose (Partie II)
Biologie Moleculaire-2013 20
Isolation d’ADN plasmidique La plupart des méthodes utilisées pour la purification de plasmide se basent sur la disruption des
cellules en présence de dénaturants puissants. La disruption peut se faire par des cycles de gel et de
dégel, le broyage ou par une lyse chimique en utilisant des solutions fortement alcalines. Les
dénaturants sont essentiels afin d’inactiver les nucléases endogènes et exogènes qui dégraderaient
l’ADN. Examinez les différentes composantes du tampon d’extraction et déterminez la fonction de
chaque composé chimique.
Les plasmides sont des réplicons bactériens extrachromosomiques circulaires non obligatoires
L’isolation d’ADN plasmidique nécessite la séparation de cet ADN de l’ADN chromosomique,
ainsi que des polysaccharides, les lipides et les protéines de la cellule. Les manipulations
subséquentes, tout particulièrement les modifications enzymatiques, nécessitent que l’ADN soit
dépourvu de ces impuretés.
Dans la procédure suivante, la lyse des cellules est accomplie avec une solution fortement alcaline
(NaOH) et les protéines sont dénaturées à l’aide d’une solution fortement alcaline et d’un détergent
(SDS). Les complexes de détergent sont ensuite précipités avec un sel neutralisant (KOAC). Le
plasmide est séparé de l’ADN bactérien en vertu de sa stabilité relative dans des conditions
alcalines. De laisser le plasmide dans la solution alcaline trop longtemps détruira le plasmide aussi.
De plus, le chromosome est lié aux membranes et sera précipité par le sel et le détergent. Il est donc
important de ne pas mélanger la solution de façon trop vigoureuse, car ceci aurait pour effet de
relâcher le chromosome qui est piégé. Le plasmide est plus petit et demeure donc libre en solution.
La solution de plasmide est séparée des débris cellulaires par une centrifugation, puis concentrée
par une précipitation à l’alcool.
Pour de plus amples informations au sujet de la purification de plasmides, vous pouvez consulter le
site Web suivant http://askabiologist.asu.edu/alkaline-lysis
Biologie Moleculaire-2013 21
Purification d’ADN plasmidique par lyse alcaline
(Groupes de 2)
A. La préparation de vos solutions:
Préparer 1 mL des solutions I & II ainsi que le T.E. à partir des solutions mères suivantes :
10N NaOH
10%SDS
0.5M glucose
1M Tris-Cl (pH 8.0)
0.5M EDTA
3 M KOAc pH 5
Isopropanol
ARNase 10mg/mL
Solution I:
50mM Glucose (tampon)
25mM Tris-Cl (pH 8.0) (tampon)
10mM EDTA (pH 8.0) (Chélateur)
Solution II:
0.2N NaOH (Alcalin)
1% SDS (Détergent)
T.E.:
10mM Tris-Cl pH 8.0
1mM EDTA pH 8.0
B. Protocole pour l’isolation du vecteur pUC19:
1. Centrifuger à vitesse maximale 1.5mL de la suspension d’E.coli/plasmide qui vous a été donnée
dans la microcentrifugeuse pour une durée de 1 minute.
2. Déverser le surnageant sans déranger le culot. Utiliser une micropipette pour enlever le
surnageant résiduel.
3. Ajouter 200μL de la Solution I au culot et le suspendre sur le vortex.
4. Ajouter 400μL de la solution II. Fermer le tube et mélanger par inversion.
5. Ajouter 300μL d’une solution glacée de KOAc. Bien mélangé et gardé sur glace pour 5 minutes.
6. Centrifuger dans la microcentrifuge à vitesse maximale pour 5-10 minutes. Ceci précipite les
protéines et l’ADN chromosomique le long de la paroi du tube.
7. Transférer 700µL du surnageant à un nouveau tube de microcentrifuge. Ajouter un volume égal
d’isopropanol. Fermer le tube et mélanger par des inversions rapides des tubes.
8. Centrifuger les tubes à vitesse maximale pour 5 minutes. Déverser le surnageant.
9. Le culot blanc au fond du tube contient l’ADN plasmidique et de l’ARN.
10. Suspendre le culot dans 50μL de TE pH8.0.
11. Ajouter 1μL d’une solution de 10mg/mL d’ARNase et incuber à 37oC 5-10 min.
Biologie Moléculaire-2014
22
Purification d'ADN plasmidique avec le kit de QIAGEN Une autre façon de purifier les plasmides consiste à utiliser des kits commerciaux tels que celui
offert par Qiagen. À la base, cette technique de purification est fondée sur la méthode de lyse
alcaline que vous avez exécutée précédemment. Afin de pouvoir comparer les deux méthodes, vous
allez répéter la purification à partir de la même culture bactérienne avec le kit de Qiagen. À la fin de
la procédure, vous devriez être capable de comparer les deux méthodes en ce qui a trait aux
similarités et les différences.
Étape 1
Étapes 2-5
Étapes 6-7
Étapes 8-9
Étape 10
Culot bactérien
Suspension
Lyse
Neutralisation
Liaison
Lavage
Élution
ADN plasmidique pure
Biologie Moléculaire-2014
23
Projet I
Mutagenèse dirigée de LacZ; isolation d’ADN plasmidique
Protocole pour l’isolation du vecteur pUC19:
1. Obtenir la culture de 1.5mL qui a été préparé pour vous et récolter les cellules par une
centrifugation à vitesse maximale pour 1 minute. Déversez-le surnageant.
2. Suspendre au vortex le culot de cellules dans 250µL de tampon P1 (+ ARNase) et transférer
dans un tube de microcentrifugeuse. Vous ne devriez pas avoir d’agrégats de cellules après
cette étape.
3. Ajoutez 250µL de Tampon P2 (qui contient du NaOH/SDS) et inversez doucement le tube 4-6
fois afin de mélanger. Ne passez pas le mélange au vortex puisque ceci causerait un
déchirement de l’ADN génomique. Si nécessaire, continuez à inverser le tube jusqu’à ce que la
solution devienne visqueuse et un peu claire. Ne pas dépasser 5 min, car l’ADN plasmidique
risquerait de se dénaturer irréversiblement.
4. Ajoutez 350µL du tampon N3 (neutralisation, tampon à forte concentration de sel) et inversez
immédiatement le tube doucement 4-6 fois. La solution devrait devenir trouble.
5. Centrifugez à vitesse maximale 10 min. Un culot compact blanc va se former au fond du tube
avec le “lysat éclairci” au-dessus.
6. Utilisez une pipette pour transférer le surnageant de l’étape 5 à une colonne QIAprep placée
dans un tube de récupération de 2mL.
7. Centrifugez 60 sec. à vitesse maximale. Jetez le volume écoulé dans les déchets organiques.
8. Lavez la colonne QIAprep en ajoutant 0.375mL de tampon PE (qui contient de l’éthanol) et
centrifugez 60 secs. Jetez l’écoulement (déchets organiques). Répétez une deuxième fois.
9. Jetez l’écoulement (déchets organiques), transférez dans un tube à centrifugeuse avec le
capuchon coupé et centrifugez pour 1 min additionnelle afin d’éliminer le tampon de lavage
résiduel.
IMPORTANT: L’éthanol résiduel du tampon PE peut inhiber des réactions enzymatiques
subséquentes. Les étapes 8 et 9 sont donc très importantes.
10. Placez la colonne QIAprep dans un tube à microcentrifugeuse (1.5mL) propre avec capuchon
coupé. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 50 µL de tampon EB (tampon d’élution = 10 mM Tris-HCl,
pH 8.5) et centrifugez 1 min.
11. Transférez dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté. Entreposez dans votre boîte à -20oC
Biologie Moléculaire-2014
24
Électrophorèse sur gel d'agarose d'ADN digéré Suite à la plupart des digestions, il est nécessaire de répondre aux questions suivantes :
L’ADN a-t-il été digéré?
Combien de fois est-ce que l’enzyme a coupé?
Quelles sont les tailles des fragments générés?
Est-ce que la digestion est complète ou partielle?
Les échantillons d’ADN sont-ils complètement digérés? S’il y a seulement eu clivage partiel de
l’ADN (exemple de cause possible : réduction de l’activité enzymatique à cause de conditions de
réactions non appropriées; impuretés dans l’ADN qui aurait inhibé l’enzyme), les fragments à
migration plus lente (qui représentent les fragments non clivés contenant un site pour l’enzyme
utilisée) sont habituellement présents à des proportions inférieures aux prédictions
stœchiométriques. Autrement dit, puisque l’intensité de la fluorescence UV est proportionnelle à la
quantité de bromure d’éthidium liée (et donc la quantité/longueur de l’ADN), ces fragments sont
moins intenses qu’ils le seraient s’ils étaient présents en quantité équimolaire aux fragments
complètement digérés.
Est-ce que les tailles calculées des fragments de restriction sont conformes? Si vous effectuez la
migration de différentes digestions d’ADN cloné, il est important de vérifier que la somme des
tailles des fragments calculées est à peu près égale pour chacune des voies de migration (c. a. d. la
taille de la molécule d’ADN intacte). Puisque l’estimation de la taille à l’aide des marqueurs de
taille n’est pas exacte (et que l’erreur associée aux fragments se trouvant dans la partie non linéaire
de la courbe étalon est plus grande), il n’y a habituellement qu’un accord approximatif (une
différence d’environ 200-300 pb pour un plasmide recombinant de 5 Kpb). Si vous obtenez de plus
grandes différences, considérez les points suivants: Y aurait-il co-migration de plusieurs fragments?
(Observez l’intensité relative de la fluorescence.) Y aurait-il des produits de digestion partielle
inclus dans vos calculs? Y aurait-il plusieurs fragments de faible masse moléculaire (donc de faible
intensité que vous avez de la difficulté à voir)? Les marqueurs utilisés pour évaluer la taille de
molécules d’ADN linéaire sont-ils aussi linéaires? Rappelez-vous que les molécules d’ADN
linéaires, circulaires déroulées et bicaténaires superenroulées ont toutes des propriétés de migrations
différentes sous nos conditions d’électrophorèse sur gel d’agarose. Puisque les marqueurs de tailles
que nous allons utiliser sont linéaires, peuvent-ils être utilisés pour estimer la taille de l’ADN d’un
plasmide recombinant non coupée?
Dans l’expérience suivante, vous allez comparer et faire l'analyse de digestions d'ADN circulaire et
linéaire.
Biologie Moléculaire-2014
25
Méthode (Groupes de 2)
1. Préparez les digestions par enzymes de restrictions du plasmide pBR322 qui se retrouve dans
votre boîte au congélateur. Toutes les réactions doivent être préparées SUR GLACE en
ajoutant les ingrédients suivants dans un tube de microcentrifuge dans l’ordre indiqué: assurez-
vous de bien mélanger!
Digestions:
HincII
PvuII
PvuII + HincII
Mélanges réactionnels
Hinc II Pvu II Hinc II + Pvu II
Eau : Compléter à un volume final de 20µL 12µL 12µL 11µL
Tampon de restriction 10X 2µL
Tango
2µL
G
2µL
G
Plasmide pBR322 5µL 5µL 5µL
Hinc II 10 unités/µL 1µL ------- 1µL
Pvu II 10 unités/µL ------- 1µL 1µL
2. Incuber les 3 réactions à 37oC pour 1 heure.
3. Après la période d’incubation, entreposer vos échantillons SUR GLACE.
4. Ajouter du tampon de chargement d'ADN 5X à chacun des tubes afin d’obtenir une
concentration finale d'au moins 1X.
Biologie Moléculaire-2014
26
DETERMINER LE RENDEMENT ET LA QUALITÉ DE L’ADN PAR SPECTROSCOPIE
ET DENSITOMÈTRE
Il existe différentes façons d'obtenir une estimation de la concentration d'ADN. Une des façons et
de déterminer l’absorbance à 260nm. Par la suite, vous pouvez estimer la concentration de l’ADN
double brin en utilisant le rapport suivant : Une absorbance de 1.0 à 260nm équivaut une
concentration d’ADN de 50g/mL.
Une autre façon est d'utiliser un colorant tel que le bromure d'éthidium. La liaison du bromure est
une fonction de la quantité d'ADN; donc l'intensité de l'ADN coloré peut être utilisée pour estimer
la quantité d'ADN.
Méthode (Groupes de 2)
1. Préparer 5 dilutions en série de 1/2 dans de l'eau de l'ADN de sperme de saumon (100ng/ml)
dans un volume final de 500µL.
2. Transférer 100µL de chacune des dilutions à des puits d'une plaque de 96 puits tel qu'illustré ci-
dessous.
3. Une fois que les plaques seront toutes chargées, leurs lectures à une longueur d'onde de 260nm
seront faites.
4. Déterminer les concentrations respectives d'après les lectures obtenues.
Plan
5. Transférer 10µL de chacune de vos dilutions d'ADN de sperme de saumon à des tubes de
microcentrifugeuse étiquetés de façon appropriés.
6. Ajouter du tampon de chargement d'ADN 5X à chacun des tubes afin d’obtenir une
concentration finale d'au moins 1X.
ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 1 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 2 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 3 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 4 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 5 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 6 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 7 ND 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Groupe 8
Biologie Moléculaire-2014
27
Électrophorèse sur gel d'agarose
Méthode (Groupes de 2)
1. Préparer un gel d'agarose de 1%.
2. Charger le gel avec vos digestions préparées plus tôt ainsi que vos dilutions d'ADN de sperme
de saumon tel qu'indiqué ci-dessous:
Puits Échantillon
1 2.5µL Échelle de poids moléculaire de 1Kpb
2 5µL du plasmide pUC19 isolé par lyse alcaline + tampon de chargement
3 5µL du plasmide pUC19 isolé par le kit Qiagen + tampon de chargement
4 5µL du plasmide pBR322 digéré avec PvuII
5 5µL du plasmide pBR322 digéré avec HincII
6 5µL du plasmide pBR322 avec PvuII + HincII
7 Vide
8 Vide
9 5µL de l'ADN de sperme de saumon non dilué
10 5µL de la dilution 1/2 de l'ADN de sperme de saumon
11 5µL de la dilution 1/4 de l'ADN de sperme de saumon
12 5µL de la dilution 1/8 de l'ADN de sperme de saumon
13 5µL de la dilution 1/16 de l'ADN de sperme de saumon
14 5µL de la dilution 1/32 de l'ADN de sperme de saumon
3. Faire la migration à 100V jusqu'a ce que le colorant ait migré à peu près 2/3 de la distance
(approx. 1-1.5 heures), puis demandez à un aide enseignant de faire la prise d’une photo.
Biologie Moléculaire-2014
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Exercice 3
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
Biologie Moléculaire-2014
29
Projet II
Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
Le but de ce projet est d’obtenir une compréhension de la technique de cartographie par des
enzymes de restrictions. Dans les semaines à venir, vous aurez à utiliser des approches
expérimentales et de bio-informatiques pour caractériser un fragment d’ADN cloné. Chaque groupe
de deux aura à travailler avec un plasmide qui contient une insertion qui représente un des gènes
listé sous la rubrique "séquences" > gène inconnu" sur la page web de ce cours. Parmi un groupe de
4 (par bout de table) les deux groupes de deux possèderont le même inconnu, mais dans des
orientations opposées. Ces insertions furent toutes obtenues d’une librairie génomique créée dans le
vecteur de clonage pUC19. Essentiellement l’ADN génomique d’un organisme a été isolé, digéré,
après quoi une ligature des fragments générés a été faite dans le vecteur pUC19 linéarisé avec une
enzyme appropriée dont le site de restriction se retrouve dans le site de clonage multiple. (Voir la
figure sur la page suivante).
LES BUTS DE CE PROJET SONT :
Utiliser une approche expérimentale pour:
o Déterminer le site d’insertion
o Vérifier la taille de l’insertion
o Vérifier l’orientation de l’insertion
o Vérifier la carte
o Prouver que le plasmide obtenu est bel et bien celui assigné
o Soumettre une carte révisée
Déterminer par bioinformatique la carte de restriction de l’insertion d’ADN
Biologie Moléculaire-2014
30
Les enzymes suivantes ne coupent pas pUC19 : AdeI, AloI, ApaI, AscI, BaeI, BbvCI, BclI, BcuI, BglII, BoxI, BpiI, BplI,
Bpu10I, Bpu1102I, BsaAI, BsaBI, BseRI, BsgI, BshTI, BsmFI, Bsp68I, Bsp119I,
Bsp120I, Bsp1407I, BspTI, Bst1107I, BstXI, Bsu15I, BtrI, Cfr42I, CpoI, DsaI,
Eco32I, Eco47III, Eco52I, Eco72I, Eco81I, Eco91I, Eco105I, Eco130I, Eco147I,
FseI, Kpn2I, KspAI, MlsI, MluI, Mph1103I, MssI, MunI, Mva1269I, NcoI, NheI,
NotI, PacI, PauI, PdiI, Pfl23II, PsiI, Psp5II, PsyI, SacII, SanDI, SexAI, SfiI,
SgfI, SgrAI, SmiI, SrfI, SstII, Van91I, XagI, XcmI, XhoI, XmaJI.
Les vecteurs pUC sont de petits plasmides, dont le nombre de copies maintenues est élevé qui
possèdent un site de clonage multiple (SCM), l’origine de réplication pMB1 nécessaire à la
réplication du plasmide (source – plasmide pBR322), et le gène bla, qui code pour la bêta-
lactamase, qui confère une résistance à l’ampicilline (source – plasmide pBR322). Noter que tous
les sites de restriction dans le site de clonage multiple se retrouvent seulement qu’une fois dans le
plasmide.
Amorce univ. reverse
PvuII
PvuII
Univ. forward primer
Univ. reverse primer
306
628
Biologie Moléculaire-2014
31
CONSEILS POUR L'UTILISATION DES ENZYMES DE RESTRICTIONS
Gardez toujours les solutions mères d’enzymes sur glace lorsqu’elles ne sont pas au congélateur à
-20oC (ce qui devrait être le temps le plus court possible).
L’enzyme est toujours la dernière composante ajoutée au mélange réactionnel et elle est ajoutée
directement à la solution dans le fond du tube plutôt que par goutte sur le bord du tube.
Assurez-vous que la solution est bien mélangée (ex. en donnant des petits coups sur le tube avec
votre doigt). S’il reste des gouttes sur le bord du tube, centrifugez brièvement les tubes. Vous
pouvez aussi les mélanger en utilisant le vortex (à moins que vous utilisiez de l’ADN génomique de
taille moléculaire élevée qui risque de se fragmenter).
Ne touchez jamais la pointe des embouts de pipette avec vos doigts ou avec autre chose que la
solution que vous voulez transférer.
Toujours utiliser un nouvel embout pour chaque opération et jeter les embouts utilisés aussitôt.
En accord avec les LIGNES DIRECTRICES SUR LE MATÉRIEL BIOLOGIQUE
DANGEREUX, tout le matériel jetable (embouts de micropipette, tubes de microcentrifugeuse,
etc.) utilisé lors de travaux avec de l’ADN recombinant et des cellules hôtes bactériennes doit être
placé dans des récipients à déchets spéciaux (c’est-à-dire, les boites de déchets à vos postes de
travail). Vous allez transférer ces déchets dans des sacs orangés qui seront autoclavés avant d’être
jetés.
Biologie Moléculaire-2014
32
CONSEILS POUR LE CLIVAGE D’ADN PLASMIDIQUES
Quantité d’ADN à utiliser:
La facilité que vous aurez à détecter vos fragments de restrictions (par fluorescence UV après une
coloration au bromure d’éthidium où l’intensité de la fluorescence est proportionnelle à la masse de
l’ADN dans un fragment) dépend du montant d’ADN utilisé (et des paramètres tels que l’épaisseur
du gel, la précision des bandes, etc.). On utilise habituellement entre 200-600ng d’ADN
plasmidique/puits pour une digestion avec une seule enzyme. Pour des digestions qui génèreront
plusieurs fragments, vous pourriez avoir besoin de faire la restriction de 400-1000ng afin de
pouvoir déceler les plus petits fragments (POURQUOI??)
Après avoir sorti les échantillons d’ADN du congélateur, assurez-vous de les dégeler complètement
avant de les prélever avec une pipette (pour obtenir la quantité adéquate d’ADN dans un volume
donné).
Vos digestions seront faites en présence d’un tampon commercial fourni par la compagnie
Fermentas. La concentration de sel idéale varie d’une enzyme de restriction à l’autre et vous
pouvez l’obtenir en utilisant différentes formulations du tampon.
Certaines enzymes requièrent des températures d’incubation autre que 37oC. Notez également que
les enzymes de restrictions qui reconnaissent les mêmes séquences s’appellent des isoschizomères
(ex. SacI et SstII). Il y a aussi des enzymes qui portent des noms très semblables (EcoRI, EcoRV)
mais qui reconnaissent des séquences distinctes (donc, soyez certain de bien lire les étiquettes sur
les tubes d’enzymes).
En principe, 1 unité d’enzyme de restriction digère complètement 1 g d’ADN purifié en 1
heure. Par contre, puisque nous utilisons souvent des préparations d’ADN brutes, nous
augmentons souvent la quantité d’enzyme utilisé et dans le cas d’ADN génomique complexe, les
temps d’incubation sont habituellement prolongés aussi. Typiquement, les enzymes de restrictions
sont fournies à des concentrations de 5-10 unités/l.
Le volume final d’enzyme ne devrait pas excéder 1/10 du volume réactionnel total, puisque le
glycérol dans la solution stock d’enzyme, que l’on ajoute pour empêcher la formation de cristaux
lors de la congélation, peut inhiber la réaction. Notez aussi que les solutions qui contiennent du
glycérol sont plus difficiles à manipuler avec des pipettes que des solutions aqueuses, soyez
attentifs aux volumes dans vos embouts de pipette.
LES MÉLANGES RÉACTIONNELS DES ENZYMES DOIVENT TOUJOURS
ÊTRES PRÉPARÉS ET GARDÉS SUR GLACE!!
Biologie Moléculaire-2014
33
GÉNÉRER UNE CARTE DE RESTRICTION D’UN PLASMIDE
Une des techniques de base dans le clonage c’est l’analyse par enzyme de restriction (AER) de
votre ADN cloné. L’AER et les cartes de restriction sont utilisées pour plusieurs différentes raisons
telles que pour faire la confirmation d’une procédure de clonage. On les utilise aussi comme
première étape dans le sous-clonage de grands fragments afin d’obtenir des fragments de plus
petites tailles pour faciliter le séquençage. Vous allez choisir un des échantillons inconnus pour
l’AER et la construction d’une carte de restriction. Ils ont chacun un vecteur pUC (voir carte) et
une insertion qui varie de taille et d’enzyme de restriction utilisé pour son clonage.
Il y a plusieurs stratégies pour l’AER. Les stratégies utilisées le plus couramment pour établir une
carte de restriction sont (1) des digestions doubles ou triples avec différentes combinaisons
d’enzymes de restriction (2) la digestion en série d’un fragment d’ADN isolé avec d’autres enzymes
(3) la digestion partielle, soit de l’ADN non marqué, ou de l’ADN qui a été marqué de façon
spécifique à une extrémité (Smith & Birnstiel, 1976, Nucl.Acids Res. 3: 2387).
La stratégie que nous allons utiliser est directe et facile à comprendre. Premièrement, vous ferez la
restriction de l’ADN avec une série d’enzymes (voir la liste des enzymes pour le site de restriction
et la concentration de tampon à utiliser). Après l’électrophorèse sur gel, vous serez capable de
déterminer quelles enzymes coupent à l’intérieur de l’insertion. Ensuite, en vous basant sur les
résultats que vous aurez obtenus, vous allez établir une stratégie pour déterminer l’emplacement de
ces sites sur une carte de restriction en utilisant des digestions doubles.
Pour un survol de la cartographie par d’enzymes de restriction, consultez les sites Web
suivants:
http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/RestMap/RestMapTutorial.html
http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/maps.html
http://wps.prenhall.com/esm_klug_essentials_5/17/4576/1171606.cw/content/index.html
Biologie Moléculaire-2014
34
Matériaux et Méthodes :
Certaines des enzymes de restrictions que vous utiliserez se retrouvent dans votre boîte au
congélateur. Si elles ne sont pas dans votre boîte, elles sont dans la boîte au congélateur du
groupe en face de vous sur le même bout de banc que vous.
Votre plasmide recombinant inconnu, à une concentration de 100g/mL est dans votre boîte
au congélateur. Assurez-vous de noter quel inconnu vous possédez!!
Les tampons 10X d’enzymes de restrictions sont dans votre boîte au congélateur.
Préparation de vos digestions : Puisque les différentes enzymes requièrent différents tampons, vous aurez à être flexible lorsque
vous ferez une digestion de restriction. Préparez un tableau en indiquant toutes les composantes que
vous avez l’intention d’ajouter et leurs volumes avant de débuter. Lorsque vous ajouterez une des
composantes à votre tube étiqueté, rayez-la de votre tableau. Choisir le tampon qui permet d’avoir
100% d’activité avec l’enzyme appropriée. (Consulter le tableau sur la page suivante)
Mélange réactionnel d’une digestion simple typique de 20µL:
Ingrédients Concentration finale/µL
ADN (100ng/µL) 250ng total
Tampon de restriction 10X 1X
Enzyme (10 unités/µL) 10 unités
Eau Compléter à 30µL
Biologie Moléculaire-2014
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Enzyme Tampon recommandé
pour 100% d'activité
% d'activité dans les tampons Fermentas
B G O R Tango
(bleu) (vert) (orange) (rouge) (jaune)
1X 1X 1X 1X 1X
ApaI B 100 20-50 0-20 0-20 20-50
BamHI BamHI 20-50 100 20-50 50-100 100
BclI G 20-50 100 20-50 20-50 100
BglI O 0-20 50-100 100 100 0-20
BglII O 0-20 20-50 100 50-100 0-20
BstXI O 20-50 100 100 50-100 50-100
ClaI Tango 20-50 20-50 20-50 20-50 100
EcoRV R 0-20 50-100 50-100 100 20-50
EcoRI EcoRI 0-20 NR 100 100 NR
HincII Tango 50-100 50-100 20-50 50-100 100
HindIII R 0-20 20-50 0-20 100 50-100
HinfI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100
HpaII Tango 50-100 50-100 0-20 20-50 100
HphI B 100 0-20 0-20 0-20 20-50
KpnI KpnI 20-50 0-20 0-20 0-20 20-50
MluI R 0-20 20-50 50-100 100 20-50
NcoI Tango 20-50 20-50 20-50 50-100 100
NdeI O 0-20 0-20 100 50-100 0-20
NheI Tango 100 20-50 0-20 0-20 100
PstI O 50-100 50-100 100 100 50-100
PvuI R 0-20 20-50 50-100 100 50-100
PvuII G 50-100 100 20-50 50-100 20-50
RsaI Tango 50-100 20-50 0-20 0-20 100
SacI SacI 50-100 20-50 0-20 0-20 50-100
SacII B 100 50-100 0-20 0-20 50-100
SalI O 0-20 0-20 100 20-50 0-20
ScaI ScaI 0-20 0-20 0-20 0-20 0-20
SmaI Tango 50-100 0-20 0-20 0-20 100
SspI G 20-50 100 0-20 50-100 100
TaqI TaqI 0-20 20-50 20-50 20-50 20-50
XbaI Tango 50-100 50-100 20-50 0-20 100
XhoI R 0-20 50-100 50-100 100 20-50
NR - Non recommandé
Biologie Moléculaire-2014
36
Vos Digestions : (Groupes de 2)
1. Préparer les digestions par enzymes de restrictions suivantes de 0.25g d’ADN.
BamHI
HindIII
PvuII
ScaI
2. Préparer un témoin de digestion, qui contient toutes les composantes, sauf pour l’enzyme.
3. Incuber à 37oC pour 60 minutes.
4. Durant l’incubation des digestions faire un gel d’agarose de 1.0% avec du bromure d’éthidium.
5. Après la période d’incubation, transférer 5L de vos digestions a des nouveaux tubes étiquetés
de façon appropriés et ensuite ajouter du tampon de chargement 5X à chacune d’entre elles afin
d’obtenir une concentration d’au moins 1X.
6. Entreposer les restants de chacune de vos digestions (étiquetées de façon appropriées) à -20oC.
7. Charger les échantillons qui contiennent le tampon de chargement dans le gel.
8. Charger 5μL du vecteur pUC9 linéarisé qui a été préparé pour vous.
9. Charger l’échelle de poids moléculaire.
10. Faire l’électrophorèse à 100V.
11. Après l’électrophorèse, examiner votre gel aux ultras violets et prendre une photo pour votre
analyse.
Projet II (Préparation pour le labo de la semaine prochaine)
Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
ANALYSE DE RESTRICTION AVEC DES DIGESTIONS DOUBLES
Après l’analyse de vos digestions, vous devriez avoir une liste d’enzymes de restrictions qui
coupent à l’intérieur du fragment cloné ainsi que les tailles des fragments produits par ces
digestions. D’après cette information, vous avez généré une carte de restriction préliminaire (ou
plusieurs cartes, s’il n’y avait pas une carte unique non ambigüe).
La semaine prochaine vous devrez utiliser ses données et vérifier la validité de la carte propose.
Votre but est d’utiliser des digestions doubles afin de confirmer aussi précisément que possible la
position des sites de restrictions à l’intérieur de l’insertion et de résoudre toutes ambiguïtés.
Un exemple simple vous démontre l’approche. Supposons qu’après la première digestion avec une
seule enzyme vous avez trouvé un site de restriction dans l’insertion pour l’enzyme X et aucun site
de restriction pour l’enzyme EcoR1. Sachant qu’EcoR1 se retrouve dans le site de clonage
multiple, une digestion double avec EcoR1 et X vous donnera la distance entre X et le site connu
d’EcoR1.
Pour le laboratoire la semaine prochaine vous devez déterminer quelles digestions doubles vous
permettront de cartographier le plus précisément possible tous les sites de restrictions qui se
retrouvent dans votre insertion. Notez que vous pourriez avoir à utiliser des enzymes de restrictions
qui n’ont pas été utilisés dans le labo cette semaine. Les enzymes à votre disposition sont listées sur
la prochaine page.
Biologie Moléculaire-2014
37
DEMANDE D’ENZYMES POUR LES DIGESTION DOUBLES
Une fois que vous aurez déterminé quelles digestions doubles vous désirez exécuter, vous aurez à
soumettre une requête pour les enzymes que vous n’avez pas déjà utilises dans le labo de cette
semaine et que vous possédez donc déjà. Vous pouvez réquisitionner jusqu’à, mais pas plus, de trois
enzymes parmi celles listées sur la page suivante. Votre réquisition doit être soumise au plus tard 72
heures avant le début du prochain labo. Par exemple, si votre labo est le mardi, votre réquisition doit
être soumise et reçu pour le samedi précèdent à 1h. Pour soumettre une réquisition, remplir toutes les
informations requises sur le formulaire de requête disponible sur la page web de ce cours sous la
rubrique « formulaire de réquisition d’enzymes ».
LISTE D’ENZYMES DE RESTRICTION UTILISÉES DANS CE COURS
ENZYME SITE
BamHI G▼
GATCC
BglII A▼
GATCT
EcoRI G▼
AATTC
HindIII A▼
AGCTT
PstI CTGCA▼
G
PvuII CAG▼
CTG
SacII (SstII) CCGC▼
GG
ScaI AGT▼
ACT
XbaI T▼
CTAGA
XhoI C▼
TCGAG
▼
- indique le lien phosphodiester clivé
Biologie Moléculaire-2014
38
Projet I
Mutagénèse dirigée de LacZ
Le but ultime de ce projet est d’utiliser la PCR pour changer certains des acides aminés dans
l’enzyme bêta galactosidase codée par le gène LacZ d’E.coli. La stratégie qui sera utilisée pour
atteindre ce but sera d’utiliser la réaction de la polymérase en chaîne afin de faire la mutagenèse
dirigée du gène tout en l’amplifiant. Ce projet comprend plusieurs parties indépendantes qui seront
exécutées pour plusieurs semaines à venir.
PARTIE I:
Des amorces ont été conçues afin de faire la mutagenèse et amplifier une partie de la séquence
codante du gène LacZ qui se retrouve dans le plasmide pUC19. Chaque groupe de 4 utilisera une
différente paire d’amorces afin de faire différents changements à la séquence. Les amorces qui seront
utilisées sont indiquées ci-dessous. Notez que plusieurs caractéristiques qui ne sont pas normalement
présentes sur la séquence de LacZ ont été ajoutées aux amorces afin de faciliter le clonage et le
criblage subséquent. Consulter les pages web suivantes pour rafraîchir vos connaissances sur la
PCR:
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
http://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
Amorces “Forward” de PCR:
GCCTGCAGGTCGACTCTCGAG GAT CC (PCRmutagenGAT)
Caractéristiques :
CTGCAG : Site PstI du site de clonage multiple de pUC19
La séquence originale du site de clonage multiple de pUC19 TCTAGA qui représente le site
XbaI a été modifiée à TCTCGA afin d’abolir le site XbaI et de créer un nouveau site de
restriction; XhoI.
Une des bases du codon « GAT » du cadre de lecture ouvert a été changée afin de créer un
nouveau codon.
Amorce « Reverse » : PCRmutagenRev
TGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAG
NdeI
PstI XbaI→ XhoI GAA=Glu (PCRmutagenGAA) TAT=Tyr (PCRmutagenTAT) GTT=Val (PCRmutagenGTT)
Biologie Moléculaire-2014
39
Méthode : (Groupes de 2)
Préparez vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50µL. Dans des tubes de PCR
étiquetés (utilisez des tubes de PCR à paroi mince de 200 µL), ajoutez les ingrédients dans l’ordre
indiqué dans le tableau ci-dessous. Pour chaque composante ajoutée, utilisez un nouvel embout
autoclavé. Notez : la polymérase Taq sera ajoutée par l’aide enseignant.
Préparation de la matrice d’ADN pUC19 :
1. Obtenez la préparation de pUC19 que vous avez isolée à la semaine 2.
2. Diluer un échantillon de votre préparation par un facteur de 100
3. Utiliser 5µL de la matrice diluée pour votre réaction de PCR
Ingrédients Conc. mère Conc. finale Volume
Eau Compléter à 50µL
Tampon PCR Taq 10X 1X
Amorce « Forward » assignée 2µM 0.2µM
Amorce « Reverse » 2µM 0.2µM
MgCl2 50mM 1.5mM
dNTP 2mM 200µM
pUC19 - 5µL
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL
Une fois que votre mélange réactionnel est complété, remettez-le à l’aide enseignant. Votre
échantillon vous sera retourné la semaine prochaine.
Conditions d’amplifications par PCR:
1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer.
2. 30 cycles de 30sec, 94oC dénaturation; 30sec, 57
oC appariement; 45sec, 72
oC extension.
3. 1 cycle de 5min, 72oC.
4. Refroidir à 4oC, indéfinie.
Biologie Moléculaire-2014
40
Exercice 4
Qu’est qu’on fait aujourd’hui !
Projet I : Mutagénèse dirigée de LacZ; PCR
Électrophorèse des amplicons de PCR
Purification des amplicons de PCR
Digestion des amplicons de PCR et du vecteur pUC19
Ligature des amplicons de LacZ
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
Biologie Moléculaire-2014
41
Projet II
Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
ANALYSE DE RESTRICTION PAR DIGESTIONS DOUBLES (II)
Vous devriez déjà avoir déterminé quelles digestions doubles vous désirez faire pour l’expérience de
cette semaine. Notez que pour chaque digestion double vous devrez aussi faire la migration des
digestions simples correspondantes sur votre gel. Par exemple si vous désirez faire une digestion
double BamHI-EcoRI, votre gel devrait aussi inclure des digestions simples BamHI et EcoRI pour
faciliter l’analyse.
Préparation de vos digestions :
1. Préparer vos digestions telles que précédemment. Puisque différentes enzymes requièrent
différents tampons, vous devrez être flexible afin de faire vos digestions. Si les deux enzymes
fonctionnent dans le même tampon, ajoutez simplement 1.0L de chacune des enzymes. Par
contre, si les deux enzymes fonctionnent dans des tampons différents, consulter le tableau de
compatibilité afin de déterminer le tampon approprié pour une activité maximale des deux
enzymes.
2. Incuber vos digestions pour 60 minutes à 37oC.
3. Migrer vos digestions tel que précédemment sur un gel d’agarose de 1%. Assurez-vous d’utiliser
le peigne approprié; celui qui fournira le nombre minimal de puits requis.
Biologie Moléculaire-2014
42
Projet II
Mutagenèse dirigée de LacZ; PCR
La semaine passée vous avez fait un PCR avec des amorces dirigées contre LacZ pour amplifier et
faire la mutagenèse dirigée du gène LacZ. Cette semaine vous utiliserez l’électrophorèse sur gel
d’agarose afin de vérifier la réussite de l’amplification avant d’initier le clonage.
ÉLECTROPHORÈSE DES AMPLICONS de LacZ
1. Récupérez vos réactions de PCR
2. Transférez 8µL de votre produit de PCR et placez-le dans un nouveau tube, puis ajoutez 2.5µL
de tampon de chargement 5X. Entreposer le restant sur glace pour des expériences subséquentes.
3. Charger vos échantillons sur un gel d’agarose de 1% précoulé qui contient du bromure
d’éthidium avec une échelle de poids moléculaire appropriée.
4. Observer sous les UV. Prendre une photo pour l’analyse.
CLONAGE DES AMPLICONS:
Consulter les sites web suivants pour un survol du clonage dans un vecteur plasmidique:
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/plasmidcloning.html
http://biology.kenyon.edu/courses/biol09/plasmid/plasmidtut1.htm
Les produits de PCR amplifiés et analysés par électrophorèse sur gel peuvent maintenant être clonés
dans un vecteur approprié. Rappelez-vous que durant votre réaction de PCR des sites de restriction
étaient présents dans chacune des amorces afin de permettre le clonage directionnel du produit de
PCR dans un vecteur. Maintenant, nous devrons digérer le vecteur ainsi que le produit de PCR afin
de générer des extrémités compatibles pour la ligature subséquente. Puisque le PCR, les digestions et
la ligature sont faites dans différents tampons, nous devrons purifier l’ADN entre ces étapes afin
d’optimiser la prochaine réaction. La suite des étapes est:
Réaction de PCR (entreposer dans le congélateur)
Purification des produits de PCR par la méthode de Qiaquick
Digestion des amplicons et du vecteur pUC19
Purification des produits de PCR digérés avec PstI et NdeI par la méthode de Qiaquick
Migration sur gel de pUC19 digéré avec PstI et NdeI suivi de sa purification par la méthode de
Qiaquick
Ligature des amplicons dans pUC19 pour les transformations subséquentes
Biologie Moléculaire-2014
43
PURIFICATION DES PRODUITS DE PCR
Protocole pour la purification des produits de PCR en utilisant le kit de purification Qiaquick
(voir l’organigramme sur la prochaine page)
NOTEZ: toutes les centrifugations auront lieu à la température de la pièce et à vitesse maximale.
ASSUREZ-VOUS D’UTILISER POUR CHAQUE CENTRIFUGATION UN AUTRE TUBE
POUR BALANCER (celui d’un autre groupe!?!).
1. Mesurez le volume de la réaction de PCR.
2. Ajoutez 5 volumes de tampon PB à 1 volume de la réaction de PCR et mélangez par inversion.
3. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.
4. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.
5. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK
dans le même tube.
6. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.
7. Jeter l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES.
8. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.
9. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le
même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon
PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.
10. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.
11. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la
colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.
12. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne
QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.
13. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez
jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon
d’élution afin de compléter le volume à 30.0µL).
Biologie Moléculaire-2014
44
Protocole pour la Purification QIAquick
Produit de PCR
ou
Morceau de gel solubilisé
ou
Réaction enzymatique
Liaison
Lavage
Élution
Biologie Moléculaire-2014
45
DIGESTIONS DES AMPLICONS DE PCR ET DU VECTEUR pUC19
Méthode: (Groupes de 2 assignés)
Un des groupes de deux fera la digestion du produit de PCR purifié tandis que l’autre groupe
de deux fera la digestion du vecteur pUC19!
1. Préparer comme suit un mélange réactionnel de 30µL ou 50uL pour faire une digestion double
PstI-NdeI de vos produits de PCR ainsi que du vecteur pUC19 que vous avez isolé à la semaine
2.
Volume PCR Volume Vecteur
Produit de PCR 10uL ---------
OU Vecteur pUC19 --------- 5uL
Tampon de restriction O range 10X 1X 1X
Pst I 1uL 1uL
Nde I 1uL 1uL
Eau Compléter à 50uL Compléter à 30uL
2. Faire la digestion à 37oC pour 1 heure.
Pour les digestions des produits de PCR
3. Suite à la digestion, purifier tel que précédemment les produits de PCR digérés une fois de plus
par la méthode de QiaQuick.
Pour les digestions de pUC19
4. Couler un gel de 1% avec le peigne de huit puits sur lequel vous avez collé deux des puits
ensemble à l’aide de papier collant. (Voir l’image ci-dessous)
5. Faire la migration de la totalité de votre digestion du vecteur pour approximativement 45
minutes.
6. Examiner votre gel sous les UV, découper la bande d’agarose qui contient le vecteur digéré et la
mettre dans un tube de microcentrifuge.
7. Poursuivre avec la purification par la méthode de QiaQuick tel qu’indiqué sur la page suivante.
Biologie Moléculaire-2014
46
PURIFICATION D’ADN SUR GEL AVEC LE KIT DE PURIFICATION QIAQUICK
NOTEZ: toutes les centrifugations auront lieu à la température de la pièce et à vitesse maximale.
ASSUREZ-VOUS D’UTILISER POUR CHAQUE CENTRIFUGATION UN AUTRE TUBE
POUR BALANCER (celui d’un autre groupe!?!).
Méthode : (Groupes de 2 assignés)
1. Déterminer le poids de votre bande d’agarose.
2. Ajouter 300µL du tampon QG pour chaque 100mg de gel.
3. Incuber à 50°C pour 10 min (ou jusqu’a ce que la bande d’agarose soit totalement dissoute)
4. Ajouter 100µL d’isopropanol pour chaque 100mg de gel.
5. Placez une colonne “spin” QIAQUICK dans un tube de récupération de 2mL.
6. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon sur la colonne QIAQUICK et centrifugez 1 min.
7. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES et replacez la colonne “spin” QIAQUICK
dans le même tube.
8. Ajoutez 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute afin de laver.
9. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES.
10. Lavez encore une fois en ajoutant 0.375mL de tampon PE à la colonne et centrifugez 1 minute.
11. Jetez l’éluat dans les DÉCHETS ORGANIQUES. Replacez la colonne QIAQUICK dans le
même tube. Centrifugez 1 minute. Cette centrifugation élimine les résidus d’éthanol du tampon
PE qui pourrait éluer avec l’ADN et interférer avec les étapes subséquentes.
12. Placez la colonne QIAQUICK dans un nouveau tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté.
13. Afin d’éluer l’ADN, ajoutez 30µL du tampon EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) au centre de la
colonne QIAQUICK et centrifugez 1 minute.
14. En utilisant un nouvel embout de pipette, transférez le liquide récupéré au centre de la colonne
QIAQUICK et centrifugez une deuxième fois pour 1 minute.
15. Transférez le liquide récupéré dans un tube à microcentrifugeuse de 1.5mL étiqueté et entreposez
jusqu’au besoin. (Si vous n’étiez pas capable de récupérer 30.0µL, ajoutez assez du tampon
d’élution afin de compléter le volume à 30.0µL).
LIGATURE DES AMPLICONS
Vous pouvez maintenant préparer les ligatures de produits de PCR au vecteur pUC19 digéré.
Préparation de vos ligatures:
Ingrédient Tube 1 Tube 2
Vecteur 5.0L 5.0L
Tampon de ligature 10 X 2.0L 2.0L
Amplicon de PCR (insertion) 5.0L 0.0L
Eau ajouter de l’eau pour compléter le volume à 20.0L
Ligase 1.0L 1.0L
DONNER VOS ÉCHANTILLONS ÉTIQUETÉS À VOTRE AIDE ENSEIGNANT
Les ligatures seront incubées à la température de la pièce jusqu'à demain puis entreposées à -20oC
Biologie Moléculaire-2014
47
Exercice 5
Qu'est-ce qu’on fait aujourd'hui!
Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ Transformation des ligatures
Projet II: Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
(dernière chance)
Project III: Empreinte génomique Isolation d’ADN génomique humain des cellules de joues
Amplification par PCR du VNTR d’ApoC2
Amplification du RFLP d’ApoB
Biologie Moléculaire-2014
48
Projet II
Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN
(Dernière chance) Dans le meilleur des mondes, les digestions doubles que vous avez exécutées la semaine dernière
étaient idéales et ont toutes fonctionné. Après l’analyse de vos résultats, vous avez pu déterminer
précisément la position d’autant des sites de restrictions que possible. Malheureusement, les choses
ne fonctionnent pas toujours parfaitement la première fois, même pour les chercheurs les plus
expérimentés. Vous pouvez répéter vos digestions, faire des digestions différentes, les faire migrer
sur un gel d’un différent pourcentage, etc.
SI NÉCESSAIRE, FAITES LES EXPÉRIENCES REQUISES AFIN DE PRÉCISER VOTRE
CARTOGRAPHIE.
Projet I
Mutagenèse dirigée de LacZ
Transformation des ligatures dans des cellules d’E.coli :
La semaine dernière, vous avez fait des ligatures afin d’introduire vos amplicons dans pUC19. Afin
d’isoler, d’amplifier et de maintenir les recombinants voulus vous allez maintenant introduire ces
plasmides recombinant dans E.coli. Vous allez transformer des cellules d’Escherichia coli TOP10
avec vos ligatures de la semaine passée. E. coli n’incorpore habituellement pas facilement l’ADN
mais ces cellules ont subi un traitement au CaCl2 afin de modifier leur paroi cellulaire. Les cellules
que vous allez recevoir sont donc COMPÉTENTES pour la transformation d’ADN. Mais, même
avec ce traitement, seulement qu’un faible pourcentage des cellules prendront de l’ADN. Afin
d’identifier celles-ci, un marqueur de sélection, la résistance à l’ampicilline, est inclus dans le
vecteur. Donc, seulement les cellules qui auront incorporé un plasmide circulaire, qui peut être
répliqué et maintenu, exprimeront cette résistance et seront capables de croître sur des géloses qui
contiennent de l’ampicilline. Toutes les cellules qui n’auront pas incorporé d’ADN ou qui auront
incorporé de l’ADN linéaire n’exprimeront pas cette résistance est ne pourront pas croître sur des
géloses sélectives.
Biologie Moléculaire-2014
49
Matériaux :
Cellules d’E.coli TOP10 compétentes
Géloses YT-AMP: (supplémentées avec 50μg/mL d’ampicilline pour la sélection).
Méthode :
1. Étiqueter 2 tubes jetables (tubes “snap-cap” de polypropylène de 15mL) et entreposés sur glace.
2. Transférer 100µL de cellules dans chaque tube, en vous assurant de ne pas contaminer les parois
du tube avec votre pipette.
3. Ajoutez 5µL de la ligature appropriée au tube étiqueté. Mélangez en remuant, et garder 30
minutes sur glace.
4. Incubez pour exactement 45 secondes dans un bain d’eau à 42ºC. Ce choc thermique est
nécessaire afin d’obtenir une bonne efficacité de transformation, mais si vous gardez les cellules à
42ºC pour trop longtemps, elles vont mourir. Ensuite, transférez immédiatement sur glace.
5. Ajoutez 0.9mL de bouillon SOC préchauffé (37ºC). Incubez 1 heure à 37
ºC en mélangeant afin de
permettre l’expression du gène de résistance à l’antibiotique.
6. Étalez 100µL et 200L de chacun des mélanges de transformation sur des géloses YT-AMP et
incubez toute la nuit à 37°C. Assurez-vous que vos plaques sont clairement étiquetées et placées à
l’envers dans l’incubateur à 37°C pour la soirée.
Les témoins de transformation suivants seront faits par vos aides enseignants:
Cellules traitées avec de l’ADN plasmidique (~5 pg de pUC circulaire)
Toujours utiliser les contenants à déchets de biohazard pour jeter les déchets microbiens et
d’ADN recombinant.
LE LENDEMAIN, VOS GÉLOSES SERONT ENTREPOSÉES À 4oC.
Biologie Moléculaire-2014
50
Projet III
Empreintes génomiques
L’analyse de polymorphismes de nucléotides simples (SNP) est devenue chose courante pour
identifier des génotypes de maladies et autres.
VNTR
Le principe de la variation évolutionnaire parmi une population est une des fondations de la biologie.
Ces variations sont le résultat de différences subtiles dans la séquence d'ADN des individus d'une
espèce donnée. Les variations surviennent souvent à cause d'erreurs de duplication de courtes
séquences de nucléotides où seulement qu'une copie était présente avant la réplication. Ceci résulte
en une répétition en tandem de la séquence originale. Si cette erreur survient encore une fois dans
une autre ronde de réplication, alors trois copies de la séquence seront en tandem (figure). Ces
répétitions en tandem font partie de nos chromosomes et sont donc héritées d'après le principe de la
génétique de Mendel. Au cours des siècles, le nombre de répétitions en tandem a augmenté ce qui
fait que chacun d'entre nous a hérité un nombre variable de répétitions en tandem (VNTRs) à
plusieurs loci dans nos génomes. On peut penser à un VNTR comme un loci avec chaque nombre de
répétitions d'une unité particulière étant analogue à différents allèles. Donc, chaque être humain (sauf
pour les vrais jumeaux) possède une combinaison unique de VNTRs et ces allèles peuvent être
utilisés dans les études de populations ou pour identifier un individu particulier.
Figure. Illustration du nombre de répétitions en tandem variable (VNTRs). Un simple brin d'ADN
du même locus de trois différents individus est montré. Dans cette région, le trinucléotide répété
CAT est présent une, deux ou trois fois ce qui donne des allèles de trois différentes longueurs.
RFLP
Un autre type de polymorphisme qui survient est appelé un polymorphisme de restriction de longueur
(RFLP). Ces polymorphismes surviennent quand un nucléotide unique est changé dans un site de
restriction, ce qui l'abolit ou le change. En conséquence, une région donnée du génome peut avoir un
site de restriction qui est absent dans la même région d'une autre copie du génome ou dans le génome
d'un autre individu.
Dans ce projet, vous déterminerez votre génotype de deux polymorphismes, un VNTR et un RFLP,
associé avec les gènes ApoC2 et ApoB respectivement.
Biologie Moléculaire-2014
51
Isolation d’ADN génomique des cellules de joues:
Méthode: (Groupes de 2)
1. Une personne de chaque groupe de deux devrait utiliser un écouvillon stérile afin de se frotter
l’intérieur d’une des joues six fois. Sans tourner l’écouvillon, le déplacer de l’autre côté et frotter
l’intérieur de l’autre joue six fois.
2. Placer la portion de coton de l’écouvillon dans un tube de microcentrifuge de 1.5mL. Ensuite,
briser la tige juste au-dessus du coton pour qu’il tombe dans le tube.
3. Ajouter 400µL de PBS 1X pH 7.4 dans le tube.
4. Ajouter 20µL de protéinase K puis 400µL du tampon AL. Mélangé immédiatement au vortex
pour 15 secs. Ne pas ajouter la protéinase K directement au tampon AL.
5. Incuber à 56oC pour 10 min. Centrifuger brièvement pour récolter le liquide sur les parois.
6. Ajouter 400µL d’éthanol à 99%. Mélanger sur le vortex pour 8 à 10 sec. Centrifuger brièvement
pour récolter le liquide sur les parois.
7. Appliquer 600µL de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols et
centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de collecte.
8. Appliquer le restant de votre mélange à la colonne. Fermer le capuchon afin d’éviter des aérosols
et centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de collecte.
9. Ajouter 500µL du tampon AW1. Fermer et centrifuger à 8k rpm pour 1min. Changer le tube de
collecte.
10. Ajouter 500µL du tampon AW2. Fermer et centrifuger à vitesse maximale pour 3min. Changer le
tube de collecte.
11. Centrifuger à vitesse maximale pour 1 min afin de retirer le tampon résiduel et prévenir le
transfère.
12. Placer une colonne QIAprep dans un nouveau tube de 1.5mL de microcentrifuge duquel vous
avez coupé le capuchon. Ajouter 150µL du tampon AE à la colonne. Attendre 1 min puis
centrifuger à 8k rpm pour 1 min afin d’éluer.
13. Transférer l'ADN élué à un nouveau tube de microcentrifuge étiqueté et entreposé pour une
utilisation ultérieure.
Biologie Moléculaire-2014
52
Amplification par PCR des gènes ApoC2 et ApoB
Méthode: (Groupes de 2)
Les groupes pairs amplifieront le gène ApoB
Les groupes impairs amplifieront le gène ApoC2
Préparer vos réactions de PCR dans un volume réactionnel total de 50L. Dans des tubes de PCR
étiquetés (utiliser des tubes de PCR de 200L à paroi mince) ajouter les ingrédients suivants dans
l'ordre indiqué dans le tableau ci-dessous. Utiliser un nouvel embout autoclavé pour chaque
composante. Notez: la polymérase Taq sera ajoutée par A.E.
Ingrédients Conc. mère Conc. Finale Volume
Eau Compléter à 50µL
Tampon de PCR Taq 10X 1X
Amorce ApoB For ou D1S80 For 2µM 0.2µM
Amorce ApoB Rev ou D1S80 Rev 2µM 0.2µM
MgCl2 50mM 2.0mM
dNTP 2mM 200µM
ADN Génomique de joue 5µL 5µL
Polymérase Taq 5 unités/µL 0.05 unités/µL
Une fois que vous aurez complété l'assemblage de votre réaction, donnez là à votre aide enseignant.
Vos échantillons vous seront retournés la semaine prochaine.
Conditions d'amplification par PCR:
1. 1 cycle de 5min, 94oC pour dénaturer;
2. 35 cycles de 30sec, 94oC dénaturer; 30sec, 55
oC (ApoB) ou 65
oC (ApoC2) appariement;
1min, 72oC extension.
3. 1 cycle de 5min, 72oC.
4. Refroidir indéfiniment à 4oC.
Biologie Moléculaire-2014
53
Exercice 6
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Projet I: Mutagénèse dirigée de LacZ Criblage par PCR des transformants
Analyse des produits de la PCR de colonies
Repiquage sur X-Gal
Projet III: Empreintes génomiques Digestion par enzyme de restriction et analyse sur gel du produit d'amplification
d'ApoB
Analyse sur gel du produit d'amplification d'ApoC2
Biologie Moléculaire-2014
54
Projet I
Mutagenèse dirigée de LacZ
Criblage et repiquage des transformants d’E.coli
Si vos transformations ont été une réussite, vous allez voir plusieurs colonies représentant des clones
indépendants d’E.coli qui possèdent des plasmides avec ou sans insertions. Votre première tâche
consiste à compter toutes les colonies sur toutes les géloses des ligatures, incluant les témoins de
ligatures et de transformation. Enregistrer le nombre de colonies sur chacune des géloses.
ASSUREZ-VOUS DE GARDER UN RAPPORT PRÉCIS DES DONNÉES; CELLES-CI NE
VOUS SERONT PAS DONNÉES À UNE DATE ULTÉRIEURE!!
Une fois les comptes enregistrés vous utiliserez la PCR pour cribler les recombinants pour des
insertions (et visualiser les produits de PCR suite à une électrophorèse). Ceci sera accompli en
utilisant des amorces contre des régions du vecteur pUC19 qui bordent le gène LacZ.
Méthode:
1. Étiqueter 4 tubes de microcentifuge de 1-4 et faire une grille sur une gélose YT+ amp + Xgal
étiquetée de 1-4.
2. Préparer un cocktail de PCR pour 5 réactions de 20L. GARDÉE SUR GLACE Ci-dessous est
la recette pour un mélange réactionnel de 20L.
Réactions de PCR
Solution Conc. mère Conc. finale
Eau L pour un volume final de 20 L
Tampon Taq 10X 1 X
Amorce MutScreenFor 2 M 0.2 M
Amorce MutScreenRev 2 M 0.2 M
MgC12 50 mM 2.5 mM
dNTPs 2mM 200 M
ADN Pol. Taq 5U/µL 2.5U
3. Distribuer 20L du cocktail à chacun des 4 tubes de PCR étiquetés (SUR GLACE)
4. Utiliser un embout de pipetteur et toucher délicatement une de vos colonies, strier sur un des
quartiers de votre gélose, puis placer l’embout dans le tube de PCR correspondant.
5. Répéter l’étape 4 avec 3 autres colonies.
6. Retirer les embouts de chacun des tubes de PCR, fermer le capuchon et donner vos tubes à votre
aide enseignant pour qu’ils soient placés dans le cycleur thermique.
7. Mettre vos géloses à l’endroit désigné pour qu’elles soient incubées.
Conditions de PCR:
i. 1 cycle de 5 min, 94oC pour dénaturer;
ii. 30 cycles de 30s, 94oC dénaturer; 30s, 55
oC appariement; 1.5min, 72
oC extension.
iii. 1 cycle de 5 min, 72oC
iv. Refroidir à 4oC.
8. Préparer un gel d’agarose de 1.25% contenant du bromure d’éthidium
Biologie Moléculaire-2014
55
Analyse des produits de PCR:
1. Obtenir vos réactions de PCR puis poursuivre comme suit :
Digestions avec XbaI
2. Préparer 4 digestions, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un volume final de 20µL
qui contient 5µL de chacun de vos produits de PCR.
3. Faire la digestion pour une heure.
Digestions avec XhoI
2. Préparer 4 digestions, une pour chacune de vos réactions de PCR, dans un volume final de 20µL
qui contient 5µL de chacun de vos produits de PCR.
3. Faire la digestion pour une heure.
Migration sur gel
4. Pour chaque réaction de PCR préparez les échantillons suivant pour l’analyse sur gel :
5µL du produit de PCR
+ 5µL
Tampon de chargement
Non digéré
Digéré avec XbaI
Digéré avec XhoI
5. Charger 5 L de chaque mélange, ainsi que l’échelle de poids moléculaire sur votre gel d’agarose
de 1.25%. Faites migrer pour 1 à 1.5 heures à 100 V.
6. Prendre une photo de votre gel.
Projet III
Empreintes génomiques Méthodes (Groupes de 2)
Gène ApoB:
1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoB.
2. Dans le cas du gène ApoB, utiliser 10µl de la réaction de PCR pour préparer une digestion par
enzyme de restriction avec l'enzyme EcoRI dans un volume final de 20µl.
3. Un groupe de la classe préparera aussi un témoin non digéré.
4. Après avoir fait la digestion pour une heure, ajoutée du tampon de chargement et chargée sur le
gel précoulé.
5. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour
votre analyse.
Gène ApoC2 1. Obtenir vos réactions de PCR du gène ApoC2.
2. Ajouter du tampon de chargement à un échantillon de 10µl de votre réaction de PCR.
3. Charger sur le gel précoulé.
4. Une fois que tout le monde aura chargé le gel, ceux-ci seront migrés et une photo sera prise pour
votre analyse.
Biologie Moléculaire-2014
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Exercice 7
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Projet IV : Contrôle transcriptionnel du gène de Mel1 Isolation d’ARN de levures
Électrophorèse d’ARN
Transfert Northern
RT-PCR
Biologie Moléculaire-2014
57
Projet IV
Contrôle transcriptionnel du gène Mel1
Cette semaine vous initierez des expériences qui vous permettront d’examiner la régulation
transcriptionnelle du gène Mel1 qui code pour l’enzyme alpha galactosidase. Vous examinerez
l’abondance relative du transcrit de Mel1 sous différentes conditions de croissances. Deux méthodes
seront utilisées. La première, est l’analyse Northern. Cette technique implique l’isolation, la
séparation et le transfert de l’ARN plutôt que de l’ADN. La deuxième technique qui pourrait être
utilisée est le RT-PCR qui sera discuté plus loin.
Isolation d’ARN totaux:
Comme dans toutes expériences, la purification du matériel de départ est cruciale. Vous allez isoler
de l’ARN de cellules de levures de S. pastorius et utiliser ensuite la spectrophotométrie afin
d’estimer la concentration et la pureté de l’ARN.
Les manipulations de l’ARN sont plus exigeantes que les manipulations de l’ADN puisque l’ARN est
moins stable et plus susceptible à la dégradation. Vous devez donc faire très attention de ne pas
contaminer aucune des solutions.
Toujours porter des gants!!
Dans l’expérience suivante, vous ferrez l’isolation d’ARN total de différentes conditions de
croissances. Une culture de levure a initialement été crue dans un bouillon avec du glucose. Au début
du laboratoire, cette culture a été transférée dans soit un milieu contenant du galactose ou un milieu
contenant du glucose plus du galactose. Chaque groupe isolera l’ARN total d’une des conditions de
croissances après le transfert à différentes périodes de temps après le transfert (T = 0, 2, 4, 6 h.).
Vous allez ensuite partager votre ARN avec celui des autres groupes qui ont isolé l’ARN d’une
différente condition de croissance afin de comparer l’abondance relative de l’ARN de Mel1 entre ces
conditions.
À la fin de cette expérience, vous devriez donc générer une membrane avec l’ARN des différentes
conditions de croissances.
Biologie Moléculaire-2014
58
Méthode : (Groupes de 2) (les étapes 1-3 ont été faites pour vous)
1. Obtenir 10 mL d’une culture de levure qui représente un transfert d’un milieu avec du glucose à
un milieu avec du galactose ou du glucose + galactose, tel qu’assigné.
2. Centrifuger pour 10 minutes à 7 000 rpm.
3. Jeter le surnageant.
4. Suspendre le culot dans 200μL de tampon de lyse.
5. Transférer à un nouveau tube avec un bouchon à vis qui contient des billes de verres et 200μL de
phénol:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1).
6. Mélanger au vortex pendant 2 minutes et ensuite placer sur glace pour 2 minutes.
7. Répéter l’étape 6 deux fois de plus.
8. Centrifuger à vitesse maximale pour 5 minutes. Transférer la phase aqueuse supérieure à un
nouveau tube.
9. Ajouter 0.1 volume de 3M NaOAc et 1mL d’ETOH de 99%, bien mélangé par inversion et
centrifuger à vitesse maximale pour 2 minutes.
10. Jeter le surnageant et suspendre le culot dans 100μL d’eau traitée au DEPC.
11. Déterminer le rendement et la pureté.
Détermination de la concentration d’ARN et la quantité récupérée par spectrophotométrie.
Préparer une dilution de votre échantillon d’ARN de 1/20 avec de l’eau dans un volume final de 100
µl. Mesurer l’absorbance aux longueurs d’onde de 260 nm et 280 nm en utilisant de l’eau comme
témoin. Vous pouvez estimer la concentration d’ARN en utilisant le rapport suivant (pour de l’ARN
simple brin): absorbance de 1.0 à 260 nm = une concentration d’ARN de 40 g/mL Si le rapport
A260/A280 >1.90, l’ARN est relativement pure et sans protéine.
Calculer la quantité d’ARN récupérée. Vous désirez obtenir 5g dans un volume maximal de 9lL
Électrophorèse d’ARN et transfert Northern (Groupes de 4)
On peut utiliser l’analyse Northern afin de détecter une seule espèce d’ARN à l’intérieur d’une
population d’ARN total provenant d’un organisme (ou organite). Avant qu’un transfert Northern
puisse être fait, les molécules d’ARN sont séparées en fonction de leurs tailles sur un gel d’agarose
dénaturant. Le type de gel d’ARN les plus couramment utilisés est celui fait de formaldéhyde. Ce
type de gel procure des conditions dénaturantes qui empêchent l’appariement des bases, réduisant
ainsi la formation de structures secondaires chez les molécules d’ARN. Ceci est important puisque,
contrairement aux fragments d’ADN bicaténaires qui ont la même conformation malgré les
différentes longueurs, les ARN monocaténaires peuvent avoir différentes conformations en raison de
l’appariement de bases à l’intérieur du brin. De telles structures secondaires affecteraient la
migration électrophorétique et rendraient l’estimation de la taille imprécise.
Biologie Moléculaire-2014
59
Matériaux:
Les ribonucléases sont partout! Afin de réduire le risque de dégradation de l’ARN, portez des gants
et conservez vos échantillons sur glace. Le formaldéhyde est toxique. Portez des gants et des
lunettes de sécurité lorsque vous manipulez cette solution et travaillez sous la hotte autant que
possible.
Méthodes :
A. Préparation d’un gel d’agarose au formaldéhyde (Un gel par groupes de 4)
1. Combinez les composantes suivantes pour la préparation d’un gel d’agarose-formaldéhyde de
1.5% (25mL) pour l’appareil BRL Horizon (en utilisant le peigne à 8 puits):
Tampon MOPS 5X, pH 7.0 5 mL
H20 15.5 mL
Agarose 0.375 g
2. Dissoudre l’agarose dans le four à micro-ondes. Laissez refroidir un peu. Ensuite, sous la hotte,
ajoutez 4.5mL de formaldéhyde (solution 37%) (ATTENTION! VAPEURS VOLATILES).
Mélangez en remuant et coulez le gel immédiatement.
3. Fermer le couvercle et laisser le gel solidifier au moins 30 minutes.
B. Préparation des échantillons d’ARN (par groupes de 4)
Vous allez préparer quatre échantillons d’ARN différents. Il est important que chaque voie de
migration du gel contienne la même quantité d’ARN.
Vous aurez besoin des échantillons d’ARN suivants :
Un échantillon d’ARN totaux de levure 0h après le transfert
Un échantillon d’ARN totaux de levure 2h après le transfert
Un échantillon d’ARN totaux de levure 4h après le transfert
Un échantillon d’ARN totaux de levure 6h après le transfert
1. Afin de préparer les échantillons d’ARN pour la migration sur le gel, mélangez les composantes
suivantes en utilisant des tubes étiquetés SUR GLACE:
Volume final = 30 µL
Échantillon d’ARN: µL (Ce volume d’échantillon devrait contenir 5 g d’ARN)
Tampon de chargement: 21µL (Tampon de chargement pour l’ARN et non pas pour l’ADN)
Eau (jusqu’à 30 µl): µL
2. Incubez vos échantillons 10 minutes à 70ºC et ensuite, placez rapidement les échantillons sur
glace. S’il y a du liquide sur le bord du tube, centrifugez quelques secondes.
3. Chaque groupe de 4 doit préparer un gel comme suit : Charger 14 µL des échantillons d’ARN des
différentes conditions de croissances sur un gel comme suit :
Biologie Moléculaire-2014
60
VOIES ÉCHANTILLONS
1 Vide
2 Vide
3 ARN de cellules de levure 0h après le transfert au galactose ou glucose + galactose
4 ARN de cellules de levure 2h après le transfert au galactose ou glucose + galactose
5 ARN de cellules de levure 4h après le transfert au galactose ou glucose + galactose
6 ARN de cellules de levure 6h après le transfert au galactose ou glucose + galactose
7 Vide
8 Vide
Ceci génèrera un gel qui contient des échantillons de deux groupes de 4 et des gels duplicata par
table.
C. Électrophorèse sur gel
1. Le tampon de migration sera du MOPS 1X. Faire migrer le gel à 80 V (courant de ~ 80 mA)
jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol dépasse la moitié du gel.
2. Enlevez le gel du boîtier d’électrophorèse, examinez sous les UV et prenez une photo.
Notez : Les gels de formaldéhydes sont plus FRAGILES que les gels non dénaturants, faites
très attention!
3. Lavez le gel 2 fois avec 5 volumes d’eau, et ensuite 1 fois en utilisant 2 volumes de 10X SSC
pour environ 5 minutes chaque fois. Ceci est nécessaire afin d’enlever le formaldéhyde qui
préviendrait l’hybridation.
D. Transfert capillaire (par groupes de 4)
On vous fournira une membrane de nylon ainsi que des papiers-filtres coupés de la même taille que le
gel. Éviter autant que possible de manipuler la membrane avec vos doigts.
1. Étiqueter une extrémité de la membrane avec le jour du labo, votre no de groupe, et « ARN ».
2. Tremper la membrane dans de l’eau distillée et ensuite dans du 2X SSC.
3. Assembler votre transfert Northern tel qu’illustré sur la page suivante. Assurez-vous que la
périphérie de votre gel est entourée avec de la pellicule de plastique afin d’éviter un court-circuit.
4. Après le transfert, la membrane est séchée, étiquetée, fixée aux UV et entreposée dans un sac de
plastique.
Biologie Moléculaire-2014
61
Transfert Capillaire Northern
Membrane de nylon coupée à
la taille exacte du gel
Gel
Face vers le bas
Deux feuilles de papiers
filtres trempés dans du
SSC 20X
Papier filtre qui trempe
dans du SSC 20X
Panneau de verre ou de plastique
pour le support sur un plateau
remplit de SSC 20X
Pile de papiers absorbants Poids
Direction capillaire
Biologie Moléculaire-2014
62
AMPLIFICATION PAR RT-PCR de L’ARNm DE L’ACTINE
Une autre méthode qui peut être utilisée pour comparer l’abondance relative d’un transcrit sous
différentes conditions est le RT-PCR. Contrairement à une analyse Northern, cette méthode est plus
sensible et idéale pour l’analyse de transcrits faiblement exprimés.
Contrairement aux réactions de PCR traditionnelles, tel que celle que vous avez faite avec l’ADN
génomique, le RT-PCR utilise l'ARN plutôt que l'ADN comme matrice. Par contre, puisque l’ADN
polymérase thermostable utilisé dans la réaction de PCR fonctionne seulement avec une matrice
d'ADN, l'ARN doit préalablement être transcrit en ADN. Ceci est accompli par un ADN polymérase
ARN-dépendante, la transcriptase inverse (RT). La transcriptase inverse est utilisée pour synthétiser
un ADN complémentaire (ADNc) simple-brin à partir de l'ARN d'intérêt. Une amorce oligo dT sera
utilisée pour cette réaction. Une fois que l'ADNc a été généré, une réaction de PCR standard peut être
utilisée pour amplifier la séquence d’ADN complémentaire à l’ARNm.
Pour un survol sur la technique de RT-PCR consultez le site web suivant :
http://www.bio.davidson.edu/courses/Immunology/Flash/RT_PCR.html
NOTEZ: CHAQUE GROUPE DE DEUX DEVRA FAIRE UNE RÉACTION DE
TRANSCRIPTASE INVERSE SUR L’ARN QU’ILS AURONT ISOLÉ DE LEVURES CRUES
SOUS LA CONDITION DE CROISSANCE ASSIGNÉE EN UTILISANT LES AMORCES
POUR L’ACTINE.
Méthode (Groupes de 2)
Chaque groupe exécutera les 5 réactions suivantes :
Réaction de RT avec l’ARN traité avec l’ADNase
Réaction de RT avec l’ARN NON traité avec l’ADNase
Réaction de PCR avec l’ARN traité avec l’ADNase non traité avec la RT
Réaction de PCR de la réaction de RT sur l’ADN traité avec l’ADNase
Réaction de PCR de la réaction de RT sur l’ADN NON traité avec l’ADNase
Réaction de PCR de l’ARN Non traité avec soit l’ADNase ou la RT
Réaction de PCR sans ARN (pas de matrice)
Préparation des échantillons d’ARN pour les réactions de RT
Préparer une dilution de votre ARN comme suit : Cette dilution sera ensuite utilisée comme votre
source d’ARN pour toutes les réactions requises décrites dans cette section.
4.0g de votre échantillon d’ARN
5.0L du tampon 10X de l’ADNase I
Eau jusqu’à un volume final de 50L
Traitement de l’ARN total avec ADNase :
1. Avant de faire votre réaction de RT, vous devez vous assurer d'éliminer tout ADN contaminant
de vos échantillons d'ARN. Dans un volume final de 25L, ajouter les composantes suivantes:
24L de votre échantillon d’ARN dilué
1L de l’ADNase I
2. Incubez 15 minutes à la température de la pièce. Après le traitement à l'ADNase, inactivez
l'enzyme en ajoutant 2.5µL d’EDTA 25mM et en incubant 5 minutes à 65ºC. Refroidir sur glace.
Biologie Moléculaire-2014
63
Réactions de transcriptase inverse :
3. Préparer votre réaction de RT dans des tubes de PCR tel qu’indiqué ci-dessous. Utiliser un nouvel
embout autoclavé pour chacune des composantes ajoutées.
4. Mettre 19.0L d’eau DEPC dans chacun de deux tubes étiquetés : +ADNase et -ADNase.
5. Ajouter 4.0L d’amorce oligo-dT.à chaque tube.
6. Ajouter 4.0L d’un mélange de dNTP à 2mM à chaque tube.
7. Réaction +ADNase : Ajouter 2L de votre ARN traité à l’ADNase au tube approprié.
8. Réaction sans ADNase : Ajouter 1.75L de votre dilution d’ARN non traité et 0.25L d’eau au
tube approprié.
9. Permettre l’appariement de l’amorce oligo-dT en incubant vos mélanges pré-réactionnels de RT à
70oC pour 5 minutes.
10. Laisser vos tubes refroidir sur votre table de travail pour 5 minutes.
11. Ajouter 8.0L du tampon RT 5X à chacun des tubes.
12. Ajouter 2.0L de DTT à 100mM pour obtenir une concentration finale de 5mM à chacun des
tubes.
13. Ajouter 1.0 L de la transcriptase inverse de MMLV à 200U/L pour obtenir une concentration
finale de 5U/L à chacun des tubes.
14. Incuber à 42oC pour 60 minutes.
15. Inactiver la transcriptase inverse en incubant le mélange réactionnel à 70oC pour 15 minutes.
Réactions de PCR :
1. Après les réactions de transcriptase inverse, préparer les réactions de PCR suivantes dans 5 tubes
étiquetés de façon appropriés :
PCR de l’ARN traité avec l’ADNase et la RT
PCR de l’ARN traité avec l’ADNase, mais non traité avec la RT
PCR de l’ARN non traité avec soit l’ADNase et la RT
Réaction de PCR sans ARN (Pas de matrice)
Amorces :
ACTIN (FOR) CGATATGGAAAAGATCTGGC
ACTIN (REV) AGAACCACCAATCCAGACGG
Échantillon Conc. mère. Conc. finale
Eau l pour un volume final de 49L
Tampon de la polymérase Taq 10 X 1X
Amorce Actine (For) 2M 0.2M
Amorce Actine (Rev) 2M 0.2M
MgCl2 50mM 2.0mM
dNTP 2mM 200M
Polymérase Taq 5unités/µL 2.5U/réaction
2. Ajouter 1L de chacune des matrices appropriés ou de l’eau à chacun des mélanges de PCR
appropriés. Une fois vos mélanges réactionnels complétés, entreposés les dans le bac à glace à
l’avant pour faire le PCR.
3. Vos réactions de PCR vous seront retournées la semaine prochaine.
Biologie Moléculaire-2014
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Vos PCR seront effectuées sous les conditions suivantes:
i. 1 cycle: 5 min, 94oC pour dénaturer;
ii. 30 cycles: 30 sec, 94oC pour dénaturer; 30 sec, 58
oC l’appariement; 30 sec, 72
oC pour élongation.
iii. 1 cycle: 5 min, 72oC.
iv. Refroidir à 4oC.
Biologie Moléculaire-2014
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Exercice 8
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1 Hybridations Northern
Analyse des réactions de RT-PCR
Biologie Moléculaire-2014
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Projet IV
Contrôle transcriptionnel de Mel1
HYBRIDATION NORTHERN
Dans les dernières semaines, vous avez généré un Northern. Cette semaine vous allez préparer les
membranes pour l’hybridation avec une sonde étiquetée avec Dig.
Informations générales sur l’hybridation d’acides nucléiques:
Avant de faire l’hybridation de la sonde à la membrane, une étape de pré hybridation est faite. Cette
étape est nécessaire afin de réduire le bruit de fond et l’hybridation non spécifique. Le bruit de
fond se définit comme la liaison non spécifique de la sonde à la membrane et elle n’implique pas
d’hybridation. L’hybridation non spécifique représente l’hybridation de la sonde à des séquences
qui possèdent un faible pourcentage d’identité. Afin de réduire ces deux évènements, les membranes
sont initialement assujetties à un réactif de blocage qui inclut habituellement une concentration
élevée d’ADN non spécifique, tel que de l’ADN de sperme de saumon. Le but de ce réactif est de
saturer tous les sites de liaisons sur la membrane ainsi que les sites d’hybridations non spécifiques sur
les acides nucléiques.
Suite à l’étape de pré hybridation, les membranes sont assujetties à la sonde étiquetée en présence du
réactif de blocage. Dépendant des conditions de stringence, la sonde va facilement faire compétition
avec des liaisons non spécifiques et donc s’hybrider de façon spécifique aux séquences
complémentaires.
L’excédant de sondes, qui sont non hybridées ou qui sont faiblement hybridée à des séquences avec
une complémentarité faible, sera enlevée par une série de lavages de stringences variées. Notez que la
stringence est déterminée par la température et la concentration de sels. Ces deux paramètres
déterminent le niveau d’homologie qui est requis pour permettre l’hybridation. Une stringence plus
faible représente des conditions d’hybridation qui sont plus permissives et permet donc l’hybridation
avec des séquences dont le niveau de complémentarité est plus faible. De façon inverse, une
stringence élevée est moins permissive et exige donc un niveau de complémentarité élevé afin de
permettre la formation d’hybrides stables.
Biologie Moléculaire-2014
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Préhybridation (Groupes de 4)
Sur chaque table, vous devriez avoir des membranes duplicatats de Northern.
Solution de Préhybridation/Hybridation :
5X SSC (20X SSC: 3M NaCl et 0.3M NaCitrate)
0.02% sodium dodecyl sulfate (SDS)
20mM sodium maléate, pH 7.5
4M Urée
100μg/mL ADN de sperme de saumon
1. Placer votre membrane Northerns dans un tube Falcon de 50mL étiquetés clairement avec votre
numéro de groupe. Ajoutez 10mL du mélange de préhybridation et fermez en serrant fortement.
2. Introduire vos tubes dans les bouteilles de verres du four d’hybridation. Assurez-vous de ne pas
égratigner les parois intérieures des bouteilles de verre.
3. Positionnez le tube en verre dans le four à hybridation. Assurez-vous que les tubes sont
balancés en plaçant un deuxième tube en verre dans la position opposée de la roue.
4. Faites tourner lentement (position no3) à 42
oC pour un minimum de 1 heure.
Hybridations
À présent, vous êtes prêts pour l’hybridation avec la sonde Mel1. Mais avant de pouvoir faire
l’hybridation, l’ADN marqué doit être dénaturé.
1. Faites bouillir la sonde pour 3 min et refroidissez là rapidement sur glace. Centrifugez brièvement
afin que l’échantillon s’accumule au fond du tube.
PRÉPARATION DE VOS HYBRIDATIONS (GROUPE DE 4)
2. Déverser la solution de préhybridation des tubes contenants votre Northern.
3. Ajouter immédiatement 10mL de solution fraîche d’hybridation à chacun des tubes.
4. Ensuite, ajouter soigneusement 50µL de la sonde Mel1 ou d’actine (tel qu’assigné) dénaturée
directement au liquide d’hybridation de la membrane du Northern. Évitez tout contact direct
entre la sonde concentrée et la membrane. Fermez les tubes fermement et installez-les dans le
four à hybridation tel qu’auparavant.
5. Faire l’hybridation de vos Northerns à 42oC toute la nuit.
APRÈS L’HYBRIDATION LES MEMBRANES SERONT LAVÉES PAR LES A.E. PUIS
ENTREPOSÉES POUR UNE UTILISATION ULTERIEUR
Biologie Moléculaire-2014
68
RT-PCR
Analyse de vos réactions de RT-PCR: (Groupe de 2)
1. Couler un gel d’agarose de 1.5%.
2. Obtenir vos réactions de RT-PCR du congélateur.
3. Ajouter la quantité appropriée du tampon de chargement d’ADN à 10 µL d’échantillon de
chacune de vos réactions.
4. Charger et migrer à 80V.
5. Après la migration, visualiser sous les UV et prendre une photo.:
Biologie Moléculaire-2014
69
EXERCICE 9
Qu'est-ce qu’on fait aujourd’hui !
Projet I : Mutagénèse dirigé du gène LacZ
Essais de bêta galactosidase
Projet IV: Contrôle transcriptionnel de Mel1 Immunodétection des membranes Northern
Projet V: Contrôle posttranscriptionnel de l’alpha-galactosidase
Biologie Moléculaire-2014
70
Projet IV
Contrôle transcriptionnel de Mel1
Les hybridations des Northerns étant faites, vous allez maintenant suivre une procédure pour la
détection des hybrides. Notez que les membranes ont été lavées pour vous afin de retirer la sonde
libre ainsi que celle qui s’est faiblement hybridée.
DÉTECTION IMMUNOLOGIQUE DES MEMBRANES D’HYBRIDATION :
Tous les traitements se font à la température de la pièce.
1. Placer toutes les membranes dans un petit sac de plastique.
2. Ajouter 15mL de tampon d’acide maléique 1X. Incuber 15 min avec agitation. Jeter la solution.
3. Ajouter 20mL de solution de blocage. Incuber 30 min avec agitation. Jeter la solution.
4. Ajouter 10mL de solution d’anticorps. Incuber 30 min avec agitation. Jetez la solution.
5. Transférer les membranes dans le contenant de Tupperware. NE LAISSEZ PAS LES
MEMBRANES SÉCHER! Ajouter 50mL de tampon de lavage. Incuber 15 min avec agitation.
Jeter la solution et répéter l’étape 5 une fois de plus.
6. Ajouter 50mL de tampon d’acide maléique. Incuber 15 min avec agitation. Jeter la solution.
7. Ajouter 10mL de tampon de détection. Incuber 5 min avec agitation. Jeter la solution.
8. Les prochaines étapes doivent être faites rapidement et de façons coordonnés. Aviser votre aide
enseignant ou le technicien avant de procéder. Mettre 2.5mL de la solution CDP-Star dans un
coin du contenant et faire glisser la solution sur la membrane pour la recouvrir. NE METTEZ
PAS la solution directement sur la membrane. Incuber 5 minutes à l’obscurité dans votre tiroir.
9. Placer la membrane avec le côté contenant l’ARN vers le haut sur un papier Whatman.
10. Placer 2 membranes avec le côté contenant l’ARN vers le haut dans l’appareil photo. Prendre une
photo de la réaction de chimioluminescence (exposition de 2 à 10 minutes).
Biologie Moléculaire-2014
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Projet I
Mutagénèse dirigé du gène LacZ
Essais de bêta-galactosidase
Essai : (Groupes de 4)
Groupes impairs
Faire l’essai avec une dilution de 1/5 des cultures bactériennes pUC; GAT; TAT; GTT; GAA ainsi
que e le témoin avec le milieu de culture non-inoculé
Groupes pairs
Faire l’essai avec une dilution de 1/10 des cultures bactériennes, pUC; GAT; TAT; GTT; et GAA.
Méthode :
1. Préparer une dilution dans un volume final de 200μL de chaque culture bactérienne dans des
microtubes pré-étiquetés.Garder sur glace.
2. Pour chaque échantillon de votre essai transférer 80μL de la solution de perméabilization dans un
tube de microcentrifuge étiqueté de façon approprié.
3. Ajouter 20μL de la dilution des cultures bactériennes. Garder sur glace.
4. Quand tous vos échantillons d’essais seront prêts, incuber vos échantillons et votre solution de
substrat à 30oC pour 20 minutes.
5. Ajouter 600μL de la solution de substrat pré-chauffé à chacun de vos échantillons d’essais.
NOTER LE TEMPS. Incuber à 30oC pour 30 minutes.
6. Arrêter les réactions en ajoutant 700μL de solution d’arrêt à tous les tubes. NOTER LE TEMPS.
7. Centrifuger à vitesse maximale pour 10 minutes tous les réactions d’essais.
8. Transférer 200μL de chacun des essais enzymatiques aux puits d'une plaque de 96 puits tel
qu'illustré sur la prochaine page.
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
B blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
C blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
D blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
E blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
F blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
G blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
H blanc pUC GAT TAT GTT GAA pUC GAT TAT GTT GAA
Tampon de perméabilization Solution de substrat
100mM dibasic sodium phosphate 60mM dibasic sodium phosphate
20mM KCl 40mM sodium dihydrogen phosphate
2mM MgSO4 1mg/mL ONPG
0.8mg/mL CTAB 2.7μL/mL β-mercaptoethanol
0.4mg/mL sodium deoxycholate
5.4μL/mL β-mercaptoethanol
Solution d’arrêt
1M carbonate de sodium (Na2CO3)
Calcul des unités de bêta galactosidase:
Β-galactosidase (Miller) unités = 1000 x FD x OD420 / [OD600 x (Vol. rxn ) x t]
où
FD = facteur de dilution
OD420 = absorbance OD420 de l’échantillon d’essai
OD600 = absorbance OD600 de la culture bactérienne
Vol. rxn = volume d’échantillon d’essai (0.020mL)
t = temps d’incubation (minutes) de la réaction (30 minutes)
Biologie Moléculaire-2014
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Projet V
Contrôle traductionnel de l’alpha-galactosidase L'expression d'un gène peut être contrôlée à plusieurs niveaux incluant transcriptionnel et
traductionnel. En effet, le fait qu'un gène arrête d'être transcrit ne résulte pas nécessairement dans une
diminution concomitante du produit protéique. Il est donc nécessaire d'examiner le produit protéique
même afin d'obtenir une compréhension globale du profil d'expression d'un gène et de son produit.
Dans l'exercice suivant vous ferrez des essais de l'alpha galactosidase sur des cellules qui ont crues
sous les mêmes conditions sous lesquelles vous avez examiné l'expression du transcrit.
Cet essai consiste à examiner la conversion d'un substrat incolore le p-nitrophenyl α-d-
Galactopyranoside (PNP-α-Gal) à un produit de couleur jaune le p-nitrophenol (voir la réaction ci-
dessous).
PNP-α-Gal + H2O → α-galactosidase → p-nitrophenol + D-galactose (λmax = 410 nm)
Notez, étant donné que la levure exporte l'alpha galactosidase à l'extérieur de la cellule, ces essais
sont faits sur le milieu dans lequel les cellules ont crues plutôt que sur les cellules elles-mêmes.
Réactifs:
Solution PNP-α-Gal (100 mM p-nitrophenyl α-d-Galactopyranoside dans de l'eau déionizée)
Solution d'arrêt 10X (1 M Na2CO3 dans de l'eau déionizée)
Tampon NaOAc 1X (0.5 M sodium acétate, pH 4.5)
Tampon d'essai
o Préparé du tampon frais avant chaque usage en combinant 2 volumes de tampon NaOAc
1X avec 1 volume de la solution PNP-α-Gal Solution [2:1 (v/v) rapport]. Bien mélanger.
Essai: (Groupes de 2)
Chaque groupe fera l'essai sur l'une des conditions de croissances suivantes tel qu'assigné:
Culture de levure après un transfert de 0h au galactose.
Culture de levure après un transfert de 2h au galactose.
Culture de levure après un transfert de 4h au galactose.
Culture de levure après un transfert de 6h au galactose.
Culture de levure après un transfert de 0h au glucose + galactose.
Culture de levure après un transfert de 2h au glucose + galactose.
Culture de levure après un transfert de 4h au glucose + galactose.
Culture de levure après un transfert de 6h au glucose + galactose.
Biologie Moléculaire-2014
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Méthode :
1. Obtenir 1mL de la culture assigné et gardé sur glace.
2. Transférer 500µL à un nouveau tube de microcentrifuge.
3. Centrifuger à vitesse maximale l'échantillon de 500µL.
4. Transférez-le surnageant à un nouveau tube (NE PAS JETER).
5. Préparer des dilutions de 1/2, 1/4, et 1/10 dans un volume final de 500µL de tampon 1X
NaOAc du surnageant récolté. Garder tous les échantillons sur glace incluant l'échantillon
non dilué.
6. Étiqueter quatre séries de trois tubes de microcentrifuge tel qu'illustré:
7. Transférer 16µL du surnageant du milieu de culture approprié à chacun des trois tubes de
microcentrifuge de la série appropriée.
8. Ajouter 48μL du tampon d'essai a chaque tube de microcentrifuge.
9. Étiqueter un tube "blanc". Ajouter 16 µL de milieu frais non inoculé + 48 μL du tampon
d'essai à ce tube.
10. Incuber à 30°C pour 60 min.
11. Terminer les réactions en ajoutant 136μL de la solution d'arrêt 10X à tous les tubes.
12. Transférer 150μL de chacun des essais enzymatiques aux puits d'une plaque de 96 puits tel
qu'illustré ci-dessous.
Par table ou groupe de 8:
13. Enregistrer les absorbances à 410nm.
Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 1
Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 2
Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 3
Nd. Nd. Nd. 1/2 1/2 1/2 1/4 1/4 1/4 1/10 1/10 1/10 Groupe 4
Blanc Blanc Blanc Blanc
Surnageant de culture: Non dilué 1/2 1/4 1/10
Biologie Moléculaire-2014
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Calcul des unités de α-galactosidase:
Une unité est de α-galactosidase est défini comme la quantité d'enzyme qui fait l'hydrolyse de 1
μmole p-nitrophenyl-α-d-galactoside à p-nitrophenol et d-galactose en 1 min à 30°C dans du tampon
acétate, pH 4.5.
α-galactosidase [milliunités/(mL x cell.)] = (OD410 x Vf x 1 000/[(ε x b) x t x Vi x OD600]) x FD
t = Temps d'incubation (en min.)
Vf= Volume final de l'essai (200 μL)
Vi= Volume du milieu de culture ajouté (16 μL)
ε x b = 10.5 (mL/μmol)
FD = facteur de dilution
Biologie Moléculaire-2014
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Annexes
Biologie Moléculaire-2014
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Acide aminé Code de 3 lettres Code d'une lettre
alanine ala A
arginine arg R
asparagine asn N
acide aspartique asp D
asparagine or acide aspartique asx B
cystéine cys C
acide glutamique glu E
glutamine gln Q
glutamine or acide glutamique glx Z
glycine gly G
histidine his H
isoleucine ile I
leucine leu L
lysine lys K
méthionine met M
phénylalanine phe F
proline pro P
serine ser S
thréonine thr T
tryptophane try W
tyrosine tyr Y
valine val V
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Conversions Spectrophotométrique
1 unité A 260 d'ADN double brin = 50 µg/ml
1 unité A 260 d'ADN simple brin = 33 µg/ml
1 unité A 260 d'ARN simple brin= 40 µg/ml
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