biochimie clinica
Post on 22-Dec-2015
267 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Lucian Bagu 2013
1 | P a g i n a
Enzimele. Generalitati
-catalizator
-Ea – AE;
-glicoproteina
Au rolul de a creste viteza de desfasurare a unui proces chimic termodinabil posibil prin
diminuarea energiei de activare. Prin diminuarea energiei de activare, moleculele compusilor aflati in
interactie vor poseda acel minim de energie necesar transformarii in produsi de reactie. Enzimele fiind
catalizori (cataliztori) se adauga (sunt necesari) in cantitati foarte mici, iar la sfarsitul transformarii se
pastreaza calitativ si cantitativ.
Reactantul asupra caruia reactioneaza enzimele se numeste substrat, iar interactia dintre
enzima si substrat necesita prezenta unei zone distincte constituita din cateva resturi de aminoacizi
numita centru activ (situs). Acest centru activ este constituit din cateva resturi de aminoacizi aflati in
pozitii neadiacente, si din aceasta cauza orice modificare de natura conformationala la nivelul protein-
enzimei poate sa induca modificarea pozitiilor relative ale acestor resturi de aminoacizi materializata
prin scaderea activitatii enzimatice.
Modificarile conformationale dar si modificarile configurationale pot fi determinate in genere de
conditiile de mediu in care actioneaza enzimele. Prin intermediul acestor conditii de mediu in acest mod
pot fi controlate reactiile enzimatice fie prin variatia unor parametri fizice sau fizico-chimici, fie prin
modificarea concentratiilor unor compusi chimici. In genere cinetica enzimatica poate fi explicata pe
baza ecuatiei Mihaelis Menten, a carei reprezentare este sub forma unei hiperbole echilatere.
Conform acestei teorii pentru orice sistem enzimatic dat, exista o valoare a vitezei Vmax atinsa
pentru o valoare bine determinata a concentratiei substratului. La aceasta valoare intreaga cantitate de
enzima este antrenata sub forma unui complex ES si astfel orice cantatitate de substrat s-ar adauga in
sistem viteza nu se modifica.
Pentru fiecare sistem ES, se poate defini constanta Mihaelis Menten (Kn) ca fiind concentratia
substratului la care viteza de desfasurare a procesului catalitic este Vmax/2.
Constanta mihaelis menten reprezinta afinitatea enzimei in raport cu substratul si aceasta
afinitate este cu atat mai mare cu cat valoarea Kn este mai mica. Ecuatia MM a fost elaborata pentru
situatiile in care enzima este o glicoproteina constituita dintr-o singura macromolecula. Atunci cand un
sistem enzimatic este constituit pe baza reunirii mai multor macromolecule glicoproteice (de regula nr
par) sistemul adopta o structura cuaternara, iar enzimele sunt de tip alosteric.
Pentru constituirea sistemului enzimatic cuaternar, macromoleculele trebuie sa actioneze prin
intermediul fortelor necovalente numai sub aceasta forma sistemul poate actiona ca un biocatalizator,
elementele componente nefiind capabile singure sa activeze procesul de transformare a reactantilor in
produsi de reactie.
Toate enzimele cu structura cuaternara poseda alaturi de centrul activ, cel putin un alt centru
numit centru alosteric, localizat in alta zona decat centrul activ, la nivelul caruia actioneaza efectorii
alosterici, care in urma interactiei induc modificari conformationale la nivelul sistemului enzimatic
Lucian Bagu 2013
2 | P a g i n a
materializate prin cresterea sau scaderea accesului substratului la nivelul centrului activ. Prin
intermediul acestor modulari structurale se realizeaza la nivelul protein enzimelor un proces de reglare a
activitatii prin intermediul efectorilor care pot fi activatori si respectiv inhibitori.
Efectorii alosterici pot fi de natura anorganica sau organica, de regula de dimensiuni relativ mici,
cei de natura organica se numesc coenzime si de regula pentru mamifere acesti efectori provin din
mediu. Complexul constituit dintre protein-enzima si cofactor (ef alosteric) se numeste holoenzima, care
este activa, comparativ cu apoenzima in care lipseste cofactorul si este practic inactiva.
Dependent de natura mediului unde actioneaza sistemele enzimatice se pot produce modificari
substantiale structurale la nivelul macromoleculelor de natura proteica, modificari care pot induce
denaturarea, care la randul ei poate sa fie ireversibila sau reversibila. Factorii care actioneaza ca agenti
denaturanti, sunt agenti caotropici (temperatura, presiune, concentratie salina, compusi organici,
detergenti).
De regula enzimele se biosintetizeaza la nivelul unor celule specializate si de la acest nivel, in
urma transportului prin intermediul lichidelor biologice, enzima actioneaza la nivelul altor tesuturi si
biosinteza se realizeaza sub forma unei enzime active (nu mai necesita activare ulterioara). Exista in
organismele mamiferelor insa unele specii enzimatice biosintetizate in forma inactiva care se transporta
ca atare pana la nivelul tesutului de actiune unde prin intermediul compusilor din mediu se activeaza
(zimogeni – factori de coagulare, absorbtie si degradarea substantelor la nivelul sistemului digestiv).
Se cunosc 6 clase de enzime:
1.oxidoreductaze
2.transferaze
3.hidrolaze
4.liaze
5.izomeraze
6.ligaze
Oxidoreductaze - Actioneaze prin schimb electronic si in special prin intermediul coenzimelor
nicotinamidice sau flavinice.
Transferaze – realizeaza transportul unor grupari functionale de pe un substrat pe altul.
Hidrolaze – catalizeaza ruperea legaturilor covalente in prezenta apei.
Liazele – catalizeaza reactii de rupere in absenta apei.
Izomeraze – catalizeaza transformarea unui izomer in altul.
Ligazele – catalizeaza reactiile de biosinteza prin consum de ATP.
In procesele enzimatice coenzimele sunt de regula molecule mici, de natura exogena si ei sunt
implicati direct in mecanismele de desfasurare a procesului catalitic.
Lucian Bagu 2013
3 | P a g i n a
Daca cofactorii sunt de dimensiuni mici, ei in genere sunt termostabili, sunt dializabili (trec prin
ochiurile de retea ale mebranelor) si sunt usor de indepartat de pe complexul enzimatic datorita
interactiilor de natura slaba, care stau la baza constituirii holoenzimei, apoenzima este termolabila si
nedializabila.
Specificul sistemelor cuaternare enzimatice este polimorfismul care permite pentru un numar
limitat de lanturi macromoleculare sa se constituie forme moleculare multiple cu efect catalitic, numite
izoenzime. Aceste specii au caracteristica de a cataliza aceiasi reactie chimica, se biosintetizeaza la
nivelul aceluiasi tesut sau aceluiasi lichid biologic, dar actioneaza la niveluri diferite in organism
dependent de valorile componentelor din mediu.
Fiind constituite (izoenzimele) din macromolecule glicoproteice diferite, prezinta configuratii
diferite dar si proprietati fizico chimice diferite: sarcina electrica – in campuri electrice continui migreaza
diferit si astfel pot fi evidentiate analitic, calitativ si cantitativ prin electroforeza sau alte tehnici in care
campuri electrice continui reprezinta factorul discriminator (electroforeza capilara).
pH-ul de actiune este diferit in cadrul speciilor de izoenzime si astfel unele pot actiona in mediu
slab bazic (fosfataza alcalina), altele pot actiona in mediu slab acid (fosfataza acida) sau puternic acid
(fosfataza prostatica). Datorita structurii diferentiate la nivelul complexului cuaternar, izoenzimele
poseda sensibilitate diferita la inhibitori, stabilitate diferita si antigenitate diferita.
Izoenzimele – de regula se biosintetizeaza la nivelul unor tesuturi sub forma unor lanturi
polipeptidice care posttranslational sufera unele modificari printre care si adaosul resturilor
oligozaharidice, in vederea constituirii macromoleculelor de natura glicoproteica.
Tot post-translational se pot produce modificari la nivelul grupelor functionale libere existente
dea lungul latului polipeptidic astfel ca, chiar daca biosinteza se realizeaza pe baza aminoacizilor
standard, la degradarea hidrolitica a lanturilor polipeptidice rezulta aminoacizi nestandard.
Activitatea enzimatica este dependenta de concentratia substratului, concentratia enzimei,
temperatura mediului, valoarea pH-ului mediului, prezenta sau absenta inhibitorilor. Enzimele alosterice
poseda o dependenta a activitatii enzimatice de tip sigmoidal in raport cu substratul, in care la
concentratii mici de substrat cresterea activitatii enzimatice este nesemnificativa insa, peste o anumita
valoare a concentratiei substratului acesta actioneaza ca activator local determinand o crestere brusca a
activitatii enzimatice.
Concentratia enzimei – influenteaza direct proportional activitatea enzimatica a unui sistem dat,
adica V= k2 * [E], unde K2 este constanta de viteza iar 1/k2 reprezinta ciclul catalitic, adica intervalul de
timp necesar pentru ca enzima sa ia ciclul de cataliza.
Temperatura – avand in vedere faptul ca enzimele sunt de natura glicoproteica, cresterea
valorilor de temperatura determina cresterea agitatiei la nivelull protein-enzimei, care determina o
modificare de tip conformational la valori mici, sau modificari de tip configurational la valori mari si
foarte mari.
Daca la valori mici ale temperaturii cresterea acesteia determina un proces de activare, la valori
mari procesul de activare se stopeaza si procesele de denaturare devin preponderente, si astfel
activitatea enzimatica poate fi diminuata sau deprimata. Valorile mici de temperatura fie de refrigerare
Lucian Bagu 2013
4 | P a g i n a
(8grade) fie de congelare (-30grade), nu afecteaza in timp activitatea enzimatica atunci cand valorile
temperaturii mediului ating valorile normale. Din aceasta cauza la valori de refrigerare sau de congelare
a temperaturilor enzimele (probele biologice care contin enzime) pot fi conservate in timp si pot fi
prelucrate atunci cand laboratorul este disponibil sa execute operatia.
pH-ul – valoarea acestuia influenteaza in mod direct structura proteinezimei prin gradul de
incarcare electric la nivelul gruparilor functionale libere existente dea-lungul lanturilor polipeptidice. In
acest mod unele grupari functionale se pot incarca pozitiv, altele se pot incarca pozitiv, altora le poate
disparea sarcina si astfel interactiile din interiorul macromoleculei (ghemul statistic) se pot modifica si
prin aceasta se poate modifica accesul substratului la nivelul centrului activ enzimatic.
Inhibitorii pot fi produsi finali de reactie sau pot fi si intermediari, si in acest mod se poate
realiza un control continuu al procesului catalitic pe baza feed-backului retroreactiei.
Inhibitia reversibila competitiva si necompetitiva
In cazul inhibitiei competitive viteza maxima de desfasurare a procesului catalitic este aceiasi pentru
sistemul dat, variaza in schimb afinitatea.
In cazul inhibitiei necompetitiva in care afinitatea se mentine constanta variind vitezele maxime de
desfasurare a procesului in prezenta sau absenta inhibitorului.
In inhibitia ireversibila – la nivelul proteinenzimei se constituie legaturi covalente stabile care
nu mai permit modulare protein enzimei in vederea interactiei cu substratul specific. In genere legaturile
care se constituie si sunt de natura covalenta apartin gruparilor functionale ester, amida sau eter.
Daca in cazul inhibitiei reversibile revenirea activitatii enzimatice este posibila prin aducerea
parametrilor mediului de reactie in conditii specifice enzimei, in cazul inhibitiei ireversibile revenirea
activiatii enzimatice nu mai este posibila deoarece taria legaturilor covalente constituite in aceste cazuri
este foarte mare comparativ cu interactiile necovalente realizate in inhibitia reversibila.
Curs 2...
Inhibitorii naturali
Sunt biosintetizati de celula vie, si prezinta caracteristica de a interactiona la nivel plasmatic sau
la nivelul intetrstitiilor unor complexe enzimatice in vederea constituirii complexelor enzima inhibitor in
conditii reversibile sau de cele mai multe ori ireversibile.
Indicatiile sunt de natura covalenta, ceea ce imprima protein-enzimei, o modificare
conformationala profunda, care conduce la inhibarea activitatii enzimatice (interactia dintre centrul
activ enzimatic si substratul specific nu se mai realizeaza). Inhibitorii naturali, prin actiunea lor la nivelul
protein enzimei, prezinta functie reglatoare asupra acestora deoarece dupa interventia lor procesul
catalitic nu se mai realizeaza si nu se mai transforma substratul in produsi de reactie.
Pentru unele specii de inhibitori naturali, lipsa acestora din organismele vii poate fi catastrofica
sau incompatibila cu viata. Cei mai cunoscuti inhibitori naturali sunt serpinele. Proteazele fac parte din
Lucian Bagu 2013
5 | P a g i n a
clasa hidrolazelor, iar serin-proteazele poseda la nivelul centrului activ enzimatic un rest serinic, capabil
sa interactioneze covalent cu inhibitorul.
Prin constituirea unei legaturi covalente la nivelul gruparii hidroxil-serinic din centrul activ
enzimatic, se realizeaza o limitare de actiune a serin enzimelor in timp si in spatiu. Toti inhibitorii
protein-serinelor prezinta migrare electroforetica in zona alpha si sunt de natura polipeptidica. Acestsa
presupune ca in conditii fiziologice inhibitorii serpinici se incarca negativ si se deplaseaza in campul
electric continu usor anodic.
S-a constatat ca in culturile de celule de fibroblaste o parte din inhibitorii serpinici sunt
biosintetizati si astfel pot fi obtinuti si in vitro, nu numai in vivo. Actiunea anti-proteazica a serpinelor se
materializeaza imediat dupa activarea serin-enzimei la nivelul tesuturilor iar acestea devin tinta unui
inhibitor cu care constituie complexul inactiv. Aceste complexe ulterior sunt preluate din circulatie si
suspuse procesului degradativ in vederea recuperarii materialului organic component.
Serin-enzimele care sunt inhibate in prezenta serpinelor fac parte din procese de coagulare
fibrinoliza si aparare imuna nespecifica (complement). Toate aceste enzime (serin enzime) sunt
zimogeni (se biosintetizeaza in forma inactiva si ulterior transportarii la nivelul tesutului de actiune sunt
activate hidrolitic. Activarea acestor zimogeni presupune eliminarea unui peptid mic din zona C
terminala a zimogenului initial.
Prin aceasta eliminare este facilitata patrunderea moleculelor substratului catre centrul activ
enzimatic, care in forma de zimogen nu se poate realiza datorita inpendimentarii din zona C terminala a
lantului polipeptidic.
Complementul este un grup de polipeptide care participa la apararea nespecifica a organismelor
vertebratelor comparativ cu apararea specifica realizata in prezenta imunoglobulinelor. Complexul
complement este constituit din 20 de componente polipeptidice dintre care, 13 participa la cascada de
activare proteolitica, iar celelalte 7 au rolul de a controla procesul de activare proteolitic.
Complementul poate actiona prin mai multe mecanisme:
-fixare proteinelor (polipeptidelor complementului pe membranele celulare invadatoare.
-constituirea unor complexe macromoleculare care conduce la destabilizarea membranara si respectiv
liza membranara.
-stimularea fagocitozei
-participa la dezvoltarea reactiilor inflamatorii, in special cele de natura acuta.
Cai de actiune: - calea clasica dependenta de prezenta imunoglobulinelor (aparare impuna
specifica) si calea alternativa, independenta de prezenta apararii imune specifice.
In calea clasica componentul C1 al complexului complement recunoaste si leaga zonele Fc, ale
imunoglobulinelor E si M, prezente intr-un complex antigen-anticorp fixat pe o membrana celulara. In
urma acestei interactii complexul macromolecular dezvoltat determina destabilizarea membranara si
respectiv liza membranara.
Lucian Bagu 2013
6 | P a g i n a
In calea alternativa nu este nevoie de prezenta complexelor Ag-Ac, iar la nivelul suprafetelor
membranare componentele complementului C5, C6, C7, C8, C9, constituie un complex membranar de
atac in prezenta componentelor C2, C3 si C4.
Prin aceasta activare a zimogenilor complementului in cascada componentul C9 polimerizeaza si
constituie la nivelul dublului strat lipidic un tub care face legatura directa intre exteriorul si interiorul
acesteia, ceea ce determina o modificare brutala a permeabilitatii membranare soldata cu distructia
celulara, si in acest mod celula recunoscuta de componentele C5-C9 ale complementului este scoasa din
circuit.
Coagularea
Participa zimogeni (factori de coagulare) care se activeaza unul pe celalalt atunci cand procesul
de coagulare este declansat producandu-se un proces de amplificare foarte puternic care in final
conduce la transformarea fibrinogenului solubil in plasma in fibrina polimer insolubila care constituie
trombii si respectiv coagulul.
In procesul de coagulare, activarea se realizeaza prin ruperea unor molecule mici tot din zona C-
terminala polipeptidica si fiecare etapa de activare necesita ioni ce Ca, fosfolipid plachetar si respectiv
suprafata plachetara sau alta suprafata.
Daca trombina este penultima serin-enzima din procesul de coagulare care determina
constituirea fibrinei monomer, factorul 13 este ultima serin-enzima din procesul de coagulare care are
capacitatea de a transforma fibrina monomer in fibrina polimer printr-un proces de transamidare. La
procesul de transamidare participa doar lanturile gama din fibrinogenul initial si reticularea presupune
constituirea unor legaturi covalente de tip amidic intre resturile de lisina dintr-un lant gama, cu resturi
de acid glutamic din alt lant gama.
Fibrinoliza
Odata ce s-a declansat procesul de coagulare, la nivelul circulator pot sa apara trombi
suspendati care datorita dimensiunilor mai mari decat diametrele capilarelor le pot infunda si in acest
mod circulatia sanguina prin aceste capilare este intrerupta. Pentru eliminarea acestui inconvenient,
trebuie sa se realizeze la nivelul organismului si fibrinoliza in urma careia fibrina polimer insolubila care
constituie trombii sa fie transformata in fibrina monomer sau fibrina degradata solubila.
Procesul de fibrinoliza se realizeaza in prezenta plasminei care este o serin-enzima rezultata din
zimogenul plasminogen, in urma activarii acestuia cu urochinaza.
Probabilitatea interactiei proteaza-inhibitor, imediat dupa activarea proteazei este mare, ceea
ce permite o actiune limitata (scurta) a acestor proteaze. Astfel incat procesul de intarziere sa nu induca
cresterea riscului pentru organism prin care enzimele sa ramana activate in timp.
Inhibitorii plasmatici: - toti fac parte din fractiunile globulinice si reprezinta aproximativ 20%
cantitativ din aceasta fractie (aceste fractii) ceea ce reprezinta 8-10% din totalul proteinelor circulante.
La nivelul plasmei inhibitia realizata de inhibitorii plasmatici este de tip ireversibil si consta in
constituirea unor legaturi covalente la nivelul centrului activ enzimatic, prin aceasta pe de o parte este
limitata actiunea serin-enzimei circulante, si pe de alta parte aceasta este eliminata din circulatie prin
degradare.
Lucian Bagu 2013
7 | P a g i n a
Cei mai cunoscuti inhibitori plasmatici sunt: - alfa 1 antitripsina, antitrombina, alfa 2-
macroglobulina si inhibitorul complementului C1.
Alfa 1 antitripsina - este un polipeptid cu masa moleculara apropiata de cea a albuminelor
aproximativ 53 KD, are puncul izoelectric 4, ceea ce seminifica faptul ca in conditii fiziologice se incarca
negativ si migreaza usor anodic. Alfa 1 at este o molecula de faza acuta. Principala caracteristica a alfa 1
at este interactia cu elastaza care este serin enzima care poseda ca substrat specific elastina
(componenta a tesuturilor a caror volum este variabil in timp, pulmon, inima etc.).
Variatii pozitive ale alfa 1 at conduc la dezvoltarea unor reactii de faza acuta, la inflamatii si pot
sa apara in sarcina dar si dupa utilizarea anti-conceptionalelor, in deficienta de alfa 1 at, se instaleaza
astmul si in special enfizemul pulmonar si la nivelul organismelor nou-nascutilor prematuri de regula
apare deficienta de alfa-1 antitripsina ceea ce determina pe langa emfizem si dezvoltarea unor hepatite
infantile.
Alfa 2 macroglobulina – este un complex macromolecular cu masa moleculara 725KD,
constituita din 2 componente polipeptidice (poseda structura cuaternara). Punctul izoelectric 5,4. Este
prezenta pe langa forma solubila plasmatica si la nivelul suprafetelor membranelor limfocitare si de
asemenea LCR.
Actiune este inhibitor in raport cu trombina, kalicreina, transportor al zincului, si mai are functia
de imunoreglare prin depresie si supresia imunoglobulinica. Deficitul partial se intalneste in pancreatita
acuta si in septicemii, nivel crescut gasim in diabet zaharat, sindrom nefrotic (pierdere proteica glomerul
/ sinteza accelerata proteine – pierderea urinara nesemnificativa), sarcina, anticonceptionale si la copii
(2-4 ani).
Inhibitorul C1 – este o glicoproteina care determina disocierea elementul C1 al complementului
si prin aceasta este mentinut in echilibru sistemul de aparare nespecific pe cale directa. In deficienta de
inhibitor C1 creste foarte puternic incidenta la dezvoltarea bolilor auto-imune, deoarece o diminuare a
concentratiei acestei specii determina un timp de viata mai mare al componentei C1 a complementului
care determina la randul sau o recunoastere a mai multor complexe antigen-anticorp (Ig G sau IgM) care
in urma legarii la nivelul unor membrane determina liza membranara.
Daca apar greseli de recunoastere a celulelor proprii, si este mentinuta concentratia C1 ridicata
se intensifica distructia celulelor proprii.
Beta-lactane
Sunt – compusi organici de dimensiuni mici biosintetizati in organismele unor ciuperci, iar la
nivelul vertebratelor prezinta actiune antibiotica, si astfel fac parte din clasa pelicilinelor si
cefalosporinelor. Beta-lactanele prezinta o structura tiazolidinica, ele continand in structura 2 cicluri
dintre care unul constituit din 4 atomi si cel de al 2-lea din 5 atomi.
Rolul beta-lactanelor este de a inhiba serin-enzimele de reticulare implicate in constituirea
peretelui bacterian. Prin aceasta inhibitie se realizeaza o fragilizare la nivelul peretelui bacterian care se
materializeaza prin diminuarea rezistentei celulei in raport cu mediul.
Ciclul tiazolidinic de 5 atomi este usor tensionat si prezinta o usoara planaritate, acesta este
condensat cu un alt ciclu de 4 atomi care este puternic tensionat si mentinut in forma planara instabila
Lucian Bagu 2013
8 | P a g i n a
datorita condensarii cu celalalt nucleu. Din aceasta cauza legatura amidica interna (lactama) se
tensioneaza foarte puternic si in conditii de reactie se va rupe, ceea ce va conduce la interactia cu o
molecula din mediu, in vederea stabilizarii termodinamice.
Moleculele asupra caror actioneaza beta-lactanele in vederea stabilizarii lor sunt: serin-
enzimele de reticulare ale peretelui membranar (bacterian) sau beta-lactamazele. Indiferent de natura
serin-enzimei se constituie intre beta-lactama si restul serinic o legatura covalenta care induce
dezactivarea enzimei legate, si in acest mod fie nu se mai dezvolta procesl de reticulare la nivelul
peretelui membranar, fie efectul antibiotic este diminuat sau anulat (beta-lactamaza).
Beta-lactamazele sunt specii enzimatice de natura-serinica care sunt biosintetizate fie pe baza
plasmidelor sau cromozomilor bacterieni. Acestea au rolul de a diminua sau suprima efectul antibiotic al
betalactamelor prin acelasi mecanism prezent in cazul enzimelor de reticulare. Ele sunt de mai multe
tipuri A, B, C, D.
Atunci cand intervine inhibitorul de tip beta-lactama fie asupra enzimei de reticulare fie asupra
beta-lactamazelor se constituie un complex de tip ester care poate suferi la nivelul tesutului sau
lichidului biologic un proces hidrolitic. Daca procesul hidrolitic este mai rapid decat procesul de acilare
(esterificare) compusul se comporta ca beta-lactamaza si este suprimat procesul antibiotic.
Invers daca procesul hidrolitic este lent complexul constituit de tip ester este stabil in raport cu
mediul, enzima ramane inhibata si astfel se declanseaza procesul antibiotic.
Afinitate si specificitate
In genere specificitatea sau selectivitatea este o caracteristica a unui sistem dat de a distinge si
diferentia compusi cu proprietati diferite pe baza unor interactii de natura necovalenta. Afinitatea spre
deosebire de specificitate este o caracteristica cuantificabila si se refera la concentratia sau cantatitea
unui analit de a interactiona cu un alt analit intr-un echilibru dinamic.
Prin aceasta afinitatea poate fi definita de contanta de echilibru a sistemului dat. Intre o
molecula si o alta molecula se desfasoara interactii de natura specifica prin intermediul unor situsuri
prezenta pe ambele entitati. Intotdeauna in raport cu o molecula de dimensiuni mari (macromolecula)
molecula legata sau partenera se numeste ligand.
Daca intre molecula si ligand exista un nr bine determinat de situsuri de interactie, acest numar
de situsuri nu va fi ocupat niciodata total, din aceste considerente in urma interactiei dintre molecula si
ligand se defineste constanta de disociere Ks***, atunci cand un numar r de situsuri este ocupat de
ligand din numarul total de situsuri “n”. Se defineste o formula Mihaelis Menten in urma reactiei dintre
formatiune si ligand r=n(L) / (Ks +[L])
Liniarizarea ecuatiei este de forma r/[L] = n/Ks – r/Ks care in reprezentare arata – vezi slide.
Atunci cand se intalnesc macromolecule care adopta structuri cuaternare si de natura proteica
intotdeauna numarul total de situsuri de legare este mai mare decat 1. Ceea ce poate fi utilizat in
aplicatiile clinice pentru amplificarea unui semnal prin intermediul numarului de situsuri ocupate.
Lucian Bagu 2013
9 | P a g i n a
Legarea proteinenzimei de un ligand
Deoarece enzimele cu importanta clinica in majoritatea cazurilor poseda structura cuaternara
(enzime alosterice) acestea poseda la nivelul macromoleculelor un numar apreciabil de situsuri de legare
posibil ocupabile de un ligand. Atunci cand o proteina, sau proteinenzima se leaga de o alta
macromolecula se realizeaza un proces de conjugare si atunci cand si molecula ligand poseda
reactivitate specifica este foarte important ca in urma interactiei dintre cele 2 entitati sa se pastreze pe
cat posibil functiile acestora.
Pentru realizarea acestui deziderat procesul de conjugare trebuie sa se realizeze in conditii
blande in asa fel incat modificarile conformationale sau configurationale de la nivelul fiecarei specii
moleculare sa fie minime. O macromolecula a unei proteine cu o functie oarecare se poate lega si de
suporturi solide, si in acest caz procesele de legare trebuie sa prezinte blandete in raport cu
proteinenzima functionala din aceleasi considerente.
Atat in cazul legarii de o alta macromolecula a proteinenzimei cat si in cazul legarii de un suport
la nivelul proteinenzimei se obtine activitate enzimatica reziduala si daca in cazul interactiei cu o alta
macromolecula a protein enzimei reactiile se pot desfasura atat in sistem omogen cat si in sistem
heterogen atunci cand legarea se realizeaza pe un suport procesul se desfasoara doar heterogen.
In urma legarii proteinenzimei de suporturi solide se modifica stabilitatea in raport cu mediul a
acesteia, selectivitatea datorita modificarilor conformationale, valoarea constantei Mihaelis Menten
(Km), care de regula creste scazand afinitatea pentru substrat si uneori se modifica pH-ul de actiune
optim.
Cele mai cunoscute interactii protein-enzima ligand se intalnesc in evidentierile imunochimice in
care specia enzimatica este conjugata la nivelul imunoglobulinei cu formarea unui imuno-conjugat, cu
aplicabilitate in sisteme heterogene. Asemanator cu sistemele imunochimice care utilizeaza conjugate
imunochimice se pot extinde observatiile si la alte sisteme aflate in sistem molecula ligand. Pentru
sistemele imunochimice de evidentiere se cunosc 2 mari posibilitati, evidentierea antigenului si
evidentierea anticorpului, prin metode directe, indirecte, sandwich sau competitie.
Daca in tehnicile directe de evidentiere analitica ale antigenului se utilizeaza direct conjugatul
imunoenzimatic in tehnicile indirecte se utilizeaza intotdeauna alaturi de un anticorp primar
biosintetizat pe o specie un al 2 –lea anticorp, secundar, biosintetizat pe alta specie. In tehnica sandwich
se utilizeaza ca si in tehnica directa o singura specie de anticorp cu deosebirea ca un anticorp se
utilizeaza ca atare iar celalalt se gaseste sub forma de imunoconjugat.
Tehnica prin competitie cu aplicabilitate larga in clinica, necesita prezenta anticorpilor din proba
de analizat care sa competitioneze cu acelasi tip de anticorp din conjugatul imun. In acest caz exista o
inversa proportionalitate intre cantitatea de anticorp din proba de analizat si semnalul analitic rezultat,
deoarece in urma competitiei o mica cantitate de conjugat imun poate interactiona cu antigenul de
captusire, cea mai mare cantitate a acestuia reactionand cu anticorpii din proba de analizat.
Lucian Bagu 2013
10 | P a g i n a
Consecintele imobilizarii enzimelor
Imobilizarea enzimelor creste stabilitatea enzimei in raport cu mediu chiar daca scade
activitatea enzimatica. Mecanic enzima este fixata pe suport si este mai greu de degradat de factorii de
mediu, sufera mai greu procesele de autooxidare, iar denaturarea si digestia sunt reduse.
Enzima fixata pe un suport poate fi usor recuperata din amestecul substrat produs de reactie, iar
cataliza poate fi efectuata practic la infinit, reluare procesului catalitic fiind deosebit de facil. Prin fixarea
enzimei pe un suport productivitatea in ceea ce priveste transformarea substratului in produsi de reactie
este marita si astfel aceste sisteme pot fi utilizate fie in organismele vii pentru obtinerea unui produs dat
pe baza substratului existent in sistem sau in procesele de amplificare clinice in urma carora produsii de
reactie prin cantitatile lor mari rezultate, pot fi relativ usor evidentiati analitic.
Prin posibilitatea fixarii unei protein-enzime de un suport aceasta poate fi utilizata in construirea
unor biosenzori cu aplicabilitate in evidentieri clinice. Aceasta linie in ultima perioada enzimele sunt
mult utilizate in construirea biosenzorilor specifici unor substraturi.
Imobilizarea enzimelor
Interactiile dintre enzima si suporturi pot fi atat slabe (forte van der walls, de hidrogen) sau
puternice (ionice, covalente). Una din cele mai utilizate tehnici de imobilizare este Adsorbtia enzimei pe
o suprafata care trebuie sa fie insolubila in mediu in asa fel incat fie sa transporte enzima fie sa o
mentina intr-un anumit spatiu. Procesele de adsorbtie implica forte de natura slaba si foarte slaba si din
aceasta cauza activitatea enzimatica remanenta este foarte mare comparativ cu toate celelalte
modalitati de legare.
Pentru ca sunt implicate forte slabe in procesele de legare, procesele de desorbtie sunt usor de
realizat fie printr-un efect al substratului, fie prin variatia unor parametri ai mediului (temperatura sau
pH). Operatia de imobilizarea a enzimelor pe suprafete prin intermediul adsorbtiei se numeste
“captusire” sau printre compusii care pot fi utilizati ca suporturi sunt:
-carbune activ (absorb CO2)
-alumina
-pamanturi diatomitice
-celuloza
-rasini sintetice
-sticla cu pori controlati.
Legarea covalenta la suprafete prin intermediul compusilor organice, procesul se numeste
grefare chimica si procesul de legare consta in interactia dintre diferite grupari functionale prezente
simultan pe macromolecula proteinenzimei si respectiv pe suprafata utilizata ca ligand. Si in acest caz se
obtin avantaje in raport cu procesul enzimatic in sensul de crestere a stabilitatii mecanice si termice in
raport cu mediul, cresterea productivitatii.
Lucian Bagu 2013
11 | P a g i n a
Legarea covalenta a proteinenzimei permite realizarea automatizarilor si aplicarea acestora fie
in vivo, fie in vitro in special pentru obtinrea unor biosenzori. Spre deosebire de legarea prin adsorbtie,
prin legarea covalenta activitatea enzimatica remanenta poate scadea substantial dependent de modul
de interactie si reactantii utilizati in fixare. De multe ori activitatea enzimatica remanenta poate atinge
cateva procente din activitatea enzimatica totala si chiar si in aceste conditii procedeul este utilizat
datorita robustetii acestuia.
Se utilizeaza ca suporturi solide: - agaroza, sepharose, Paa, PVC, Pmetacril, sticla poroasa, si
nanoparticule.
Imobilizarea enzimelor prin forte ionice
Este aplicabila restrictiv deoarece implicarea unor anioni sau cationi ai proteinenzimei ca situs
de legare determina modificarea substantiala a functiei enzimatice de regula se realizeaza imobilizarea
pe schimbatori de ioni: CM (carboxi-metil)- celulozita – cationit
-DEAE (dietilaminoetil)-celuloza – anionit
-DEAE-sephadex- anionit.
Imobilizarea pe transportori anorganici. Deoarece suprafetele anorganice poseda grupari
functionale in numar limitat la suprafata acestora, este strict necesara derivatizarea acestor suprafete
prin intermediul unor reactanti care asigura: - o grupare functionala capabila sa interactioneze cu
protein enzima si un brat covalent (distanta intre suprafata anorganica si proteinenzima) in asa fel incat
impedimentarile sterice la nivelul macromoleculei enzimatice sa fie minime.
Imobilizarea covalenta E pe polimeri sintetici. Dependent de natura polimerilor sintetici exista la
suprafetele acestora diverse grupari functionale (COOH, OH), acestea pentru a putea fi utilizate in
procesele de legare ale enzimelor necesita ca si in cazul anterior derivatizarea.
Reticularea enzimelor – o macromolecula de proteinenzima care intotdeauna poseda grupari
amino libere dealungul lantului polipeptidic poate fi reticulata cu ea insasi prin intermediul
dialdehidelor. Intre gruparile carbonil aldehidic si gruparile amino se constituie legaturi covalente de tip
baza-Schiff si in acest mod macromoleculele constituie sisteme reticulate in spatiu capabile sa
interactioneze in sistem heterogen cu moleculele substratului.
S-a ales glutar-aldehida ca agent de reticulare deoarece contine 5 atomi de C in molecula si
permite constituirea unor ochiuri de retea in care tensiunile intra macromoleculare sunt minime, in asa
fel incat accesul substatului la nivelul centrului activ enzimatic sa fie liber.
Includerea enzimelor in geluri. De regula prin acest procedeu enzima ocupa pozitii in ochiurile de
retea ale gelurilor fara sa interactioneze fizic sau chimic cu componentele ochiului, din aceasta cauza
activitatea enzimatic remanenta este apropiata de activitatea enzimatica maxima a enzimei.
Procesul de includere a moleculelor de enzima in ochiurile de retea ale gelurilor consta in
constituirea unor amestecuri heterogene dintre un gel si enzima care in urma incalzirii treptate si la
valori mici ale temperaturii determina transformarea gelurilor in lichidul corespunzator si respectiv
includerea macromoleculelor de enzime in retelele de 3d la racirea treptata. (agar, alginat)
Lucian Bagu 2013
12 | P a g i n a
Este posibil ca printr-o tehnica asemanatoare cu cea anterioara sa fie incluse macromoleculele
proteinenzimei in ochiurile de retea ale unui gel in formare (reticulare). Cel mai cunoscut caz este al
poliacrilamidei. Pentru obtinerea acestui sistem este necesar ca in amestecul supus procesului de
polimerizare sa fie inclusa macromolecula enzimei.
Reactoare enzimatice – acestea presupun includerea proteinenzimelor in incinte la nivelul
carora au acces prin difuzie simpla doar substraturile si respectiv produsii de reactie fara ca enzima (dim
mari) sa fie supusa procesului difuziv. Procesul de obtinere a procesului de reactie in acest caz poate fi
considerat ca se desfasoara continuu si la infinit intr-un sistem enzima-substrat care poseda activitate
enzimatica intacta, singurul proces care limiteaza cataliza fiind transferul de masa prin difuzie.
Reactorul cu membrana semi-permeabila (microreactorul) este consituit dintr-o incinta in care
se introduce enzima si la partea superioara a acestei incinte se gaseste o membrana semipermeabila
care permite transferul de masa doar pentru substratul enzimatic si produsul de reactie, fara sa permita
transferul de masa al enzimei prin difuzie. Deasupra acestei incinte se afla o alta incinta tampon care
comunica cu prima prin intermediul membranei semipermeabile.
Daca prima incinta este alimentata cu substrat specific enzimei acesta este transformat in
produs de reactie si conform gradientului de concentratie produsul de reactie va depasi bariera
membranara si va trece in cea de a 2-a incinta in vederea utilizarii. Procesul practic poate fi realizat la
infinit atat timp cat reatorul este alimentat cu substrat.
Intre reactorul de dializa si reactorul cu membrana substratul si produsul de reactie se intalnesc
in acest caz in amestecul determinat de cantitatea de substrat introdusa, in timp ce in cazul reactorului
cu membrana in incinta a 2-a concentratia produsului de reactie este mult mai mare decat a substratului
datorita gradientului mult mai mare de concentratie.
Reactorul gaz-membrana –este constituit din 2 compartimente separate de o membrana semi-
permeabila care permite circulatia moleculelor mici dar nu permite circulatia enzimelor si in special a
ionilor. Unul din cele mai cunoscute reactoare gaz-membrana este construit pe baza a 2 enzime LDH si
ADH, substraturile acestora fiind acidul piruvic si respectiv alcoolul etilic.
Prin intermediul coenzimelor nicotinamidice formele oxidate si respectiv reduse se realizeaza
transformarea acidului piruvic in acid lactic prin reducerea in prezenta NADH si respectiv LDH.
Nicotinamidele in forma oxidata rezultate sunt utilizate in prezenta alcool-dehidrogenazei in oxidarea
alcoolului etilic si transformarea acestuia in acet-aldehida.
Acet-aldehida rezultata fiind de dimensiuni mici, conform gradientului de concentratie trece in
cel de al 2-lea compartiment unde in prezenta borohidrurii de Na, este redusa pana la alcool etilic care
reia ciclul in prezenta ADH. Nicotin-amidele reduse rezultate anterior in prezenta LDH continua
transformarea acidului piruvic in acid lactic s.a.m.d
Nanoreactoarele enzimatice – la baza constructiei nanoreactoarelor enzimatice, veziculelor,
stau macromoleculele cu caracteristici amfifile (poseda o zona hidrofila mica si o zona hidrofoba uriasa).
Spre deosebire de sistemul micelar in care zona centrala prezinta caracteristici hidrofobe. veziculele
poseda un dublu strat amfipatic care in zona centrala inchide o zona cu caracterisitici hidrofile (apoasa).
Lucian Bagu 2013
13 | P a g i n a
Acest sistem este conceput pentru substituirea celulei vii care in cazul eucariotelor este
constituit dintr-un dublu strat lipidic si nu amfipatic. Datorita faptului ca in raport cu vezicula atat in
exterior cat si in interior exista spatii cu caracteristici hidrofile, in interiorul acestora pot fi desfasurate
reactii asemanatoare cu cele din metabolismul celular, unde enzimele sunt cele care sunt implicate in
toate transformarile chimice.
Daca la nivelul dublului strat amfipatic sunt incluse unele sisteme peptidice sau polipeptidice
capabile sa functioneze in procesele de transfer de masa din interior spre exterior si invers. Cu exceptia
macromoleculelor, la nivelul zonei centrale pot fi retinute fizic speciile enzimatice dorite care sa
actioneze la nivelul substraturilor specifice in vederea transformarii in produsi de reactie. –vezi slide
Nano-medicina
Nano medicina face parte integranta din nano-stiinte. Daca nano-stiintele s-au dezvoltat
incepand cu anii 1980, nano-medicina a inceput sa fie recunoscuta ca disciplina incepand cu anii 2000. In
nano-medicina se lucreaza cu sisteme disponibile, ustensile, aparate, care poseda dimensiuni cuprinse
intre 20 si 200nm.
In nano-medicina in prima parte a dezvoltarii sale s-a lucrat cu particule confectionate din
diverse materiale (carbune, metale, materiale plastice, materiale compozite). Marele avantaj al
tehnicilor bazate pe nano-medicina se refera la faptul ca dimensiunile foarte mici ale sistemelor utilizate
creiaza o suprafata de contact foarte mare dintre acestea si tesuturi.
Un salt calitativ remarcabil s-a realizat prin cresterea suprafetelor particulelor realizata prin
constituirea in zona interna a acestora a unor spatii libere, unde prin intermediul unor forte de natura
slaba pot fi retinute diferite substante care pot fi implicate in diverse procese la nivelul tesuturilor sau
celulelor.
Veziculele fac parte din ultima generatie de nano-particule si acestea rezulta din polimeri
sintetici de diferite naturi care se asociaza intr-un dublu strat care inchide in zona centrala un spatiu
hidrofil (apos). Macromoleculele polimerilor care constituie primul strat se asociaza concentric prin
intermediul legaturilor de natura slaba si foarte slaba, ele fiind de natura hidrofoba majoritara avand
insa zone foarte mici si cu caracteristici hidrofile.
Acest aranjament spatial al macromoleculelor din dublul strat permite constituirea unui sistem
vezicular termodinamic stabil in raport cu mediul si in acelasi timp permite difuzia libera a unor molecule
de dimensiuni mici. De regula moleculele care efectueaza difuzia prin dublu strat sunt de natura
hidrofoba si aceastea pot asigura tranzitul inspre interiorul si inspre exteriorul veziculei.
Din punct de vedere al stabilitatii termodinamice factorii de care depinde aceasta sunt:
-temperatura, ph-ul, compozitia in macromolecule a dublului strat.
Temperatura – este un factor perturbator al veziculelor deoarece prin cresterea sa, creste
agitatia termica si respectiv macromoleculele care interactioneaza slab pot suferi detasari in afara
dublului strat si astfel sistemul vezicular se poate destrama.
pH-ul actioneaza la nivelul gruparilor functionale prezente de-a lungul lanturilor
macromoleculelor schimband gradul de incarcare electrica a dublului strat ceea ce se poate materializa
Lucian Bagu 2013
14 | P a g i n a
fie prin cresterea stabilitatii veziculare daca sarcinile electrice sunt de semn opus, fie scaderea stabilitatii
veziculare daca sunt de acelasi semn.
Componentele macromoleculare – constituiente ale dublului strat sunt de natura amfifila, la care
se pot adauga diverse molecule peptidice sau polipeptidice. Compozitia dublului strat prezinta
importanta in procesul de difuzie, ceea ce permite constituirea unor vezicule capabile sa asigura
tranzitul unor compusi fara a asigura tranzitul altor compusi prin difuzie.
Pentru utilizarea veziculelor in medicina la nivelul dublului strat vezicular pot fi legati chimic sau
fizic diverse substante (marcare: receptor, lectina, antigen, imunoglobuline). Dupa constituirea veziculei
care poarta in zona centrala hidrofila unul sau mai multi compusi care nu pot efectua un proces de
difuzie si dupa marcarea veziculara acestea se pot utiliza fie in vivo, fie in vitro.
Daca se utilizeaza in vivo acestea necesita vehiculare prin intermediul lichidelor biologice iar pe
perioada vehicularii acestea trebuie sa prezinte stabilitate termodinamica in raport cu mediile
traversate. Marcarea veziculara prezinta importanta pentru faptul ca prin intermediul markerilor legati
chimic veziculele recunosc doar specific o alta specie moleculara la nivelul careia se desfasoara interactii
de natura slaba in vederea fixarii veziculei si actionarii doar la acest nivel a speciei (speciilor) prezente in
zona centrala veziculara.
Posibile aplicatii ale veziculelor
(nanoreactoarelor)
Tratamentul infarctului miocardic – vezi slide – in constituirea unui tromb intervine fibrina
polimer (reticulata), iar pentru distrugerea acestuia este strict necesara prezenta plasminei ca enzima
capabila sa catalizeze hidrolitic ruperea legaturilor covalente dintre macromoleculele de fibrina
monomer, eliberandu-le pe acestea.
Plasmina rezulta din plasminogen (zimogen) in urma catalizei efectuate de streptokinaza,
urokinaza sau activatorul tisular al plasminogenului. Procesul de transformare al plasminogenului in
plasmina nu se realizeaza in vivo decat dupa interactia plasminogenului cu trombul. In vederea utilizarii
sistemelor veziculare in degradarea trombilor in vezicula in zona centrala se introduce unul sau mai
multi activatori ai plasminogenului (care nu pot parasi vezicula prin difuzie), iar la nivelul dublului strat
vezicular se realizeaza marcarea cu plasminogen.
Sistemul rezultat (vezicula marcata) este introdus pe cale circulatorie si in urma recunoasterii
dintre plaminogenul fixat pe vezicule si trombi se realizeaza o destabilizare veziculara permitand
eliberarea activatorilor sau activatorului plasminogenului in mediu, ceea ce permite transformarea in
vivo si locala a plasminogenului in plasmina care va actiona astfel la nivelul trombilor in vederea
transformarii fibrinei monomer in fibrina polimer (degradarea trombului).
Tratamentul in diabet – in diabetul insulino-dependent, lipsa sau concentratia insuficienta de
insuline determina ca procesul de degradare al glucozei sa fie diminuat, pe de o parte datorita inactivarii
glucochinazei, iar pe de alta parte mentinerii unei difuzii slabe a glucozei prin membranele tuturor
celulelor.
Utilizarea sistemului vezicular in tratamentul diabetului se poate realiza prin introducerea in
zona centrala a veziculei a gluco-oxidazei (macromolecula mare) si a insulinei care este un polipeptid
Lucian Bagu 2013
15 | P a g i n a
mic. Acest sistem vezicular se introduce pe cale circulatorie, iar dublul strat vezicular prezinta
permeabilitate in raport cu glucoza circulanta.
In urma patrunderii glucozei in vezicula, glucoz-oxidaza o transforma in acid gluconic, care prin
acumulare modifica valoarea pH-ului intravezicular. Ceea ce determina o destabilizare a dublului strat
vezicular care permite eliberarea moleculei mici (insulinei) si circularea acesteia catre toate celulele
organismului in vederea cresterii permeabilitatii membranare si cresterii capacitatii de transformare a
glucozei prin glicoliza.
Tratamentul in prezenta lectinelor – lectina este o glicoproteina care este capabila sa recunoasca
si sa lege un rest monozaharinic prezent intr-un lant oligozaharidic singular sau legat de un alt lant
polipeptidic. Aplicarea tratamentelor in prezenta lectinelor necesta: - legarea lectinei de o vezicula la
nivelul careia in zona centrala a fost introdus medicamentul si sistemul rezultat este introdus in
circulatie.
Lectina marker se alege in asa fel incat aceasta sa fie specifica tesutului unde urmeaza sa
actioneze medicamentul. In acest mod in urma interactiei dintre celula tinta si vezicula se destabilieaza
sistemul vezicular, medicamentul paraseste vezicula si actioneaza strict local doar la nivelul acestui
tesut.
Determinarea analitica a interactiilor AG-AC
Este cunoscut faptul ca in ELISA se utilizeaza conjugatele imunoenzimatice care de regula rezulta
prin legarea covalenta a imunoglobulinei de o enzima. In urma acestei legari ambele functii (Ac si
catalitica) se diminueaza drastic, activitatile remanente ale celor 2 specii atingand cateva procente din
activitatea speciilor libere.
Aplicarea sistemelor veziculare in evientierile Ac-Ag utilizeaza enzimele implicate in conjugatele
imunoenzimatice sub forma libera (se introduc in zona centrala a veziculei libere). Procesul de
evidentiere se initializeaza in vitro si veziculele in care se gasesc enzimele (fosfataza alcalina sau
peroxidaza) se markeaza cu una din speciile imune (Ac).
Prin introducerea acestui sistem in proba de analizat prezenta antigenelor in proba determina
interactia specifica Ag-Ac care se materializeaza prin aparitia unui complex imunoenzimatic mare pe
suprafata veziculara care determina instabilitate. Prin aceasta fosfataza alcalina paraseste vezicula si in
forma libera poate actiona asupra unui substrat specific, aprioric, introdus in proba de analizat, ceea ce
determina aparitia unui salt a unei caracteristice biochimice masurabil.
Decontaminarea apelor industriale
Apele industriale, in special cele provenite de la centralele nucleare contin dizolvati cationi ai
metalelor, de regula divalenti, care la nivelul organismelor vii pot actiona defavorabil acestora. Pentru ca
in sistemele clasice nu pot fi eliberati din apele din mediu cationii metalici pana la concentratii suficient
de mici care se asigure utilizarea apelor din sistemele biologice, prin utilizarea reactoarelor enzimatice
cationii pot fi transformati in prezenta acidului fosforic (eliberat in situ- sistem) sub forma de fosfati greu
solubili care pot fi usor ulterior eliberati fie prin centrifugare, fie prin filtrare.
In acest scop se utilizeaza fosfataza ca enzima retinuta in interiorul particulelor si substratul
acesteia poate fi un fosfat organic care in urma catalazei elibereaza acidul fosforic. Atat acidul fosforic
Lucian Bagu 2013
16 | P a g i n a
cat si fosfatul organic prezinta in raport cu membrana capacitate difuziva si astfel acidul fosforic rezultat
in vezicule paraseste vezicula, patrunde in proba de apa unde in prezenta ionilor pozitivi ai metalelor
formeaza complexe insolubile separabile.
Determinarea interactiei Ag-Ac (ELISA)
In genere in practica analitica,in tehnica ELISA se utilizeaza alaturi de speciile imunochimice (Ag,
Ac) si complexe macromoleculare rezultate in urma interactiei covalente dintre Ac si enzima (conjugat
imuno-enzimatic). In urma reactiei chimice dintre cele 2 specii, atat activitatea anticorpica cat si cea
enzimatica sunt deprimate, atingandu-se activitati remanente foarte mici, care scad sensibilitatea
procesului analitic.
Pentru evitarea acestui inconvenient la nivelul imunoglobulinei se leaga o vezicula in care se
gaseste sechestrata o enzima si in acest mod activitatea enzimatica este controlata doar de efectul
difuziv prin membrana veziculara a substratului si respectiv produsilor de reactie si nu de diminuarea
drastica a capacitatii catalitice.
Determinarea glucozei in vitro
Problematica determinarii glucozei in sistem vezicular poate fi rezolvata prin sechestrarea unui
numar de cel putin 2 enzime in zona centrala a veziculei in asa fel incat produsul de reactiei al unei
reactii catalizate sa fie substrat pentru urmatoarea enzima. Daca se alege tandemul glucozo-oxidaza ->
peroxidaza si se doreste determinarea glucozei din probele de analizat, in urma difuziei glucozei prin
membrana veziculara glucoz-oxidaza actioneaza asupra glucozei pe care o transforma in acid gluconic si
(H2O2).
La nivelul central al veziculei trebuie sa difuzeze din mediu substratul specific peroxidazei (amina
aromatica) care in prezenta apei oxigenate eliberate anterior se transforma in produs quinonic colorat,
care are capacitatea de a modifica culoarea mediului initial (probei) si astfel poate fi evidentiata calitativ
si cantitativ prezenta in proba a glucozei.
Degradarea ROS
In aceste situatii se propune introducerea unui numar de 3 enzime in vezicula care ca si in cazul
anterior actioneaza in cascada (produsul de reactie al uneia fiind substratul alteia). Daca in proba de
analizat se gaseste o specie reactiva, cea mai cunoscuta fiind anionul radical superoxid, acesta este
transformat de SOD (superoxid-dismutaza) in peroxid de hidrogen, care devine substratul peroxidazei in
prezenta unui substrat specific si astfel, fie la nivelul probei se masoara o diferenta de potential (datorita
schimbului de sarcina) fie produsul reactiei catalitice de peroxidaza modifica culoarea mediului de
reactie.
In acelasi sistem pentru determinarea xantinei sau hipoxantinei se adauga celor 2 enzimei
xantinoxidaza care este enzima care catalizeaza transformarea celor 2 substraturi in acid uric. In
procesul de transformare al xantinei si a hipoxantinei in acid uric se elibereaza in mediu anionul radical
superoxid ca produs secundar, care actioneaza ca substrat al superoxid dismutazei si care este
transformat in peroxid de Hidrogen, care la randul sau este utilizat impreuna cu substratul de catre
peroxidaza in vederea obtinerii unui produs colorat.
Lucian Bagu 2013
17 | P a g i n a
Limitarea inflamatiilor
In inflamatii apar de regula specii reactive ale oxigenului care pot fi anihilate prin introducerea la
nivel local a veziculelor in care sunt sechestrate diferite specii enzimatice cu rol antioxidant (PX catalaza
SOD-superoxiddismutaza). Daca SOD actioneaza si anihilieaza anionul radical Superoxid, catalaza si
peroxidaza anihileaza peroxidul de H. Sunt diminuate efectele inflamatiei si nu inflamatia.
Degradarea xenobioticelor in vivo si in vitro
In procesele de degradare a xenobioticelor intervine o paleta foartea mare de specii enzimatice
la nivel celular care au rolul de a actiona asupra acestora in vederea modificarii structurilor transformarii
din compusi hidrofobi in compusi hidrofili in vederea eliberarii din organism pe cale renala (preferential).
Printre enzimele implicate in transformarea xenobioticelor hidrofobe in produsi hidrofili se
numara hidrolazele, oxidoreductazele, transferazele. Citocromii P450 (peste 1000 de specii) actioneaza
ca oxidoreductaze in anihilarea xenobioticelor si sunt de regula mono-oxigenaze in sensul ca introduc in
molecula xenobiotic un atom de O preluat din mediu.
In degradarea xenobioticelor citocromii care actioneaza in prezenta nicotin-amidelor in forma
oxidata sunt cuplati cu alte enzime care sunt capabile sa actioneze in cascada in raport cu acestia. In
acest sens in interiorul veziculelor pot fi sechestrate 2 sau mai multe enzime, iar in raport cu membrana
veziculara trebuie sa existe in sistem compusi care pot efectua difuzia simpla, si care sa actioneze ca
substraturi enzimatice.
Activitatea citocromului P450 asupra xenobioticului poate fi realizata in prezenta glucozo-6-
fosfat dehidrogenazei, care are capacitatea de a transforma forma oxidata a nicotin amidelor in forma
redusa NADPH, si in acest mod nicotinamidele reduse in prezenta xenobioticului si in prezenta
citocromului se transforma in nictinamida forma oxidata dar transforma xenobioticul in forma mono-
oxigenata, nicotin amida oxidata fiind capabila sa reia ciclul degradativ asupra xenobioticului.
Imobilizarea veziculelor pe suprafete (membrane)
Pe suprafata unui electrod poate fi imobilizata o enzima sechestrata in vezicule. Pe celalalt
electrod poate fi imobilizata alta enzima cu conditia ca acestea sa lucreze in cascada, adica produsul de
reactie al unei enzime sa fie substratul celeilalte enzime. Daca procesul chimic este redox schimbul la
nivelul electrolitului se poate realiza prin intermediul compusului comun celer 2 enzime, iar contactul
extern se poate realiza prin intermediul fluxului de electroni care se scurge ordonat de la un electrod la
celalalt.
Alegand tandemul peroxidaza si GO poate fi imaginat un biosenzor pentru evidentierea analitica
a glucozei din proba de analizat cu conditia ca glucoza, peroxidul de H si substratul peroxidazei sa
prezinte permeabilitate in raport cu membrana veziculara. In acest mod glucoza la nivelul veziculei va
elibera in prezenta glucozoxidazei H2O2 care prin difuzie libera va patrunde la nivelul veziculelor unde
sunt fixate moleculele de peroxidaza unde in prezenta substratului acesta este transformat in produs
oxidat.
Semnalul analitic rezultat poate fi fie spectrofotometrat, fie masurat ca un curent (potential
electric).
Lucian Bagu 2013
18 | P a g i n a
Imobilizarea cofactorilor
Cofactorii sunt molecule mici care actioneaza la nivelul centrelor alosterice enzimatice si au rolul
de a modula structura proteinenzimei in vederea accesului facil al substratului la nivelul centrului activ
enzimatic. Cei mai cunoscuti cofactori cu aplicabilitate in procese de amplificare ale semnalelor analitice
prezinta structura apropiata de cea a biotinei sau chiar biotina.
Biotina (vitamina H) prezinta o molecula relativ mica si stabila termodinamic in raport cu mediu.
Ia prezinta afinitate in raport cu avidina si strepavidina care sunt macromolecule de natura glico-
proteica. Intre biotina si avidina (streptavidina) se realizeaza interactii de natura slaba prin
complementaritate, astfel ca fiecare macromolecula poseda cate 4 centre de legare a biotinei.
Bazandu-se pe aceste observatii determinarile analitice au utilizat biotina si avidina in procesul
de cromatografie de afinitate, prin care pe faza solida a fost imobilizata una dintre cele 2 specii, iar faza
mobila a transportat cealalta specie prin faza stationara.
In procesele de amplificare se utilizeaza interactiile antigen anticorp, cuplate cu interactiile
avidina-biotina prin care semnalul analitic este multiplicat prin intermediul unui marker care este fixat
pe unul sau pe ambele specii (biotina, Ac, avidina).
Citocromii P450
Structura generala a citocromilor presupune existenta unui sistem protidic constituit dintr-o
zona ciclica de natura hemica (heminica) legata in zona centrala a ghemului statistic de un lant
polipeptidic. Se cunosc multe clase de citocromi, cei mai cunoscuti fiind prezenti in catena de transport
de electroni prezenta pe membrana interna mitocondriala.
Mecanismul care sta la baza actiunii citocromilor este de natura redox, deoarece ionul feros
(Fe2+) se transforma reversibil in ion feric (Fe3+). Prin acest mecanism se elibereaza sau este preluat un
electrod din mediu si din aceasta cauza electronul poate fi pus la dispozitia altor compusi care se pot
reduce iar daca sunt preluati de la alti compusi acestia se oxideaza.
Transferul de electroni din catena respiratorie presupune angrenarea Coe nicotinamidice si
flavinice in eliberarea electronilor si atomilor de H in vederea obtinerii la capatul catenei respiratorii a
energiei metabolice prin catabolism.
Coe reduse din catena respiratorie provin din transformarea oxidativa a componentilor
alimentari preponderent. La nivelul catenei respiratorii se intalnesc Citocromii B, C1, C, A, A3, al caror
potential electric difera de la unul la celalalt dependent de structura lantului polipeptidic pe de o parte
dar si natura substituientilor prezenti pe nucleul hemic.
Citocromii P450 formeaza o superfamilie in care se intalnesc peste o mie de tipuri structural
diferite. Ei nu fac parte catena respiratorie si ei se biosintetizeaza in organismele vii ca raspuns la atacul
pesticidelor, hidrocarburi aromatice policiclice, ingrasaminte chimice, coloranti, adjuvanti si
medicamente.
Biosinteza lor este o necesitate deoarece compusii xenobiotici majoritari lipofili au tendinta de a
se concentra la nivelul tesuturilor grase si de a induce stari patologice. Impotriva acestor acumulari
Citocromii P450 actioneaza ca raspunsuri celulare cu rolul de a biotransforma xenobioticele glicofile in
Lucian Bagu 2013
19 | P a g i n a
produsi cu caracteristici mai hidrofile in vederea circularii lor prin lichidele biologice pentru eliberarea
lor din organism pe cale renala cat si pe cale biliara; in acest mod in raport cu xenobioticele invadatoare,
organismele vii, tind sa se protejeze si sa limiteze efectele toxice ale acestora.
Se cunosc 2 faze distincte ale procesului de biotransformare: faza 1 si faza 2. In faza 1 a
procesului de biotransformare Citocromii P450 actioneaza ca sisteme enzimatice la nivelul ficatului,
rinichiului, plamanului si intestinului, in vederea cresterii caracterului hidrofil si scaderii capacitatii de
toxicitate a xenobioticelor. In genere in faza 1 de biotransformare se produce un proces de derivatizare
prin care la nivelul molecului xenobioticului invadator se introduc diverse grupari functionale prin:
-metilare
-carboxilare
-hidroxilare
-tiol derivatizare.
Odata cu cresterea caracterului hidrofil al xenobioticului si respectiv cresterea capacitatii de
transport prin lichidele biologice, xenobioticul derivatizat prezinta o reactivitate marita, ceea ce
presupune o potentiala crestere a capacitatii de interactie cu compusii endogeni. Atunci cand compusii
endogeni prezinta functii biologice, in urma interactiei cu xenobioticele derivatizate, se modifica
structura dar se poate modifica si functia acestora.
Daca compusii endogeni sunt de natura protein-enzimica, activitatea enzimatica se diminueaza
si odata cu aceasta se modifica metabolismul organismului viu si respectiv apar stari patologice diverse.
Daca interactia se realizeaza la nivelul acizilor nucleici modificarea structurii de baza a acestora poate
conduce la aparitia mutatiilor genetice si respectiv la aparitia unor stari patologice de natura
canceroasa.
In aceste situatii procesele de detoxifiere sunt cuplate cu procesele de bioactivare iar echilibrul
dintre acestea determina instalarea sau nu a starii patologice .
Faza 2 de biotransformare: - este determinata ca o necesitate ca si faza I care a aparut de-
alungul evolutiei speciilor si aceasta consta in preluarea xenobioticelor derivatizate (cu caracter hidrofil)
de catre compusi endogeni, legarea lor chimic in conditii enzimatice in vederea cresterii puternice a
hidrofilicitatii pentru grabirea eliminarilor preferential renala si diminuarea pe cat posibil a instalarii
starilor patologice datorate cresterii reactivitatii.
Procesele din faza a 2-a de biotransformare se numesc procese de conjugare, iar compusii
endogeni de care sunt legate xenobioticele derivatizate sunt de dimensiuni mici si puternic hidrofile.
Enzimele implicate in ce de a 2-a faza a procesului de transformare sunt glutation-S-
transferazele, in care co-substratul este glutationul alaturi de xenobioticul derivatizat, sulfo-
transferazele ST, in care Co-substratul este 3’ fosfo-adenozil, 5’ fosfo-sulfatul si respectiv uridin difosfat-
glucuronozil transferazele si co-substrat este acud UDP-glucuronic.
Reactii de faza 2, catalizate pot fi: de metilare, de sulfurare, de glucuronidare, constituire de
glutation conjugate si glicin conjugare.
Lucian Bagu 2013
20 | P a g i n a
Caracteristici Citocromi P450
Activitatea citocromilor P450 este preferential monooxigenazica (actioneaza doar in prezenta
oxigenului molecular si in urma catalizei introduce un singur atom de O in molecula xenobioticului).
Aceasta clasa se numeste Cyt P450 deoarece toate speciile moleculare din aceast grupare, in prezenta
monoxidului de C determina disparitia benzii de absorbtie la 450nm care este specifica tuturor
citocromilor. Pot proveni din bacterii si sunt solubili si din eucariote si sunt insolubili datorita prezentei
lor exclusive la nivelul membranelor celulare sau intracelulare.
Cyt P450 au mase moleculare relativ mici (45-60kD), se biosintetizeaza preponderent la nivel
hepatocitar si sunt implicati in transformarea medicamentelor hormonilor si a xenobioticelor puternic
lipofile.
Substraturile asupra carora pot actiona se transforma in hidroxi-derivati, epoxi-derivati sau
compusi nesaturati, fiind capabili sa elimine atomii de hidrogen in prezenta oxigenului molecular. In
procesele de biotransformare de faza 1, in prezenta Cyt P450 alaturi de O molecular trebuie sa fie
prezente si nicotinamidele in stare redusa, care au rolul de a transfera electronii si pe celalalt atom de O
din molecula Oxigenului pentru obtinerea apei.
Benzo(a)pirenul (PAH) – cancerigen
Ochratoxina (OTA)
Zearalelona (ZEA)
Patulina (fructe)
Implicarea citocromilor P450 in metabolismul celular normal:
La nivelul organismului uman Cyt P450 prezinta efecte enzimatice specifice in raport cu natura
tesutului unde actioneaza asupra produsilor endogeni fiind implicati astfel in biosinteza unor compusi
strict necesari organismului.
Aromataza (citocrom P450) – este un citocrom P450 care in prezenta unei reductaze flavinice
este implicata in biosinteza hormonilor sexuali feminini prin transformarea ciclului A din nucleul
ciclopentanoperhidrofenantrenic intr-un nucleu aromatic cuplat cu eliminarea gruparilor functionale
metil si respectiv hidroxilarea acestuia. In acest mod se biosintetizeaza estrola si estriolul.
Oxidul nitric (monoxidul de azot) – este sintetizat in organismul uman in prezenta unui Cyt P450
numit NO-sintetaza folosind ca substrat arginina. Oxidul nitric se obtine in urma monooxigenarii
argininei si din punct de vedere al activitatii organismului uman se remarca prezenta electronului
neimperecheat care determina o capacitate mare de interactie cu alte molecule iar rolul fundamental al
NO este in transmiterea influxului nervos la nivelul cerebelului.
Membrane plasmatice
Receptorul este o structura macromoleculara de natura glicoproteica sau un ansamblu de
macromolecule de natura glicoproteica care are capacitatea de a recunoaste si de a lega alte structuri si
de a transmite semnalul legarii altor structuri biologice in vederea efectuarii unui lucru.
Lucian Bagu 2013
21 | P a g i n a
Se poate vorbi despre receptori prin raportare la membrana celulara, deoarece aceste specii pot
fi fie membranari (intrinseci – incapsati in dublul strat lipidic), fie intracelulari (citoplasmatici).
Membrana celulara este o structura inalt elastica si inalt viscoasa care are rolul de a mentine o
diferenta semnificativa a concentratiilor componentilor intracelulari in raport cu cei extracelulari.
Membranele celulare individualizeaza celula, dar aceste sisteme dublu lipidice se intalnesc si la nivelul
citoplasmei unde sunt individualizate organitele.
Proprietatea fundamentala a membranelor este permeabilitatea selectiva, care se realizeaza pe
mai multe cai:
-difuzie simpla
-difuzie facilitata
-difuzie activa (transport activ) prin canale sau prin pompe ionice.
Alaturi de aceste posibilitati de transfer a materiei in raport cu interiorul celulei se intalnesc si 2
forme de transfer de unzanta limitanta (exocitoza si endocitoza). In afara schimbului de materie dintre
celula si mediu exista posibilitatea realizarii schimbului de materie dintre celula si celula prin intermediul
jonctiunilor Gap.
La nivelul membranei celulare exista posibilitatea transferului si a energiei nu numai a materiei
care presupun existenta unor canale speciale la nivelul carora se poate realiza fie fotosinteza, fie
fosforilarea oxidativa. Din punct de vedere termodinamic membranele prezinta o relativa stabilitate in
raport cu mediu si ele sunt asamblate necovalent, interactiile de baza fiind cele de natura hidrofoba (in
mediu apos).
Membranele in afara transferului de materie si energie pot fi implicate si in unele functii
celulare, deci in afara dublului strat lipidic trebuie sa existe la acest nivel si unele specii macromoleculare
capabile sa efectueze anumite activitati biologice. Alaturi de lipide care sunt majoritare la nivelul
celulelor se intalnesc proteine respectiv glicoproteine care au rolul de a imprima functie biologica
membrane si implicit celule sau organitului, acestea pot functiona ca enzime, pompe de ioni, canale sau
antigene, receptori.
Raportul dintre cele 2 entitati (lipide si protide) membranare si tipul de componente lipidice sau
protidice sunt strict specifice fiecarui tip de celula sau organism.
Transferul selectiv transmembranar
Se poate realiza prin difuzie simpla (fara consum de energie) sau facilitata doar de catre acele
specii care sunt (nepolare, neincarcate electric). Toate celelalte specii polare, puterni polare,
macromoleculare ionice, trebuie sa gaseasca alt mecanism, fie prin consum de energie, fie prin
intermediul unor canale speciale pentru depasirea barierei membranare.
Endocitoza pentru desfasurare necesita energie metabolica din ATP; ioni de Ca prezenti
extracelulari si elemente contractile intracelulare, prin endocitoza se poate realiza fagocitoza atunci
cand avem particole care trebuie sa patrunda in celule; si pinocitoza cand se preiau fluide extracelulare.
Procesele de endocitiza si exocitoza pentru cele 200 de celule diferentiate din organismul uman
sunt reglate prin intermediul unui numar de 50 de hormoni, care la randul lor la nivelul membranei
Lucian Bagu 2013
22 | P a g i n a
trebuie sa posede receptorii specifici. Este posibil ca un hormon sa controleze un numar mai mare de
celule diferentiate si invers, o celula sa fie controlata de mai multi hormoni, dependent de activitatile
fiziologice care urmeaza sa fie desfasurate.
Prin intermediul jonctiunilor Gap, pot fi reglate treceri ale moleculelor mici de 1-2kD si a unor
specii ionice. Jonctiunile Gap sunt niste canale ionice cu caracteristici hidrofile, intercitoplasmatice
constituite din conexoni care au la baza structuri alfa helicale capabile sa constituie canalul de
comunicare.
Receptorii trebuie sa posede un element de decelare a unui proces fiziologic, si un alt element
de legare specifica a unei molecule semnal. Prin intermediul procesului de receptare se realizeaza o
asociere intre receptori si molecula semnal care ulterior actioneaza fie direct fie indirect asupra altor
sisteme prezente in celula vie.
In acest mod se realizeaza o comunicare prin limbaj chimic dintre celula vie si mediu. Intre
receptori si molecula semnal intervin intotdeauna interactii de natura necovalenta care sunt reversibile.
Este posibil ca la nivelul receptorului alaturi de molecula semnal sa actioneze si alte molecule cu
structuri apropiate, in acest caz se poate vorbi de actiune agonica sau antagonica.
In general actiunea antagonica presupune un proces de inhibitie de tip competitiv in timp ce
actiunea agonica presupune dezvoltarea aceluiasi efect biologic pe care l-a dezvoltat molecula semnal
care are receptorul specific.
Moleculele semnal se gasesc intotdeauna la nivel extracelular, sunt biosintetizate la distanta
mare in raport cu receptorul sau pot patrunde in organism ca xenobiotice prin intermediul apei, hranei
sau a medicatiei. Aceste molecule pot avea caractere hidrofil sau hidrofob si pot fi transportate ca atare
daca sunt hidrofile sau sub forma unor particole lipoproteice daca au caracteristici hidrofobe.
Receptorii de suprafata
Se gasesc ca specii moleculare glicoproteice intrinseci in raport cu membrana celulara, care
traverseaza o singura data dublul strat lipidic si in urma receptarii moleculei semnal, modificarea
conformatiei si configuratiei determina dezvoltarea unor procese biologice membranare sau
intracelulare prin reglare alosterica. (f.imp)
De regula receptorii membranari in urma activitatii alosterice activeaza proteinele de tip G care
sunt implicate in sinteza unui mesager secund la nivel membranar de regula care fiind hidrofil si de
dimensiuni mici poate circula la nivelul citoplasmei in vederea dezvoltarii altor procese biologice
intracelulare.
In general moleculele semnal din mediu extracelular se gasesc in concentratii mici si foarte mici
si din aceasta cauza afinitatea si specificitatea trebuie sa fie deosebit de inalte. Capacitatea de a
evidentia existenta unui semnal la concentrati mici, deosebit de mici – afinitatea, in timp ce
specificitatea este o masura a complementaritatii dintre receptor si molecula semnal.
Toate speciile de receptori de suprafata poseda 3 zone distincte:
-zona externa macromoleculara in raport cu membrana se numeste zona ligand care are rolul de a
interactiona cu molecula semnal.
Lucian Bagu 2013
23 | P a g i n a
-zona intracelulara sau citoplasmatica care este capabila sa genereze mesagerii secunzi in vederea
efectuarii lucrului biologic
-zona transmembranara care are rolul de a fixa receptorul la nivelul dublului strat lipidic si din aceasta
cauza aceasta zona este constituita din resturi de aminoacizi cu caracter hidrofil diminuat.
Receptorii citoplasmatici sunt speicifici moleculelor semnal cu caracteristici hidrofobe prezente
in lichidul extracelular. Aceste molecule semnal (hidrofobe) pot strabate membrana care are aceleasi
caracteristici si in acest mod receptorul celular se poate constitui la nivel citoplasmatic.
In urma constituirii sistemului receptor receptat sistemului citoplasmatic, aceste agregate
macromoleculare patrund in nucleul celular depasind membrana si se fixeaza pe siturile specifice DNA si
astfel actioneaza ca factor de transcriptie in procesul biosintetic proteic.
Intre molecula semnal si receptor se desfasoara interactii de tip complementar. Numarul de
receptori specifici unei molecule semnal este limitat la nivelul celular (fie extra fie intra). Din aceasta
cauza gradul de saturare variaza in raport cu concentratia moleculei semnal dupa o curba de tip
hiperbola echilatera, in care la concentratii mici si foarte mici ale moleculei semnal exista o directa
proportionalitate intre gradul de saturare si concentratie si respectiv efectul celular.
In schimb atunci cand intreaga cantitate de receptori celulari este ocupata de molecule semnal
specifice gradul de saturare atinge 100% iar efectul celular este maxim posibil indiferent de cat de mare
este concentratia moleculei semnal.
Canale ionice activate de ligand
Spre deosebire de membranele celulare care au caracter dielectric (izolator) canalele ionice au
caracter electric conducator. Ca si receptorii celulari canalele ionice sunt de natura glicoproteica, se
intalnesc tot la nivelul membranei dublu lipidice si au rolul de a permite trecerea ionilor din mediu in
celula si invers, fie ionii organici fie cei anorganici sub controlul gradientilor ionici si respectiv al
potentialelor membranare.
Totodata prin deplasarea ordonata a sarcinilor intra sau extra celular prin intermediul canalelor
ionice se poate realiza indirect controlul potentialelor electrochimice celulare. Pentru ca molecula
semnal incarcata electric sa depaseasca bariera membranara este necesara o activare a acesteia, si in
urma acestei activari sistemul rezultat poate induce la nivelul canalului care functioneaza ca un receptor
(sa induca modificari conformationale care sa conduca la inchiderea sau deschiderea canalului pentru
realizarea transferului).
Proteinele G
Simbolistica proteinelor G provine de la faptul ca acestea sunt in corelatie cu Guanozin fosfatii in
raport cu care actiuneaza ca hidrolaze. In urma actiunii hidrolitice proteinele G rup legaturile
macroergice din nucleotidele derivate din guanina si astfel este pusa in libertate o cantitate de energie
necesara unor procese celulare si gruparea fosfat eliberata poate fi utilizata de unele transferaze sau
sintetaze in procese biochimice.
Proteinele G sunt implicate in numeroase procese celulare de reglare a proceselor biochimice,
de traducere si transcriere a semnalului la nivelul membranelor celulare in biosinteza proteica atunci
Lucian Bagu 2013
24 | P a g i n a
cand actiunea se exercita la nivelul nucleilor sau a nucleolilor sau a polizomilor. Secretia si exocitoza sunt
procese de natura fizica controlate prin intermediul Proteinelor G si astfel unii produsi in special de
natura macromoleculara pot parasi celulele biosintetizatoare.
Motilitatea si contractibilitatea care necesita atat grupari fosfat cat si energie metabolica se
gasesc sub controlul proteinelor G, si cresterea, diferentierea si multiplicarea celulara se gasesc in buna
masura sub coordonarea acestor proteine.
In general proteinele G sunt proteine prezente la nivelul membranelor, si acestea actioneaza in
urma interactiei dintre molecula semnal si receptorul membranar, principala functie fiind biosinteza
mediatorilor secunzi.
Din punct de vedere structural proteinele G sunt de natura cuaternara in care un nr de
macromolecule polipeptidice interactioneaza prin intermediul legaturilor necovalente. De regula
proteinele G sunt heterotrimere, ele fiind constituite pe baza unui nr de 3 subunitati ale caror functii la
nivelul intregului sistem sunt binedeterminate.
Subunitatea afla – prezinta o structura capabila sa recunoasca si sa lege Guanozin-trifosfatul si in
acest mod sa actioneze hidrolitic la nivelul legaturilor macroergice, in vederea eliberarii energiei
metabolice. Se cunosc 4 subfamilii ale subunitatii alfa (Gs, Gi, Gq, G12) dintre care fiecare prezinte
actiune specifica sau specifica de grup.
Subfamilia Gs – actioneaza la nivelul: -adelilatciclazei care este implicata din catalizarea
transformarii ATP in cAMP ca mesager secund; -formarea cAMP determina activarea proteinkinazei A
care prezint rol primordial ca transferaza la nivelul gruparii fosfat, astfel prin intermediul proteinkinazei
A se realizeaza fosforilarea anumitor proteine celulare in special din categoria enzimelor, iar aceste
enzime fosforilate pot fi activate sau dezactivate in prezenta gruparii fosfat ceea ce se materializeaza
prin desfasurarea unor procese metabolice fie mai accelerat fie mai decelerat.
Subfamilia Gi – actioneaza la nivelul adenilatciclazei dar cu rol inhibitor si astfel cele 2 subfamilii
realizeaza reglajul biosintezei cAMP ca mediator secund al semnalului primordial. Subfamilia Gi participa
la reglarea canalelor ionice cu specificitate relativa in raport cu ionii de K, Ca.
Subfamilia Gq – actioneaza la nivelul membranelor stimuland fosfolipaza C, care prezinta
activitate enzimatica in raport cu fosfolipidele la nivelul carora actioneaza in vederea transformarii
acestora in Diacilglicerol si un ester fosfat printre care poate fi si fosfoinozitolul pe care il poate cliva mai
departe intre inozitol-trifosfat si in diacilgrlicerol.
Receptorii agentilor terapeutici
In procesele de administrare a medicamentelor, acestea necesita concentratii circulante mari
datorita disiparii in intreg organismul, ele necesitand pentru actiune la nivelul unui tesut prezenta unui
anumit receptor. Prin interactia dintre medicament si receptorii agentilor terapeutici se realizeaza la
nivel celular activarea sau inactivarea sistemelor enzimatice si astfel procesele biochimice controlate de
aceste sisteme enzimatice se desfasoara fie limitat fie accelerat in asa fel incat afectiunea locala sa fie pe
cat posibil diminuata.
Prin interactia cu receptorii agentilor terapeutici se poate interveni si la nivelul proteinelor
transportoare in special la nivelul pompelor de ioni, dar si la nivelul proteinelor structurale.
Lucian Bagu 2013
25 | P a g i n a
Receptorii agentilor terapeutici pot sau nu sa se suprapuna peste receptorii de legare a
anumitor molecule semnal. Indiferent de natura interactiei molecula semnal receptor pentru acestia se
deosebesc numarul de situsuri si respectiv activitatea situsurilor, afinitatea in raport cu moleculele
semnal.
Alte caracteristici ale receptorilor penrtu medicamente pot varia substantial cu varsta
pacientului, natura agentului terapeutic, mutatiile care pot interveni si alti factori. Atunci cand un agent
terapeutic este introdus in organismul uman pot fi modificate in mod special numarul si specificitatea
situsurilor de legare si astfel acestea pot fi crescute sau pot fi scazute.
Mesageri secunzi
Sunt compusi de natura organica sau anorganica, de dimensiuni mici sau foarte mici, care se
gasesc intracelular si care poseda la nivelul citoplasmei difuzie relativ usoara. Prin intermediul
mesagerilor secunzi se realizeaza transmiterea si multiplicarea informatiei chimice provenite de la
molecula semnal, care intotdeauna este de natura extracelulara. In acest mod se realizeaza o integrare a
informatiei chimice celulare in prezenta factorilor externi.
Mesagerii secunzi pot fi: -din punct de vedere structural (hidrofobi, hidrofili – majoritatea, gaze-
hidrofoba).
Adenozin-monofosfatul ciclic se biosintetizeaza intracelular din ATP in prezenta adenilatciclazei.
Procesul de biosinteza al cAMP este contrabalansat de degradarea hidrolitica in prezenta
fosfodiesterazelor, care transforma cAMP in adenozin-monofosfat care nu mai prezinta activitate de
mesager secund.
cAMP se biosintetizeaza ca urmare a interactiilor moleculelor semnal hidrofile cu receptorii
membranari: - catecolaminele, prostaglandinele, prostaciclinele, paratiroidhormonul, histamina,
glucagon, TSH, serotonina, ADH, GC, ACTH.
Actiunea moleculelor semnal hidrofile prin intermediul cAMP
cAMP are rolul ca prin activarea enzimelor celulare sa intervina in mobilizarea energiei stocata
sub diverse forme (glucide sau lipide).
-cresterea contractiilor si frecventei miocardului prin intermediul catecolaminelor
-reglarea echilibrului calcic.
-conservarea apei la nivel renal
-reglarea biosintezei hormonilor steroizi
-relaxarea muschilor netezi.
Substraturi proteinkinaza A:
Proteinkinaza A care actioneaza in cascada coordonata de cAMP prezinta importanta in
procesele de fosforilare a protein enzimelor si care se materializeaza prin amplificarea semnalului primit
prin intermediul moleculei semnal initial.
Lucian Bagu 2013
26 | P a g i n a
La nivelul canalelor ionice priteinkinaza A controleaza patrunderea sau nu a ionului de Ca la nivel
celular dar si la nivelul canalelor ionice de clorura, la nivelul IS in vederea secretiei apei. Ea activeaza
factorii de transcriptie in biosinteza proteica, si in sfarsit actioneaza la nivelul Histonelor (peptide de
dimensiuni mici incarcate positiv datorita prezentei excedentare a resturilor glisinice si argininice;
sarcina pozitiva a histonelor determina interactia acestor specii cu acizii nucleici care sunt incarcati
negativ) implicate in expresia genelor.
cGMP (guanozin-monofosfatul ciclic) se aseamana strucutral cu cAMP, biosinteza de asemenea
se aseamana cu biosinteza cAMP, insa functiile difera. Biosinteza se realizeaza in urma receptiei dintre
molecula semnal si receptorul membranar in prezenta Guanilatclazei care transforma GTP in cGMP.
Acesta actioneaza asupra protein-kinazelor in vederea fosforilarii.
Procesul biosintetic al cGMP se gaseste sub controlul fosfodiesterazelor, care au capacitatea de
a degrada molecula hidrolitic transformandu-se in GMP.
De regula in biosinteza guanozinmonofosfatului ciclic ca molecule semnal intervin acetil-colina si
histamina. Efectele induse de acest mediator secund se manifesta la nivelul fosforilarii kinazelor
specifice in special in procesele contractile (miozina), in conductia unor canale ionice si glicogenoliza si
apoptoza.
Ca si in cazul cAMP fosfodiesteraza specifica regleaza atat timpul de actiune al cGMP cat si
intensitatea de actiune prin controlul concentratiei acestei specii. Raspunsurile fiziologice la activitatea
cGMP sunt intalnite in: contractiile musculare, inflamatiei, relaxare vasculara, activare plachetara.
Fosfodiesterazele care controleaza concentratiile celor 2 mesageri secunzi si cGMP pot fi
inhibate fie neselectiv prin intermediul papaverinei si teofilinei, si astfel se obtine o crestere substantiala
a concentratiei celor 2 specii si respectiv o crestere a semnalului si a efectelor induse de mesagerii
secunzi. Se intalnesc procese de inhibare selectiva a fosfodiesterazelor in numeroase procese
patologice.
NO
Este o molecula anorganica foarte mica, cu caracter hidrofob, se sintetitzeaza fie din arginina, fie
din nitroderivatii din organism, cel mai cunoscut fiind nitroglicerina, care actioneaza ca vasodilatator.
Actiunea monoxidului de azot poate sa fie directa in prezenta guanilat ciclazei, prezenta la nivelul
creierului, sistemului cardio-vascular si respectiv la nivelul muschilor netezi.
Ca – este un compus anorganic, de dimensiuni mici si cu incarcatura electrica. Actioneaza prin
intermediul proteinelor G, in special la nivelul canalelor ionice. Ionul de Ca prezinta concentratii
intracelulare mult mai mici decat cele extracelulare, din aceasta cauza exista tendinta relativ usoara de
migrare a Ca extracelular intracelular, care se poate materializa prin aparitia unor complecsi in prezenta
proteinelor citoplasmatice greu solubili si nefunctionali. Din aceasta cauza in raport cu ionul de Ca la
nivel celular se consuma energie metabolica pentru mentinerea gradientului de concentratie al ionului
de Ca in intervalul optim.
Proteina reglatoare la nivel celular (al tuturor celulelor dependente de calciu***) este
calmodulina. Ionul de Ca intervine ca mesager secund in numeroase procese fiziologice: diferentiere si
Lucian Bagu 2013
27 | P a g i n a
proliferare, fertilizarea ovulului, motilitatea celulara, secretia proteinelor si reglarea citoplasmatica a
proteinelor functionale.
Calmodulina – este un polipeptid de dimensiuni mici (17kD) si poseda un ghem statistic
(proteina globulara), la nivelul lantului polipeptidic calmodulina poseda 4 situsuri de legare specifica a
ionului de Ca. Prin interactia dintre calmodulina si ionii de Ca se realizeaza o modulare a moleculei
proteinei care permite activarea unor proteine sau canale ionice: adenilatkinaza, proteinkinaza Ca
dependenta, Ca-Mg atp-aza, fosfodiesteraza ale nucleotidelor ciclice, proteine ale citoscheletului, canale
ionice, NO-sintetaza, fosforilazkinaze, fosfoproteinfosfataze si receptori.
Proteinkinaza A (PKA) este cAMP dependenta (activitatea ei depinde de prezenta cAMP), este un
sistem oligomeric in care se intalnesc 2 protomeri catalitici C si 2 protomeri reglatori R. Acest complex
C2R2 este inactiv si se activeaza dupa legarea cAMP care are rolul de a indeparta din complex protomerii
reglatori si de a ramane protomerii catalitici.
Rolul catalitic al PKA este de transferaza si catalizeaza transferul gruparii fosfat de pe ATP pe o
proteina celulara, transferul realizandu-se la nivelul resturilor Ser, Tyr, Thr.
Procese reglate de proteina A:
-steroidogeneza
-secretia
-transportul ionilor
-metabolismul zaharidelor si lipidelor
-inductia enzimatica
-reglarea genelor
-transmisia sinaptica
-cresterea celulara si replicarea.
Proteinkinaza C
-este constituita din lanturi polipeptidice in sistem oligomer, cunoscandu-se 3 familii in care se
intalnesc 10 izoenzime. Activatorii proteinkinazei C sunt produsii rezultati in urma catalizei fosfolipazelor
A2, C si D.
De regula prin interventia Proteinkinazei C sunt activate proteinele care prezinta resturi serinice
sau treoninice.
Acidul arahidonic- este mediatorul proceselor inflamatorii. Mesagerii secunzi implicati in
actiunea acidului arahidonic, fosfolipaza C, proteinkinaza C. Produsii de transformare sunt eicosanoide,
prostaglandine, prostacicline care sunt implicati in modularea canalelor ionice, pompelor ionice si
proteinkinazei.
Lucian Bagu 2013
28 | P a g i n a
Energie: Capacitate efectuare W
Este elementul fundamental al tuturor sistemelor vii deoarece orice sistem viu presupune creare
de ordine in raport cu mediul. Conform principiului 2 al termodinamicii, in natura entropia creste
(dezordinea) si pentru crearea ordinii o mare parte a energiei metabolice este consumata, iar atunci
cand acest increment energetic nu mai poseda sistemul, acesta revine la litosfera.
Din punct de vedere al entropiei toate sistemele vii sunt anti-entropice. Tinand cont de faptul ca
in principiul I al termodinamicii se postuleaza ca energia este nedestructibila, nu se creeaza ci se
transforma dintr-o forma in alta in cantitati echivalente, toate sistemele vii trebuie sa obtina pe baza
componentelor din mediu energia metabolica.
Daca Plantele obtin energia metabolica din compusi anorganici in prezenta radiatiilor solare,
toate celelalte vietuitoare obtin energia pe baza compusilor organici prezenti in mediu in care energia
este inmagazinata sub forma legaturilor covalente. Prin destructia acestor legaturi covalente se
elibereaza energia din compusii organici si este transferata in biosisteme sub forma altor compusi de
natura organica in care legaturile covalente sunt tensionate puternic (compusi macroergici), care au
capacitatea de a inmagazina si de a transfera la randul lor energia intr-un mod utilizabil la nivel celular.
Procesul fundamental prin care se obtine energia metabolica in majoritatea sistemelor vii este
fosforilarea oxidativa la nivelul careia coenzimele reduse flavinicE si nicotinamidice rezultate in
catabolism se oxideaza pe seama transferului protonilor si electronilor la nivelul catenei respiratorii,
cand se obtin potentiale chimice sau electrochimice capabile sa se transforme rapid si eficient in energie
chimica inmagazinata sub forma de legatura covalenta in ATP.
Procesele energetice de acest tip se produc la nivelul mitocondriei si foarte rar la nivelul
citoplasmei, iar alaturi de ATP ca produs principal macroergic se poate inmagazina si creatinfosfatul,
care spre deosebire de ATP nu depaseste concentratia de 2mmol celulara, se poate inmagazina in
concentratii mult mai mari.
Exigente energetice ale organismului uman
Pentru organismul uman necesarul energetic majoritar (app 50%) este satisfacut de zaharide, si
doar 34% este satisfacut de lipide, chiar daca arderea aceleiasi cantitati de lipid este mult mai eficienta
decat arderea aceleiasi cantitati de zaharid. Proteinele indiferent de natura exogena sau endogena sunt
implicate relativ putin in satisfacerea necesarului energetic, deoarece aminoacizii sunt preferential
utilizati in procesele biosintetice proteice care asigura cresterea, dezvoltarea dar si toate echipamentele
necesare functionarii organismului de natura polipeptidica (proteine functionale).
Exigentele energetice pentru organismul uman sunt dependente de natura tesutului, Creier
(2%/ organism), dar consuma aproximativ 150g glucoza pe zi (app intreaga cantitate de glucoza
inmagazinata in ficat). Este un organ gluco-dependent deoarece acizii grasi cu potential energetic mare
nu pot depasi bariera singe-creier pentru ca nu circula singuri (sunt insolubili) ci ei circula doar legati de
albumine, care sunt macromolecule cu dimensiuni medii (60kD) care nu depasesc aceasta bariera.
In schimb acizii grasi solubili (corpii cetonici) prezenti in conditii normale in organism pot fi
utilizati in scopuri energetice la acest nivel in urma cetolizei. Ei putand asigura in anumite momente
pana la 20% din necesarul energetic al organismului uman.
Lucian Bagu 2013
29 | P a g i n a
Energia metabolica necesara creierului este utilizata majoritar pentru intretinerea pompelor de
ioni in special cele de tip ATP-azice, care mentin potentialul membranar la transferul influxului nervos.
Globulele rosii ca si creierul constituie sisteme gluco-dependente datorita lipsei mitocondriilor la
nivelul carora s-ar putea desfasura Beta-oxidarea acizilor grasi. In genere la nivelul eritrocitelor se
produce glicoliza ca element fundamental energetic , proces care se desfasoara in anaerobioza
profunda, produsul final nefiind acidul piruvic ci acidul lactic, deoarece in prezenta lactat-
dehidrogenazelor pot fi recuperate CoE NAD oxidate, din cele reduse rezultate in glicoliza normala strict
necesare pentru reluarea ciclului glicolitic.
La nivelul eritrocitelor in continuu se produce acid lactic care fiind hidrosolubil este transferat la
nivelul hepatocitelor unde sufera procesul de gluconeogeneza, asigurand astfel in continuu un minim de
glucoza organismului.
Ficatul – este un organ gras in care se produc majoritatea proceselor degradative si
metabolizante, cunoscute in organism si care utilizeaza ca sursa energetica preferetial acizii grasi, si
postprandial – glucoza alimentara.
Tesuturile adipoase utilizeaza ca sursa energetica preferentiala acizii grasi prin Beta-oxidare si
TCA, si ca si ficatul postprandial utilizeaza glucoza alimentara.
Muschii – in special cei striati utilizeaza acizii grasi de asemenea preferential, dar postprandial
pot utiliza si glucoza alimentara cat si corpii cetonici ca si acizi grasi solubili. In aerobioza profunda, in
conditii de efort mare, la nivel muscular o parte din energia metabolica poate fi satisfacuta cu ajutorul
glucozei (fie alimentare, fie rezultate din gluconeogeneza).
Miocardul - se deosebeste de restul muschilor striati in ceea ce priveste asigurarea necesarului
energetic prin consumul si al lactatului alaturi de corpii cetonici, glucoza si acizii grasi.
Glucoza este o rezerva energetica limitata deoarece se gaseste in circulatie si stocata sub forma
de glicogen hepatic sau muscular, cea mai mare cantitate de glicogen se gaseste la nivelul muschilor
striati (aproximativ 300g). Originea glucozei poate sa fie alimentara dar si metabolica. Din rezervele de
glicogen , glucoza se obtine prin glicogenoliza, atat hepatica cat si musculara deoarece glucoza este
solubila in lichidele biologice si transportabila.
Acizii grasi – se gasesc majoritar sub forma de combinatii cu glicerina, sub forma de
triacilgliceroli care sunt insolubili in lichidele biologice si care la nivelul organismului uman se intalnesc
sub forma de depozite fiziologice.
Depozitele de TGL constituie tesutul adipos care reprezinta 10% din greutatea organismului, si
reprezinta 95% din necesarul energetic al acestuia. Hidrofobicitatea TGL si caracterul redus al
moleculelor acestora determina ca acesti compusi sa se gaseasca sub forma anhidra, comprativ cu
glicogenul care are caracter hidrofil puternic, este insolubil dar are capacitate mare de hidratare, din
aceasta cauza arderea in vederea obtinerii energiei metabolice al unui gram de TGL este echivalentul a
6g de glucoza.
Daca TG sunt molecule mici ale acizilor grasi, glicogenul este sub forma de macromolecula care
confera o presiune osmotica deosebit de mica comparativ cu glucoza si astfel asigura la nivelul
organismului uman un echilibru hidric.
Lucian Bagu 2013
30 | P a g i n a
Acizii grasi pot avea origine alimentara, ei patrunzand in organism la nivel circulator sau de
origine metabolica. Acizii grasi biosintetizandu-se atat la nivel mitocondrial, dar in special la nivel
citoplasmatic in majoritatea celulelor.
Pentru obtinerea a.g. din tgl se desfasoara un proces de lipoliza. Aminoacizii se utilizeaza rar ,
foarte rar ca sursa energetica in organismul uman, ei au origine alimentara preponerent si metabolica
prin degradarea proteinelor dupa expirarea timpului de viata.
Procesele de transformare ale proteinelor interne in energie metabolica se produc doar in
posturile prelungite ale ogranismului prin proteoliza musculara limitata dar organismul sufera in aceste
conditii putand sa apara stari patologice de tipul miodistrofiilor.
Particularitati metabolism:
In conditii normale: se consuma in scopuri energetice glucoza si acizii grazi, hormonul principal
implicat fiind insulina, deoarece prin biosinteza sa pancreatica dependenta de concentratia glucozei
circulante asigura pe de o parte patrunderea glucozei din lichidele biologice in celula si declansarea
procesului glicolitic prin activarea primei reactii de glicoliza.
De-alungul unei zile, raportul insulina/glucagon este cel care regleaza procesele de ardere ale
glucozei in raport cu lipidele, glucagonul intervenind in hipoglicemii.
Adaptarea organismului la post
Postul inseamna intreruperea alimentatiei organismului, diminuarea aprovizionarii tesuturilor
cu glucide si lipide. Si in post se pune problema stringenta a asigurarii rezervelor de glucoza pentru
tesuturile gluco-dependente si prezervarea proteinelor musculare din organism.
In postul fiziologic se pune problema mentinerii glicemiei in limite normale si organismul
consuma glucoza circulanta si asigura in acelasi timp glucoza prin gluconeogeneza hepatica preferential,
rezultata din transformarea glicerolului sau acidului lactic in glucoza.
Daca acidul lactic rezulta in aerobioza, la nivelul eritrocitului, glicerolul rezulta in aceasta etapa
in cantitati mari in urma lipolizei. Muschii striati si miocardul consuma in postul fiziologic glucoza
rezultata din glicogenoliza si acizi grasi rezultati din triacil gliceroli. De asemenea consuma glucoza
rezultata din gluconeo-geneza hepatica.
In postul ne-fiziologic scurt (pana la 1 saptamana) in acest interval se consuma cantitati limitate
de glucoza circulanta rezultata din glicogenoliza, deoarece glicogenul este limitat in organism, in schimb
se consuma acizi grasi in cantitati foarte mari ca sa asigure necesarul energetic ceea ce determina
cresterea procesului de cetogeneza hepatica cu aparitia corpilor cetonici care asigura necesar energetic
in acest interval pentru miocard creier si muschi si se declanseaza un proces de gluconeogeneza plecand
de la aminoacizii rezultati printr-un proces incipient de proteoliza musculara in special gluconeogeneza
din alanina.
Procesul de proteoliza musculara este sub controlul cortizolului. In postul nefiziologic si lung
(peste o saptamana), asigurarea energiei organismului se realizeaza prin gluconeogeneza hepatica
cuplata cu gluconeogeneza renala ca urmare a intensificarii consumului de acizi grasi, se intensifica
Lucian Bagu 2013
31 | P a g i n a
procesul cetogenetic si astfel corpii cetonici asigura in aceste conditii pana la 2/3 din necesarul energetic
al creierului.
Simultan cu aceste procese se intensifica proteoliza musculara cu aparitia miodistrofiilor, iar
supravietuirea organismului este dependenta doar de rezervele lipidice ale organismului.
Adaptarea metabolica in efort intens a organismului (sprinter)
In organismul sprinterului contractiile musculare prezinta o frecventa foarte mare, si necesita un
consum foarte mare de oxigen, in aceste conditii cantitatea de mioglobina prezenta la nivel muscular
este insuficienta si astfel preluarea si stocarea oxigenului molecular la nivelul celulelor musculare sunt
deficiente si astfel celula functioneaza in anaerobioza, sau anaerobioza profunda.
In aceste conditii glucoza degradata glicolitic se transforma pana la acid lactic, glucoza provenind
atat din rezerve cat si din gluconeogeneza. Lactatul eliberat in conditii de anaerobioza se utilizeaza la
nivel hepatocitar in gluconeogeneza si astfel se asigura un minim de glucoza pe aceasta cale strict
necesara in special tesuturilor gluco-dependente.
Creatin-fosfatul ca forma facila de inmagazinare a energiei metabolice in aceasta stare sufera o
transformare chimica prin transferul gruparii fosfat pe ADP in vederea obtinerii ATP care se utilizeaza ca
atare in scopul obtinerii energiei de miscare.
Adaptarea metabolica in efort mediu si lung (maraton)
In maraton organismul uman sufera procese fizice de natura medie ca intensitate si timp
indelungat, contractiile musculare sunt relativ lente, mioglobina asigura necesarul celular de oxigen
molecular si astfel organismul functioneaza in aerobioza. In acest proces organismul uman consuma
preferential glucoza rezultata prin glicogenoliza, consuma acizii grasi rezultati la lipoliza in cantitati mai
mari decat in conditii normale si din aceasta cauza se declanseaza procesul de cetogeneza care asigura
corpi cetonici necesari consumului energetic.
Sub impulsul cortizolului se produce o proteoliza limitata si in faza incipienta si astfel o parte din
proteina musculara se transforma in amino-acizi si se asigura in acest mod alanina necesara in gluco-
neogeneza.
Pentru organismele antrenate aceste procese se modifica substantial in sensul ca energia
metabolica este asigurata prin arderea preferentiala, nu a glucidelor, ci a lipidelor rezultate in urma
lipolizei, glicoliza este in acest mod diminuata si are un aport minim energetic la nivelul organismului,
rezervele de glicogen sunt mentinute relativ constante in asa fel incat la sprintul final acestea sa se
consume prioritar in detrimentul lipolizei si beta-oxidarii.
In organismele antrenate
Nu se declanseaza procesul de ceto-geneza hepatica.
Lucian Bagu 2013
32 | P a g i n a
Speciile reactive ale oxigenului ROS
Sunt derivate de la Oxigenul molecular si sunt prezente preponderent la nivelul organelor
aerobe. In conditii normale oxigenul molecular face parte din majoritatea compusilor de natura organica
din organismele vii sub forma incarcata cu 2 sarcini negative si mai putin alte stari de oxidare sau de
excitare.
Molecula de oxigen este slab reactiva in raport cu compusii prezenti in organismele vii, chiar
daca structural acesta adopta o forma triplet cuantica in care sunt prezenti 2 electroni liberi (structura
biradicalica).
Asemanator cu molecula de oxigen, in natura se intalneste si atomul de oxigen care prezinta tot
structura biradicalica in care dintre cei 6 electroni de pe ultimul nivel electronic, 2 se gasesc necuplati.
Aceasta specie atomica insa datorita reactivitatii foarte mari prezinta un timp de viata limitat, deoarece
tinde sa se stabilizeze rapid pe seama altor compusi din mediu.
Transformarea oxigenului molecular in specii ROS, necesita reducerea prin intermediul captarii
electronilor din mediu, din aceasta cauza cantitatile cele mai mari de ROS se sintetizeaza la nivelul
catenelor respiratorii celulare. Trecerea de la oxigenul molecular la ROS se face etapizat deoarece
pentru obtinerea formei stabile O2- oxigenul molecular necesita acceptarea unui nr de 4 electroni in
cascada.
Speciile intermediare derivate ale oxigenului molecular, in trecerea spre starea stabila prezinta
reactivitate in raport cu alte molecule din mediu datorita electronilor neinperecheati prezenti pe
orbitalele moleculare.
Moleculele din mediu cu stabilitatea termondinamica, in urma interactiei cu ROS se transforma
in radicali molecule sau macromolecule care la randul lor sunt instabile si tind sa se stabilizeze prin
generarea altor reactivi la nivelul altor molecule, dezvoltand astfel un sistem in cascada de constituire a
unui numar mare si variat de specii reactive.
La nivelul organismelor vii aerobe speciile reactive pot avea un rol benefic limitat la fagocitoza si
respectiv rol daunator datorita implicarii acestora in dezvoltarea unor patologii. Speciile ROS la nivelul
organismului uman apar in urma metabolismului normal in special la nivelul celulelor in urma proceselor
prin care sunt elaborate specii moleculare de tipul peroxidului de H, care face parte integranta din
speciile ROS, care are rol toxic la nivelul organismului si a carui concentratie in timp trebuie riguros
controlata, prin intermediul unor specii de natura enzimatica sau neenzimatica.
Alaturi de reactiile normale din metabolism care pot induce biosinteza ROS prezenta in mediu a
anumitor generatori de ROS poate sa induca dezvoltarea in mod accelerat a biosintezei ROS care ulterior
pot fi implicate in dezvoltarea unor procese patologice (radiatiile UV sau ionizante, agenti poluanti,
hidrocarburi aromatice policiclice, nanoparticole suspendate si medicamentele).
Toti acesti factori implicati in generarea ROS au rolul de a genera sau de a transfera electroni
relativ usor si astfel in prezenta electronilor eliberati, oxigenul molecular poate fi transformat in ROS.
Speciile ROS sunt generate in organismul iman la nivelul leucocitelor, granulocitelor,
microzomilor, polimorfonuclearelor, mitocondriilor si cloroplastelor. La nivelul mitocondriei este
generata cantitatea cea mai mare de specii ROS deoarece la nivelul membranei interne mitocondrile se
Lucian Bagu 2013
33 | P a g i n a
gaseste catena respiratorie celulara la nivelul careia se realizeaza transferul electronic de la
nicotinamidele sau flavinele reduse catre oxigenul molecular in vederea obtinerii energiei metabolice.
Simultan cu obtinerea energiei metabolice prin fosforilare oxidativa aproximativ 2% din
cantitatea totala de oxigen necesara este implicata in generarea ROS, astfel ca intre elaborarea energiei
metabolice si elaborarea speciilor ROS exista o relativa dependenta.
In raport cu speciile ROS la nivelul organismului uman se intalnesc specii antioxidante care au
rolul de a echilibra nivelul de generare al ROS si respectiv procesele inflamatorii prin detoxifiere in
raport cu ROS se intelege distrugerea acestor specii in asa fel incat dezvoltarea proceselor patologice sa
fie stopata. Detoxifierea in raport cu ROS prezinta importanta capitala la nivel celular deoarece ROS pot
pune in discutie supravietuirea celulei.
In organismul uman in afara proceselor mitocondriale unde se dezvolta ROS exista si unele
procese metabolice normale in urma carora se pot elabora fie una fie mai multe specii ROS. Cea mai
cunoscuta reactie metabolica in acest sens este transformarea xantinei sau a hipoxantinei in acidul uric
prin care se pune in libertate anionul radical superoxid care datorita instabilitatii se transforma in
prezenta peroxidazelor si a altor factori celulari in peroxid de H, compus mai putin toxic.
In catena respiratorie intervin speciile enzimatice care au rolul de a facilita transferul electronic
de la CoE reduse catre oxigenul molecular. Prin cresterea concentratiei protonului la nivel
intermembranar (proton provenit din CoE reduse) se obtine o crestere a procesului de elaborare a ROS
datorita intensificarii transferului de electroni prin intermediul enzimelor catenei respiratorii.
Aceste fenomene sunt dependente de factorul energetic celular (cresterea concentratiei ADP,
respectiv scaderea concentratiei ATP). Se cunosc numeroase specii reactive derivate ale oxigenului
molecular:
1.anionul radical O2 superoxid
2.radicalul hidroxil OH
3.radicalul hidroperoxil H-O-O
4.radicalul alcooxil R-O
5.Radical peroxil R-O-O
Masura reactivitatii speciilor reactive este timpul de injumatatire (timpul de viata) care cu cat
este mai mic cu atat specia este mai reactiva, din acest punct de vedere radicalul hidroxil prezinta timpul
de viata cel mai scurt si respectiv reactivitatea cea mai mare. Daca pentru majoritatea ROS exista la
nivelul organismului uman specii antioxidante capabile sa anihileze activitatea acestora, in raport cu
radicalul hidroxil nu exista nicio specie enzimatica capabila sa il anihileze.
Cele mai eficiente sisteme antioxidante in raport cu ROS sunt de natura enzimatica
(superoxiddismutaza, catalaza, peroxidaza). Formarea radicalului hidroxil se poate realiza fie in prezenta
altor specii reactive, fie in absenta acestora prin reactii specifice (reactiva fenton), in care peroxidul de
hidrogen in prezenta metalelor divalente se transforma rapid si eficient in radical hidroxil. Avand in
vedere faptul ca ionul feros se gaseste in concentratii mari, fie sub forma libera (lichide biologice) fie sub
Lucian Bagu 2013
34 | P a g i n a
forma legata in special la nivelul metaloenzimelor, iar peroxidul de H se gaseste in conditii normale atat
la nivel celular cat si la nivelul lichidelor biologice, aceasta reactie se poate produce relativ usor.
Alta reactie este reactia Haber-Weiss – in care peroxidul de H reactioneaza cu radicalul
superoxid in vederea eliberarii radicalului hidroxil. Ca si in cazul anterior ambii reactanti sunt prezenti in
conditii normale in organismul uman, si astfel aceasta reactie se poate produce relativ usor.
Acidul hipocloros in prezenta radicalului anion superoxid genereaza deasemenea radicali
hidroxil, acidul hipocloros se gaseste deasemenea la nivelul celular prin interventia mieloperoxidazei si
prin prezenta Cl-.
Monoxidul de N ca specie reactiva derivata a oxigenului in prezenta radicalului anion superoxid
constituie in prima faza peroxinitritul care datorita tensionilor intramoleculare mari se transforma rapid
in 2 specii radicalice foarte reactive, radicalul hidroxil si radicalul nitro-dioxidul de N.
Radicalul superoxid-anion prezinta actiune oxidanta in raport cu unele specii moleculare
prezente in organismele vii: ascorbati, tioli, catecolamine.
Actiunea oxidanta – actiunea radicalului anion-superoxid asupra unor sisteme enzimatice induce
modificarea substantiala a unor procese metabolice normale. Datorita faptului ca prezinta actiune
oxidanta in raport cu ionii metalelor din metaloenzime, aceste specii enzimatice sunt afectate in primul
rand prin scaderea activitatii lor si diminuarea efectului catalitic.
Toate enzimele implicate in catena respiratorie cat si aconitaza prezenta in TCA sunt
metaloenzime asupra carora anionul radical superoxid actioneaza. In genere ionii metalici divalenti
chelatizati la nivelul metalo-enzimei sunt eliminati din sistemele respective si ulterior supusi unui proces
de oxidare, in urma caruia structura se modifica, modificandu-se simultan si capacitatea de interactie cu
protein-enzima in vederea desfasurarii procesului catalitic.
Cel mai cunoscut exemplu este intalnit in cazul aconitazei care este o Fier-enzima si care
catalizeaza transformarea acidului ciclic in acid izociclic in procesul TCA. Prin eliminarea Fe divalent din
fier-enzima acesta in prezenta acidului ciclic este oxidat la fier 2+, la ion feric si astfel procesul TCA in
intregime este diminuat si simultan cu acesta transformarea ionului Feros in ion feric diminueaza
desfasurarea reactiei Fenton prin diminuarea concentratiei ionului Feros, transformat in ion feric.
Alaturi de xantin-oxidaza care este implicata in elaborarea celor mai mari cantitati de radicali
anion-superoxid lipooxigenaza si ciclooxigenaza prezente in metabolismul acidului arahidonic participa
la alaborarea acestei specii reactive.
In raport cu radicalul anion-superoxid la nivelul celulelor si lichidelor biologice exista un sistem
antioxidant eficient bazat pe super-oxid dismutaze care in urma unei reactii de dismutare il transforma
in peroxid de H (specie mai putin reactiva) si O moleculare, care daca se elaboreaza la nivel celular poate
fi utilizat in scopuri proprii celulei.
Concentratia celulara a anionului radical superoxid poate fi diminuata si prin interventia sa in
elaborarea altor specii radicalice.
Radicalul Hidroxil – este cel mai reactiv dintre ROS si are capacitatea sa genereze dezvoltarea
unor lanturi in cascada de reactii in urma carora se genereaza alte specii radicalice. De regula radicalul
Lucian Bagu 2013
35 | P a g i n a
hidroxil intervine la nivelul moleculelor prin substituirea atomului de H prezent in diverse pozitii la
nivelul moleculelor sau macromoleculelor. Atacul predilect al radicalului hidroxil se indreapta catre acizii
grasi polinesaturati si respectiv acizi nucleici.
Daca prin interventia la nivelul PUFA sunt implicate lipidele membranare celulare, la nivelul
acizilor nucleici procesele determina transformarea unor resturi nucleotidice in alte resturi cu aparitia
mutatiilor genetice care induc dezvoltarea unor stari patologice deosebit de periculoase pentru speciile
vii.
La nivelul acizilor grasi polinesaturati de regula este substituit atomul de H prezent in pozitia
alilica. Odata constituit radicalul derivat al acidului acesta prin izomerizare se poate transforma in alte
specii radicalice si in final acestea pot actiona asupra oxigenului molecular in sistem autocatalitic cand se
obtin radicalii peroxil, hidroperoxil si respectiv hidroxil, toti cu implicatii in dezvoltarea altor procese de
degenerescenta moleculara.
Prin aceste procese in care intervine radicalul Hidroxil sunt afectate atat particulele LDL care
sunt implicate la randul lor in dezvoltarea aterosclerozelor cat si membranele celulare. Alaturi de
radicalii care pot fi generati prin interventia radicalului hidroxil la nivelul PUFA, pot sa apara in mediile
celulare numerosi alti compusi care sunt implicati in dezvoltarea unor procese patologice.
Epoxizii sau hidroxiacizii – sunt compusi puternic tensionati datorita diferentei dintre unghiurile
de valenta specifice atomului de O care in ciclurile triatomice se diferentiaza radical de valorile teoretice,
aceste tensiuni intramoleculare determina ruperea de regula homolitica a legaturilor covalente cu
formarea unor specii radicalice reactive.
Peroxidul de H – este singura specie moleculara care nu prezinta electroni nepereche in raport
cu toate celelalte specii ROS, din aceasta cauza peroxidul de H prezinta reactivitate diminuata in raport
cu alte specii moleculare. Principala reactie prin care se obtine peroxidul de H este pornind de la
radicalul anion superoxid care prin dismutare in prezenta SOD se transforma in acesta specie.
Chiar daca este slab reactiv organismul uman poseda atat la nivel celular cat si la nivelul
lichidelor biologice, sisteme antioxidante capabile sa mentina concentratia acestei specii reactive in
echilibru. Peroxidaza transforma peroxidul de H in apa in prezenta electronilor si a protonilor iar catalaza
transforma peroxidul de H in apa si O2 care deasemenea la nivelul celular poate fi utilizat in scopuri
proprii.
In conditii normal peroxidul de hidrogen se biosintetizeaza la nivelul peroxizomilor si reticulului
endoplasmatic si la nivelul celulelor sau lichidelor biologice, peroxidul de H isi manifesta actiunea
peroxidanta prin actiunea la nivelul gruparilor tiol prezente la nivelul proteinelor functionale, enzimelor
sau glutationului.
Efectul oxidant predominant al peroxidului de H se manifesta in raport cu glutationul care se
gaseste in concentratii mult mai mari decat ale proteinelor functionale sau ale enzimelor pe care il
transforma din forma redusa (activa) intr-o forma oxidata (inactiva).
Radicalul monoxid de N – este o specie reactiva derivata de la atomiul de N care se
biosintetizeaza la nivel celular din arginina in prezenta oxigenului molecular si a arginin-monoxid de N
sintetazei NADP dependenta.
Lucian Bagu 2013
36 | P a g i n a
Functia de baza a monoxidului de N se refera la inducerea relaxarii celulelor musculare netede
din peretii vasculari si la nivelul sistemului nervos unde actioneaza fie ca mesager secund, fie ca
modulator sau neuro-mediator. Monoxidul de N ca specie reactiva datorita prezentei unui electrod
nepereche se transforma in prezenta radicalului anion peroxid in peroxinitrit care datorita instabilitatii
moleculare se transforma rapid in 2 specii radicalice deosebit de reactive: radicalul OH si radicalul bioxid
de N.
Peroxinitritii rezultati datorita reactivitatii lor pot interactiona si ca atare cu alte specii
moleculare cu formarea unor derivati in care sarcina electrica negativa a acestora creste, crescand in
acest mod si incidenta dezvoltarii unor procese patologice (aterosclerozele).
Monoxidul de azot este implicat in inactivarea unor sisteme enzimatice printre care se intalnesc
in special metalo-enzimele, atat cele prezente in catena respiratorie cat si cele prezente in TCA, efectul
fiind diminuarea ambelor procese. Sunt implicate in diminuarea potentialului membranar mitocondrial
si in controlul functiei mitocondriale. Alaturi de factorul TNF este implicat in distrugerea celulelor
tumorale.
Anionul hipocloros – (ClO-) – se obtine ca acid hipocloros in urma actiunii mielo-peroxidazei
asupra anionului clorura in prezenta peroxidului de H. Acidul hipocloros este un agent foarte puternic
oxidant la nivel celular si in prezenta peroxidului de H este capabil sa smulga un atom de H si astfel sa fie
generat radicalul hidroperoxid care prezinta reactivitate asemanatoare cu cea a radicalului hidroxil.
Prin cresterea concentratiei mielo-peroxidazei la nivelul celulelor sau lichidelor biologice se
elaboreaza concentratii mari de anion hipocloros care este implicat in dezvoltarea unor boli
coronariene.
Stresul oxidativ
-reprezinta totalitatea metabolitilor acumulati la nivelul tesuturilor si lichidelor biologice datorate
cresterii concentratiei speciilor reactive. Cresterea concentratiei ROS este intotdeauna dezechilibrului de
la nivelul organismului intre sistemele antioxidante si capacitatea biosintetica a speciilor ROS.
Stresul oxidativ este implicat in numeroase procese metabolice de la nivelul celular, subcelular
sau al lichidelor extracelulare.
Sistemele antioxidante – au rolul fundamental in diminuarea efectelor induse de ROS, rolul
principal al antioxidantilor fiind transformarea ROS in produsi slabi reactivi sau nereactivi. Pentru ca un
sistem sa functioneze ca sistem antioxidant este necesar ca acesta sa se gaseasca in apropierea locului
de biosinteza al ROS pentru ca in conditii de distanta ar necesita timp pentru deplasare in vederea
anihilarii ROS, insa ROS prezinta timp de viata si de actiune foarte mici si astfel ar avea posibilitatea in
aceste conditii sa actioneze negativ.
Sistemele antioxidante pentru cresterea eficientei lor in raport cu ROS functioneaza de regula
sinergic, interconectandu-se reciproc in vederea regenerarii lor dar si pentru actiunea lor fata de
sistemele ROS.
Lucian Bagu 2013
37 | P a g i n a
Sunt cunoscute 2 mari clase de sisteme antioxidante: enzimatice – specifice, si cele cu actiune
nespecifica, de dimensiuni mici si nu au calitati enzimatice.
Sistemele de aparare enzimatice
Superoxidazele: - enzime alosterice de tip metaloenzime in care unul sau mai multe specii
metalice (cationi) sunt legate prin intermediul legaturilor coordinative la nivelul proteinenzimei
(chelatizare). La procesul de chelatizare intervin de regula atomii de N prezenti in resturile imidazolice
din lanturile polipeptidice.
Pot fi chelatizate: Cu, Zn, Mn, Fe la nivelul superoxiddismutazelor, preferabil in stare de oxidare
2+ si din aceasta cauza mecanismul de actiune enzimatic se realizeaza pe baza schimbului electronic
(elementele metalice fiind tranzitionale si cu stari de oxidare multiple). Substituirea unui cation divalent
din macromolecula proteinenzimei conduce inevitabil la inactivarea acesteia si respectiv la diminuarea
proceselor catalizate.
CuZn-SOD este o enzima specifica lichidelor extracelulare si respectiv la nivelul hematiilor fiind
prezenta doar citoplasmatic. Enzima este alosterica si prezinta 2 subunitati identice cu masa moleculara
totala de app 230kD, iar capacitatea de chelatizare este de cate 2 cationi de Cu respectiv de Zn pentru
fiecare macromolecula enzimatica.
Daca cationii de Cu sunt implicati in mecanismul de transferare a electronilor la nivelul reactiei
catalizate (Cu2+ -> Cu1+), Zn neavand mai multe stari de oxidare are rolul de a stabiliza sistemul enzimatic.
MnSOD este deasemenea o enzima alosterica in care cationul Mn se gaseste in mai multe stari
de oxidare (2+, 4+, 5+, 7+) si astfel este implicat direct in procesul de transfer electronic din reactiile
catalizate. Se gaseste preferential la nivelul mitocondriilor unde se elibereaza o mare cantitate de specii
ROS si care asigura echilibrul la acest nivel, absenta acestei enzime de la nivelul mitocondriilor fiind
incompatibila cu viata.
Prin prezenta Mn in forma chelata la nivelul acestei enzime cianurile pot actiona ca inhibitori
datorita scoaterii cationului din complexele chelate si astfel proteinenzima SOD ramasa nu mai poate fi
implicata in schimbul electronic. Deoarece peroxidul de H este produsul reactiei catalizate acesta
actioneaza prin feedback negativ asupra enzimei si din aceasta cauza catalaza actioneaza ca activator al
mangan-SOD deoarece peroxidul de H rezultat este consumat rapid si eficient de catalaza, si astfel
capacitatea de inhibitie scade.
La nivel celular de regula intre cele 2 specii enzimatice se realizeaza o actiune concertata
deoarece produsul de reactie al Mn-SOD devine substratul catalazei.
Catalaza – ca si MnSOD, catalaza se gaseste in toate celulele aerobe, preferential la nivelul
peroxizomilor unde transforma excedentul de peroxid de H in apa, diminuand astfel stresul oxidativ,
deasemenea catalaza se mai intalneste si la nivelul citoplasmei eritrocitare unde este implicata din
diminuarea stresului oxidativ.
Lucian Bagu 2013
38 | P a g i n a
Ea este o enzima alosterica care poseda 4 protomeri, cu masa moleculara de ~250kD, pentru
efectuarea catalizei, catalaza necesita prezenta unor donori de protoni si de electroni si a unui substrat
(CoSubstrat) la nivelul caruia sa fie transferati echivalentii de reducere.
Peroxidazele – hemoproteine cu masa moleculara de aproximativ 40kDa si ele constituie un
ansamblu de 7 izoenzime datorita protomerilor constituienti. Dintre toate enzimele cu actiune la nivelul
sistemelor antioxidante, peroxidazele prezinta cea mai mare stabilitatea in timp si actioneaza ca si
catalaza asupra peroxidului de H insa nu realizeaza un proces de dismutare, ci un proces de
transformare a acestuia in apa.
Dintre peroxidaze se remarca glutatio-peroxidazele care necesita in vederea preluarii fluxului de
e- si de protoni prezenta glutationului care este in acest fel transformat din forma redusa in forma
oxidata in prezenta hidroperoxizilor care sunt redusi.
Glutatio-peroxidazele sunt selenium-enzime in care cationul de selenium este chelatizat prin
intermediul resturilor de cisteina din lanturile de proteinenzime. Ca si MnSOD se gaseste in toate
celulele aerobe dar si la nivelul unor lichide biologice.
Seleniul chelatizat din glutation-peroxidaze poate fi preluat de cianuri in acelasi mod ca si Mn
din MnSOD si astfel cianurile actioneaza ca inhibitori ai glutationperoxidazelor.
Glutationul – este un peptid (dipeptid) care la nivelul organismului uman se biosintetizeaza
dupa necesitati si nu conform codului genetic cum se sintetizeaza tot restul peptidelor sau
polipeptidelor. Se gaseste preferential la nivel pulmonar si la nivelul tegumentelor la concentratii foarte
mari comparativ cu alte componente care pot atinge 10mmol.
Specii antioxidante - taurina – etil-amina sulfonata, se utilizeaza in cea mai mare cantitate la
nivelul organismului uman in biosinteza sarurilor biliare si in cantitati reduse ca specie antioxidanta cu
rol anihilant al anionului hipocloros cu care formeaza un Clor-derivat cu actiune oxidanta limitata. In
acest mod prin intermediul taurinei este inhibata formarea oxizilor derivati de la N si respectiv a
compusilor reactivi ai N.
Tocoferolii – se gasesc la nivelul lichidelor biologice si sunt implicati in numeroase procese
antioxidante ca atare sau in cuplaj cu alte sisteme antioxidante, in special cu Vitamina C si A si acidul
lipoic.
Vitamina C -
top related