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Universidade Federal do Rio de Janeiro
BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:
MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO
Felipe Gomes Naveca
2006
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II
BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:
MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO
Felipe Gomes Naveca
Tese de doutorado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências (Microbiologia),
Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes
(IMPPG), da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências
(Microbiologia).
Orientadora: Vera de Souza Gouvêa
Rio de Janeiro Agosto de 2006
III
Naveca, Felipe Gomes.
Bases moleculares da atenuação viral: modelo reovírus aviário/ Felipe Gomes Naveca. Rio de Janeiro: UFRJ / IMPPG, 2006.
xii, 142f. Orientadora: Vera de Souza Gouvêa. Tese (doutorado) – UFRJ / IMPPG / Programa de Pós-Graduação em
Ciências (Microbiologia), 2006. Referências Bibliográficas: f. 130-142. 1. reovírus aviário. 2. análise de seqüências. 3. bioinformática. 4.
patogênese. 5. atenuação. 6. proteína recombinante. I. Gouvêa, Vera. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia). III. Título.
IV
RESUMO
BASES MOLECULARES DA ATENUAÇÃO VIRAL:
MODELO REOVÍRUS AVIÁRIO
Felipe Gomes Naveca
Orientadora: Vera de Souza Gouvêa
Resumo da tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes (IMPPG), da
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários
à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Os reovírus vem sendo utilizados há vários anos como modelo no estudo da patogênese viral em infecções naturais e experimentais. Muito progresso foi alcançado no estudo de amostras de reovírus isolados de mamíferos, entretanto não foi possível estabelecer um quadro clínico como característica da infecção por esse grupo de reovírus. Por outro lado, os reovírus aviários são importantes patógenos, que podem levar a perdas consideráveis na avicultura. A principal doença relacionada à infecção pelos reovírus aviários é a artrite/tenosinovite. Nosso modelo de estudo consistiu de duas amostras de reovírus aviários: S1133wt, uma amostra artrogênica isolada nos anos 70 nos EUA e P100, uma amostra vacinal atenuada derivada de S1133wt. Reportamos as seqüências completas de cinco dos dez segmentos de dsRNA que compõem cada genoma viral, caracterizando as diferenças entre as amostras, tanto ao nível de ácido nucléico quanto das seqüências protéicas deduzidas. As principais diferenças foram encontradas nas seqüências das proteínas σC, onde uma substituição de aminoácido, T106R, cria um ambiente favorável para formação de uma ponte salina entre Asp102 e Arg106. Para proteína µB foi criado um modelo tridimensional onde ficou demonstrado que três das substituições de aminoácidos estão localizadas na região responsável pela interação com a célula hospedeira durante a penetração da membrana plasmática. A segunda parte desta tese foi a expressão da proteína, de função desconhecida, p17 em E. Coli. As diferenças entre as amostras patogênica e vacinal observadas nesse estudo, certamente contribuirão para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na patogênese e atenuação de amostras virais.
Palavras Chaves: reovírus aviário; análise de seqüências; bioinformática; patogênese; atenuação; proteína recombinante.
Rio de Janeiro
Agosto de 2006
V
ABSTRACT
MOLECULAR BASIS OF VIRAL ATTENUATION:
THE AVIAN REOVIRUS MODEL
Felipe Gomes Naveca
Orientadora: Vera de Souza Gouvêa
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em
Ciências, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes (IMPPG), da
Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários
à obtenção do título de Doutor em Ciências (Microbiologia).
Reoviruses have long been used as a model to study viral pathogenesis in natural and experimental infections. A great deal of progress was achieved by studying mammalian reoviruses, but definitive association with a specific disease could not be established. On the other hand, avian reoviruses are important pathogens of poultry, which may lead to economic losses. The principal disease related to avian reovirus infection is viral arthritis, otherwise known as tenosynovitis, characterized by an intense inflammatory response in the hock joints and flexor tendons. Our study model consisted of two avian reoviruses: S1133wt, an arthrogenic strain isolated in 70´s in USA and P100, an attenuated vaccine strain derived from S1133wt. We report the complete sequences of five dsRNA segments of each virus genome, characterizing differences between the two strains at the nucleic acid and deduced protein levels. Major differences were found on σC, the virus spike, in which a residue substitution, T106R in P100, creates the environment of a predicted salt bridge between Asp102 and Arg106, and on µB protein, in which three important differences were located on 3D model at domain IV, responsible for interaction with the plasmatic membrane during infection. The second part of this thesis was the expression of p17 in E. Coli., an avian reovirus protein of yet unknown function. Differences between pathogenic and attenuated strains demonstrated in this study should contribute to a better understanding of the mechanisms involved in pathogenesis and attenuation of viral strains.
Keywords: avian reovirus; sequence analysis; bioinformatics; pathogenesis;
attenuation; recombinant protein.
Rio de Janeiro
Agosto de 2006
VI
Dedico esta Tese à minha família:
Minha mulher Vivianne,
Meu irmão Fábio e meus pais Vanda e Felipe.
Em especial aos meus incansáveis e queridos avós Tereza e Zildo,
Meu muito obrigado.
Aos meus saudosos avós Maria e João, In memorian.
VII
Agradecimentos
Ao final desta tese gostaria de expressar meus agradecimentos a todos aqueles que
de uma maneira ou de outra contribuíram para a sua realização.
Agradeço a Deus pela vida e pela saúde afim de que eu pudesse realizar esse
trabalho;
Agradeço a Professora Vera de Souza Gouvêa, minha orientadora, por ter
confiado em mim e ter me dado condições de desenvolver meu trabalho;
Agradeço a minha mulher Vivianne o carinho e a compreensão durante o
desenvolvimento desta tese;
Agradeço aos meus avós Teresa e Zildo pela dedicação demonstrada durante toda
minha vida estudantil;
Agradeço a meus pais Felipe e Vanda e a meu irmão Fábio pelas palavras de
incentivo em todos os momentos;
Agradeço a meus amigos e amigas do Laboratório de Virologia Molecular e
Tropical pelo convívio agradável e a ajuda no desenvolver dessa tese;
Agradeço a Professora Viviana Malirat e ao amigo José Barros pela ajuda com a
análise das seqüências obtidas nesta tese;
Agradeço ao professor José Nelson Couceiro do Laboratório de Virologia
Molecular I e aos professores Maria Isabel Liberto e Maulorí Curie Cabral do
Laboratório de Estruturas de Superfície e Interferon pela utilização da infra-estrutura
de seus laboratórios durante o desenvolvimento dessa tese;
Agradeço a todos os meus amigos do Departamento de Virologia, em especial a
amiga Marleide, por sempre estarem dispostos a colaborar;
Agradeço as minhas ex-orientadoras professoras Maria Genoveva Von Hubinger e
Iná Pires de Carvalho pela contribuição na minha formação acadêmica;
Agradeço ao Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, na pessoa de sua
diretora professora Ângela Hampshire;
Agradeço a Pós-graduação do Instituto de Microbiologia, na pessoa de sua
coordenadora à época de minha entrada no doutorado, professora Leila Fonseca;
Agradeço a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela bolsa de doutorado;
Agradeço a todos aqueles que se interessarem em consultar esta obra.
VIII
Sumário
1. Introdução 13 1.1 Histórico 13
1.2 Família Reoviridae 14
1.3 Gênero Orthoreovirus 14
1.3.1 Genoma 15
1.3.1.1 Genoma segmentado 15
1.3.1.2 Seqüências não traduzidas 18
1.3.2 Mutantes 19
1.3.3 Partículas virais e sub-virais 20
1.3.4 Proteínas Estruturais 22
1.3.5 Proteínas não estruturais 28
1.3.6 Replicação dos reovírus 29
1.3.6.1 Entrada dos reovírus nas células hospedeiras 30
1.3.6.2 A proteína de ligação à célula: σ1 31
1.3.6.3 Interações de μ1/μ1C com a membrana celular durante a penetração 32
1.4 Patogênese na infecção experimental 34
1.4.1 Infecção experimental em mamíferos 34
1.4.2 Reovírus aviários 36
1.4.2.1 Diagnóstico 41
1.4.2.2 Proteínas codificas pelos reovírus aviários 41
1.4.2.3 Prevenção e controle da infecção pelos reovírus aviários 44
2. Objetivos 47
3. Material e métodos 48 3.1 Amostras virais 48
3.1.2 Extração de dsRNA 49
3.1.3 Desenho dos iniciadores para o segmento S1 49
3.1.4 RT-PCR para o segmento genômico S1 50
3.1.5 Seqüenciamento do segmento genômico S1 51
3.1.6 Desenho dos iniciadores para os segmentos genômicos da classe M e S2 54
3.1.7 RT-PCR para os segmentos genômicos da classe M e S2 55
3.1.8 Amplificação por PCR dos segmentos genômicos classe M 56
3.1.9 Amplificação por PCR do segmento genômico S2 57
IX
3.1.10 Semi-nested PCR para segmentos da classe M e S2 58
3.1.11 Seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e S2 60
3.1.12 Ferramentas de bioinformática utilizadas na análise das seqüências 64
3.2 Clonagem e expressão da proteína p17 68
3.2.1 Desenho dos iniciadores 68
3.2.2 Amplificação por PCR da ORF-p17 68
3.2.3 Purificação do amplicon ORF-p17 69
3.2.4 Clonagem da ORF-p17 no vetor pCR T7 / NT-TOPO 69
3.2.5 Transformação de células competentes TOP10F´ 69
3.2.6 Análise dos transformantes por PCR 70
3.2.7 Análise dos transformantes por seqüenciamento 70
3.2.8 Estocagem do clone com o plasmídeo TOPO-p17 71
3.2.9 Transformação de células BL21(DE3)pLysS 71
3.2.10 Indução da expressão da proteína p17 72
3.2.11 Análise da expressão da proteína His-p17 por SDS-PAGE 73
3.2.12 Confirmação da expressão de His-p17 por western blotting 74
4. Resultados 76 4.1. Seqüenciamento e análise dos segmentos genômicos M1, M2, M3, S1 e S2. 76
4.1.1 Desenho dos iniciadores para os segmentos M1, M2, M3, S1 e S2. 76
4.1.2 Transcrição reversa e amplificação das seqüências de cDNA por PCR 77
4.1.3 Comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2 77
4.1.4 Análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA 84
4.1.5 Análise da seqüência das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA 93
4.1.6 Alinhamento da região N-terminal de σC 102
4.1.7 Análise da hidrofobicidade da região N-terminal de σC 104
4.1.8 Modelagem por homologia da proteína µB 105
4.2 Expressão de p17 em sistema heterólogo 108
4.2.1 Amplificação e clonagem da ORF2 do segmento S1 de S1133wt 108
4.2.2 Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17 108
4.2.3 Comprovação da expressão de His-p17 por SDS-PAGE e western-blotting 109
5. Discussão 111
6. Conclusões 127
7. Bibliografia 129
X
Índice de Figuras
Figura 1. Representação esquemática da partícula de reovírus. 22 Figura 2. Reconstrução 3D da secção central do vírion de ARV (amostra 138). 44 Figura 3. Estratégia de seqüenciamento do segmento S1. 52 Figura 4. Estratégia de semi-nested PCR para os segmentos da classe M e S2. 59 Figura 5. Estratégias de seqüenciamento para os segmentos da classe M e S2. 62 Figura 6. Árvore filogenética de µA. 85 Figura 7. Árvore filogenética de µB. 86 Figura 8. Árvore filogenética de µNS. 87 Figura 9. Árvore filogenética de p10. 88 Figura 10. Árvore filogenética de p17. 89 Figura 11. Árvore filogenética de σC. 91 Figura 12. Árvore filogenética de σA. 92 Figura 13. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de S1133wt. 96 Figura 14. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de P100. 96 Figura 15. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de S1133wt. 97 Figura 16. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de P100. 97 Figura 17. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de S1133wt. 98 Figura 18. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de P100. 98 Figura 19. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de S1133wt. 99 Figura 20. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de P100. 99 Figura 21. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de S1133wt. 99 Figura 22. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de P100. 99 Figura 23. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de S1133wt. 100 Figura 24. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de P100. 100 Figura 25. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de S1133wt. 101 Figura 26. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de P100. 101 Figura 27. Alinhamento N-Terminal das seqüências de σC, entre 35 amostras. 103 Figura 28. Gráfico de hidrofobicidade da região N-terminal de σC. 104 Figura 29. Alinhamento estrutural de µB versus µ1. 105 Figura 30 (A). Modelo 3-D da Proteína µB de P100. 106 Figura 30 (B). Modelo 3-D da Proteína µB de P100. 107 Figura 31. Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17. 109 Figura 32. SDS-PAGE proteína His-p17. 110 Figura 33. Western-blotting proteína His-p17. 110
XI
Índice de Tabelas
Tabela 1. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus de mamíferos (T3D*). 17 Tabela 2. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus aviários. 43 Tabela 3. Iniciadores desenhados para esta tese. 63 Tabela 4A. Números de acesso no GenBank para as seqüências das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17 e σA utilizadas nas análises. 66 Tabela 4B. Números de acesso no GenBank para as seqüências da proteína σC utilizadas nas análises. 67 Tabela 5. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M1. 78 Tabela 6. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M2. 80 Tabela 7. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M3. 81 Tabela 8. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S1. 82 Tabela 9. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S2. 83 Tabela 10. Resultados da Ferramenta ProtParam. 93
XII
Abreviaturas utilizadas
μg Micrograma μl Microlitro Å Angstron AA Aminoácidos ATPase Adenosina Trifosfatase BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato bp Pares de base cap 7-metil guanosina trifosfato cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar CEF Fibroblasto de embrião de galinha DMSO dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucléico dNTP Desoxirribonucleosídeo trifosfato dsRNA Ácido ribonucléico fita-dupla DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ELISA Ensaio imunoenzimático em fase sólida FAST Proteína transmembrana associada a fusão GITC Isotiocianato de guanidina HCA Análise de cluters hidrofóbicos IBDV Vírus da doença infecciosa da Bursa IFN Interferon IPTG Isopropil-β -D-thiogalactopiranosídeo ISVPs Partículas sub-virais infecciosas kDa Kilodaltons LB Meio Luria-Bertani MDa Mega Dalton mM Milimolar mRNA Ácido ribonucléico mensageiro NBT Nitro-azul tetrazolio nm Namômetro ORF Seqüência de leitura aberta PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida PCR Reação em cadeia da polimerase RdRp RNA polimerase RNA dependente RNA Ácido ribonucléico RPM Rotações por minuto RT Reação da transcriptase reversa RT-PCR Reação em cadeia da polimerase associada à transcrição reversa SCID Imunodeficiência combinada severa SDS Dodecil sulfato de sódio SPF Livre de patógeno específico TEMED N,N,N´,N´- tetrametiletilenodiamina ts Temperatura sensível UV Ultravioleta
13
1. Introdução
1.1 Histórico
Em 1959, Sabin propôs que um grupo de vírus previamente classificados como
membros do grupo 10 dos echovírus fossem re-classificados em uma nova família.
Como estes vírus eram tipicamente isolados do trato respiratório e gastrointestinal e
não estavam associados com nenhuma doença conhecida, ele propôs o nome reovírus
(respiratory, enteric, orphan viruses). No inicio dos anos 70 se descobriu um grande
grupo de vírus, denominados rotavírus. Devido à sua característica aparência na
microscopia eletrônica e ao seu genoma de RNA fita-dupla segmentado esses agentes
virais também foram introduzidos na família Reoviridae (Fields, 1996).
Os vírus de RNA fita-dupla são agrupados em 25 gêneros divididos em sete
famílias (Fauquet et al., 2005). Duas dessas famílias Reoviridae e Birnaviridae
infectam vertebrados e apenas os membros da família Reoviridae infectam mamíferos
(Nibert & Schiff, 2001).
Atualmente a família Reoviridae é constituída de doze gêneros: Orthoreovirus,
Orbivirus, Rotavirus, Coltivirus, Seadornavirus, Aquareovirus, Cypovirus,
Idnoreovirus, Fijivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus e Mycoreovirus (Fauquet et al.,
2005). Quatro desses gêneros, Orthoreovirus, Orbivirus, Rotavirus e Coltivirus
infectam humanos, enquanto que os outros foram encontrados em insetos, plantas,
peixes, répteis, aves, aracnídeos, crustáceos e fungos (Mertens, 2004).
14
1.2 Família Reoviridae
Os vírus de genoma de RNA fita-dupla (dsRNA) ilustram o potencial de
evolução, organização e replicação que os genomas podem adotar. Vários patógenos
humanos apresentam este tipo de organização do genoma, sendo os principais os
rotavírus e o vírus da febre do carrapato do Colorado.
Os estudos com a família Reoviridae contribuíram para vários conceitos
fundamentais nos campos da virologia e biologia molecular (Nibert & Schiff, 2001).
Através desses estudos foram obtidas algumas das primeiras descobertas envolvendo
a síntese de RNA in vitro, além da evidência da estrutura do cap 5´ nos RNA
mensageiros (mRNA) eucarióticos, a importância destes no processo de tradução
protéica e a evidenciação da existência de uma seqüência consenso para o início da
tradução dos mRNA eucarióticos (Kozak & Shatkin, 1978).
Estudos relacionados às bases da patogênese viral, como o papel de uma
molécula receptora para a ligação da partícula viral, são outros exemplos de
descobertas obtidas através do estudo de vírus de genoma dsRNA, em particular os
reovírus de mamíferos (Nibert & Schiff, 2001).
1.3 Gênero Orthoreovirus
Os protótipos do gênero Orthoreovirus são os reovírus de mamíferos. Dessa
forma a grande maioria das informações obtidas no estudo dos reovírus são baseadas
na homologia entre os diferentes sorotipos desses vírus.
Uma amostra isolada de uma criança sadia é o protótipo do reovírus tipo 1 (T1L
ou Lang); uma outra isolada de uma criança com diarréia é o protótipo do reovírus
15
tipo 2 (T2J ou Jones); os protótipos do tipo 3 foram isolados de uma criança com
diarréia (T3D ou Dearing) e de uma criança com doença respiratória (T3A ou Abney)
(Nibert & Schiff, 2001).
1.3.1 Genoma
A observação de que células infectadas com reovírus coram-se
ortocromaticamente com Laranja de Acridina levou à descoberta de que o RNA
genômico era constituído de moléculas de fita-dupla. Todas as propriedades físico-
químicas do vírion são consistentes com sua natureza de vírus de genoma em fita-
dupla: (I) sua alta temperatura de desnaturação; (II) sua densidade de 1,61g/cm3 em
gradiente de CsCl, a qual é menor do que aquela esperada para RNA fita-simples; (III)
sua relativa resistência a RNase I, e susceptibilidade a RNase III, a qual é específica
para RNA fita-dupla. Ademais, a composição do RNA indica uma razão purina :
pirimidina de 1, sugerindo que existem duas fitas complementares. Estudos de
difração de raios-X indicam que o RNA fita-dupla dos reovírus forma uma dupla
hélice, orientada à direita, com aproximadamente 10 pares de base por volta, e
nucleotídeos orientados em um ângulo de 75-80o em relação ao longo do eixo (Nibert
& Schiff, 2001).
1.3.1.1 Genoma segmentado
O RNA dos reovírus ocorre em segmentos lineares discretos. A eletroforese em
gel de poliacrilamida revelou que se tratavam de dez segmentos de RNA fita-dupla
(Shatkin, Sipe & Loh, 1968). Uma outra evidência de que os fragmentos não são
16
artificialmente gerados a partir de uma única molécula incluem as observações de
que: (I) existem vinte terminais 3` hidroxila livres em cada partícula de reovírus; (II)
cada segmento possui um cap na extremidade 5`da fita positiva.
Os segmentos de RNA fita-dupla são resistentes à digestão pela nuclease S1,
indicando que as fitas positivas e negativas são colineares e complementares. Os
segmentos são separados em três classes: grandes (large ou L), médios (medium ou
M) e pequenos (small ou S), apresentando-se com três, três e quatro segmentos em
cada classe, respectivamente (Shatkin, Sipe & Loh, 1968). Dessa forma a classe de
segmentos grandes tem como representantes os segmentos L1, L2 e L3, a classe de
tamanho médio engloba os segmentos M1, M2 e M3, e finalmente na classe dos
pequenos, os segmentos: S1, S2, S3 e S4 (Nibert & Schiff, 2001).
Nas preparações purificadas existem quantidades equimolares dos dez
segmentos (Joklik, 1998). Os segmentos homólogos de diferentes isolados, incluindo
os três protótipos dos reovírus de mamíferos, exibem mobilidade eletroforética
diferente em um mesmo gel. O fato dos reovírus possuírem genoma de RNA fita-
dupla segmentado tem uma importante conseqüência biológica: a alta capacidade de
gerar rearranjos moleculares ou reagrupamentos (reassortment) durante infecções
mistas (Nibert & Schiff, 2001).
As proteínas codificadas pelos dez segmentos também podem ser separadas por
eletroforese em diferentes géis de SDS-PAGE (McCrae & Joklik, 1978). Os dez
segmentos dos reovírus codificam onze proteínas para os protótipos de mamíferos
(λ1, λ2, λ3, μ1, μ2, μNS, σ1, σ1s, σ2, σNS, σ3) sendo oito estruturais e três não
estruturais que medeiam funções durante as etapas da replicação viral (Nibert &
Schiff, 2001) (Tabela 1).
17
Tabela 1. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus de mamíferos (T3D*).
Segmento
Tamanho
(bp) Proteína
Tamanho
(AA) Massa (kDa)
Localização
No de cópias
Vírion Propriedades
L1 3854 λ3 1267 142 Capsídeo interno 12 RNA polimerase RNA dependente (RdRp)
L2 3916 λ2 1290 145 Capsídeo externo 60 Guanililtransferase
L3 3896 λ1 1233 137 Capsídeo interno 120 Liga-se ao dsRNA
M1 2304 μ2 736 83 Capsídeo interno 12 Co-fator RdRp
M2 2203 μ1 708 76 Capsídeo externo 600 Penetração / transcrição
M3 2235 μNS 719 80 Não estrutural 0 Montagem/ transcrição 2a
S1 1416 σ1 +σ1s 455 + 120 49 + 14 Capsídeo externo 36-48 / 0 Ligação à célula
S2 1331 σ2 418 47 Capsídeo interno 120-180 Liga-se a dsRNA
S3 1198 σNS 366 41 Não estrutural 0 Montagem
S4 1196 σ3 365 41 Capsídeo externo 600 Tradução
*Adaptado de (Nibert & Schiff, 2001).
18
Cada segmento genômico é transcrito em um mRNA que inclui uma longa
seqüência de leitura aberta (ORF) capaz de codificar a maior proteína prevista para
este segmento. Na maioria dos reovírus de mamíferos, o segmento genômico S1 é o
único que codifica uma segunda proteína, σ1s, em uma seqüência de leitura separada,
porém sobreposta, àquela de σ1. A exceção a esta regra é o reovírus Baboon, que
possui também o segmento S4 como bicistrônico (Dawe & Duncan, 2002). O códon
de iniciação para a tradução de σ1s é o primeiro AUG fora do código de leitura,
dentro da ORF para σ1. Outras seqüências de leitura aberta são encontradas em vários
segmentos genômicos dos reovírus, porém suas traduções em células infectadas ainda
não foram comprovadas (Nibert & Schiff, 2001).
1.3.1.2 Seqüências não traduzidas
Estudos de seqüenciamento revelaram que as regiões não traduzidas nos
terminais 5´ e 3´ presentes nos segmentos dos reovírus representam uma pequena
parte do genoma. O tamanho das regiões não traduzidas na extremidade 5´ varia entre
12 e 32 bases, e na extremidade 3´ varia entre 35 e 184 bases. Essas regiões não
traduzidas incluem seqüências para o empacotamento do mRNA, reconhecimento
pela RNA polimerase para iniciação da síntese das fitas positiva e negativa, e ainda
determinam a eficiência de tradução (Nibert & Schiff, 2001).
Estudos com criomicroscopia eletrônica e difração de raios-X de pequeno
ângulo indicam que o genoma dos reovírus se encontra dentro de uma esfera central
de 49nm de diâmetro, ordenado como hélices adjacentes localizadas paralelamente e
separadas por distâncias de 25 a 27Å (Joklik, 1998). O peso molecular total do RNA
genômico é calculado em 15,1 MDa (Nibert & Schiff, 2001).
19
1.3.2 Mutantes
Muitos progressos nos estudos dos reovírus foram obtidos através da análise de
amostras que surgem naturalmente, apresentando diferenças fenotípicas ou
polimorfismos (Ramig et al., 1978; Sharpe et al., 1978; Hrdy, Rosen & Fields, 1979;
Wu et al., 1994; Chappell et al., 1997). Um ensaio clássico tem sido o de identificar
um polimorfismo entre amostras, definir os eletroferótipos dos rearranjos obtidos
através da co-infecção com diferentes amostras e analisar as características
polimórficas desses rearranjos para associar isto a um segmento específico (Nibert &
Schiff, 2001).
Alguns estudos identificaram o segmento S1 como o determinante primário de
diferenças entre amostras, no que se refere a tropismo e/ou virulência (Chappell et al.,
1997; Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Alguns estudos tiveram êxito em
associar diferenças relativas a um único segmento, enquanto que outros verificaram
diferenças relativas a mais de um segmento (Nibert & Schiff, 2001). As diferenças
entre os eletroferótipos de diferentes amostras são além de úteis para estudos
genéticos, aplicados na classificação dos reovírus (Hrdy, Rosen & Fields, 1979; Wu et
al., 1994).
Com exceção do segmento genômico S1, os segmentos homólogos dos
protótipos são idênticos quanto ao tamanho, perfeitamente alinhados, sem gaps, e
muito similares quanto à seqüência, com 75 a 96% de identidade para os nucleotídeos
e 86 a 99% de identidade referente à seqüência de aminoácidos (Nibert & Schiff,
2001).
O segmento S1 dos reovírus é aquele que exibe a maior variabilidade. Esta
variabilidade inclui diferenças no tamanho, utilização de gaps para alinhar seqüências
20
deduzidas para a proteína σ1, com uma conseqüente redução na similaridade de 26 a
49% de identidade nestas seqüências entre diferentes amostras de reovírus (Nibert &
Schiff, 2001).
Uma característica importante encontrada em algumas amostras virais é o
fenótipo sensível à temperatura (ts). Os mutantes de reovírus sensíveis à temperatura
são definidos pela sua reduzida capacidade de replicação a 39oC, diferentemente do
que acontece a 31oC (Ramig et al., 1978). A reversão de mutantes ts para o fenótipo
normal pode ocorrer devido a uma mudança no mesmo segmento, no mesmo ponto da
mutação original (reversão verdadeira) ou em um segundo sítio (supressão
intragênica) (Nibert & Schiff, 2001). De uma maneira alternativa, uma mutação em
um segundo segmento pode suprimir o defeito produzido pela mutação original, o que
é chamado de supressão extragênica. Um possível mecanismo para supressão
extragênica envolve mutações em produtos gênicos que interagem diretamente (Nibert
& Schiff, 2001).
1.3.3 Partículas virais e sub-virais.
Os vírions podem ser convertidos em dois tipos distintos de partículas sub-
virais: partículas infecciosas ou ISVPs e o cerne. Essas partículas diferem em
composição protéica, conformação e outras propriedades biológicas e físico-químicas
(Nibert & Schiff, 2001). Estudos de microscopia eletrônica com coloração negativa
indicaram diâmetros de 73nm para os vírions, 64nm para as ISVPs e 51nm para os
cernes. Os diâmetros obtidos com criomicroscopias eletrônicas, nas quais artifícios
comuns à coloração negativa são mínimos foram: 85nm para os vírions, 80 para as
partículas sub-virais e 60nm para o cerne (excluindo-se as espículas). Os valores
21
obtidos através de criomicroscopia eletrônica corroboram aqueles encontrados por
difração de raios-X de pequeno ângulo (Nibert & Schiff, 2001).
As observações através da microscopia eletrônica com coloração negativa
definiram a organização das partículas de reovírus em duas camadas concêntricas de
proteínas denominadas capsídeo interno e externo, além do cerne englobando o
genoma de RNA fita-dupla (Joklik, 1998; Nibert & Schiff, 2001). A descrição de duas
camadas protéicas individualizadas é confirmada pelos resultados utilizando
espalhamento dinâmico de luz, difração de raios-X de pequeno ângulo, e
criomicroscopia eletrônica com reconstrução de imagens. Os capsídeos internos e
externos exibem simetria icosaédrica (Nibert & Schiff, 2001).
As proteínas λ2 (60 cópias) e μ1 (600 cópias) juntas formam a estrutura T=13
do capsídeo externo. As duas proteínas restantes, σ1 (36-48 cópias) e σ3 (600 cópias)
ocupam posições mais externas que λ2 e μ1 (Nibert & Schiff, 2001). As proteínas λ1
(120 cópias) e σ2 (120-180 cópias estimadas) são as principais proteínas do cerne e
formam a estrutura icosaédrica primária do capsídeo interno. As proteínas λ3 e μ2
(com números estimados de 12 cópias para cada uma) ainda não possuem suas
localizações exatas determinadas no capsídeo interno (Nibert & Schiff, 2001).
As partículas de reovírus são conhecidamente estáveis visto que mantêm sua
infecciosidade mesmo após longos períodos de estocagem. Tal como outros vírus não-
envelopados, possuem relativa resistência aos tratamentos com solventes orgânicos e
detergentes (Nibert & Schiff, 2001).
Os vírions resistem à exposição a forças iônicas extremas: variação de pH entre
dois e nove e a temperaturas de até 55oC. A exposição da partícula à radiação
ultravioleta ou à luz visível na presença de corantes fotoreativos causa uma redução
22
na infecciosidade de uma preparação viral. Os reovírus são estáveis em aerossóis,
especialmente em alta umidade (Nibert & Schiff, 2001). Aparentemente é a proteína
σ3 que dá ao vírion uma estabilidade maior que aquela das ISVPs e deve ser crucial
para manter infecciosa a partícula quando a mesma é transmitida entre diferentes
hospedeiros na natureza (Nibert & Schiff, 2001).
1.3.4 Proteínas Estruturais
As proteínas incorporadas aos vírions maduros (proteínas estruturais)
apresentam diversas funções relacionadas à infecção pelo reovírus. Essas mesmas
proteínas podem desempenhar importantes funções nas células infectadas (Nibert &
Schiff, 2001).
Figura 1. Representação esquemática da partícula de reovírus.
λ1, λ2, λ3, µ1C, µ2, σ1, σ2 e σ3 proteínas estruturais; L, M, S classe de segmentos
genômicos. Adaptado de Duncan, 1996.
23
λ1
A proteína λ1 é o principal componente do capsídeo interno, onde interage com
as proteínas σ2, λ3 e com λ2, a espícula do cerne (McCrae & Joklik, 1978). Esta
proteína também pode interagir com a proteína do capsídeo externo μ1. A dedução da
seqüência de aminoácidos de λ1 inclui um motivo de ligação a nucleotídeos próximos
à região N-terminal, sugerindo uma atividade enzimática relacionada à transcrição
(Yue & Shatkin, 1998).
A seqüência de λ1 contém um motivo de “dedo de zinco” próximo ao terminal
amino. O papel do Zn2+ na função de λ1 é desconhecido, todavia, a proteína λ1 pode
se ligar a RNA fita-dupla, sugerindo que o “dedo de zinco” possa estar envolvido
nesta atividade (Nibert & Schiff, 2001).
λ2
Pentâmeros da proteína λ2 formam as espículas do cerne nas partículas de
reovírus. Acredita-se que λ2 interaja com σ1, σ3 e μ1 no capsídeo externo e com λ1 e
λ3 no capsídeo interno (Nibert & Schiff, 2001). Vírus mutantes, sensíveis à
temperatura, que apresentam lesões no segmento L2, que codifica λ2, formam, em
temperaturas não permissivas, partículas semelhantes ao cerne, mas não partículas
inteiras, sugerindo um papel para λ2 na montagem do capsídeo externo.
Estudos bioquímicos demonstraram que λ2 é a guanililtransferase dos reovírus
(Yue & Shatkin, 1998). A proteína λ2 também pode agir como uma metiltransferase
que modifica as bases de guanina na extremidade 5´ do mRNA dos reovírus (Yue &
Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
24
λ3
A proteína λ3 é encontrada em pequena quantidade no capsídeo interno, porém
sua localização exata no cerne ainda não foi determinada. Esta proteína interage com
λ1 e λ2 e acredita-se que também interaja com μ2 (McCrae & Joklik, 1978; Nibert &
Schiff, 2001).
Partículas virais mutantes ts com lesões no segmento L1 apresentam a síntese de
RNA seriamente afetada e formam partículas vazias em temperaturas não
permissíveis (Ramig et al., 1978). A seqüência de aminoácidos deduzida de λ3 inclui
um motivo GDD comum a todas as polimerases (Nibert & Schiff, 2001). A expressão
de λ3 através de um vetor vaccínia revelou uma proteína com uma atividade de
polimerase poli(C)-poli(G) dependente. Estes resultados sugerem que λ3 contêm o
sítio catalítico da RNA polimerase RNA-dependente (RdRp) dos reovírus (Yue &
Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Tal como outras enzimas com a mesma
atividade supõe-se que λ3 funcione durante a transcrição e a síntese da fita negativa
do genoma viral na presença de co-fatores (Nibert & Schiff, 2001).
μ1
A proteína μ1 é o principal componente do capsídeo externo (McCrae & Joklik,
1978), onde interage com as proteínas λ2 e σ3. Evidências genéticas sugerem ainda
que esta proteína também interage com λ1, proteína do capsídeo interno (Nibert &
Schiff, 2001). A proteína μ1 é modificada pela adição de um ácido mirístico na região
N-terminal. A presença deste grupamento miristoil em μ1 confere caráter hidrofóbico
a esta região da proteína, sugerindo participação durante a penetração nas membranas
celulares (Yue & Shatkin, 1998).
25
A maioria das proteínas μ1 existentes no capsídeo externo são encontradas na
forma de um fragmento de 72-kDa, μ1C, gerado através da clivagem proteolítica de
μ1, entre os resíduos de Asn42 e Pro43 (Nibert & Schiff, 2001; Su et al., 2006). As
proteínas μ1 e μ1C passam por uma distinta clivagem proteolítica próximo às suas
extremidades carboxílicas quando expostas a proteases in vitro, ou quando dentro dos
compartimentos endocíticos de células infectadas. Esta clivagem gera um fragmento
N-terminal denominado μ1δ, quando derivado de μ1, e denominado δ quando
derivado de μ1C, tal como um fragmento C-terminal menor, altamente básico,
denominado φ. Acredita-se que a clivagem proteolítica de μ1/μ1C seja importante
para a penetração de membranas celulares (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff,
2001).
A apoptose, induzida pelos reovírus, já foi associada às proteínas σ1 e µ1,
contudo um estudo recente associa µ1 como único determinante viral para apoptose
induzida pela ligação de partículas opsonizadas via receptor de Fc, nesse caso a
proteína µ1 teria um papel essencial na sinalização de estímulos pré-apoptóticos
(Danthi et al., 2006).
μ2
μ2, assim como λ3, é uma proteína encontrada em pequena quantidade no
capsídeo interno (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Foram relatados
casos de mutantes defeituosos no segmento M1 que falhavam na síntese do RNA fita-
dupla, o que pode sugerir um papel inicial para esta proteína na síntese de RNA, ou na
montagem da estrutura em fita-dupla (Brentano et al., 1998; Yue & Shatkin, 1998).
De fato a proteína µ2 já foi associada a diversas funções biológicas tais como:
NTPase, ligação a RNA, associação com microtúbulos e co-fator da RNA dependente
26
RNA polimerase viral (Su et al., 2006) Outros trabalhos sugerem que μ2 pode
determinar diferenças na extensão do efeito citopático e no tamanho das placas em
ensaios de plaqueamento. Existe ainda uma hipótese de que μ2 possa agir como um
regulador dos efeitos citopáticos ao nível da transcrição in vivo (Nibert & Schiff,
2001).
σ1
A proteína σ1 é a responsável pela ligação à célula hospedeira. É a
hemaglutinina viral e contém os epítopos primários para os quais a resposta específica
é dirigida (Chappell et al., 1997; Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). A
proteína σ1 interage com λ2 e talvez com σ3 no capsídeo externo (Nibert & Schiff,
2001). σ1 está presente tanto nos vírions como nas ISVPs em uma forma oligomérica
e pode assumir uma conformação estendida na qual aparece como uma longa fibra
com uma morfologia de “cabeça e cauda” projetando-se a partir da superfície da
partícula.
Estudos com a mutagênese de resíduos conservados na porção N-terminal de σ1
sugerem que aminoácidos não contínuos contribuam para a estrutura e função do
domínio de ligação ao receptor (Nibert & Schiff, 2001). Um grande número de
trabalhos sugere que σ1 atinja sua conformação nativa via um processo em etapas
(Yue & Shatkin, 1998). Monômeros de σ1 não se ligam às células e exibem uma
extrema sensibilidade às proteases, indicando a importância da oligomerização de σ1
para sua estrutura final e função biológica (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff,
2001).
27
σ2
A proteína σ2 interage com λ1 para formar o capsídeo interno. Partículas de
vírus com mutações no segmento genômico σ2 apresentam redução na síntese de
RNA e formam capsídeos vazios quando em temperaturas não permissíveis, o que
sugere que σ2 esteja envolvida em uma ou mais etapas da montagem da partícula,
incluindo o recrutamento de moléculas de RNA ou a replicação (Nibert & Schiff,
2001). O estudo de mutantes ts mostrou que a reversão para o fenótipo normal se dá
exclusivamente através de eventos intragênicos. Em todos os casos analisados foi
observada uma reversão verdadeira no resíduo 383 (Coombs, 1996).
σ3
A proteína σ3, juntamente com μ1, forma a base do capsídeo externo. As
evidências mostram que σ3 interage com λ2 e μ1 e talvez com σ1 nos vírions (Nibert
& Schiff, 2001). Essa proteína aparenta ser responsável pela estabilidade da partícula
em ambientes extracelulares, entretanto, é necessária que seja feita a sua remoção dos
vírions, por meio de proteólise, para que a infecção ocorra (Yue & Shatkin, 1998;
Nibert & Schiff, 2001). Estudos analisando o segmento S4 levam a crer que σ3
desempenhe um papel importante na montagem do capsídeo externo. Alguns estudos
genéticos sugerem que mutações no segmento S4 são responsáveis pelo
estabelecimento de infecções persistentes, enquanto outros estudos sugerem que S4
seja responsável pela inibição da síntese de RNA e proteínas celulares (Nibert &
Schiff, 2001).
28
1.3.5 Proteínas não estruturais
A análise das proteínas sintetizadas nas células infectadas com reovírus levou à
descoberta de duas proteínas não estruturais μNS e σNS (McCrae & Joklik, 1978;
Nibert & Schiff, 2001). Essas proteínas são sintetizadas em grande quantidade nas
células sugerindo que, como elas não são proteínas estruturais dos vírions, devem
desempenhar papeis chaves na montagem das partículas. Estudos posteriores levaram
à identificação de uma outra proteína não estrutural codificada por uma segunda ORF
no segmento S1. Essa proteína é denominada σ1s e está presente em quantidade
relativamente pequena (Nibert & Schiff, 2001).
μNS / μNSc
Duas proteínas relacionadas, μNS e μNSc são produzidas em quantidades
similares nas células infectadas por reovírus (McCrae & Joklik, 1978). Embora
anteriormente se achasse que μNSc era um produto da clivagem de μNS, estudos
recentes mostram que μNSc é sintetizada a partir de uma tradução alternativa que se
inicia de um segundo AUG na seqüência de leitura aberta (Nibert & Schiff, 2001).
Outros estudos verificaram que a única diferença das duas proteínas é que μNS possui
5 kDa a mais que μNSc na sua região N-terminal. Não se conhecem diferenças
funcionais entre μNS e μNSc. A proteína μNS associa-se com o citoesqueleto, para
talvez, ancorar as estruturas virais. O mRNA dos reovírus liga-se a μNS logo após a
síntese, antes de se ligar a outras proteínas (Nibert & Schiff, 2001).
σNS
A proteína σNS é rica em cisteínas e, em seqüências capazes de formar α-
hélices. Ela apresenta grande afinidade por RNA fita-simples (Yin & Lee, 1998; Yin
29
& Lee, 2000). A proteína σNS liga-se de uma maneira única a cada classe de tamanho
do mRNA; acredita-se que essa atividade de ligação ao mRNA seja responsável pela
formação de complexos das moléculas durante a morfogênese (Nibert & Schiff,
2001).
σ1s
Estudos de seqüenciamento indicam que σ1s é uma proteína básica e que um
conjunto de resíduos básicos na região N-terminal é conservado entre as proteínas
σ1s. Essa proteína pode ser responsável por algumas das funções biológicas
associadas ao segmento S1 e atribuídas à proteína σ1, tais como a inibição da síntese
de DNA celular. Todavia, a proteína σ1s parece ser dispensável para propagação em
cultura de células (Rodgers et al., 1998; Nibert & Schiff, 2001).
1.3.6 Replicação dos reovírus
De uma maneira geral, as amostras virais são selecionadas de forma que,
somente se estabelecem aquelas que conseguem utilizar sua limitada informação
genética de maneira a vencer as barreiras de defesa do hospedeiro (Duncan, 1996).
Os vírus de RNA fita-dupla multisegmentados, tais como os reovírus,
aparentemente possuem funções ligadas a replicação ao nível de proteínas estruturais,
ao invés do mRNA. Nas infecções por reovírus são produzidos mRNAs que
correspondem a praticamente todo o tamanho do segmento genômico, não sofrem
splicing e, com uma exceção, possuem uma única seqüência de leitura aberta (ORF).
A maioria das proteínas estruturais, se não todas, possuem atividades enzimáticas que
são essenciais para a propagação viral (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
30
1.3.6.1 Entrada dos reovírus nas células hospedeiras
A fase de entrada, na infecção pelos reovírus, inclui diversas etapas distintas:
ligação à superfície celular, endocitose, internalização e desnudamento. As proteínas
do capsídeo externo σ1, μ1/μ1C e σ3 estão todas envolvidas nesses eventos (Yue &
Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
A entrada dos reovírus nas células hospedeiras é mediada primeiramente por
interações de μ1/μ1C e σ1 com os componentes e receptores presentes na superfície
celular (Sharpe & Fields, 1981; Yin & Lee, 1998). Uma etapa chave no processo de
desnudamento é a remoção proteolítica da proteína σ3 gerando as ISVPs. Essas
partículas contêm fragmentos gerados através de clivagem de μ1/μ1C e possuem a
proteína σ1 em uma conformação estendida. As ISVPs são infecciosas e são geradas
em sítios extracelulares in vivo e dentro dos endossomos tardios ou lisossomos de
células infectadas (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Dentro destes
vacúolos lisossomais as proteínas do capsídeo externo sofrem clivagens específicas,
que são dependentes de pH ácido e representam uma etapa essencial no processo de
infecção. Este processo é mediado in vivo por uma ou mais proteases endossomais e
pode ser mimetizado in vitro pela digestão de vírions purificados com quimotripsina.
A entrada das ISVPs, geradas por proteólise extracelular, é independente de pH ácido
e não requer endocitose (Nibert & Schiff, 2001). A remoção de σ1 e μ1 das ISVPs
resulta no cerne, que são partículas subvirais não infecciosas, porém ativas para a
transcrição. As ISVPs são as formas predominantes do vírus encontradas nas
primeiras 8 horas de infecção (Nibert & Schiff, 2001).
31
Embora as etapas iniciais da infecção por reovírus estejam descritas como uma
endocitose mediada por receptor, seguida da associação dos vacúolos com
endossomas e lisossomas, alguns detalhes das interações entre as proteínas do
capsídeo e das proteínas da superfície viral com a membrana celular permanecem
indefinidos (Yue & Shatkin, 1998).
1.3.6.2 A proteína de ligação à célula: σ1
Um grande número de trabalhos demonstrou que σ1, a hemaglutinina viral,
medeia a ligação do vírus aos receptores celulares (Chappell et al., 1997; Yue &
Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001). Embora σ1 seja o componente em menor
quantidade na superfície do vírion, é responsável pelo sorotipagem, infecciosidade e
tropismo celular. Esta proteína interage no capsídeo externo com σ3 e a proteína
pentamérica λ2 (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
Baseando-se nas diferenças de infecciosidade e hemaglutinação específica dos
vírions e das partículas sub-virais infecciosas derivadas de diferentes amostras, foi
sugerido que a proteína σ1 do sorotipo 3 (T3D) contém mais de um domínio de
ligação aos receptores celulares (Nibert & Schiff, 2001). A glicoforina A poderia agir
como um receptor para os reovírus (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001),
porém, recentemente, foi descrito que a molécula de adesão de junção (JAM) é o
principal receptor celular para os reovírus de mamíferos (Barton et al., 2001). Foi,
também, demonstrado que o ácido siálico pode agir como co-receptor (Yue &
Shatkin, 1998; Tyler, 2001).
32
1.3.6.3 Interações de μ1/μ1C com a membrana celular durante a penetração
Existe um consenso de que a principal proteína do capsídeo externo μ1/μ1C
desempenhe um papel importante na penetração das partículas de reovírus na
membrana da célula hospedeira (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
O desnudamento do vírus é geralmente precedido da remoção de σ3 para expor
um domínio de interação com a membrana em μ1/μ1C. Esta proteína contém uma
seqüência de miristilação conservada na região N-terminal que é modificada tanto in
vitro quanto in vivo pela adição de um grupamento miristil ao resíduo de glicina na
posição dois. A adição de grupamentos de ácidos graxos aumenta a hidrofobicidade, o
que, presumivelmente, facilita a interação com a membrana celular. Em segundo lugar
diversas regiões distintas de hidrofobicidade estão presentes na região N-terminal de
μ1, e um longo par de α-hélices anfipáticas delimitam um sítio de clivagem para
tripsina ou quimotripsina na região C-terminal (Yue & Shatkin, 1998).
μ1C e μ1 são ambas clivadas na região C-terminal para gerar o grande
fragmento N-terminal δ (ou μ1δ) e um fragmento menor φ. Este processamento
proteolítico ocorre in vivo nos endossomos e lisossomos tardios e pode ser
mimetizado pelo tratamento com proteases em preparações de vírions purificados. As
ISVPs resultantes contêm quantidades estoiquiométricas de δ (μ1δ) e φ (Yue &
Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001).
Em concordância com esses resultados, a entrada dos reovírus em células L de
camundongo é dependente da atividade próton-ATPase no vacúolo, que pode
acidificar os endossomos e ativar as proteases. Foi também sugerido que a região
33
central de μ1/μ1C seria também responsável pela permeabilização da membrana
celular (Yue & Shatkin, 1998).
Muito avanço vem sendo alcançado no estudo dos mecanismos pelo quais os
reovírus e outros vírus não-envelopados tais como os rotavírus penetram a bicamada
lipídica (Dormitzer et al., 2004; Zhang et al., 2005a). De acordo com o papel de
penetração na membrana descrito para a proteína μ1/μ1C processada, partículas de
reovírus ts defeituosas no segmento M2 ficam aparentemente aprisionadas nos
endossomos nas temperaturas não permissíveis, o que resulta em um decréscimo na
replicação (Yue & Shatkin, 1998; Zhang et al., 2005a).
A transcrição dos reovírus é conservativa e assimétrica. Dez diferentes
transcritos foram identificados por hibridização e seqüenciamento e aparentam
representar cópias inteiras dos dez fragmentos genômicos. Durante a morfogênese, as
proteínas dos reovírus desempenham atividades de polimerase, helicase, RNA tri-
fosfatase, guanililtransferase e metiltransferase (Yue & Shatkin, 1998; Nibert &
Schiff, 2001; Tyler, 2001).
Dois tipos de transcrição ocorrerem no interior de células infectadas. A
transcrição primária mediada pelas partículas sub-virais que entraram na célula e a
transcrição secundária mediada pelas partículas recém formadas. Os transcritos
primários são detectados cerca de duas horas pós-infecção (pi), atingindo um pico
máximo entre 6-8 horas pi e, a partir de 12 horas pi não são mais detectados (Nibert &
Schiff, 2001). Após dez horas de infecção quase todas as proteínas sintetizadas pela
célula são virais (Yue & Shatkin, 1998; Nibert & Schiff, 2001; Tyler, 2001).
O mecanismo pelo qual os segmentos genômicos são colocados no interior do
vírion recém montado permanece obscuro. De uma maneira geral é aceito que o
34
arranjo dos dez segmentos genômicos ocorre ao nível de mRNA e a síntese da fita
negativa para formação do RNA fita-dupla se dá no interior das partículas virais
recém formadas (Joklik, 1998; Patton & Spencer, 2000).
A replicação dos reovírus desenvolve a formação de viroplasmas (locais onde
ficam agrupadas as proteínas virais), reorganização de elementos do citoesqueleto,
inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas celulares, além da indução de interferon
e outras citocinas (Martínez-Costas et al., 2000; Tyler, 2001; Forrest & Dermody,
2003).
1.4 Patogênese na infecção experimental
1.4.1 Infecção experimental em mamíferos
A patogenia viral é o processo pelo qual são produzidas doenças durante um
quadro de virose. Muito do conhecimento sobre a patogenia causada pelas infecções
virais foi obtido através do estudo em modelos animais. Esses modelos, mesmo não
sendo perfeitos, são muitas vezes, aquilo de mais próximo que se pode chegar para a
compreensão de doenças humanas. A patogenia das infecções virais está intimamente
ligada à virulência de uma amostra viral e à capacidade de resposta do hospedeiro
frente à infecção (Tyler & Nathanson, 2001).
A virulência de uma amostra viral é definida como sua capacidade de quando
comparada com outras amostras semelhantes, produzir danos ao hospedeiro. Dessa
maneira, a virulência está ligada a fatores tais como o tamanho do inóculo, capacidade
de resistir ao meio ambiente até chegar a um hospedeiro suscetível, rota de entrada e
fatores genéticos de melhor adaptação da amostra frente ao hospedeiro. Enquanto que
35
os fatores relativos ao hospedeiro: idade, sexo, estado imunitário e espécie, estão
intimamente ligados à defesa do organismo (Tyler & Nathanson, 2001).
Uma vez infectado um hospedeiro susceptível, há um processo de replicação
inicial com conseqüente aumento do número de partículas virais, geralmente próximo
ao local de entrada. As amostras virais que produzem infecções sistêmicas precisam
ainda vencer barreiras do hospedeiro a fim de utilizar as principais vias de
disseminação pelo organismo: sanguínea, linfática e neural. Atravessar com sucesso
todas essas etapas resulta na chance de estabelecer o quadro clínico associado à
determinada virose (Tyler & Nathanson, 2001).
Em modelos experimentais observou-se que os reovírus são capazes de
espalhar-se a partir do trato gastrintestinal para outros órgãos e até atingir o sistema
nervoso central (SNC) após inoculação oral. Estudos com rearranjos entre os
protótipos T1L X T3D indicaram que o segmento S1 determina o padrão de
espalhamento da infecção dos músculos para o SNC (Tyler, 2001). A importância do
segmento S1 para o neurotropismo também é verificada em culturas de células
neuronais (Sharpe & Fields, 1981; Chappell et al., 1997; Tyler, 2001). Ensaios
envolvendo rearranjos entre diferentes amostras dentro do sorotipo T3 mostraram que
o segmento M2 também era responsável pela neurovirulência (Rubin & Fields, 1980).
Esses foram experimentos clássicos mostrando as diferentes capacidades patogênicas
de diferentes sorotipos de reovírus.
Outros quadros clínicos relacionados à inoculação de reovírus via
intraperitoneal em camundongos SCID e nude são: miocardite, característica
associada aos segmentos M1 e L2; infecção pulmonar associada ao segmento S1 e
inflamações hepatobiliares, pancreáticas e endócrinas ainda não associadas a um
36
determinado segmento (Chappell et al., 1997; Brentano et al., 1998; Tyler, 2001;
Forrest & Dermody, 2003).
Os Orthoreovirus nunca foram comprovadamente associados a nenhum quadro
clínico específico em mamíferos, por via de infecção natural, dessa forma não são
considerados patógenos para o homem. Apesar de não se ter uma comprovação de que
os reovírus são responsáveis por quadros clínicos no homem, esses vírus já foram
isolados de casos de enterite, infecções respiratórias, exantema, hepatite neonatal,
miocardite e de casos de linfoma de Burkitt (Tyler, 2001).
De uma maneira geral, a grande maioria das infecções por reovírus são
assintomáticas e levantamentos epidemiológicos mostram que a maioria das pessoas
possui anticorpos para os reovírus já na infância (Tyler, 2001).
1.4.2 Reovírus aviários
Ao contrário dos reovírus de mamíferos, os reovírus aviários (ARV) são uma
importante causa de diversas doenças que causam considerável perda na criação de
aves (Gouvea & Schnitzer, 1982; Gouvea et al., 1983; Jones, 2000).
Os resultados de estudos presentes na literatura sugerem que os reovírus
aviários são muito similares, em estrutura e composição molecular, aos reovírus de
mamíferos (Schnitzer, Ramos & Gouvea, 1982; Varela et al., 1996; Martínez-Costas
et al., 1997). Os reovírus aviários diferem dos de mamíferos na ausência de
capacidade hemaglutinante, na capacidade de induzir fusão celular, na variação de
hospedeiro e na associação com importantes condições patológicas (Duncan, 1996;
Duncan & Sullivan, 1998).
37
A infecção pelos reovírus aviários é bastante difundida e todos os animais de
granja são infectados em algum momento da vida. Todavia, cerca de 85-90% das
infecções não são patogênicas. Estudos sobre a estabilidade das partículas de reovírus
em materiais comuns encontrados nas granjas mostraram que as partículas podem
permanecer infecciosas mesmo após dez dias em penas, madeira, vidro, borracha,
metal galvanizado e água. As partículas de reovírus aviários são resistentes a agentes
químicos tais como formaldeído 2% e fenol 2%, porém são rapidamente inativadas
pelo álcool etílico (Jones, 2000).
A artrite/tenosinovite é o quadro clínico característico da infecção patogênica
pelos reovírus aviários. Outros quadros tais como: enterite ulcerativa, doença
respiratória, osteoartrite, hepatite e lesões cardíacas (Gouvea & Schnitzer, 1982) e/ou
renais em aves jovens e a síndrome de má-absorção são relacionados às infecções
pelos reovírus (van der Heide, Lutticken & Horzinek, 1981; Sterner et al., 1989;
Jones, 2000). Mesmo amostras virais caracterizadas como artrotrópicas são
encontradas em vários tecidos durante a fase inicial da doença. Vasconcelos et al.,
(2001b) observaram lesões esplênicas 48 horas após a inoculação de uma amostra
artrogênica de reovírus aviários, 72 horas pi foram observadas processos inflamatórios
no miocárdio e fígado.
Em um grande número de casos de síndrome de má-absorção foram encontrados
outros agentes infecciosos tais como: parvovírus, enterovírus, calicivírus bem como
alguns tipos de bactérias. Este fato leva à suspeita de que a síndrome de má-absorção
seja uma doença multi-fatorial, no entanto as amostras de reovírus 1733 e 2408,
classificadas como altamente patogênicas (Rosenberger et al., 1989), são capazes de
induzir a síndrome de má-aborção sem a presença de outros patógenos (van der
Heide, 2000).
38
A artrite/tenosinovite é uma doença predominantemente de aves para abate e é
uma importante causa de fraqueza nas pernas. As aves maiores geralmente
manifestam os piores quadros de artrite/tenosinovite em função até do próprio peso,
contudo o nível de comprometimento patológico é determinado por um conjunto de
fatores que vão desde a idade da ave, desenvolvimento do sistema imune, até a
variante com que a ave foi infectada (Rosenberger et al., 1989; Sterner et al., 1989;
Jones, 2000).
Essa condição clínica é rara em aves com menos de quatro a cinco semanas e é
comumente encontrada em aves de até dezesseis semanas de idade, com um pico de
incidência por volta das sete semanas de vida. Os efeitos patogênicos podem variar
em função da amostra com que a ave está infectada, sendo que a grande maioria das
amostras patogênicas apresenta tropismo pelos tecidos das juntas (Jones, 2000).Vários
estudos têm demonstrado que o tropismo e a virulência das amostras de reovírus
aviários são geneticamente determinados pelo segmento S1. Mecanismos de
patogênese também estão associados a segmentos da classe M (Huang et al., 1987b).
Os reovírus aviários causam lesões de caráter inflamatório crônico na
articulação tibiotársica levando as aves acometidas a dificuldade de locomoção e
alteração na conversão alimentar, havendo incidência de mortes devido a desidratação
e desnutrição. A primeira alteração observada na articulação de aves inoculadas tanto
por via oral como no coxim plantar é um infiltrado inflamatório na bainha tendinosa
do tendão flexor digital cerca de uma semana após a inoculação, porém quando o
local inoculado é o coxim plantar, as primeiras lesões locais são observadas cerca de
24 horas pi (Vasconcelos et al., 2001a).
Na inoculação oral, as partículas virais são replicadas primeiramente no epitélio
intestinal atingindo a circulação através das Placas de Peyer. O aparecimento do
39
infiltrado inflamatório com presença de heterófilos e células mononucleares é a lesão
característica da fase aguda, enquanto que a formação de folículos linfóides, a
hiperplasia das células da membrana sinovial e a fibroplasia com substituição do
tecido tendíneo por fibrose são alterações encontradas na fase de cronificação da
doença (Vasconcelos et al., 2001a).
A maior severidade das lesões provocadas pela inoculação no coxim plantar em
relação aquelas encontradas através da inoculação por via oral sugerem que baixos
títulos virais atinjam as articulações, uma vez que grande parte das partículas virais é
excretada nas fezes. Seguindo este raciocínio, altos títulos virais estão relacionados ao
nível de patogênicidade observada em uma infecção, além de que na via de
inoculação oral haveria maior probabilidade de sensibilizar o sistema imunológico
(Vasconcelos et al., 2001a).
A reação inflamatória pode ser tão intensa que, nos casos mais graves, ocorre a
ruptura total dos tendões e a necrose da cartilagem da articulação. A ruptura dos
tendões é acompanhada de uma intensa hemorragia. Alguns agentes infecciosos tais
como Mycoplasma synoviae, Staphylococcus aureus, os vírus IBDV (Infectious
bursal disease virus) e o vírus da anemia das galinhas parecem aumentar os efeitos
patogênicos da infecção pelos reovírus aviários (Shirai et al., 1990; Jones, 2000).
Aves adultas SPF, infectadas experimentalmente via nasal, apresentam o vírus
distribuído por todo o trato respiratório, entérico e nas juntas. Após três dias o vírus
pode ser encontrado por todo o corpo. Anticorpos circulantes podem ser
demonstrados no soro de aves infectadas através de técnicas de neutralização,
imunodifusão e ELISA. Os anticorpos maternos (imunização passiva) são eficazes na
proteção da prole sendo assim uma das bases da imunização em granjas (Jones, 2000).
40
Alguns trabalhos sugerem que a artrite causada pela infecção com reovírus
aviários é uma doença auto-imune e que, como tal, poderia servir de modelo para a
artrite reumatóide em humanos. Apesar de algumas evidências apontarem para essa
semelhança, nenhum fator reumatóide foi demonstrado. A infecção pelos reovírus
aviários não compromete a capacidade funcional das células T, porém induz a
ativação de macrófagos supressores que inibem a função das células T (Jones, 2000).
A resistência de aves mais velhas à infecção pelos reovírus pode estar
relacionada à maturação da resposta imune mediada por células T. A maturação dos
macrófagos também pode estar relacionada a esta resistência, uma vez que essas
células são possíveis alvos da infecção e, com o amadurecimento, teriam melhores
condições de responder à infecção (Roessler & Rosenberger, 1989; O´Hara et al.,
2001). Quando não leva ao óbito, a infecção pelos reovírus aviários pode levar ao
estabelecimento de um quadro de persistência, principalmente se a infecção for
causada por uma amostra de alto grau de patogenicidade (Jones, 2000).
A transmissão dos vírus se dá tanto vertical como horizontalmente, conforme
pode ser confirmado em laboratório (Menendez, Calnek & Cowen, 1974). Os estudos
de campo mostram que é comum encontrar infecções mistas em uma mesma ave,
assim, mais de uma amostra de reovírus pode ser isolada de um mesmo animal
(Moradian, Thorsen & Julian, 1990; Shirai et al., 1990).
Devido a uma série de fatores que vão desde a grande resistência da partícula de
reovírus até a rota de transmissão, torna-se praticamente impossível a criação de aves
livres de reovírus. Esse fato demonstra que são imprescindíveis uma boa estratégia de
vacinação e a caracterização das amostras em circulação (Jones, 2000).
41
1.4.2.1 Diagnóstico
O diagnóstico da infecção pelos reovírus requer uma confirmação laboratorial
através do isolamento do vírus proveniente das juntas afetadas. Alguns métodos
rápidos têm sido utilizados, tais como o PCR. Na rotina das granjas são utilizadas
técnicas sorológicas, principalmente a de ELISA, porém devido à infecção pelos
reovírus ser muitas vezes sub-clínica, a interpretação dos resultados torna-se difícil
(Jones, 2000).
Diversos tipos de cultura de células primárias de embriões ou de aves adultas
são susceptíveis à infecção pelos reovírus aviários, sendo as células de fígado de
embrião de galinha (CELi) as mais sensíveis (Gouvea & Schnitzer, 1982). O típico
efeito citopático observado em culturas de células infectadas com os reovírus aviários
é a formação de sincícios (Gouvea et al., 1983; Theophilos, Huang & Holmes, 1995;
Jones, 2000).
1.4.2.2 Proteínas codificas pelos reovírus aviários
A capacidade fusogênica dos reovírus aviários tem sido alvo de alguns estudos
recentes (Shmulevitz & Duncan, 2000; Bodélon et al., 2002). Esses trabalhos
mostraram que essa capacidade fusogênica é atribuída a uma proteína não estrutural
(p10) codificada pela menor ORF das três do segmento S1 (Bodélon et al., 2001).
Essa proteína apresenta uma estrutura bem diferente das demais proteínas fusogênicas
conhecidas, sendo assim, foi criada uma nova família com a sigla FAST - fusion-
associated small transmembrane (Shmulevitz & Duncan, 2000).
42
Existem outros dois reovírus que induzem a formação de sincícios e não são
vírus de aves: o vírus Nelson Bay e o vírus Baboon, os quais apresentam proteínas
não estruturais semelhantes à p10 dos reovírus aviários (Shmulevitz et al., 2002).
Uma segunda proteína não estrutural é codifica pelo segmento S1 (ORF2) dos
reovírus aviários. A proteína p17 não possui homologia significativa com outras
proteínas, o que impede que sejam feitas predições quanto a sua função (Bodelón et
al., 2001). Algumas propriedades foram recentemente descritas (Costas et al., 2005;
Liu et al., 2005), porém sua função biológica durante a replicação dos reovírus ainda
não foi definitivamente comprovada.
A nomenclatura das proteínas dos reovírus aviários já foi motivo de muita
controvérsia. Em uma mesma época, diferentes autores usavam nomenclaturas
também diferentes para a mesma proteína. Atualmente, há um consenso em se utilizar
a nomenclatura inicialmente proposta por Schnitzer, Ramos & Gouvea (1982) (Tabela
2 e Figura 2).
43
Tabela 2. Segmentos genômicos e proteínas dos reovírus aviários.
Segmento genômico Tamanho (bp) ORF Proteína
Análogo Mamífero Tamanho (aa) Localização Função ou
propriedade
L1 3959 22-3903 λA λ1 1293 Cerne Participa do complexo replicase12
L2 ND ND λB λ3 ND Cerne RNA polimerase RNA dependente (RdRp)12
L3 3907 13-3870 λC λ2 1285 Cerne + superfície Guanililtransferase8
M1 2283 13-2211 µA µ2 732 Cerne Co-fator RdRp, NTPase13, DNA metilase?14
M2 2158 30-2060 µB µ1 676 Superfície Penetração de membranas celulares9, 13, 14
M3 1996 25-1932 µNS µNS 635 Celular Montagem da partícula12, 13, 14
S1 1643 25-321 293-733 630-1610
p10 p17 σC
NE NE σ1
98 146 326
Celular Celular
Superfície
Fusão5 Retardo ciclo celular11
Ligação à célula2,1
S2 1324 16-1266 σA σ2 416 Cerne Ligação a dsRNA6,10, resistência ao IFN4
S3 1202 24-1127 σB σ3 367 Superfície Proteção de µB9 Ligação dsRNA7
S4 1192 17-1120 σNS σNS 367 Celular Ligação a ssRNA3
Adaptado de 1Schnitzer, Ramos & Gouvea, 1982; 2Martínez-Costas et al., 1997; 3Yin & Lee, 1998; 4Martínez-Costas et al., 2000; 5Shmulevitz & Duncan, 2000; 6Yin, Shien & Lee, 2000; 7Olland et al., 2001; 8Hsiao et al., 2002; 9Liemann et al., 2002; 10Yin, Su & Lee, 2002; 11Liu et al., 2005; 12Zhang et al., 2005b; 13Noad et al., 2006; 14Su et al., 2006. (ND: não determinado, NE: não existe).
44
Figura 2. Reconstrução 3D da secção central do vírion de ARV (amostra 138).
Adaptado de Zhang et al., 2005b. λA, λB, λC, µA, µB, σA, σB e σC proteínas
estruturais. 2f, 3f e 5f eixos de simetria icosaédrica. Pontilhados representam
disposição das fitas de dsRNA.
1.4.2.3 Prevenção e controle da infecção pelos reovírus aviários
O principal método para a prevenção da artrite/tenosinovite viral é através da
utilização de vacinas atenuadas em aves jovens com a intenção de proteger a prole
com os anticorpos maternos. A grande maioria das vacinas atenuadas comercializadas
atualmente é oriunda de uma das sementes preparadas por van der Heide a partir da
amostra S1133wt, isolada nos EUA. (van der Heide, 2000).
O próprio Louis van der Heide desenvolveu algumas sementes de vacinas a
partir da propagação da amostra S1133wt em ovos embrionados. Essas sementes
foram enviadas para outros laboratórios sendo testadas ao todo em mais de 400.000
45
aves nos EUA. Assim, existem diversas variantes da amostra S1133wt sendo usadas
como vacinas atenuadas ou inativadas (van der Heide, 2000).
A amostra S1133wt, quando no curso de uma infecção normal, causa um quadro
clínico severo de artrite/tenosinovite com moderada taxa de mortalidade, contudo em
infecções experimentais através da inoculação subcutânea ou intramuscular na pata do
animal é observada uma altíssima taxa de mortalidade (Gouvea et al., 1983).
A vacina P100 foi desenvolvida após 235 passagens seriadas da amostra
S1133wt em ovos embrionados e mais 100 passagens em células primárias de
fibroblasto de embrião de galinha (CEF), sendo que 65 dessas passagens em CEF
foram feitas a 32oC (van der Heide, Kalbac & Brustolon, 1983). As passagens
seriadas em CEF a 32oC para a obtenção da amostra P100 induziram a atenuação da
amostra S1133wt a ponto de poder ser usada com segurança e eficácia em aves jovens
mesmo com um dia de idade, algo que não é encontrado em outras amostras virais
usadas para a vacinação, mesmo aquelas derivadas de S1133wt (van der Heide,
Kalbac & Brustolon, 1983; Huang et al., 1987a; Huang et al., 1987b).
As amostras S1133wt e P100 apresentam diferenças quanto à replicação em
sistemas com temperaturas diferentes. A amostra P100 apresenta-se como uma
amostra ts apresentando replicação eficiente entre 33-37oC com um pico em 33oC,
após 48 horas; já a amostra S1133wt alcança bons títulos (até 109,5 PFU/ml) entre 37-
41oC no mesmo período de 48 horas (Gouvea et al., 1983).
Embora os efeitos patológicos causados pela infecção com os reovírus aviários
tenham sido bem descritos (Gouvea & Schnitzer, 1982), pouco é sabido a respeito dos
mecanismos envolvidos na patogênese ou de sua bioquímica ou biologia molecular
(Yin & Lee, 1998; Grande et al., 2000; Yin & Lee, 2000; Yin, Shien & Lee, 2000).
46
Em um estudo anterior (Naveca, 2002) foram verificadas diferenças em pelo
menos três segmentos genômicos entre as amostras S1133wt e P100. Essas diferenças
foram demonstradas nos segmentos M1, M2 e S1. Esse resultado aliado aos dados
presentes na literatura sobre os segmentos genômicos dos reovírus associados a
virulência nos levaram a certeza de que a caracterização das diferenças entre S1133wt
e P100 servem como um importante modelo no estudo dos mecanismos de patogênese
e atenuação de amostras virais.
47
2. Objetivos
Para esta tese foram estabelecidos os seguintes objetivos:
Objetivo Geral:
Comparar duas amostras de reovírus, uma patogênica e uma vacinal, a fim de
entender os mecanismos envolvidos na atenuação viral.
Objetivos específicos:
A. Caracterização das diferenças entre os segmentos genômicos
M1, M2, M3 e S1 das amostras S1133wt e P100; através da análise da
seqüência de nucleotídeos e da dedução das seqüências protéicas;
B. Promover uma análise filogenética das seqüências deduzidas
das proteínas virais das amostras S1133wt e P100 frente a outras seqüências
depositadas no GenBank;
C. Analisar a estrutura primária das proteínas virais e assim
caracterizar as principais diferenças entre as amostras virais que possam ter
levado ao fenótipo vacinal de P100;
D. Obtenção da proteína de função desconhecida, p17 através de
sistema de expressão heteróloga.
48
3. Material e métodos
3.1.1 Amostras virais
As amostras de reovírus aviários S1133wt (73ª passagem em membrana
corioalantóica - CAM) isolada originalmente de aves com artrite/tenosinovite durante
um surto em Connecticut, EUA por van der Heide & Kalbac (1975) e P100, uma
vacina obtida através da atenuação da amostra S1133wt devido a 235 passagens em
CAM, seguida de 65 passagens em culturas de células primárias de fibroblasto de
embrião de galinha (CEF) a 32ºC, e outras 35 passagens à 37ºC (van der Heide,
Kalbac & Brustolon, 1983), foram originalmente cedidas pelo Doutor Louis van der
Heide, para estudos anteriores onde foram propagadas em CEF e purificadas por
plaqueamento três vezes (Gouvea et al 1983), sendo desde então mantidas alíquotas
em nitrogênio líquido.
Para esta tese foram utilizadas alíquotas do sobrenadante de culturas de células
Vero (rim de macaco verde africano) previamente inoculada com a amostra de
reovírus aviário S1133wt ou com a amostra P100. Após o desenvolvimento do efeito
citopático, cerca de 72 horas após a inoculação, as culturas foram submetidas a três
ciclos de congelamento-descongelamento, centrifugadas a 1.000g para remoção dos
debris celulares, sendo os sobrenadantes das culturas de células recolhidos e
armazenados à -20ºC, até a hora da extração do dsRNA viral.
49
3.1.2 Extração de dsRNA
O genoma viral foi extraído do sobrenadante das culturas de células utilizando
isotiocianato de guanidina (GITC) e sílica, de acordo com o seguinte protocolo. Em
um tubo de 1,5ml, tipo eppendorf, foram colocados 400µl do sobrenadante de cultura
de células, adicionados de 600µl de GITC 6M, sendo os tubos incubados durante
cinco minutos a temperatura ambiente. Após esse período foi adicionado 3µl de
matriz de sílica (Biotools) sendo essa mistura colocada em um homogeneizador de
sangue durante 20 minutos a temperatura ambiente. Em seguida foi feita a
centrifugação do tubo a 11.000g durante três minutos, sendo então descartado o
sobrenadante com uma pipeta. Ao precipitado adicionou-se 300µl da solução de
lavagem gelada (20mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA; 50mM NaCl e 50% etanol),
ressuspendendo com uma pipeta. Foi feita nova centrifugação a 11.000g e repetiu-se a
lavagem. Ao final dessa etapa foi feita nova centrifugação sendo removida toda a
solução de lavagem. O tubo aberto foi colocado durante um minuto em banho-seco a
60ºC sendo então adicionado 25µl de água livre de nucleases (Promega - P1193) pré-
aquecida. O precipitado foi reconstituído e novamente centrifugado a 11.000g durante
três minutos, sendo que agora o sobrenadante contendo o dsRNA extraído foi
estocado a -20ºC. Este protocolo foi utilizado todas as vezes em que foi feita extração
de dsRNA.
3.1.3 Desenho dos iniciadores para o segmento S1
O primeiro passo foi pesquisar por seqüências do segmento S1 de reovírus
aviários depositadas no GenBank. Selecionamos quatro seqüências completas de
50
reovírus aviários: Amostras 1733 e 176, classificadas como altamente patogênicas;
138 classificada como pouco patogênica e S1133B (oriunda de um dos lotes sementes
de vacinas derivados de S1133wt). Como existem algumas seqüências depositadas no
GenBank com o nome S1133, colocamos um sufixo no nome da amostra para poder
especificá-la. No caso anterior a amostra S1133B, recebeu este sufixo por ter sido
depositada pelo grupo do Professor Javier Benavente da Universidade de Santiago de
Compostela, Espanha.
Com base nessas seqüências fizemos um alinhamento no programa MegAlign
do pacote DNASTAR que demonstrou as regiões conservadas, nas extremidades 5´ e
3´, o que é uma característica da família Reoviridae. Para esta região foram
desenhados, utilizando o programa PrimerSelect (DNASTAR), os iniciadores ARS1a
e ARS1b (Tabela 3) a fim de serem utilizados em reação de transcritase reversa (RT)
para a obtenção do cDNA do segmento S1, seguindo-se de reação em cadeia da
polimerase (PCR) para amplificação do número de cópias em DNA do segmento S1.
3.1.4 RT-PCR para o segmento genômico S1
O dsRNA genômico das amostras S1133wt e P100 extraído com sílica e GITC
conforme descrito anteriormente, foi utilizado como molde para reação de RT-PCR
utilizando “SuperScript One-Step RT-PCR with Platinum Taq” (Invitrogen - 10928-
034) de acordo com as recomendações do fabricante.
Brevemente: foi preparado um master mix para duas reações de 25µl contendo
14µl de H2O livre de nucleases, 25µl da mistura de reação 2X (Solução tampão
adicionada de 0,4mM de cada deoxinucleotídeo (dNTP) e 2,4mM de MgSO4) e 1µl da
mistura de transcritase reversa (SuperScript II) mais Taq DNA polimerase com hot
51
start (Platinum Taq). Em dois tubos de 0,2ml, uma para cada amostra viral, foi
preparada a mistura do dsRNA genômico para desnaturação. Três microlitros do
dsRNA extraído, 1,7µl de DMSO (Sigma – D8418, 7% concentração final) 0,5µl de
cada iniciador (ARS1a e ARS1b – 0,4µM). Esses tubos foram incubados a 95ºC
durante três minutos sendo rapidamente colocados em banho de gelo. Após um
minuto foi adicionado 20µl do master mix em cada tubo. Os dois tubos com as
reações de RT-PCR foram colocados em um termociclador Applied Biosystems
modelo 2400, utilizando o seguinte programa: 45ºC / 30´, 94ºC / 2´, 35 X [94ºC / 45´´,
50ºC / 45´´, 72ºC / 2´] 72ºC / 7´ 4ºC / ∞. Após esse período, 8µl de cada reação foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% adicionado de brometo de etídeo
(0,5µg/ml), a 100V durante uma hora, sendo em seguida observado em
transiluminador UV.
3.1.5 Seqüenciamento do segmento genômico S1
Para o seqüenciamento do segmento S1 foram realizadas novas reações de RT-
PCR, de maneira a obter uma quantidade maior de DNA. As reações foram feitas
exatamente como descrito anteriormente, exceto que foram feitas reações de 100µl.
Após a etapa de RT-PCR o volume total de cada reação foi submetido à eletroforese
em gel de agarose, tal como descrito anteriormente; a fim de purificar as bandas
correspondentes aos segmentos S1 de S1133wt e de P100. Para essa purificação foi
utilizado “Wizard SV gel and PCR clean-up system” (Promega - A9281), de acordo
com as recomendações do fabricante.
Brevemente, as bandas correspondentes aos segmentos S1 foram cortadas do gel
com o auxílio de uma lâmina sendo colocadas em tubos tipo eppendorf de 1,5ml
52
previamente pesados. Em seguida foi feita nova pesagem dos tubos e adicionado a
solução de ligação à membrana (membrane binding solution), na proporção de 10µl
para cada 10mg do gel. Os tubos foram então incubados à 60ºC durante 10 minutos
com agitação ocasional. Após esse período cada gel dissolvido foi colocado em uma
coluna do kit e incubado durante um minuto à temperatura ambiente, sendo em
seguida centrifugado a 10.000g, também durante um minuto. Os precipitados foram
descartados e a coluna adicionada de solução de lavagem (membrane wash solution).
Finalmente o DNA correspondente ao segmento S1 de cada amostra foi eluído da
coluna com 35µl de H2O livre de nucleases (Promega).
Para seqüênciar os amplicons previamente purificados, foi utilizada uma
estratégia (Figura 3) utilizando os iniciadores ARS1a e ARS1b, utilizados para o RT-
PCR, além de outros quatro iniciadores internos: FN2GC, FN3, P10AS e ARS1c
(Tabela 3), desenhados da mesma maneira que ARS1a e ARS1b. Assim foram
processadas seis reações de seqüenciamento para cada segmento genômico, três no
sentido senso e outras três, no sentido anti-senso.
Figura 3. Estratégia de seqüenciamento do segmento S1. As setas indicam o sentido
dos iniciadores.
Todas as reações foram realizadas utilizando o kit ABI PRISM BigDye
Terminator v3.1 da Applied Biosystems (4337455), baseado na metodologia de
dideoxinucleotídeos (Sanger, Nicklen & Coulson, 1977), utilizando o seguinte
53
protocolo. Em cada tubo de 0,2ml foi adicionado 3µl do DNA de S1
(aproximadamente 50ng), 2µl de H2O tridestilada, 2µl de tampão de MgCl2 5X
(80mM Tris-HCl pH 9,0; 2mM MgCl2), 2µl de BigDye e 1µl do iniciador (0,33µM).
As doze reações, seis para S1 de S1133wt e seis para S1 de P100, foram colocadas em
um termociclador Applied Biosystems modelo 2400, sendo utilizado o seguinte
programa: 94ºC / 4´, 30 X [96ºC / 10´´, 50ºC / 5´´, 60ºC / 4´] 4ºC / ∞. Ao final da
reação os produtos foram purificados por precipitação com isopropanol (Berger &
Kimmel, 1987). Os precipitados foram secos durante três minutos em bloco aquecedor
à 60ºC sendo em seguida reconstituídos em 10µl de formamida Hi-Di (Applied
Biosystems - 4311320), incubados à 95ºC durante dois minutos e finalmente
colocados em um seqüenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer de 16
capilares.
Os arquivos de saída do seqüenciador (*.abi) foram inicialmente inspecionados
no programa Chromas versão 1.4, disponível gratuitamente em
(http://www.technelysium.com.au/chromas_lite.html), para rapidamente se ter uma
noção da qualidade do cromatograma e do tamanho confiável da seqüência. Em
seguida esses arquivos foram analisados cuidadosamente e utilizados para montar o
contig de cada amostra utilizando o programa SeqManII (DNASTAR). Uma vez
terminada essa etapa, foi salva a seqüência consenso de cada contig.
Assim obtivemos os arquivos S1 S1133wt.seq e S1 P100.seq, com as
seqüências de nucleotídeos dos segmentos S1 de ambas as amostras. Essas mesmas
seqüências foram utilizadas para dedução das seqüências de aminoácidos das
proteínas p10, p17 e σC, todas produtos do segmento genômico S1, no programa
EditSeq (DNASTAR) utilizando o mecanismo de busca por fases de leitura aberta
(ORF) e comparando com os dados da literatura. As seqüências de nucleotídeos e
54
aminoácidos foram alinhadas no programa MegAlign (DNASTAR), e dessa maneira
foram determinadas as diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento
genômico S1.
3.1.6 Desenho dos iniciadores para os segmentos genômicos da classe M e S2.
Em uma nova pesquisa no GenBank, verificamos que haviam sido recém
depositadas seqüências completas para o segmento genômico M3, o que nos
encorajou a desenhar iniciadores para as regiões altamente conservadas 5´e 3´
verificadas através do alinhamento das seqüências utilizando o programa MegAlign.
Fizemos então o desenho no programa PrimerSelect dos iniciadores ARM3a e
ARM3b. Esses iniciadores foram utilizados para obtenção do cDNA e posterior
amplificação por PCR de todo o segmento genômico M3. Além de serem utilizados
para o seqüenciamento das amostras.
Ainda baseado no alinhamento das seqüências de M3 depositadas no GenBank,
foram desenhados outros seis iniciadores: ARM3c, ARM3e e ARM3g no sentido
senso e ARM3d, ARM3f e ARM3h no sentido anti-senso (Tabela 3). Para todos os
iniciadores internos desenhados foi observado um cuidado para que não fosse
utilizada uma região com alguma mutação, em qualquer das seqüências do GenBank,
nas últimas sete posições da extremidade 3´ do iniciador. Outro cuidado foi tomado de
maneira que os iniciadores ficassem a uma distância entre 400 e 550 bases uns dos
outros em um mesmo sentido.
Esta mesma análise foi realizada para as seqüências depositadas para os
segmentos M1 e M2, os quais tiveram as suas primeiras seqüências depositadas nesta
ordem. A exceção para os segmentos M1 e M2 foi um número maior de iniciadores
55
internos, oito para M1: ARM1c, ARM1e, ARM1g e ARM1i, no sentido senso e
ARM1d, ARM1f, ARM1h e ARM1j, no sentido anti-senso. E outros oito para M2:
ARM2c, ARM2e, ARM2g e ARM2i, no sentido senso e ARM2d, ARM2f, ARM2h e
ARM2j, no sentido anti-senso (Tabela 3).
De maneira análoga ao que foi utilizado para os segmentos da classe M,
decidimos obter iniciadores também para o segmento S2. Assim foram desenhados
ARS2a, ARS2c, ARS2e e ARS2g no senti senso e ARS2b, ARS2d, ARS2f e ARS2h
no sentido anti-senso (Tabela 3). Com a inclusão do segmento S2, aumentamos para
cinco o número de segmentos genômicos seqüenciados nesta tese, superando os
objetivos iniciais.
3.1.7 RT-PCR para os segmentos genômicos da classe M e S2
Tal como para o segmento S1, o sobrenadante das culturas de células Vero
inoculadas com as amostras de reovírus aviários S1133wt e P100, foi utilizado para
extração do dsRNA viral, utilizando o mesmo protocolo de sílica e GITC descrito
anteriormente.
A partir do segmento M3, foi utilizada uma outra metodologia. As etapas de RT
e PCR, não foram mais realizadas em um único passo, e sim passamos a fazer as
reações separadas, em duas etapas distintas.
Cinco microlitros de cada dsRNA extraído foram colocados em dois tubos de
0,2ml adicionados de 1,4µl de DMSO (7% concentração final) e 0,25µl de cada
iniciador (ARM3a e ARM3b - 0,25µM). Os tubos com essa mistura foram incubados
à 95ºC durante três minutos para promover a desnaturação das fitas de dsRNA, sendo
imediatamente acondicionados em banho de gelo, durante um minuto. Um outro tubo
56
foi preparado com os outros reagentes necessários para a reação. Nesse tubo foi
adicionado 8,2µl de H20, 8µl de tampão de reação 5X (50mM Tris-HCl pH 8,3;
75mM KCl; 3mM MgCl2), 4µl de DTT (20mM), 2µl de dNTPs (0,5mM cada), 2µl
(40U) de RNasin (Promega - N2611) e 2µl (200U) da transcritase reversa (Superscript
II - 18064-014). Dessa maneira foram preparadas duas reações de 20µl, uma para
cada amostra viral. Os tubos com as reações foram então colocados em um
termociclador Applied Biosystems modelo 2400 utilizando o seguinte programa: 42ºC
durante 50 minutos, seguida de uma etapa a 70ºC durante 15 minutos para inativação
da transcritase reversa, sendo as amostras então incubadas à 37ºC durante 20 minutos.
Nesta última etapa foi adicionado 1µl (2U) de RNaseH em cada tubo (Life
Technologies - 18021-014). Este mesmo protocolo para reação de transcritase reversa
foi utilizado para as reações subseqüentes: M1, M2 e S2, apenas utilizando o par de
iniciadores próprios de cada segmento.
3.1.8 Amplificação por PCR dos segmentos genômicos classe M
Após a obtenção do cDNA dos segmentos genômicos, foi realizada a etapa de
amplificação do número de cópias de DNA por PCR. Para tanto foram utilizados 1µl
de cada reação de RT para 25µl de reação de PCR. Durante a etapa de otimização do
PCR para os segmentos genômicos da classe M foi utilizado primeiro um protocolo
com uma DNA polimerase comum (Taq DNA polimerase Invitrogen - 11615-010).
Uma vez estabelecidas as melhores condições para as reações, passamos a utilizar
uma mistura de enzimas com atividade de correção e hot start (Platinum Taq HiFi
Invitrogen - 11304-011). Nesse protocolo definitivo preparava-se uma mistura de
reação com 40,5µl de H2O, 5µl de tampão de reação 10X (60mM Tris-SO4 pH 8,9;
57
18mM de sulfato de amônio), 2µl de MgSO4 (2mM), 1µl de dNTPs (0,2mM cada),
0,3µl de cada iniciador (0,25µM) e 0,2µl (1U) de Platinum Taq HiFi, essa mistura foi
dividida em dois tubos com 24µl. Cada tubo então recebeu 1µl de uma das reações de
RT, ou para S1133wt ou para P100. Estabelecemos este protocolo de maneira que
todas as reações fossem elas para M1, M2 ou M3, seriam realizadas da mesma forma.
Uma vez preparadas as misturas para as reações de PCR, os tubos de 0,2ml
foram então colocados em um termociclador Applied Biosystems modelo 2400. Foi
então utilizado o seguinte programa para a amplificação de qualquer segmento
genômico da classe M. 94ºC / 2´ 35X [94ºC / 45´´, 55ºC / 45´´ e 68ºC / 2,5´] 68ºC / 7´
4º / ∞.
Uma vez terminada a reação, 8µl de cada amplicon foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose 0,8% acrescido de brometo de etídio (0,5µg/ml) a
100V durante uma hora. Após este período o gel foi então visualizado em
transiluminador de UV. O segmento genômico M3 foi, em ordem cronológica, o
segundo totalmente seqüenciado nesta tese, posteriormente foram determinadas as
seqüências dos segmentos M1, M2 e S2.
3.1.9 Amplificação por PCR do segmento genômico S2
Para a amplificação do segmento genômico S2 foi utilizado o mesmo protocolo
descrito para a classe M, com a exceção dos iniciadores utilizados (ARS2a e ARS2b)
e do programa de PCR que foi utilizado: 94ºC / 2´ 30X [94ºC / 45´´, 47ºC / 45´´ e
68ºC / 1,5´] 68ºC / 7´ 4º / ∞.
58
3.1.10 Semi-nested PCR para segmentos da classe M e S2
A fim de facilitar o seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e de
S2, decidimos mudar a estratégia utilizada anteriormente para o segmento S1. Agora
antes de purificar os amplicons para o seqüenciamento, foi adicionada uma nova etapa
de PCR em semi-nested. Utilizando como molde a primeira reação de PCR na qual
era amplificado todo o segmento genômico.
Nesta segunda etapa era utilizada uma nova combinação de pares de iniciadores:
ARM3a com ARM3d e ARM3c com ARM3b para o segmento genômico M3. Para os
segmentos genômicos M1 e M2 foram utilizados os pares de iniciadores ARMXa com
ARMXf e ARMXe com ARMXb, onde X corresponde ao número do segmento
amplificado. Por exemplo, se estivesse sendo amplificado o segmento M1 seria
utilizada a combinação ARM1a com ARM1f e ARM1e com ARM1b. O programa
utilizado para o semi-nested PCR dos segmentos da classe M foi: 94ºC / 2´ 28X [94ºC
/ 45´´, 55ºC / 45´´ e 68ºC / 1,5´] 68ºC / 7´ 4º / ∞
Esta metodologia foi utilizada para todos os segmentos da classe M, sendo,
portanto gerados dois amplicons, parcialmente sobrepostos, para cada segmento
(Figura 4). Metodologia semelhante foi utilizada para o segmento genômico S2, a
diferença sendo a combinação dos pares de iniciadores utilizados, ARS2a com ARS2d
e ARS2c com ARS2b (Figura 4) e o programa utilizado: 94ºC / 2´ 28X [94ºC / 45´´,
52ºC / 45´´ e 68ºC / 1´] 68ºC / 7´ 4º / ∞. As reações de semi-nested foram realizadas
tal como descrito anteriormente para a amplificação por PCR dos segmentos
genômicos da classe M e S2, com a diferença de que foi utilizado um volume total de
100µl para cada reação.
59
Figura 4. Estratégia de semi-nested PCR para os segmentos da classe M e S2. As setas
indicam o sentido de cada iniciador.
1324bp 1 ARS2a
ARS2b
ARS2c
S2.2
Estratégia de Semi-Nested S2
S2.1 ARS2d
1996bp 1 ARM3a
ARM3b
ARM3e
ARM3dM3 .1
M3.2
1 ARM3a
ARM3b
ARM3e
ARM3dM3 .1
M3.2
1 ARM3a ARM3a
ARM3b ARM3b
ARM3eARM3e
ARM3dARM3dM3 .1
M3.2Estratégia de Semi-Nested M3
2158bp 1 ARM2a
ARM2b
ARM2e
ARM2fM2 .1
M2.2
1 ARM2a
ARM2b
ARM2e
ARM2fM2 .1
M2.2
1 ARM2a ARM2a
ARM2b ARM2b
ARM2eARM2e
ARM2fARM2fM2 .1
M2.2Estratégia de Semi-Nested M2
2283bp 1 ARM1a
ARM1b
ARM1e
ARM1fM1 .1
M1.2
1 ARM1a
ARM1b
ARM1e
ARM1fM1 .1
M1.2
1 ARM1a ARM1a
ARM1b ARM1b
ARM1eARM1e
ARM1fARM1fM1 .1
M1.2
Estratégia de Semi-Nested M1
60
Todos os amplicons obtidos por semi-nested foram purificados com “GFX PCR
DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare - 27-9602-01), de acordo com o
protocolo do fabricante.
Brevemente: as bandas correspondentes aos amplicons foram cortadas do gel
com o auxílio de uma lâmina sendo colocadas em tubos tipo eppendorf de 1,5ml
previamente pesados. Em seguida foi feita nova pesagem dos tubos e adicionado o
tampão de captura 10µl para cada 10mg do gel. Os tubos foram então incubados a
60ºC durante 10 minutos com agitação ocasional. Após esse período os géis
dissolvidos foram colocados um em cada coluna do kit e incubados durante um
minuto à temperatura ambiente, sendo em seguida centrifugados a 10.000g durante 30
segundos. Os precipitados foram descartados e a coluna lavada com 500μl de tampão
de lavagem. Finalmente o DNA correspondente aos segmentos de cada amostra foram
eluídos da coluna com 35µl de H2O livre de nucleases (Promega).
3.1.11 Seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e S2
Para o seqüenciamento dos segmentos genômicos da classe M e o segmento S2,
foi utilizada estratégia semelhante àquela utilizada para o segmento S1. A diferença
entre as estratégias foi dada pelo fato de que para cada segmento havia dois
amplicons, de maneira que deveriam ser observados quais os iniciadores deveriam ser
utilizados com cada amplicon.
Para seqüênciar o amplicon M3.1, flanqueado pelos iniciadores ARM3a e
ARM3d, foram utilizados os iniciadores ARM3a e ARM3c no sentido senso e
ARM3d, ARM3f e ARM3h no sentido anti-senso. O amplicon M3.2 flanqueado pelos
61
iniciadores ARM3e e ARM3b, foi seqüenciado fazendo-se o uso dos iniciadores
ARM3e e ARM3g no sentido senso e ARM3b no sentido anti-senso.
O amplicon M1.1, flanqueado pelos iniciadores ARM1a e ARM1f, foi
seqüenciado utilizando os iniciadores ARM1a, ARM1c e ARM1e no sentido senso e
ARM1f, ARM1h e ARM1j no sentido anti-senso. Para o amplicon M1.2, flanqueado
pelos iniciadores ARM1e e ARM1b, foram utilizados os iniciadores ARM1e, ARM1g
e ARM1i no sentido senso e ARM1b, ARM1d e ARM1f no sentido anti-senso.
Por último para a classe M, o amplicon M2.1, flanqueado pelos iniciadores
ARM2a e ARM2f, foi seqüenciado utilizando os iniciadores ARM2a, ARM2c e
ARM2e no sentido senso e ARM2f, ARM2h e ARM2j no sentido anti-senso. Para o
amplicon M2.2, flanqueado pelos iniciadores ARM2e e ARM2b, foram utilizados os
iniciadores ARM2e, ARM2g e ARM2i no sentido senso e ARM2b, ARM2d e ARM2f
no sentido anti-senso.
Para o segmento S2, O amplicon S2.1, flanqueado por ARS2a e ARS2d foi
seqüenciado utilizando os iniciadores ARS2a e ARS2c no sentido senso e ARS2d,
ARS2f e ARS2h, no sentido anti-senso. A segunda parte do segmento S2, S2.2 foi
seqüenciada utilizando os iniciadores ARS2c, ARS2e e ARS2g no sentido senso,
enquanto que no sentido anti-senso foram utilizados os iniciadores ARS2b e ARS2d.
Todas as estratégias de seqüenciamento dos segmentos da classe M e do segmento S2
estão ilustradas na Figura 5, assim como todos os iniciadores estão listados na Tabela
3.
62
Figura 5. Estratégias de seqüenciamento para os segmentos da classe M e S2. As setas
indicam o sentido de cada iniciador.
Estratégia de Seqüenciamento M1
ARM1aM1.1 1352pb
ARM1c
ARM1fARM1hARM1j
ARM1e
ARM1bM1.2 1446pb
ARM1e ARM1g ARM1i
ARM1f ARM1d
Estratégia de Seqüenciamento M1
ARM1aM1.1 1352pb
ARM1c
ARM1fARM1hARM1j
ARM1eARM1aARM1aM1.1 1352pb
ARM1cARM1c
ARM1fARM1fARM1hARM1hARM1jARM1j
ARM1eARM1e
ARM1bM1.2 1446pb
ARM1e ARM1g ARM1i
ARM1f ARM1d ARM1bARM1bM1.2 1446pb
ARM1eARM1e ARM1gARM1g ARM1iARM1i
ARM1fARM1f ARM1dARM1d
Estratégia de Seqüenciamento M2
ARM2aM2.1 1258pb
ARM2c
ARM2fARM2hARM2j
ARM2e
ARM2bM2.2 1267pb
ARM2e ARM2g ARM2i
ARM2f ARM2d
Estratégia de Seqüenciamento M2
ARM2aM2.1 1258pb
ARM2c
ARM2fARM2hARM2j
ARM2eARM2aARM2aM2.1 1258pb
ARM2cARM2c
ARM2fARM2fARM2hARM2hARM2jARM2j
ARM2eARM2e
ARM2bM2.2 1267pb
ARM2e ARM2g ARM2i
ARM2f ARM2d ARM2bARM2bM2.2 1267pb
ARM2eARM2e ARM2gARM2g ARM2iARM2i
ARM2fARM2f ARM2dARM2d
ARM3aM3.1 1190pb
ARM3c
ARM3dARM3fARM3h
ARM3bM3.2 922pb
ARM3e ARM3g
Estratégia de Seqüenciamento M3
ARM3aM3.1 1190pb
ARM3c
ARM3dARM3fARM3h
ARM3aARM3aM3.1 1190pb
ARM3cARM3c
ARM3dARM3dARM3fARM3fARM3hARM3h
ARM3bM3.2 922pb
ARM3e ARM3g
ARM3bARM3bM3.2 922pb
ARM3eARM3e ARM3gARM3g
Estratégia de Seqüenciamento M3
Estratégia de Seqüenciamento S2
ARS2a S2.1 911pb
ARS2c
ARS2dARS2f
ARS2b S2.2 928pb
ARS2c ARS2e
ARS2h
ARS2g
ARS2d
63
Tabela 3. Iniciadores desenhados para esta tese.
Segmento Iniciador Sentido Seqüência 5´- 3´ Tamanho posição
M1 ARM1a S 5´- GCTTTTCTCGACATGGCCTATC - 3´ 22 1 - 22 M1 ARM1c S 5´- AAATCCACTGATCGCATCTTCG - 3´ 22 544 - 565 M1 ARM1e S 5´- GCAATGACACCTCCTCGTGG - 3´ 20 838 - 857 M1 ARM1g S 5´- GATGTGGGTGATGCTTTGG - 3´ 19 1330 - 1348 M1 ARM1i S 5´- GTGTTAGCATGGTATATTCCTTCC - 3´ 24 1831 - 1854 M1 ARM1j AS 5´- GAACGACGAGAAGGAAGCAA - 3´ 20 241 - 260 M1 ARM1h AS 5´- GAGGAGGTGTCATCGCTTGAAC - 3´ 22 832 - 853 M1 ARM1f AS 5´- GGATCCAAAGCATCACCCAC - 3´ 20 1333 - 1352 M1 ARM1d AS 5´- GGAAGGAATATACCATGCTAACAC - 3´ 24 1831 - 1854 M1 ARM1b AS 5´- GATGAGTATCTCAAGACGACTAACCC - 3´ 26 2258 - 2283 M2 ARM2a S 5´- GCTTTTTCAGTGCCAGTCTTTCTC - 3´ 24 1 - 24 M2 ARM2c S 5´- CTATGTCGATTGTTTTGTGGGT - 3´ 22 455 - 476 M2 ARM2e S 5´- AATCAATGCGCTTGGTGAATG - 3´ 21 892 - 912 M2 ARM2g S 5´- TATCGCCCAAGTGGCTGAAGT - 3´ 21 1289 - 1309 M2 ARM2i S 5´- AGCACGCGCACTCCAACCT - 3´ 19 1778 - 1796 M2 ARM2j AS 5´- GGAAGAAACCCAGTAGAATTACC - 3´ 23 267 - 289 M2 ARM2h AS 5´- TGTCATTAGTAGCAAGTGAAGGAG - 3´ 24 799 - 822 M2 ARM2f AS 5´- TCAAAAGGTATTTTCGACTGCAT - 3´ 23 1236 - 1258 M2 ARM2d AS 5´- GGAGTGCTAAAGGGAGAAGACTC - 3´ 23 1704 - 1726 M2 ARM2b AS 5´- GATGAATAACGTGCCAATCCAG - 3´ 22 2137 - 2158 M3 ARM3a S 5´- GCTTTTTGAGTCCTAGCGTGG - 3´ 21 1 - 21 M3 ARM3c S 5´- AAGATCTTAGCTAAGCAGCAGAC - 3´ 23 508 - 530 M3 ARM3e S 5´- GAGGCTGCTATTCTCATGGAT - 3´ 21 1075 - 1095 M3 ARM3g S 5´- CATGAGGCTAGTGCTGAGTGG - 3´ 21 1612 - 1632 M3 ARM3h AS 5´- AGTAGGAATTTCTCATAATGCTC - 3´ 23 307 - 329 M3 ARM3f AS 5´- GCGTAGTACATGTCCATAAACGG - 3´ 23 640 - 662 M3 ARM3d AS 5´- AGCGCACCGAGTAAGAAGG - 3´ 19 1172 - 1190 M3 ARM3b AS 5´- GATGAATAACCGAGTCCGCC - 3´ 20 1977 - 1996 S1 ARS1a S 5´- GCTTTTTCAATCCCTTGTTC - 3´ 20 1 - 20 S1 FN3 S 5´- ATGGCGGGTCTCAATCCAT - 3´ 19 630 - 648 S1 ARS1c S 5´- ACTAGTAACGTCGTGTTATTAACC - 3´ 24 1347 - 1370 S1 P10AS AS 5´- TCAAACGTCGTATGGCGGAGCC - 3´ 22 300 - 321 S1 FN2GC AS 5´- CCGCCGCCCGTCAGCCGTTCATAGAT - 3´ 26 726 - 751 S1 ARS1b AS 5´- GATGAATAACCAATCCCAGTAC - 3´ 22 1622 - 1643
S1 ORF2 *P17S S 5´- ATGCAATGGCTCCGCCATACGAC - 3´ 23 293 - 315 S1 ORF2 *P17AS AS 5´- TCATAGATCGGCGTCAAATCGCC - 3´ 23 711 - 733
S2 ARS2a S 5´- GCTTTTTCTTCCACGATGGCG - 3´ 21 1 - 21 S2 ARS2c S 5´- TACCCTAGATGGGCAAACAGACG - 3´ 23 397 - 419 S2 ARS2e S 5´- GCATTTCGCTTACGTGTGTGC - 3´ 21 810 - 830 S2 ARS2g S 5´- AACGCAGGAGGCTAATGACTT - 3´ 21 1080 -1100 S2 ARS2h AS 5´- TGACAATCCTTCATCAGTCCA - 3´ 21 298 - 318 S2 ARS2f AS 5´- TCATATTCGGCCACGTCTCAAC - 3´ 22 499 - 520 S2 ARS2d AS 5´- GGTTGACGGCAAGCCAT - 3´ 17 895 - 911 S2 ARS2b AS 5´- GATGAATACATCCACGTGCTGCC - 3´ 23 1302 -1324
S: Sentido senso; AS: Anti-senso; * iniciadores para clonagem.
64
Para todas as reações de seqüenciamento dos segmentos da classe M foram
utilizados entre 60 e 80ng de DNA das amostras, 2µl de tampão de MgCl2 5X (80mM
Tris-HCl pH 9,0; 2mM MgCl2), 2µl de BigDye v3.1, 1µl do iniciador (0,33µM) e H20
tridestilada q.s.p. 10µl. O mesmo programa foi utilizado para todas as reações: 40X
[94º / 10´´; 50ºC / 30´´; 60ºC / 4´] em um termociclador Applied Biosystems modelo
2400.
Ao final da reação os produtos foram purificados por precipitação com
isopropanol, como utilizado anteriormente para S1. Os precipitados foram secos
durante três minutos em bloco aquecedor à 60ºC sendo em seguida reconstituídos em
10µl de formamida Hi-Di (Applied Biosystems), incubados à 95ºC durante dois
minutos e, finalmente lidos em um seqüenciador automático modelo 3100 Avant
Genetic Analizer (Applied Biosystems) de 4 capilares.
Os arquivos de saída do seqüenciador foram analisados da mesma maneira que
para o segmento S1, sendo, ao final da análise obtidos os arquivos M3 S1133wt.seq,
M3 P100.seq, M1 S1133wt.seq, M1 P100.seq, M2 S1133wt.seq, M2 P100.seq, S2
S1133wt.seq e S2 P100.seq. Tal como realizado para o segmento S1, foram
determinadas as ORFs e deduzidas as seqüências de aminoácidos. Foram então
utilizadas para a análise as seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos relativas aos
segmentos genômicos M1, M2 e M3 e S2.
3.1.12 Ferramentas de bioinformática utilizadas na análise das seqüências
Foram utilizadas diversas ferramentas de bioinformática para realizar as análises
das seqüências de nucleotídeos e aminoácidos relativas aos segmentos genômicos S1,
S2 e M1 a M3 seqüenciados nesta tese, além de outras seqüências de reovírus aviários
65
disponíveis no GenBank (Tabela 4A e 4B). Além dos já mencionados anteriormente:
EditSeq, MegAlign, PrimerSelect e SeqManII todos do pacote de programas
DNASTAR e do programa Chromas para visualização dos cromatogramas também
foram utilizadas ferramentas disponíveis gratuitamente tanto para download quanto
outras em servidores da Internet.
Foram utilizados o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics
Analysis v. 3.1) descrito por Kumar, Tamura & Nei (2004) para analise filogenética; o
programa BioEdit (Hall, 1999) para alinhamento e análise de seqüências de
nucleotídeos e aminoácidos. Os programas ProtParam e ProtScale (Gasteiger et al.,
2003; Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy (Expert Protein Analysis System
– www.expasy.org) para cálculo de parâmetros físico-químicos relacionados as
seqüências deduzidas das proteínas. Marcoil (http://www.isrec.isb-
sib.ch/webmarcoil/webmarcoilC1.html - Delorenzi & Speed, 2002) e MultiCoil
(http://multicoil.lcs.mit.edu/cgi-bin/multicoil - Wolf, Kim & Berger, 1997) para
predição de estruturas em coiled-coil (Lupas, van Dyke & Stock, 1991; Lupas, 1997).
O servidor 2ZIP (http://2zip.molgen.mpg.de/index.html - Bornberg-Bauer, Rivals &
Vingron, 1998) para predição de motivos de zíperes de leucina; o servidor DrawHCA
(http://bioserv.rpbs.jussieu.fr - Gaboriaud et al., 1987) para análise de clusters
hidrofóbicos; o programa Swiss-PdbViewer (http://www.expasy.org/spdbv/ - Guex
& Peitsch, 1997) e o servidor Swiss-Model (http://swissmodel.expasy.org/) para
modelagem por homologia; e o programa RasMol (www.rasmol.org – Sayle &
Milner-White, 1995), para visualização de estruturas de proteínas.
66
Tabela 4A. Números de acesso no GenBank para as seqüências das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17 e σA utilizadas nas análises.
Números de acesso das seqüências de proteínas Amostras µA µB µNS p10 p17 σA
1017-1 AAV49512 AAV34177 AAS78988 AAR10964 AAR11843 AAG44961 138 AAT52024 AAW78485 AAT52026 AAF45154 AAF45155 AAC18122 1733B ND ND AAQ81873 ND ND ND 1733L AAV49513 AAV34180 AAS78989 AAB61605 AAB61606 AAG44956 176 AAT52025 AAW78486 AAT52027 AAF45151 AAF45152 AAC18121 2408 AAV49514 AAV34179 AAS78990 AAR10969 AAR11848 AAG09473 601G AAV49515 AAV34183 AAS78991 AAR10961 AAR10971 AAG45147 601SI ND ND ND AAR10963 AAR11842 AAG44968 750505 AAV49516 AAV34184 AAS78992 AAQ92364 AAR10970 AAG44966 916 AAV49517 AAV34185 AAS78993 AAR10968 AAR11847 AAG44963 918 AAV49518 AAV34187 AAS78994 AAR10960 AAR10972 AAG44965 919 AAV49519 AAV34181 AAS78995 AAR10967 AAR11846 AAG44962 FC ND ND ND DQ868789* DQ868789* ND OS161 AAV49520 AAV34186 AAS78996 AAR10965 AAR11844 AAG44969 R2 AAV49521 AAV34182 AAS78997 AAR10966 AAR11845 AAG44964 S1133B ABC01917 ABC01918 AAT85608 AAK18186 AAK18187 ND S1133L AAV49511 AAV34176 AAS78987 ND ND AAD17921 T6 AAV49522 AAV34178 AAS78998 AAR10962 AAR11841 AAG44967
ND: não disponível; * Seqüência do segmento S1 completo.
67
Tabela 4B. Números de acesso no GenBank para as seqüências da proteína σC
utilizadas nas análises.
Amostras Números de Acesso σC 1017-1 AAG44982
138 AAF45156 1733L AAB61607
176 AAF45153 2408 AAF97730 601G AAG44983 601SI AAF97732
750505 AAF97735 916 AAG44980 918 AAG44981 919 AAF97734 FC DQ868789*
OS161 AAF97731 R2 AAG44979
S1133B AAK18188 S1133G AAW55563 S1133S AAC42113
T6 AAF97733 GuangxiR1 AAY32587
RAM-1 AAA57268 Somerville 4 AAA57218 GEI09 97M AAL83491 GEI10 97M AAL83490 GEL01 96T AAL83492 GEL03 97T AAL83493 GEL05 97M AAL83494 GEL06 97M AAL83495 GEL12 98M AAL83496 GEL13a98M AAL83497 GEL13b98M AAL83498 NLA13 96T AAL83499 NLI02 88M AAL83500 NLI12 96M AAL83501
* Seqüência do segmento S1 completo.
68
3.2 Clonagem e expressão da proteína p17
3.2.1 Desenho dos iniciadores.
Com o auxílio do programa PrimerSelect foram desenhados dois iniciadores,
P17S e P17AS (Tabela 3) de maneira a amplificar toda a segunda ORF do segmento
S1. Não foram incluídos sítios para enzimas de restrição nos iniciadores, mas apenas o
códon de iniciação (ATG) na extremidade 5´ do iniciador P17S e a seqüência para o
códon de terminação (TGA) na extremidade 5´ do iniciador P17AS.
3.2.2 Amplificação por PCR da ORF-p17
O amplicon purificado utilizado para seqüenciamento do segmento S1 da
amostra S1133wt foi utilizado como molde para a amplificação da ORF-p17 com os
iniciadores P17S e P17AS. Em um tubo de 0,2ml foi adicionado 41µl de H20, 5µl de
tampão de reação 10X (10mM Tris-HCl, pH 8,3; 50mM KCl; 2,5mM MgCl2 e
0,001% gelatina), 0,5µl de dNTPs (0,125mM cada), 1µl de cada iniciador (0,4µM),
0,5µl (2,5U) de Platinum Taq e 1µl do DNA molde. Após o preparo da reação o tubo
foi colocado em um termociclador , utilizando o seguinte programa: 94ºC / 2´ 25X
[94ºC / 30´´, 55ºC / 30´´, 72ºC / 50´´] 72ºC / 10´ 4ºC / ∞. Ao final da reação 5µl do
amplicon foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% acrescido de
brometo de etídio (0,5µg/ml) a 100V durante 40 minutos.
69
3.2.3 Purificação do amplicon ORF-p17
Todo o restante do produto de PCR da ORF-p17 (45µl) foi purificado com GFX
(GE Healthcare) diretamente do tubo de PCR, de acordo com as instruções do
fabricante.
3.2.4 Clonagem da ORF-p17 no vetor pCR T7 / NT-TOPO
Dois microlitros do amplicon ORF-p17 purificado foram adicionados a um tubo
de 0,2ml contendo 1µl de uma solução salina (200mM NaCl; 10mM MgCl2), 2µl de
H20 estéril (Invitrogen) e 1µl do vetor (10ng). Essa reação foi misturada gentilmente e
incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente. Após esse período a reação foi
colocada em banho de gelo. Essa construção permitiu a expressão da proteína p17
fusionada a uma cauda de histidina N-terminal codificada pelo vetor.
3.2.5 Transformação de células competentes TOP10F´
O kit utilizado para a clonagem e expressão da proteína p17, pCR T7 / NT-
TOPO TA expression (Invitrogen - K4200-01) fornece células TOP10F´
quimicamente competentes as quais foram utilizadas para a transformação com o
plasmídeo TOPO-p17. Assim 2µl da reação de clonagem foram adicionados a um
tubo contendo células TOP10F’ competentes. Após uma breve homogeneização o
tubo foi incubado em banho de gelo durante 15 minutos. Após essa incubação o tubo
foi submetido a um choque térmico por incubação à 42ºC durante 30 segundos, sendo
imediatamente colocado em banho de gelo por mais dois minutos. Em seguida foram
70
adicionados 250µl de meio SOC à temperatura ambiente. O tubo foi então incubado à
37ºC sob agitação (70 RPM) durante 30 minutos. Ao final desse período três alíquotas
(10, 50 e 100µl) foram estriadas em placas de ágar LB contendo ampicilina
(100µg/ml) sendo incubadas durante 16 horas à 37ºC.
3.2.6 Análise dos transformantes por PCR
Algumas colônias crescidas nas placas de ágar LB foram analisadas quanto à
presença e correta orientação do incerto por PCR utilizando os iniciadores T7 forward
(Invitrogen) e P17AS. Em cada tubo de 0,2ml, um para cada colônia, foram
adicionados 20,5µl de H20, 2,5µl de tampão de reação 10X, 0,75µl de MgCl2
(1,5mM), 0,5µl de dNTPs (0,2mM cada), 0,3µl do iniciador T7 forward (0,2µM),
0,25µl do iniciador P17AS (0,2µM) e 0,2µl (1U) de Taq DNA polimerase (Invitrogen
- 11615-010).
Cada colônia a ser analisada foi tocada com uma ponteira sendo essa utilizada
para homogeneizar um tubo de reação de PCR. Após isso ser feito para cada colônia
analisada os tubos com as reações foram colocados no termociclador, utilizando o
seguinte programa: 94ºC / 10´ 25X [94ºC / 45´´, 47ºC / 30´´, 72ºC / 1´] 72ºC / 7´ 4ºC /
∞.
3.2.7 Análise dos transformantes por seqüenciamento
Uma colônia selecionada pela reação de PCR foi inoculada em 10ml de meio
LB suplementado com ampicilina (100µg/ml) e incubada durante 16 horas à 37ºC. No
dia seguinte o plasmídeo TOPO-p17 foi extraído (miniprep) com “Wizard Plus SV
71
Minipreps DNA Purification System” (Promega – A1330), de acordo com as
recomendações do fabricante.
Foram preparadas duas reações de seqüenciamento para o plasmídeo TOPO-
p17. A primeira utilizou 2µl do plasmídeo, 3µl de H2O tridestilada, 2µl do tampão
MgCl2 5X, 2µl de BigDye v3.1 e 1µl do iniciador T7 forward (0,33µM). A segunda
reação foi preparada exatamente como a primeira, exceto pela utilização do iniciador
T7 reverse. Dessa maneira foi obtida a seqüência do plasmídeo na região com o
inserto.
3.2.8 Estocagem do clone com o plasmídeo TOPO-p17
O clone caracterizado por PCR e seqüenciamento foi inoculado em 2ml de meio
LB suplementado com ampicilina (100µg/ml) e incubado à 37ºC até atingir a fase
estacionária de crescimento. Em seguida o meio inoculado foi dividido em duas
alíquotas as quais foram adicionadas de glicerol estéril (15% concentração final) e
congeladas em nitrogênio líquido. O plasmídeo TOPO-p17, purificado na miniprep,
foi estocado a -20ºC.
3.2.9 Transformação de células BL21(DE3)pLysS
O plasmídeo TOPO-p17 está sob controle de um promotor T7, o qual necessita
da T7 RNA polimerase para que o inserto seja transcrito. Por esse motivo o plasmídeo
TOPO-p17 foi utilizado para transformar células BL21(DE3)pLysS.
O plasmídeo TOPO-p17 foi diluído de maneira a se ter 10ng do vetor em 2µl de
H2O. Esses 2µl foram então adicionados a tubo de “One Shot BL21(DE3)pLysS”,
72
células quimicamente competentes (Invitrogen) e incubados em banho de gelo durante
30 minutos.
O tubo foi exposto a um choque térmico por incubação à 42ºC em banho-maria
durante 45 segundos, sendo então imediatamente recolocado em banho de gelo por
dois minutos. Foram adicionados 250µl de meio SOC à temperatura ambiente, sendo
o tubo incubado a 37ºC durante 30 minutos sob agitação (70 RPM).
Após esse período de incubação, toda a reação de transformação foi adicionada
a 10ml de meio LB suplementado de ampicilina (100µg/ml) e cloranfenicol
(34µg/ml). O tubo então foi incubado durante 16 horas à 37ºC sob agitação.
3.2.10 Indução da expressão da proteína p17
A partir do tubo que foi deixado durante 16 horas com a transformação de
células BL21(DE3)pLysS foram retirados 500µl para cada novo inóculo (três) em
10ml de meio LB. Os tubos foram então incubados à 37ºC até atingir uma OD600 entre
0,5 e 0,8, o que ocorreu aproximadamente duas horas após a incubação. Cada uma das
culturas foi então dividida em duas com 5ml cada. Foi então adicionado IPTG nas
concentrações de 0,5; 0,75; 1; 1,5 e 2,0 mM. Um tubo permaneceu sem a adição de
IPTG como controle negativo da indução.
Foram retirados 500µl de cada cultura, centrifugados a 13.000g e descartados os
sobrenadantes. Esses precipitados, tempo zero de indução, foram guardados a -20ºC.
As culturas foram incubadas até 5 horas à 37ºC sendo retiradas duas alíquotas de
250µl a cada hora. As alíquotas foram centrifugadas e guardadas tal como feito para o
tempo zero.
73
3.2.11 Análise da expressão da proteína His-p17 por SDS-PAGE
Uma das alíquotas de 250µl retirada a cada tempo foi reconstituída em 40µl de
tampão de amostra de SDS-PAGE 1X. Todos os tubos foram então incubados a 100ºC
durante cinco minutos e centrifugados 15 segundos. Cinco microlitros de cada
amostra foram aplicados em gel de SDS-PAGE descontínuo (4% gel de empilhamento
e 10% gel de resolução) (Laemmli, 1970).
A outra alíquota de cada tempo foi descongelada e reconstituída em 250µl de
tampão de lise (50mM de fosfato de potássio pH 7,8; 100mM NaCl; 100mM KCl;
10% glicerol; 0,5% Triton X-100 e 10mM imidazol). As amostras foram congeladas
rapidamente em nitrogênio líquido e descongelas em banho-maria à 42ºC. Esse ciclo
de congelamento e descongelamento foi repetido 3 vezes.
As amostras foram então centrifugadas a 13.000g durante um minuto à 4ºC para
precipitar as proteínas insolúveis. Os sobrenadantes foram transferidos para os tubos
de 1,5ml e colocados em banho de gelo. Vinte microlitros do sobrenadante foram
retirados e misturados volume a volume em tampão de amostra de SDS-PAGE 2X
(Laemmli, 1970) e incubados a 100ºC durante cinco minutos.
Os precipitados foram reconstituídos em 100µl de tampão de amostra de SDS-
PAGE 1X e também incubados a 100ºC durante cinco minutos. Dez microlitros do
sobrenadante em tampão de amostra e 5µl do precipitado, também em tampão de
amostra, foram submetidos a SDS-PAGE. Para todos os géis de SDS-PAGE foi
aplicada uma tensão de 100V, durante duas horas e dez minutos. Ao final da
eletroforese, os géis foram corados com azul de Coomassie e observados em
transiluminador.
74
3.2.12 Confirmação da expressão de His-p17 por western blotting
Para a confirmação de que a proteína superexpressa encontrada nos precipitados
era His-p17, foi realizada a detecção da cauda de histidina por western blotting. As
amostras testadas foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida, tal como
descrito anteriormente. Após a eletroforese os géis foram utilizados para transferência
das amostras para uma membrana de nitrocelulose Hybond-C extra (Amersham –
RPN203E) durante 30 minutos a uma corrente de 140mA, utilizando tampão de
Bjerrum e Schafer-Nielsen gelado (48mM Tris base; 39mM glicina; 20% metanol pH
9,2) em um equipamento de transferência Trans-Blot Semi-Dry (Biorad - 170-3940).
Após a transferência, a membrana foi incubada em um tampão TBST-leite
(10mM Tris-HCl, pH 8,0; 150mM NaCl; 0,05% Tween-20; 5% (p/v) leite em pó
desnatado), durante uma hora, a fim de saturar sítios de ligação não específicos. Ao
final dessa etapa a membrana foi lavada três vezes, durante 10 minutos, com TBST.
Uma vez lavada a membrana, foi adicionada a solução com o anticorpo
monoclonal primário anti-cauda His (Novagen - 70796-4) diluído 1:10.000 em
tampão TBST. A membrana foi então incubada à 37ºC durante uma hora com
agitação constante. Ao final desse período, a solução com os anticorpos primários foi
removida, foi feita então a lavagem da membrana três vezes, durante 10 minutos, com
TBST para efetuar a remoção de anticorpos não ligados.
Após a etapa de lavagem a membrana foi mergulhada em uma solução contendo
o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado a fosfatase alcalina
(Novagen - 69266-3) diluído 1:5.000 e incubada novamente por uma hora à 37ºC.
Findo o tempo de incubação, a solução contendo o anticorpo secundário foi removida
e a membrana foi novamente lavada com TBST, como descrito anteriormente. Após
75
as lavagens com TBST foram feitas duas lavagens com TBS, também durante 10
minutos cada.
A reação foi revelada pela adição do substrato cromógeno BCIP/NBT (5-
bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato / nitro-azul tetrazólio, Promega – S3771) em tampão
de revelação de fosfatase alcalina (100mM NaCl; 5mM MgCl2; 100mM Tris-HCl pH
9,2). A membrana ficou mergulhada nessa solução, sob agitação, até ser atingida a
intensidade desejada para coloração das bandas, sendo então lavada duas vezes com
TBS, seca a temperatura ambiente e fotografada com câmera digital.
76
4. Resultados
4.1. Seqüenciamento e análise dos segmentos genômicos M1, M2, M3, S1 e S2.
4.1.1 Desenho dos iniciadores para os segmentos M1, M2, M3, S1 e S2.
Quando os objetivos desta tese foram traçados não havia sido publicada sequer
uma seqüência para quaisquer dos segmentos da classe M das amostras de reovírus
aviários. Em função disto, algumas metodologias foram estudadas de maneira a ser
possível a obtenção destas seqüências. Foi então escolhida a metodologia
originalmente descrita por Lambden et al., (1992) e posteriormente adaptada por
outros pesquisadores (Vreede et al., 1998; Potgieter, Steele & van Dijk, 2002), a qual
consiste na adição de um oligonucleotídeo aos terminais 3´ das moléculas de dsRNA e
a utilização de um iniciador complementar ao oligonucleotídeo ligado para então
promover a transcrição reversa e a posterior amplificação por PCR.
Estavam sendo realizados os primeiros ensaios com esta técnica quando foram
disponibilizadas as primeiras seqüências do segmento M3, logo em seguida do
segmento M1 e por fim do segmento M2. Uma vez que os terminais 5´ e 3´ das
moléculas de dsRNA dos reovírus aviários são bastante conservados, principalmente
quando comparados os mesmos segmentos, decidimos então desenhar os iniciadores
com base no alinhamento das seqüências disponíveis, tal como descrito em material e
métodos.
Para os segmentos S1 e S2 já eram conhecidas seqüências de outras amostras e
pode-se então fazer o alinhamento dessas seqüências e desenhar os iniciadores, como
depois foi realizado para os segmentos da classe M.
77
4.1.2 Transcrição reversa e amplificação das seqüências de cDNA por PCR
Todas os segmentos genômicos foram transformados em cDNA e amplificados
como descrito em material e métodos. Os amplicons foram submetidos a eletroforese
em gel de agarose para confirmação da amplificação dos produtos com os tamanhos
esperados. Dessa forma, foram visualizadas bandas de tamanho compatível com
1643bp para as amostras S1133wt e P100 quando da amplificação do segmento S1;
outras com tamanho próximo aos 1324bp para os segmentos S2 e bandas compatíveis
com o tamanho de 2283, 2158 e 1996bp quando foram amplificados os segmentos
M1, M2 e M3, respectivamente.
4.1.3 Comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2
Após os cromatogramas das reações de seqüenciamento terem sido devidamente
analisados e transformados em seqüências, foram realizados o alinhamento e
comparação das seqüências dos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2 das amostras
S1133wt e P100.
O resultado do alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas para o
segmento M1 mostrou 11 diferenças entre as amostras S1133wt e P100 (Tabela 5).
Todas as mutações foram observadas na região codificante de M1 (proteína µA),
dessas diferenças entre as duas amostras, seis estão localizadas em uma região entre
os nucleotídeos 1347 e 1602. Dez diferenças foram mutações nas terceiras posições
dos códons, enquanto que apenas uma foi encontrada em uma primeira posição. Nove
mutações em terceiras posições e a única em uma primeira posição foram provocadas
por transições (C – T = 5, T – C = 3, A – G = 1, G – A = 1) e somente a mutação
78
observada no nucleotídeo 1347, foi provocada por uma transversão (G – T). Não
foram observadas diferenças nas segundas posições dos códons. Entre as 11 mutações
na seqüência de nucleotídeos de M1 entre S1133wt e P100, nove foram silenciosas e
duas não silenciosas. As mutações nas posições 1347 e 2005, G – T e A – G,
respectivamente, levaram a alteração na seqüência de aminoácidos predita para a
proteína µA da amostra P100.
Tabela 5. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M1.
Posição (nucleotídeos) 150 606 1011 1347 1353 1539 1548 1584 1602 2005 2112
S1133wt C C C G C T T T C A G P100 T T T T T C C C T G A
Códons S1133wt cgc agc ccc ttg ccc agt ttt ttt acc atc cag P100 cgt agt cct ttt cct agc ttc ttc act gtc caa
Posição (aminoácidos) 445 665 S1133wt Leu Ile P100 Arg Ser Pro
Phe Pro Ser Phe Phe Thr
Val Gln
Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada
códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).
O alinhamento entre as seqüências de nucleotídeos dos segmentos M2 de
S1133wt e P100 mostrou 23 diferenças (Tabela 6). Todas as mutações observadas
foram encontradas dentro da seqüência codificante do segmento M2 para a proteína
µB. Oito diferenças foram observadas entre os nucleotídeos 813 e 1197. Das 23
diferenças, 12 foram mutações nas terceiras posições dos códons, oito mutações em
primeiras posições e três foram mutações em segundas posições. Das 23 mutações, 20
79
foram provocadas por transições (T – C = 7, C – T = 6, A – G = 5 e G – A = 2), e as
outras três mutações foram provocadas por transversões (A – T = 1, C – A = 1 e A –
C = 1). Das 23 diferenças, 13 foram mutações silenciosas enquanto que dez levaram a
mutações não silenciosas. Especificamente as mutações das posições 309, 813, 915,
1003, 1122, 1191, 1197, 1473, 1651 e 1876, todas em primeira ou segundas posições,
levaram a diferenças na seqüência deduzida da proteína µB da amostra P100.
Para o segmento M3, o alinhamento das seqüências de S1133wt e P100 mostrou
14 diferenças de nucleotídeos (Tabela 7). Tal como encontrado nos outros segmentos
da classe M, todas as mutações foram localizadas dentro de uma região codificante,
neste caso para a proteína µNS. Quatro mutações foram localizadas entre os
nucleotídeos 196 e 258 e outras quatro entre as posições 1812 e 1914. Das 14
diferenças entre S1133wt e P100, 12 foram mutações nas terceiras posições dos
códons, uma mutação em uma primeira posição e outra em uma segunda posição.
Entre as 14 mutações, 13 foram provocadas por transições (G – A = 3, T – C = 6, C –
T = 1, A – G = 3) e apenas uma por uma transversão (A – C). Das 14 diferenças, 12
levaram a mutações silenciosas e duas provocaram mutações não silenciosas,
justamente aquelas ocorridas fora das terceiras posições dos códons, nucleotídeos 196
(primeira posição) e 494 (segunda posição).
.
80
Tabela 6. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M2.
Posição (nucleotídeos)
80 143 251 309 402 431 704 813 915 926 1003 1122 1191 1196 1197 1473 1478 1496 1556 1634 1651 1745 1876
S1133wt T T C A C C C A G T C G C T A A A T A T A T C P100 C C T G T T T T A C T A A C G G C C G C G C T
Códons
S1133wt ggt ccc ctc atg ctg tcc gac act gtt gat aca gtt cag ggt act aat gta gat gta ggt aaa gct aca
P100 ggc cct ctt gtg ttg tct gat tct att gac ata att aag ggc gct gat gtc gac gtg ggc aga gcc ata
Posição (aminoácidos)
94 262 296 325 365 388 390 482 541 616
S1133wt Met Thr Val Thr Val Gln Thr Asn Lys Thr P100
Gly Pro Leu Val
Leu Ser Asp Ser Ile
Asp Ile Ile Lys
Gly Ala Asp
Val Asp Val Gly Arg
Ala Ile
Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de
acordo com suas características (Hall, 1999).
81
Tabela 7. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento M3.
Posição (nucleotídeos)
30 75 196 204 225 258 474 494 597 975 1812 1848 1893 1914
S1133wt G T G T C A T T G T T A A A P100 A C A C T G C C A C C C G G
Códons
S1133wt gcg cat gtt gtt ttc tta gct gtc acg att aat gca gaa gaa
P100 gca cac att gtc ttt ttg gcc gcc aca atc aac gcc gag gag
Posição (aminoácidos)
58 157
S1133wt Val Val P100
Ala His Ile
Val Phe Leu Ala Ala
Thr Ile Asn Ala Glu Glu
Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada
códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).
As seqüências de nucleotídeos obtidas com as reações de seqüenciamento do
segmento S1 das amostras S1133wt e P100 também foram alinhadas e analisadas
quanto às suas diferenças. Foram observadas 11 diferenças entre as duas seqüências,
todas dentro da região codificante de S1, ORF1, ORF2 e ORF3 para as proteínas p10,
p17 e σC, respectivamente (Tabela 8).
A região entre os nucleotídeos 842 e 1034 apresentou sete das 11 mutações
encontradas. Três diferenças foram mutações nas primeiras posições dos códons,
outras três diferenças foram encontradas em segundas posições e seis nas terceiras
posições dos códons mutados restantes. Sete das 11 mutações foram provocadas por
transições (G – A = 3, A – G = 3 e C – T = 1), ao passo que as outras quatro mutações
foram provocadas por transversões (C – A = 2, C – G = 1 e A – C = 1).
Quatro das 11 mutações foram silenciosas, enquanto que as outras sete foram
responsáveis por alterações nas seqüências deduzidas de p10, p17 e σC. O fato do
82
segmento genômico S1 possuir três regiões codificantes parcialmente sobrepostas em
distintas fases de leitura proporcionou que uma única mutação (C – A) na posição 700
fosse ao mesmo tempo em uma terceira posição (ORF2) e em uma segunda posição
(ORF3). Essa mutação foi responsável por duas alterações de nas seqüências de
aminoácidos, uma na seqüência de p17 e outra na seqüência de σC. Outra
particularidade encontrada na comparação das seqüências dos segmentos S1 foi o fato
de que duas mutações (G – A) na posição 1032 e (A – C) na posição 1034, foram
responsáveis pela mudança de um mesmo códon, na primeira e terceira posições,
levando a uma mudança de aminoácido na seqüência de σC da amostra P100.
Tabela 8. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S1.
Posição (nucleotídeos) ORF1 ORF2 ORF3 48 99 226 700 700 842 946 967 983 984 1032 1034
S1133wt G A G C C C C C A A G A P100 A G A A A A G T G G A C
Códons
S1133wt tcg caa gtc gac act acc aca aca caa act gta
P100 tca cag atc gaa aat aca aga ata cag gct atc Posição (aminoácidos) p10 p17 σC 68 136 24 106 113 119 135
S1133wt Ser Gln Val Asp Thr Thr Thr Thr Gln Thr Val P100 Ile Glu Asn Arg Ile Ala Ile
Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada
códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).
83
O alinhamento das seqüências de nucleotídeos do segmento S2 entre as
amostras S1133wt e P100 revelou sete nucleotídeos diferentes, distribuídos por todo o
segmento dentro da região codificante para a proteína σA (Tabela 9). Cinco das sete
diferenças foram mutações nas terceiras posições dos códons, enquanto que as outras
duas mudanças foram mutações encontradas em primeira e segunda posição.
Dentre as sete mutações observadas no segmento S2 de P100, seis foram
provocadas por transições (A – G = 3, G – A = 2 e T – C = 1) e uma por uma
transversão (A – C). Foram observadas cinco mutações silenciosas e outras duas não
silenciosas provocadas pelas mudanças de nucleotídeos nas posições 256 e 917.
Tabela 9. Diferenças entre S1133wt e P100 relativas ao segmento S2.
Posição (nucleotídeos) 174 256 291 432 687 917 1125
S1133wt A A G A G T A P100 C G A G A C G
Códons
S1133wt tca agt ggg caa ggg gtg cta
P100 tcc ggt gga cag gga gcg ctg
Posição (aminoácidos) 81 301
S1133wt Ser Val P100
Ser Gly
Gly Gln Gly Ala
Leu
Posições de nucleotídeos referentes ao segmento completo. Em negrito nucleotídeos diferentes em cada
códon. Aminoácidos diferentes foram coloridos de acordo com suas características (Hall, 1999).
84
4.1.4 Análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA.
As seqüências deduzidas das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA foram
utilizadas para um estudo filogenético frente a outras seqüências de reovírus aviários
depositadas no GenBank.
Para a análise das seqüências de µA, foram utilizadas outras 15 seqüências da
proteína µA, inclusive de duas seqüências depositadas com o nome de S1133. Para
facilitar a interpretação dos dados foram utilizados dois sufixos: B, já citado
anteriormente como a amostra seqüenciada e depositada pelo grupo do Professor
Javier Benavente e o sufixo L, para a seqüência depositada pelo grupo do professor
Long Huw Lee da Universidade Nacional de Chung Hsing, Taiwan. A mesma
nomenclatura foi utilizada para a amostra 1733 a qual, também teve mais de uma
seqüência depositada para o mesmo segmento.
Todas as análises filogenéticas foram conduzidas no programa MEGA
(Molecular Evolutionary Genetics Analysis v. 3.1) descrito por Kumar, Tamura & Nei
(2004) utilizando o método de neighbor-joining (Saitou & Nei, 1987). A árvore obtida
para a proteína µA (Figura 6) mostra uma proteína altamente conservada entre as
amostras de reovírus aviárias seqüenciadas até o momento. As amostras 1733L, 2408,
919 e T6 apresentam 99,9% de identidade com a amostra S1133wt, enquanto que as
amostras mais distantes, 916 e R2 possuem 2,8% de divergência com S1133wt. Os
mesmos resultados foram observados em relação a P100 que possui 99,7% de
identidade com S1133wt.
Com a utilização do programa BioEdit (Hall, 1999) foi realizada uma pesquisa
por regiões conservadas nas seqüências da proteína µA, com um tamanho mínimo de
15 resíduos. Esta análise demonstrou 17 regiões conservadas variando em tamanho de
85
15 a 46 resíduos. As regiões estão localizadas nas posições de 1 a 16; 23 a 41; 43 a
73; 103 a 126; 149 a 169; 214 a 243; 245 a 290; 331 a 374; 399 a 417; 419 a 444; 446
a 465; 554 a 575; 583 a 597; 599 a 626; 642 a 659; 666 a 698 e 700 a 732. A presença
de várias regiões conservadas corrobora com a baixa divergência encontrada no
alinhamento das seqüências de µA.
Figura 6. Árvore filogenética de µA. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
Para as seqüências de µB a análise filogenética mostrou um grau maior de
divergência que aquele encontrado para µA. A maior distância frente à amostra
S1133wt foi encontrada na amostra 918 com 15.5% de divergência, enquanto que
S1133L, 1733L, 2408 e T6 apresentaram a maior identidade (99,3%) com S1133wt.
Em relação a P100 também foi a amostra 918 que apresentou a maior divergência
919 T6 2408 1733L S1133B S1133wt P100 S1133L 176 601G 750505 918 OS161 138 1017-1 916 R2
02468
86
(16,4%), enquanto que a amostra S1133B apresentou a maior identidade (99,1%)
frente a P100. A amostra S1133wt em relação a P100 possui 98,5% de identidade.
A procura por regiões conservadas, tal qual realizada pra µA demonstrou apenas
seis regiões conservadas em todas as 17 seqüências analisadas. O tamanho destas
seqüências também foi menor se comparado a µA, variando entre 15 a 21 resíduos. As
regiões conservadas estão localizadas entre os aminoácidos 12 a 26; 28 a 48; 116 a
135; 440 a 458, 558 a 573 e 640 a 659. Ainda com base nestes resultados pode ser
verificada uma grande região entre os aminoácidos 136 e 438 onde estão localizadas a
maioria das diferenças entre as seqüências.
S1133wt
2408
P100
S1133BVacinas
S1133L
1017-1
1733L
T6
176
919
R2
138
601G
750505
916
OS161
918
010203040
Figura 7. Árvore filogenética de µB. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
Para a proteína µNS, a análise filogenética mostrou uma divergência menor que
aquela encontrada para µB, porém maior que do que foi encontrado para µA. A
87
amostra mais distante de S1133wt foi novamente 918 com 10,2% de divergência, por
outro lado as amostras 2408 e 919 apresentam 99,5% de identidade com S1133wt. Em
relação a P100, a amostra mais distante também é a 918 com 10,6% de divergência. A
amostra S1133B apresenta a maior identidade com P100 (99,8%). S1133wt em
relação a P100 possui 99,7% de identidade.
Sete regiões conservadas foram localizadas nas regiões: 14 a 31; 36 a 55; 64 a
78; 329 a 348; 360 a 381; 462 a 496 e 553 a 571, com um tamanho variando entre 15
e 35 resíduos. Novamente foi observada uma grande região entre os aminoácidos 79 e
328 onde estão localizadas a maioria das diferenças entre as amostras.
2408
919
S1133wt
1733L
S1133L
1733B
P100
S1133BVacinas
176
138
T6
OS161
601G
750505
1017-1
916
918
R2
051015202530
Figura 8. Árvore filogenética de µNS. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
As seqüências deduzidas das três proteínas codificadas pelo segmento S1 foram
utilizadas para análise filogenética frente a seqüências depositadas no GenBank. Para
88
a comparação com as seqüências da proteína p10 de S1133wt e P100 foram utilizadas
16 seqüências de reovírus aviários. A análise da árvore de p10 mostrou a baixa
diversidade das seqüências desta proteína. Dez amostras (176, T6, 750505, 919, 1017-
1, OS161, 1733, 601SI, 918 e 2408) possuem 100% de identidade com a amostra
S1133wt, enquanto que a amostra mais distante de S1133wt foi a amostra 138 com
95,8% de identidade. Quando analisada a seqüência de P100 foi encontrada uma
amostra com 100% de identidade S1133B, enquanto que novamente a amostra 138 foi
aquela com menor identidade também com 95,8%. A comparação entre S1133wt e
P100 também mostra alta identidade 98,9%. Foi encontrada uma grande região
conservada com 39 resíduos de tamanho entre as posições 16 e 54.
176 S1133wt 1017-1 1733 2408 601SI 918 919 750505 T6 OS161 FC P100 S1133B
Vacinas
138 601G 916 R2
0.00.51.01.5
Figura 9. Árvore filogenética de p10. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
89
As mesmas amostras foram utilizadas na análise filogenética para a proteína
p17, onde foi observado o maior número de seqüências idênticas entre todas as
analisadas, 11 seqüências (OS161, T6, 750505, 919, 918, 601SI, 2408, 1733, 1017-1,
176 e FC) possuem 100% de identidade com a amostra S1133wt, enquanto duas
amostras 916 e 601G apresentaram a maior divergência 19,8%. Em relação a P100,
uma amostra apresentou 100% de identidade, S1133B. Novamente as amostras 916 e
601G foram as mais distantes com 20,6% de divergência. A comparação entre
S1133wt e P100 mostrou uma identidade de 99,3%. Foi encontrada uma região
conservada, com 18 resíduos entre os resíduos 58 e 75.
1733 918 176 T6 1017-1 919 S1133wt 750505 2408 FC 601SI OS161 P100 S1133B
Vacinas
138 R2 601G 916
024681012
Figura 10. Árvore filogenética de p17. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
90
A proteína σC é aquela com maior número de seqüências depositadas no
GenBank, por esse motivo foram adicionadas às seqüências de S1133wt e P100 outras
33, todas de reovírus aviários, inclusive além de S1133B, outras duas seqüências
depositadas com o nome de S1133. Da mesma maneira que utilizado anteriormente
foram atribuídos sufixos ao nome S1133 a fim de diferenciar as amostras. A
seqüência depositada por Shapouri et al. (1995), recebeu o sufixo S, sendo então
S1133S e a seqüência depositada por Ghorashi e Morshedi, não publicada, recebeu o
sufixo G, sendo então nomeada S1133G. O grande número de seqüências analisadas
fez com que fossem observadas várias linhagens. Quase todas as amostras asiáticas,
canadenses e norte-americanas ficaram agrupadas em um grande ramo (I). Uma
amostra asiática e uma alemã ficaram juntas no pequeno ramo II. As amostras alemãs
restantes juntamente com as amostras holandesas e as amostras australianas RAM-1 e
Sommerville -4 ficaram agrupadas no ramo III.
Duas amostras (FC e 176) demonstraram possuir 100% de identidade com
S1133wt, outras quatro amostras também apresentaram identidade alta com S1133wt:
1733 (99,7%); 2408, OS161 e T6 todas com 99,1% de identidade. Contudo, a
filogenia frente à proteína σC também mostrou as maiores distâncias entre aquelas
observadas nesse estudo. Duas amostras 1017-1 e 918, mostraram possuir a maior
divergência frente a S1133wt (72% para ambas).
Em relação a seqüência de P100, duas amostras mostraram 100% de identidade:
S1133B e S1133G; outras cinco amostras encontraram-se muito próximas a P100:
S1133S, 1733, 2408, OS161 e T6, (98,8% de identidade). A identidade entre S1133wt
e P100 ficou em 98,5%. Não foram observadas regiões conservadas utilizando os
mesmos parâmetros descritos anteriormente. O mesmo resultado foi obtido quando
foram utilizadas somente as amostras analisadas para as proteínas da classe M.
91
2408º
OS161ª
T6ª
919ª
601SIª
750505ª
1733º
GuangxiR1ª
S1133wtº
FCªª
176ªª
S1133Sº
P100º
S1133Bº
S1133Gº
Vacinas
138ªª
601Gª
R2ª
GEL06ºº
GEL12ºº
GEI09ºº
I
916ª
GEL13a98Mºº II
GEL13b98Mºº
RAM-1**
Somerville**
GEI10ºº
1017-1ª
918ª
NLI02*
GEL01ºº
GEL03ºº
NLI12*
NLA13*
GEL05ºº
III
020406080
Figura 11. Árvore filogenética de σC. Escala significa número de aminoácidos
diferentes. Origem das amostras: ª asiáticas, ªª canadenses, º norte-americanas,
ºº alemãs, * holandesas e ** australianas.
92
Para a análise filogenética da proteína σA foram incluídas outras 15 seqüências
depositadas no GenBank. Verificamos que σA é outra proteína altamente conservada
entre as amostras de reovírus aviários seqüenciadas até o momento. Em relação a
S1133wt foi encontrada uma amostra com 100% de identidade (2408), enquanto que
cinco amostras: 176, 750505, 1733L, 919 e OS161 apresentaram 99,8% de identidade.
A amostra com menor identidade foi R2 (97,3%). Para P100 foram encontradas duas
seqüências com 99,5% de identidade: S1133wt e 2408, enquanto que cinco amostras,
novamente 176, 750505, 1733L, 919 e OS161, apresentaram 99,3% de identidade. A
amostra com a menor identidade foi novamente R2 (97,3%).
A procura por regiões conservadas demonstrou onze regiões variando em
tamanho de 17 a 36 resíduos, localizadas nas posições 6 a 29; 44 a 63; 92 a 117; 144 a
179; 187 a 212; 214 a 231; 265 a 300; 302 a 318; 320 a 342; 345 a 375 e 391 a 416.
Figura 12. Árvore filogenética de σA. Escala significa número de aminoácidos
diferentes.
S1133wt
2408
176
750505
T6
1733L
919
OS161
P100
918
S1133L
601G
138
1017-1
916
R2
601SI
012345
93
4.1.5 Análise da seqüência das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA
Os principais parâmetros físico-químicos das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17,
σC e σA foram avaliados em função das seqüências primárias utilizando a ferramenta
ProtParam (Gasteiger et al., 2003; Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy
(Expert Protein Analysis System) mantido pelo Instituto Suíço de Bioinformática
(SIB). Os resultados estão agrupados na tabela seguinte.
Tabela 10. Resultados da Ferramenta ProtParam.
Amostra Proteína Tamanho Mw pI AA (+)
AA (-) EC1 EC2 HL II AI GRAVY
S1133wt µA 732 82080,6 8,39 74 69 102635 101760 >10 43,22 98,29 0,035
P100 µA 732 82100,6 8,39 74 69 102635 101760 >10 42,78 97,62 0,033
S1133wt µB 676 73234,7 5,31 57 69 84380 83880 >10 37,71 86,41 -0,152
P100 µB 676 73239,7 5,32 58 70 84380 83880 >10 36,96 88,43 -0,130
S1133wt µNS 635 70850,9 5,88 73 84 54485 53860 >10 49,06 90,02 -0,280
P100 µNS 635 70836,8 5,88 73 84 54485 53860 >10 49,31 89,87 -0,284
S1133wt p10 98 10270,9 8,80 7 4 11710 11460 >10 37,46 93,78 0,427
P100 p10 98 10285,0 8,80 7 4 11710 11460 >10 36,89 94,80 0,430
S1133wt p17 146 16868,3 8,34 16 14 24200 23950 >10 55,12 90,89 -0,125
P100 p17 146 16882,4 8,34 16 14 24200 23950 >10 55,12 90,89 -0,125
S1133wt σC 326 34761,5 4,90 18 31 16055 15930 >10 37,87 88,22 -0,054
P100 σC 326 34825,6 5,00 19 31 16055 15930 >10 41,68 90,03 -0,050
S1133wt σA 416 46062,1 8,77 26 30 94100 93850 >10 41,34 76,54 -0,205
P100 σA 416 46004,1 8,77 26 30 94100 93850 >10 41,18 76,08 -0,209
Tamanho: Número de aminoácidos; Mw: Peso molecular em Dáltons; pI: Ponto isoelétrico teórico; AA (+):
Número de aminoácidos carregados positivamente (Asp + Glu); AA (-): Número de aminoácidos carregados
negativamente (Arg + Lys); EC1: Coeficiente de extinção 1 (assumindo todas cisteínas como meia cistina);
EC2: Coeficiente de extinção 1 (assumindo nenhuma cisteína como meia cistina); HL: Meia vida teórica em
E. coli (horas); II: Índice de instabilidade; AI: Índice Alifático; GRAVY: Média de hidropaticidade.
94
A predição de estruturas em coiled-coil foi avaliada pela utilização de duas
ferramentas, Marcoil (http://www.isrec.isb-sib.ch/webmarcoil/webmarcoilC1.html -
Delorenzi & Speed, 2002) e MultiCoil (http://multicoil.lcs.mit.edu/cgi-bin/multicoil -
Wolf, Kim & Berger, 1997).
Em ambas as análises, somente as proteínas µNS e σC apresentaram alta
probabilidade de formação de estruturas em coiled-coil. A análise com a ferramenta
Marcoil demonstrou uma região com 99% de probabilidade de formação de estrutura
em coiled-coil na proteína µNS entre os aminoácidos 543 e 585, tanto para a
seqüência de S1133wt, quanto para a de P100. Para a proteína σC também foi
verificada a presença de uma região com 99% de probabilidade para formação de
estruturas em coiled-coil entre os aminoácidos 47 e 149, tanto para S1133wt quanto
para P100.
Os resultados da ferramenta Multicoil revelaram uma predição idêntica para
µNS e muito próxima para a proteína σC em relação a S1133wt e P100. As predições
realizadas no programa Multicoil indicam uma maior possibilidade de que as regiões
em coiled-coil sejam formadas por trímeros, tanto na proteína µNS quanto em σC.
Para completar esta análise sobre predições de estruturas em coiled-coil foi feita
uma pesquisa por motivos de zíperes de leucina no servidor 2ZIP
(http://2zip.molgen.mpg.de/index.html - Bornberg-Bauer, Rivals & Vingron, 1998).
Para ambas as amostras S1133wt e P100 somente foram detectados motivos de
zíperes de leucina nas proteínas µNS, entre os aminoácidos 571 e 592, e em σC, entre
os aminoácidos 65 e 103.
Uma análise de clusters hidrofóbicos (HCA) (Gaboriaud et al., 1987) foi
realizada utilizando o servidor DrawHCA. Não foram observadas diferenças na
comparação das seqüências de µA entre S1133wt e P100; de acordo com os
95
resultados de HCA µA apresenta uma distribuição de aminoácidos hidrofóbicos
compatível com uma proteína com muitas regiões em folha-beta além de uma grande
região hidrofóbica entre os aminoácidos 340 e 350 (Figuras 13 e 14).
A comparação entre as seqüências de µB mostrou duas diferenças em regiões
hidrofóbicas (setas), uma próxima ao resíduo 325, onde uma alteração T – I na
seqüência de P100 torna maior um cluster hidrofóbico, o mesmo acontecendo na
região próxima ao aminoácido 616 onde outra mutação T – I também aumenta a
interação hidrofóbica nesta região. Uma grande região hidrofóbica foi localizada entre
os aminoácidos 140 e 150 em ambas as seqüências (Figuras 15 e 16).
Para a proteína µNS foi encontrada uma pequena diferença próxima ao resíduo
157 (seta) devido a uma mutação V – A. Várias regiões hidrofóbicas estão presentes
ao longo da estrutura protéica, muitas vezes em mesmo contexto com diversos
aminoácidos carregados por toda a extensão da proteína (Figuras 17 e 18).
Entre as proteínas codificadas pelo segmento S1, somente σC apresentou uma
alteração relacionada a regiões hidrofóbicas, causada pela mutação T113I observada
em P100 a qual tornou maior a interação hidrofóbica nesta região (seta) (Figuras 23 e
24). A distribuição de aminoácidos hidrofóbicos em σC é compatível com a predição
de estrutura em coiled-coil na região N-terminal e em folhas-beta na região C-
terminal. Em p10 foi observada uma grande região hidrofóbica entre os aminoácidos
52 e 62 (Figuras 19 e 20), enquanto que p17 apresenta diversas pequenas regiões
hidrofóbicas em toda sua extensão (Figuras 21 e 22).
Na seqüência da proteína σA foi observada uma grande região hidrofóbica entre
os aminoácidos 207 e 226 para as ambas amostras e uma pequena redução em uma
região hidrofóbica causada pela substituição V301A na seqüência de P100 (seta)
(Figuras 25 e 26)
96
Figura 13. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de S1133wt.
Figura 14. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µA de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
97
Figura 15. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de S1133wt.
Figura 16. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µB de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
98
Figura 17. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de S1133wt.
Figura 18. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína µNS de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
99
Figura 19. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de S1133wt.
Figura 20. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p10 de P100.
Figura 21. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de S1133wt.
Figura 22. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína p17 de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
100
Figura 23. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de S1133wt.
Figura 24. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σC de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
101
Figura 25. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de S1133wt.
Figura 26. Análise de clusters hidrofóbicos da proteína σA de P100.
Verde: aminoácidos hidrofóbicos; Vermelho: aminoácidos carregados (+); Azul: aminoácidos carregados (-);Thr ( ); Gly ( ); Ser ( ) e Pro ( ).
102
As análises das seqüências de aminoácidos revelaram que as mudanças mais
importantes ocorridas durante o processo de atenuação da amostra S1133wt até a
obtenção da amostra P100 aconteceram nas proteínas µB e σC. Por esse motivo, essas
proteínas foram estudadas em maior detalhe.
4.1.6 Alinhamento da região N-terminal de σC
Para que fosse possível a comparação das mutações encontradas na proteína σC
de P100, as trinta e cinco seqüências utilizadas para análise filogenética foram
alinhadas na região N-terminal. Nove seqüências (P100, S1133B, S1133G, S1133S,
1017-1, 916, 918, GEL12 98M e GEI09 97M) apresentaram uma asparagina na
posição 24 (Figura 27).
Somente as quatro amostras vacinais utilizadas para o alinhamento (P100,
S1133B, S1133G e S1133S) apresentaram uma arginina, ou qualquer outro
aminoácido carregado na posição 106. Somente nas amostras vacinais foi observada a
presença de uma isoleucina na posição 113 e/ou 135, nesta última posição todas as
outras amostras apresentam uma valina. Finalmente uma alanina na posição 119 foi
uma característica somente encontrada em P100 (Figura 27). As setas indicam as
posições das substituições encontras na amostra P100.
103
Figura 27. Alinhamento N-Terminal das seqüências de σC, entre 35 amostras.
10 20 30 40 50 60 70....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S1133wt MAGLNPSQRREVVSLILSLTSNVTISHGDLTPIYERLTNLEASTELLHRSISDISTTVSNISANLQDMTHFC ......................................................................176 ......................................................................P100 .......................N..............................................S1133B .......................N..............................................S1133G .......................N..............................................S1133S .......................N................................S.............138 ......................AH.N............S....A.S.Y....SM.....D...D..NV.R1017-1 .D..TQ.......G.........N.NP...AQLR..VSA..SANASINE.V.NVLSEMTSL.SRMGQL.T1733 ......................................................................2408 ......................................I...............................601G ......L..............ST.TNP....AV...........KS.RQ.L.S.VSDL.DV.VD...T.R601SI ......................................I...............................916 ....T........G.......SANTNC.....V.D..LS..SAVAS.DG.VGVL.QK..DLESD..GVVS918 .D..TQ.......G.........N.NP...AQLR..VSA..SANASINE.V.NVLSEMTSL.SRMEKL.T919 ......................................I...............................750505 ......................................I...............................OS161 ......................................I...............................R2 ......L..............ST.TNP....AV...........KS.RQ.L.S.VSDL.DV.VD...T.RT6 ......................................I...............................GuangxiR1 ........................M...........................G.................RAM-1 .D..TQQ......G.......S....P....H.R...SA..SASVS.SE.VNTALSKLAGL.VA.DN.AASomerville 4 .D..TQQ......G.......S...NP....Q.R...SA..SANAS.SE.VNTALSRLTDL..A.GN.ATNLI12 96M .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAANLI02 88M .E..TQ.......G.......SAIT.T...AQ.RN..SA..S..AS.SETVNGALSQLVLL.SR.DNLAANLA13 96T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL13b98M .E..T.L......G.......S.S..S...I.L....SAI.KMCTTVND.LGHLTSS..E...RID.LAEGEL13a98M ....T.L......G.......ST.T.C...AA.N.K.IK.DSAV.S.TD..GIL.QK.LTLESE.RNTASGEL12 98M ......L................NTNP....SV.....S......S..Q.V.SM.A.I.D.F.D...T.RGEL06 97M ......L.................TNP....SV.....S......S..Q.V.GM.AAI.D...D...T.RGEL05 97M .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..SETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL03 97T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RS..SA..S.NA..GETVNGALSQLVVL.SR.DNLAAGEL01 96T .E..TQ.......G.......SA.T.T...AQ.RN..SA..SFNAS.SETVNGALSQLVAF.SR.DNLAAGEI09 97M ......L................NTNP....SV.....S......S..Q.V.SMAA...D...D...T.RGEI10 97M .D..TQQ......G.......S...NP....Q.R...SA..SANAS.SE.VNAVLSKLADL.VA.NN.AV
80 90 100 110 120 130 140....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
S1133wt TLDDVTANLDGLRTTVTALQDSVSILSTNVTDLTNTSSAHAATLSSLQTTVDGNSTAISNLKSDVSSNGLFC ......................................................................176 ......................................................................P100 ...................................R......I.....A...............I.....S1133B ...................................R......I.....................I.....S1133G ...................................R......I.....................I.....S1133S ..........................P........R......I.....................I.....138 A..........M.V.I.T......T...T.........V.SEA....R.I......T.D...........1017-1 SVTGIN.E.NSVAINMQE.RV.LNSI.DTL.S.SANVDD..SS..D.RQS..TL..DVA.......TQ..1733 I.....................................................................2408 I.....................................................................601G A...AI.T.K..N...A...N..AS..ST.NG..DI....SEA..F.R..I...TV...K..G...T...601SI I.....................................................................916 S.GQANST.TE.SKELRQ.SS..DN.M.SLS..ST.V.GNQ.AIAGI..S.HA.T.D......S..AIS.918 SVTGIN.E.NSVAINIQEFRV.LNSI.DTL.S.SANVDD..SS..D.RQS..TL..DVA.......TQ..919 I.....................................................................750505 I.....................................................................OS161 I.....................................................................R2 A...AI.T.K..N...A...N..AS..ST.NG..DI....SEA..F.R..I...TV......G...T...T6 I.....................................................................GuangxiR1 I.....................................................................RAM-1 SVAETKVE.NS.VSD.Q..RT.LDSS.SELAS.SLLVRN..SSI.D..KEGHAL.GE.D..N.S...Q..Somerville 4 SVAEMKVE.NS.ISD.Q..RT.LDSS.SELAS.SLLVHD.DSSI.D..KESHAL.GD.T..N.S..AQ..NLI12 96M .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.AHQFGLLT.DTA...T..ATQS.NLI02 88M .VA.GQLE.RA.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVRE.DSSITD.ARQIGLLT.DTA...T..AAQS.NLA13 96T .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL13b98M .VRNTVTD.NNVQIR.....S.FDS..S...T.SSSV.NQESQ.ATVS.S.NAL..NV...Q.....TA.GEL13a98M SVGQI.SSVAE.SDKLHQ.SV.LTDVV.S.SGISG.LTE.GNLI.A..VS.QN.T.DVD....S..TL..GEL12 98M A.....VT.KS.S.SI....N.ITT..AT.AE..D.....SG.........S...S..AS......A.S.GEL06 97M A.....VT.SN.S.SIA...N..TT..AT.DE........SGA........S...S...S......A.S.GEL05 97M .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL03 97T .VA.GQLE.RS.T.D.KNIRSLLDDI..T.AS.SASVHE.DSSI.D.ARQFGLLT.DTA...T..ATQS.GEL01 96T .VA.GQLE.RS.T.D.GSIRSLLDDI..I.AS.SVSVRE.DSSI.D.VRQFGLLT.DTA...T..AAQS.GEI09 97M A.....VT.KS.S.SI....N..TT..AT.AE..D.....SG.........S...N..AS......A.S.GEI10 97M SVAETRVE.NSVASD.QG..T.LDSSISELASISSLVHD.SSSI.G..RDSGAL.SEVG....S...Q..
104
4.1.7 Análise da hidrofobicidade da região N-terminal de σC
As regiões N-terminais das proteínas σC de S1133wt e P100 foram submetidas
à análise de hidrofobicidade com a ferramenta ProtScale (Gasteiger et al., 2003;
Gasteiger et al., 2005) no servidor do ExPASy, utilizando os parâmetros definidos por
Kyte & Doolittle (1982). Verificamos nesta análise uma maior variação entre as
seqüências de S1133wt e P100 na região das substituições T106R, T113I e T119A.
Quando analisamos individualmente essas mutações ficou demonstrado que esta
maior variação se deveu às mutações das posições 106 onde, com a substituição de
treonina para arginina houve um aumento de contribuição hidrofílica, e na
substituição da posição 113, onde ocorreu justamente o inverso com um ganho de
hidrofobicidade devido a mudança de treonina para uma isoleucina (Figura 28)
A
-2,2
-1,7
-1,2
-0,7
-0,2
0,3
0,8
1,3
1,8
2,3
5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145
Aminoácido
Hid
rofo
bici
dade
Figura 28. Gráfico de hidrofobicidade da região N-terminal de σC.
___ S1133wt e ---P100
105
4.1.8 Modelagem por homologia da proteína µB
A fim de obter um melhor entendimento das mudanças ocorridas na seqüência
da proteína µB de P100, construímos um modelo da estrutura da proteína µB, usando
como base a estrutura resolvida por cristalografia de raios-X para a proteína mu1 da
amostra de reovírus de mamíferos T1L (Liemann et al., 2002). Utilizamos o programa
Swiss-PdbViewer (www.expasy.org/spdbv/ - Guex & Peitsch, 1997) para fazer o
alinhamento estrutural da seqüência de µB e do arquivo EXpdb 1jmuB (Figura 29).
Figura 29. Alinhamento estrutural de µB versus µ1. Asterístico: resíduos
conservados; pontos: aminoácidos com características semelhantes.
106
O alinhamento de µB e 1jmuB foi submetido ao servidor do Swiss-Model,
sendo então gerado um modelo baseado nas coordenadas atômicas do modelo de µ1.
As principais alterações na seqüência de aminoácidos da proteína µB da amostra
P100: T325I (verde), Q388K (azul), T390A (roxo), N482D (vermelho) e T616I
(amarelo) foram destacadas no programa RasMol (www.rasmol.org), sendo o modelo
observado por dois ângulos diferentes (Figuras 30A e 30B).
(A)
107
Figuras 30A e 30B. Modelo 3-D da Proteína µB de P100. Substituições T325I
(verde), Q388K (azul), T390A (roxo), N482D (vermelho) e T616I (amarelo).
(B)
108
4.2 Expressão de p17 em sistema heterólogo
4.2.1 Amplificação e clonagem da ORF2 do segmento S1 de S1133wt
A eletroforese em gel de agarose de uma alíquota da amplificação da ORF2 do
segmento S1 mostrou uma única banda com tamanho compatível com 441bp, o que
corresponde a amplificação completa da região codificante para a proteína p17.
Portanto, o restante da reação, ainda no tubo de PCR foi purificado e utilizado para a
clonagem no vetor pCR T7 / NT-TOPO.
A transformação das células TOP10F´ foi confirmada pelo crescimento em meio
seletivo com ampicilina, sendo a correta orientação do incerto confirmada por PCR.
Quatro das cinco colônias analisadas foram amplificadas por PCR com os iniciadores
T7 forward e P17AS, como descrito em material e métodos, produzindo uma banda
com tamanho compatível aos 626bp esperados.
4.2.2 Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17
Escolhemos a colônia cujo PCR apresentou a banda mais intensa para
seqüênciar. Para isso a colônia foi crescida em meio LB líquido, sendo posteriormente
realizada uma miniprep. O DNA purificado foi utilizado como molde para a reação de
seqüenciamento. Utilizando os iniciadores T7 forward e T7 reverse, comprovamos a
correta construção do plasmídeo TOPO-p17 (Figura 31).
109
Figura 31. Seqüenciamento do plasmídeo TOPO-p17. Em caixa alta a seqüência da ORF-p17.
O sublinhado pontilhado indica seqüência deduzida da cauda fusionada de histidina e em
sublinhado contínuo a seqüência deduzida de p17.
4.2.3 Comprovação da expressão de His-p17 por SDS-PAGE e western-blotting
Através da análise de géis de SDS-PAGE verificamos que a proteína His-p17
não podia ser observada junto as proteínas encontradas na fração solúvel, pelo
contrário a proteína p17 estava sendo encontrada em corpos de inclusão. Após o
tratamento dos corpos de inclusão com tampão de lise e ciclos de congelamento e
descongelamento, foi possível observar a proteína His-p17 como uma banda de
aproximadamente 22kDa nos géis de SDS-PAGE (Figura 32).
10 20 30 40 50 60 70 80 90....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 atgcggggttctcatcatcatcatcatcatggtatggctagcatgactggtggacagcaaatgggtcgggatctgtacgacgatgacgatHIS-p17 MetArgGlySerHisHisHisHisHisHisGlyMetAlaSerMetThrGlyGlyGlnGlnMetGlyArgAspLeuTyrAspAspAspAsp
100 110 120 130 140 150 160 170 180....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 aaggatccaacccttATGCAATGGCTCCGCCATACGACGTTTGAAGTGCAACGATTTAATTTCTGTCCGCTATCACTTCGCGAACTTGCTHIS-p17 LysAspProThrLeuMetGlnTrpLeuArgHisThrThrPheGluValGlnArgPheAsnPheCysProLeuSerLeuArgGluLeuAla
190 200 210 220 230 240 250 260 270....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 ATCCCATCATTTACTGCTATAACTGGGGCTGACCCATCACAGTATTTTAACATTGAGCTCCCACACACTCATCCTCTCTATTCCAAATTGHIS-p17 IleProSerPheThrAlaIleThrGlyAlaAspProSerGlnTyrPheAsnIleGluLeuProHisThrHisProLeuTyrSerLysLeu
280 290 300 310 320 330 340 350 360....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 CCTACTCTGTTATCTCAACCTTGTAGGGTCCACGTGCGGCTGATTCGCCGGTTCGCTCTCTATTCAACATTGTCAAGTATTTGTGAGTACHIS-p17 ProThrLeuLeuSerGlnProCysArgValHisValArgLeuIleArgArgPheAlaLeuTyrSerThrLeuSerSerIleCysGluTyr
370 380 390 400 410 420 430 440 450....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 GATTGTGCTCTACTATTCTCCCCACACGCTATCGTTCCATTGCCTGCATCCGATCGGCGGTCTTGTCTTATAGTTCATTGGGATGGCGGGHIS-p17 AspCysAlaLeuLeuPheSerProHisAlaIleValProLeuProAlaSerAspArgArgSerCysLeuIleValHisTrpAspGlyGly
460 470 480 490 500 510 520 530 540....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
TOPO-p17 TCTCAATCCATCGCAGCGAAGAGAGGTCGTCAGCTTGATACTGTCATTGACTTCGAACGTGACTATAAGTCATGGCGATTTGACGCCGATHIS-p17 SerGlnSerIleAlaAlaLysArgGlyArgGlnLeuAspThrValIleAspPheGluArgAspTyrLysSerTrpArgPheAspAlaAsp
....|.
TOPO-p17 CTATGAHIS-p17 Leu
110
Figura 32. SDS-PAGE proteína His-p17. Linhas: (1) 0,5mM; (2) 0,75mM e (3)
1mM de IPTG com 2 horas de indução. (4) 0,5mM; (5) 0,75mM e (6) 1mM de IPTG
com 4 horas de indução. (7) Padrão de peso molecular Benchmark (Invitrogen -
10748-010).
A confirmação de que a banda observada nos géis de SDS-PAGE era His-p17
foi obtida através de uma reação de western-blotting, frente a uma preparação
monoclonal de anticorpos anti-His. Foi observado o aparecimento de uma única banda
de aproximadamente 22kDa nas alíquotas testadas (Figura 33).
Figura 33. Western-blotting proteína His-p17. Linhas: (1) Padrão de peso
molecular Benchmark (Invitrogen); (2) 0,5mM; (3) 0,75mM e (4) 1mM de IPTG com
4 horas de indução.
1 2 3 4 5 6 7
His-p17
1 2 3 4
His-p17
111
5. Discussão
A patogenia das infecções virais sempre foi um dos principais alvos de estudos
da virologia. Os mecanismos envolvidos nesse processo estão diretamente ligados a
capacidade de defesa do hospedeiro e ao potencial de virulência imposto por um
agente viral (Tyler & Nathanson, 2001).
No presente estudo seqüenciamos cinco dos dez segmentos genômicos de duas
amostras de reovírus aviários: S1133wt, uma amostra patogênica isolada
originalmente de galinhas com quadros de artrite/tenosinovite (van der Heide &
Kalbac, 1975) e P100, uma vacina derivada da amostra S1133wt obtida através de
sucessivas passagens em ovos embrionados, seguida de passagens em cultura de
células primárias de embrião de galinha mantidas à 32ºC e depois novas passagens a
37ºC (van der Heide, Kalbac & Brustolon, 1983).
O histórico de passagens associado ao desenvolvimento de uma amostra vacinal
fez com que surgisse uma amostra temperatura sensível (ts). P100 apresenta baixa
capacidade replicativa quando do curso de uma infecção na temperatura fisiológica do
hospedeiro (41ºC) (Gouvea & Schnitzer, 1982; Gouvea, et al., 1983), sendo assim
acredita-se que somente em regiões de menor temperatura corporal, juntas
tibiotársicas por exemplo, poderiam servir como locais para propagação da amostra
P100 (Gouvea, et al., 1983).
Os segmentos genômicos da classe M e o segmento S1 já foram associados à
patogênese em diversos estudos, tanto da patogênese experimental com amostras de
reovírus oriundas de mamíferos, quanto em estudos envolvendo amostras de reovírus
aviários (Huang et al., 1987b; Hazelton & Coombs, 1995; Tyler et al., 1996; O'Hara,
et al., 2001; Derrien, Hooper & Fields, 2003; Forrest & Dermody, 2003).
112
Estávamos estudando estratégias para o seqüenciamento dos segmentos
genômicos da classe M, cujas seqüências até então eram desconhecidas, quando dois
grupos que também vislumbraram a importância de se conhecer melhor a informação
contida nesses segmentos genômicos depositaram no GenBank as primeiras
seqüências no início do ano de 2005 (Noad et al., 2006; Su et al., 2006). O fato de não
sermos mais os primeiros a publicar uma seqüência dos segmentos da classe M a
principio foi desencorajador, por outro lado reforçava a idéia de que havia
importância em se conhecer as peculiaridades dessa classe de segmentos do genoma
viral, principalmente caracterizando as diferenças encontradas no modelo de
atenuação viral estudado nesta tese. Uma vez que já existiam seqüências de outras
amostras de reovírus aviários, utilizamos esta informação para, através do
alinhamento dessas seqüências, verificar a presença de regiões conservadas além das
regiões não codificantes 5´e 3´e assim desenhar os iniciadores que foram utilizados
para a obtenção das seqüências, tal como descrito em material e métodos.
De posse das seqüências dos segmentos da classe M, S1 e S2 foi feita à
comparação das seqüências das amostras desse estudo, S1133wt e P100. A alta
similaridade entre todas as comparações das seqüências de nucleotídeos demonstra
que apesar do intenso histórico de passagens ao qual foi submetida a amostra S1133wt
para a obtenção da vacina P100, 235 vezes em ovos embrionados e 100 vezes em
cultura de células com passagens em baixa temperatura, o genoma permaneceu pouco
alterado. O máximo de divergência encontrado foi pouco mais de 1% para o segmento
M2 e o mínimo de divergência, pouco mais de 0,5%, foi encontrado quando
comparados os segmentos S2. Em um estudo anterior já haviam sido demonstradas
diferenças entre os segmentos M1, M2 e S1, quando comparadas as amostras
S1133wt e P100 (Naveca, 2002).
113
A baixa divergência encontrada nas seqüências analisadas demonstra que, pelo
menos em relação aos segmentos M1, M2, M3, S1 e S2, foram poucas as mutações
que contribuíram para o aparecimento do fenótipo não patogênico de P100. Quando
são comparadas as seqüências de proteínas codificadas por esses segmentos
genômicos, fica ainda mais restrito o número de diferenças que chamam a atenção em
função de uma mudança de caráter físico-químico do resíduo de aminoácido
substituinte. A seqüência de aminoácidos é a principal força que define o
enovelamento e a conformação tridimensional das proteínas (Mitraki & King, 1992;
Aramli & Teschke, 1999) sendo, portanto um dos principais parâmetros para
comparação de proteínas mutantes.
As principais alterações nas seqüências preditas de proteínas foram observadas
em µB e σC, codificadas pelos segmentos genômicos: M2 e S1. De uma maneira
interessante esses dois segmentos foram relacionados à patogênese experimental de
amostras de reovírus de mamíferos (Hazelton & Coombs, 1995; Tyler et al., 1996;
O'Hara, et al., 2001; Forrest & Dermody, 2003) e também de amostras aviárias
(Huang et al., 1987b; Shih et al., 2004). Mutantes ts de amostras de reovírus aviários
foram associados ao segmento M2, em alguns casos, com uma única alteração de
aminoácido da seqüência da proteína µB predita (Xu et al., 2005).
As duas únicas alterações encontradas quando comparadas as seqüências das
proteínas µA das amostras S1133wt e P100 foram para aminoácidos que
compartilham das mesmas características: na alteração L445F as características de
hidrofobicidade e de neutralidade foram preservadas, contudo houve uma troca no que
tange ao tipo de cadeia lateral com a substituição de uma cadeia alifática, da
isoleucina por um grupamento aromático presente da fenilalanina. Já a segunda
alteração na seqüência de µA foi ainda mais conservadora, uma vez que a substituição
114
I665V, manteve as propriedades hidrofóbicas, de neutralidade e alifáticas (Stryer,
1996).
Para a proteína µNS também foram observadas apenas duas substituições na
seqüência de aminoácidos. A primeira V58I foi novamente uma substituição em que
foram mantidas as propriedades dos aminoácidos, tal como descrito anteriormente
para a mutação I665V na seqüência de µA. A segunda modificação na seqüência de
µNS foi a substituição de uma valina por uma alanina na posição 157, onde
novamente foram mantidas as características principais de neutralidade, cadeia
alifática e hidrofobicidade, sendo que nesta última houve uma diminuição por conta
do menor índice hidrofóbico da alanina de acordo com o trabalho de Kyte & Doolittle
(1982).
Na comparação das seqüências para proteína σA das amostras S1133wt e P100,
verificamos novamente duas alterações entre os 416 aminoácidos. A alteração S81G
mantêm algumas características entre os aminoácidos, tais como neutralidade e
características hidrofílicas. Um fator importante, e que exatamente por esse motivo
não acarretaria mudanças mais drásticas, refere-se a uma característica intrínseca da
glicina: é o único aminoácido que não apresenta cadeia lateral, essa peculiaridade
permite que a glicina apresente as maiores possibilidades de rotação ao longo das
ligações C-C e C-N na cadeia polipeptídica, o que pode levá-la a assumir a posição de
outros aminoácidos, sem, na maioria das vezes, acarretar importantes mudanças
conformacionais (Varfolomeev, Uporov & Fedorov, 2002). A mudança de valina para
alanina na posição 301 foi comentada anteriormente para a proteína µNS na posição
157 e a princípio não deve acarretar mudanças significativas.
Em função do descrito anteriormente para as proteínas µA, µNS e σA, especial
atenção foi dada para as alterações encontradas na comparação das seqüências dos
115
segmentos M2 e S1, mais precisamente para as seqüências deduzidas das proteínas
µB e σC.
O segmento M2 foi aquele em que foram encontrados o maior número de
mutações na seqüência de nucleotídeos, das 23, dez foram responsáveis por alterações
nas seqüências de aminoácidos da proteína µB. Entre essas dez substituições de
resíduos, cinco despertaram um maior interesse. A substituição de uma treonina por
uma isoleucina na posição 325, a substituição de uma glutamina por uma lisina na
posição 388, a substituição de treonina por uma alanina na posição 390, a substituição
de uma asparagina por um ácido aspártico na posição 482 e a substituição de uma
treonina por uma isoleucina na posição 616.
Na substituição T325I a principal mudança ocorrida foi relacionada a
hidropaticidade, uma vez que houve a substituição de um resíduo hidrofílico
(treonina) por um altamente hidrofóbico, no caso uma isoleucina. Na substituição
Q388K foi mantido o caráter hidrofílico do resíduo, porém foi observada uma
importante alteração com respeito à carga do aminoácido: a glutamina é um
aminoácido neutro em pH 6-7, enquanto que a lisina em um mesmo ambiente pode
adquirir carga negativa (Stryer, 1996).
Na posição T390A houve uma alteração novamente relacionada a
hidropaticidade: a substituição de um aminoácido pouco hidrofílico no caso a treonina
por um aminoácido com características hidrofóbicas, a alanina. Na substituição
N482D houve outra mudança relacionada à carga do aminoácido na seqüência de
P100: foi observada uma alteração entre um resíduo hidrofílico e neutro, uma
asparagina, por um também hidrofílico, porém que pode apresentar carga positiva, no
caso um ácido aspártico. Por fim, na seqüência de µB de P100 foi observada uma
substituição T616I, a mesma observada na posição 325 onde a diferença principal
116
mais uma vez fica relacionada a alteração de um aminoácido hidrofílico por um
hidrofóbico (Stryer, 1996).
Quando pensamos nas alterações encontradas na seqüência da proteína µB de
P100 em relação ao encontrado na seqüência de S1133wt, verificamos que uma
melhor compreensão do significado dessas mudanças seria obtida através da
comparação dessas diferenças em nível estrutural. Para alcançar este objetivo
construímos um modelo tridimensional da proteína µB de P100, usando como base a
estrutura resolvida de µ1, proteína análoga de µB nos reovírus de mamíferos que teve
sua estrutura resolvida por cristalografia de raios-X (Liemann et al., 2002).
Utilizando o recurso da modelagem comparativa, fizemos um alinhamento
estrutural das duas seqüências que foi enviado ao servidor do Swiss-Model no
Instituto Suíço de Bioinformática, o qual retornou um modelo com as prováveis
posições das cadeias laterais dos aminoácidos da seqüência de µB de P100. Esse
modelo compreende os resíduos 68 ao 676, portanto todas as mudanças observadas na
seqüência de P100.
No modelo criado foi possível observar que as alterações T325I (verde nas
Figuras 30A e 30B) e T616I (amarelo nas Figuras 30A e 30B) estão situadas em um
mesmo plano voltado para o interior da estrutura quando esta é posicionada próximo
ao observado no homotrímero de µB (Figura 30A), forma como é encontrada a
proteína µB no vírion (Liemann et al., 2002). Outras observações, talvez até mais
importantes, são verificadas nas posições ocupadas pelos resíduos Lys388, Ala390 e
Asp482 no modelo (azul, roxo e vermelho, respectivamente). Todas estão localizadas
no domínio IV da proteína µB. Essa região predominantemente em folhas-beta
interage com a proteína σB e provavelmente é responsável também pela interação
com estruturas de superfície na célula hospedeira (Liemann et al., 2002).
117
O modelo ainda ressalta a possibilidade da formação de uma ponte salina devido
à proximidade dos resíduos de lisina e acido aspártico, fato que não poderia ser
previsto sem a utilização de um modelo como este, lembrando que na seqüência da
amostra virulenta S1133wt não existe este tipo de interação, pelo menos não nesta
posição. Ainda deve ser levado em consideração que tipo de alterações uma mudança
como esta observada na proteína µB de P100 pode estar causando na estrutura
trimérica, ou mesmo no complexo heterohexamérico (µB3σB3) formado pelo trímero
de µB com o trímero de σB (Liemann et al., 2002).
No modelo proposto para penetração de membranas celulares durante a infecção
pelos reovírus são necessárias mudanças conformacionais no trímero de µ1 (Liemann
et al., 2002). As substituições encontradas na seqüência da proteína µB podem estar
relacionadas a uma maior estabilidade do trímero de µB, ou mesmo da estrutura
formada por µB3σB3, algo que poderia contribuir negativamente para atingir as
alterações conformacionais necessárias para a penetração da membrana plasmática.
Uma vez que uma amostra viral se encontra no interior de um hospedeiro
susceptível, partes deste vírion que asseguram a resistência ao ambiente deixam de ser
necessárias e muitas vezes são removidas, para dar prosseguimento à patogênese.
Como exemplo a clivagem proteolítica de estruturas do capsídeo, que ao invés de
atenuar uma amostra viral contribuem muitas vezes para um aumento da
infecciosidade (Tyler & Nathanson, 2001).
As mudanças observadas na proteína µB podem ter relação com este fato uma
vez que existem interações importantes entre µB e a proteína do capsídeo externo σB,
a qual é removida pela ação de proteases, ou no meio extracelular ou no interior dos
endossomos, dando origem as ISVPs (Nibert & Schiff, 2001; Olland et al., 2001). A
maior estabilidade da proteína σB de P100 quando comparada com S1133wt já foi
118
descrita (Gouvea et al., 1983), e pode estar associada às interações com µB. A certeza
quanto a essas observações poderá ser obtida com a determinação da seqüência de
σB.
As mutações na seqüência do segmento S1 em P100 foram responsáveis por
sete mudanças de aminoácidos nas três proteínas codificadas por este segmento. As
duas primeiras mudanças observadas aparentemente não têm contribuição para o
caráter avirulento de P100. A substituição V68I na seqüência da proteína p10, produto
da primeira das três ORFs parcialmente sobrepostas e em diferentes fases de leitura,
não reflete uma possível mudança na proteína p10, uma vez que foram mantidas as
principais características do resíduo substituído: ambos são resíduos hidrofóbicos,
neutros e alifáticos (Stryer, 1996). A segunda substituição, observada na seqüência da
proteína p17 também mantém as mesmas características bioquímicas, uma vez que foi
observada uma alteração D136E, onde ambos os resíduos apresentam características
de hidrofilicidade e principalmente ambos podem ser carregados positivamente,
mantendo a proteína com as mesmas características.
As outras cinco mudanças de aminoácidos foram encontradas na proteína-
espícula σC, mais precisamente na região N-terminal entre os resíduos 24 e 135. A
princípio as mudanças mais significativas ficam por conta das alterações T106R,
T113I e T119A, uma vez que na posição 24 a substituição de uma treonina por uma
asparagina mantém as características hidrofílicas e de neutralidade. O mesmo é
observado na posição 135 onde a substituição de uma valina por uma isoleucina
mantém todas as características de hidrofobicidade, neutralidade e de cadeia alifática
(Stryer, 1996).
Por outro lado, as substituições de uma treonina por uma arginina na posição
106, de uma treonina por uma isoleucina na posição 113 e de uma treonina por uma
119
alanina na posição 119 alteram as características da proteína. A substituição T106R é
talvez a mais importante observada nesse contexto, pois a arginina é o aminoácido de
maior hidrofilicidade e maior cadeia lateral, podendo ainda assumir carga negativa
(Stryer, 1996). Todas essas alterações relacionadas ao caráter bioquímico da arginina
na posição 106 já são por si só relevantes, mas tornam-se ainda mais importantes no
contexto onde esta mutação está localizada. A região aproximadamente entre os
aminoácidos 50 e 150 é predita de ser uma superestrutura em coiled-coil (Bassel-
Duby et al., 1985; Chappell et al., 2002; Calvo et al., 2005), um homotrímero
formado pela proteína σC nas amostras aviárias e pela proteína σ1 nas amostras de
reovírus de mamíferos (Strong et al., 1991).
Estruturas em coiled-coil são formadas por duas ou mais alfa-hélices anfipáticas
que se entrelaçam e são mantidas, principalmente, através de interações hidrofóbicas.
Esses motivos ocorrem em um grande número de proteínas, incluindo proteínas
estruturais, proteínas motoras, fatores de transcrição e proteínas de fusão de
membrana, tais como a hemaglutinina do vírus da influenza e as proteínas do
envelope do vírus da leucemia murina e o HIV-1. Em todos esses casos acredita-se
que a região em coiled-coil seja responsável pela conexão de proteínas e
macromoléculas como, por exemplo, os microtúbulos (Newman, Wolf & Kim, 2000;
Rose et al., 2005).
Nas estruturas em alfa-hélice resíduos carregados dispostos a uma distância de
quatro aminoácidos (i - i+4) estão em ótimo contexto para interação iônica (Beck et
al., 1997). Isto é observado na seqüência da proteína σC de P100, onde a mutação
para arginina na posição 106 cria um ambiente para interação iônica devido à
presença de um acido aspártico na posição 102, portanto uma carga positiva que
provocaria uma atração com a carga negativa da arginina, além da presença de outra
120
carga negativa também a quatro posições da Arg106, His110 com a qual haveria uma
repulsão de cargas.
Além da possibilidade desta ligação intracadeia, também existe a possibilidade
desta mudança afetar a estabilidade e/ou flexibilidade do trímero como um todo. Esse
tipo de alteração foi observado no trabalho de Beck et al., (1997), onde uma única
mudança de aminoácido alterava o estado de oligomerização de um domínio em
coiled-coil. É importante ressaltar que esta região em coiled-coil é responsável pela
trimerização eficiente, estabilidade do oligômero e incorporação da espícula na
partícula viral no modelo de reovírus de mamíferos (Leone et al., 1991; Leone, Mah
& Lee, 1991); além disso, a trimerização da proteína σ1 induz mudanças
conformacionais necessárias para uma eficiente ligação ao receptor celular (Leone,
Duncan & Lee, 1991).
A estrutura viral evolui de maneira a permitir que determinada amostra viral
possa superar os obstáculos impostos pelo hospedeiro em determinados estágios da
patogênese (Tyler & Nathanson, 2001). As mudanças observadas na seqüência
N-teminal da proteína σC de P100 parecem ir contra esta afirmação. Especulamos a
possibilidade das mudanças observadas nas posições 106, 113 e 119 contribuírem em
um sentido oposto, dificultando a formação do trímero de σC, ou mesmo contribuindo
para uma maior estabilidade que impedisse o papel previsto pra essa região, a qual é
predita de desempenhar papel estrutural na projeção da região C-terminal para além
do vírion durante as etapas iniciais da infecção (Calvo et al., 2005). Dessa forma uma
alteração nesta posição que comprometesse a funcionalidade da estrutura certamente
seria prejudicial ao vírus.
As outras mudanças T113I e T119A convergem para um aumento de
hidrofobicidade nesta região da proteína. Cabe ainda ressaltar que as alterações
121
T106R, T113I e V135I só foram observadas em outras seqüências da proteína σC de
amostras vacinais também oriundas de S1133wt, enquanto que a alteração T119A só é
observada na seqüência de σC da amostra P100.
Infelizmente não foi possível a criação de um modelo tridimensional para esta
região da proteína σC, uma vez que as seqüências que apresentam homologia e para
as quais existem estruturas, até mesmo de reovírus aviário, não contemplam a região
N-terminal de σC. Somente a estrutura da região C-terminal, onde não encontramos
diferenças, foi determinada até o momento (Calvo et al., 2005).
Um modelo bastante parecido ao que encontramos em P100, isto é onde
mutações em mais de segmento genômico contribuem para o fenótipo ts e para a
atenuação viral, foi proposto para produção de vacinas eficazes e seguras para outros
gêneros da família reoviridae, tais como Rotavirus e Orbivirus (Roner et al., 1997).
A análise filogenética das proteínas µA, µB, µNS, p10, p17, σC e σA das
amostras S1133wt e P100 frente a outras seqüências de reovírus aviários depositadas
no GenBank demonstrou que as proteínas µA, p10 e σA estão entre as mais
conservadas nesse estudo. A variação entre a maior e a menor identidade observada
frente a S1133wt ou P100 para essas proteínas ficou entre 100 e 97,2% para µA, 100 e
95,8% para p10 e 100 e 97,3% para σA. Também para essas proteínas foi observado o
maior número de regiões conservadas: 17 para µA e 11 para σA. Na análise da
proteína p10 foi observada uma única região conservada, porém p10 é uma proteína
relativamente pequena (98 aminoácidos) se comparada com as outras duas, µA possui
732 aminoácidos e σA 416. A região conservada em p10 corresponde a
aproximadamente 40% do tamanho da proteína.
Para a proteína p17 encontramos um resultado peculiar, enquanto que em um
dos ramos da árvore filogenética encontramos 13 seqüências variando em menos de
122
1%, no outro ramo estavam agrupadas seqüências com até 20,6% de divergência em
relação ao primeiro grupo, onde estavam as amostra S1133wt e P100.
O maior número de diferenças foi encontrado na comparação das seqüências das
proteínas µB, µNS e σC, cujas identidades em relação às amostras S1133wt ou P100
variaram entre 99,3 e 83,6%, 99,8 e 89,4% e 100 e 28%, respectivamente. A procura
por regiões conservadas também refletiu esta variação. Foram encontradas seis
regiões conservadas em µB e sete em µNS, um número inferior aquele observado, por
exemplo, para µA e σA, e nenhuma em σC, mesmo quando utilizadas somente as 17
amostras analisadas para µB e µNS.
Outro dado importante retirado da análise filogenética foi que em todas as
árvores, com exceção de µA e σA, a amostra P100 sempre esteve agrupada com
outras amostras vacinais: com S1133B nas árvores de µB, µNS, p10 e p17 e com
S1133S, S1133B e S1133G na árvore de σC. Ao mesmo tempo a amostra S1133wt
foi encontrada agrupada com outras amostras patogênicas nas árvores das proteínas
µNS, p10, p17, σC e σA.
A segunda parte desta tese foi a expressão da proteína p17 em um sistema
heterólogo. Foi escolhida a expressão em Escherichia Coli, um sistema bastante
estudado, o qual não deveria apresentar dificuldades. O primeiro passo nesse sentido
foi a escolha do vetor a ser utilizado para a clonagem e expressão da segunda ORF do
segmento genômico S1, a qual codifica para a proteína p17 (Bodelón et al., 2001).
Decidimos utilizar um vetor que pudesse ser utilizado tanto para clonagem
quanto para expressão, evitando assim a necessidade de uma etapa de subclonagem.
Foi utilizado o kit pCR T7 / NT-TOPO da Invitrogen, o qual permite a utilização do
mesmo vetor nas etapas de clonagem e expressão, além do vetor se utilizar de uma
característica encontrada nos amplicons gerados pela enzima Taq polimerase, qual
123
seja a adição de uma base de adenina na extremidade 3´ da fita de DNA (Brownstein,
Carpten & Smith, 1996). Essa característica permite que o amplicon gerado com Taq
polimerase seja diretamente utilizado para clonagem em um vetor com uma base de
timidina a mais na fita 3´ (T/A cloning), sem que haja a necessidade da utilização de
enzimas de restrição (Zhou & Gomez-Sanchez, 2000). Esse tipo de estratégia permitiu
que fossem desenhados os iniciadores P17S e P17AS (Tabela 3), sem a inclusão de
sítios de restrição, observando apenas que os iniciadores deveriam flanquear a ORF-
p17 em correta fase de leitura com o vetor, mas com a colocação do códon de
terminação da ORF-p17 na extremidade 5´ do iniciador P17AS, afim de que a
proteína expressa nesse sistema tivesse apenas a cauda de histidina N-terminal (Terpe,
2003). A ligação do inserto no vetor foi realizada pela enzima topoisomerase I
(Shuman, 1994), ligada covalentemente nas extremidades do vetor (Wasden &
Goldberg, 2001).
Após a etapa de clonagem, as colônias crescidas na placas de ágar seletivo
foram analisadas quanto à presença e correta orientação do inserto em uma única
reação. A utilização de uma estratégia de PCR, utilizando os iniciadores T7 forward e
o iniciador P17AS, permitiu ter a certeza de quais colônias apresentavam o inserto em
correta orientação, uma vez que, na orientação invertida não haveria a amplificação
com esse par de iniciadores. De maneira a caracterizar completamente a construção
foi realizado o seqüenciamento do clone selecionado.
Esse clone foi seqüenciado com os iniciadores T7 forward e T7 reverse, o que
demonstrou que a construção era perfeita, com a correta inserção da ORF-p17 em fase
com o restante do vetor. Uma vez que o clone foi totalmente caracterizado, foi
iniciada a fase de expressão da proteína His-p17. Como dito anteriormente, não foi
necessária uma etapa de subclonagem, porém como a etapa de clonagem foi realizada
124
em células TOP10F’, se fez necessária a purificação da construção e transformação de
células capazes de promover a expressão da proteína His-P17.
As células TOP10F’, não possuem a enzima T7 RNA polimerase, portanto não
poderiam ser utilizadas para expressão uma vez que o vetor utilizado estava sob o
controle de um forte promotor viral T7 (Davanloo et al., 1984). Mesmo a expressão
basal da T7 RNA polimerase pode ser prejudicial nas etapas de caracterização da
construção, uma vez que se a proteína recombinante for tóxica para a célula, a
tendência é de que as células morram ou não mantenham essa construção estável,
prosseguindo para a cura (Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989). Por esse motivo,
seguindo as recomendações do fabricante do kit as etapas iniciais, incluindo a
propagação, caracterização e estocagem do plasmídeo TOPO-p17 foram todas
realizadas em células TOP10F’.
Para a expressão da proteína p17 foram utilizadas células BL21(DE3)pLysS, as
quais carreiam o bacteriófago DE3 em lisogenia. Esse fago contém o gene lacI; o
gene da T7 RNA polimerase sob o controle de um promotor lacUV5 e uma pequena
porção do gene lacZ. Nesse sistema a expressão da T7 RNA polimerase é reprimida
até que haja a adição do indutor (IPTG) que se liga ao repressor codificado pelo gene
lacI, permitindo a expressão da T7 RNA polimerase o que, conseqüentemente, leva à
expressão da proteína sob o controle do promotor T7, no caso a proteína His-p17.
Verificamos que havia ocorrido a expressão da proteína His-p17 quando foram
solubilizados os precipitados das induções com IPTG, o fato de uma proteína
superexpressa não ser encontrada solúvel é bastante comum, uma vez que esse grande
acúmulo protéico forma estruturas bastante densas denominadas de corpos de inclusão
(Singh & Panda, 2005).
125
Nesta fase, como haviam sido previamente removidas as proteínas em solução,
a proteína His-p17 foi encontrada parcialmente purificada, com um tamanho
compatível com o previsto para a proteína fusionada, em torno de 22 kDa (Figura 32).
Através da técnica de western-blotting, utilizando anticorpos monoclonais anti-His
confirmamos que a proteína encontrada nos géis de SDS-PAGE era His-p17 (Figura
33).
Os experimentos com a expressão de proteínas virais recombinantes foram
iniciados no Laboratório de Virologia Molecular e Tropical (LVMT) em um estudo
anterior (Favacho et al., 2006), o qual contou com a valiosa colaboração da professora
Eleonora Kurtenbach do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ, durante algumas
etapas do seu desenvolvimento. Por outro lado, o estudo envolvendo a clonagem e
expressão da proteína His-p17, com exceção do seqüenciamento do clone, foi
totalmente realizado no LVMT, iniciando uma nova fase de experimentos realizados
no Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes.
Recentemente foram publicados dois estudos sobre a proteína p17, os quais
mostraram que esta proteína induz um retardo no crescimento de células transfectadas
(Liu et al., 2005) e que p17 possui uma seqüência sinal para localização nuclear
(Costas et al., 2005). As repercussões dessas descobertas no ciclo replicativo viral
ainda são incertas. Novos estudos com essa proteína têm o potencial de decifrar
mecanismos envolvidos na propagação de amostras de reovírus aviários e
possivelmente de outros agentes virais. Nesse contexto a obtenção da proteína p17
recombinante, será de grande valor em futuros trabalhos relacionados à determinação
de sua atividade biológica.
O crescente aumento de estruturas protéicas determinadas em alta resolução por
cristalografia de raios-X ou ressonância magnética nuclear reflete o potencial dessas
126
técnicas para o entendimento do enovelamento e conseqüentemente das funções
biológicas assumidas por cada proteína. Para se chegar a esse estágio é necessária a
obtenção da proteína em estudo em grande quantidade e com certa pureza. Por isso,
na maioria das vezes são utilizados sistemas de expressão heteróloga, tal qual o
utilizado nesta tese.
A utilização de uma tecnologia recombinante nos permite obter grande
quantidade da proteína His-p17, além da facilidade de purificação através da
cromatografia de afinidade por íons metálicos. Nossa idéia futura é justamente utilizar
a proteína p17 nesse tipo de ensaio e assim aumentar o conhecimento dessa proteína
por homologia estrutural de função.
127
6. Conclusões
No presente trabalho foram determinadas as seqüências de cinco segmentos
genômicos e a seqüência deduzida de sete proteínas de duas amostras de reovírus
aviários. Em pelo menos duas proteínas, µB e σC, foram encontradas diferenças
significativas entre as duas amostras.
Na proteína µB, cinco principais diferenças foram verificadas em função da
análise da estrutura primária. O posicionamento dos aminoácidos substituídos na
seqüência da amostra P100 foi determinado através da construção de um modelo
tridimensional baseado nas coordenadas atômicas da estrutura resolvida para a
proteína análoga das amostras de reovírus de mamíferos µ1.
Somente com a geração desse modelo foi possível verificar que as substituições
T325I e T616I encontram-se em um mesmo plano voltado para o interior do trímero
de µB. Essas alterações para aminoácidos hidrofóbicos podem estar contribuindo para
um aumento da estabilidade do complexo e, uma vez que foram localizadas apenas na
amostra vacinal, cujos títulos no hospedeiro são bastante reduzidos, podemos
especular que essas mudanças contribuem negativamente para uma eficiente
propagação da amostra viral. Outras três mudanças também observadas em µB estão
localizadas próximas entre si e em uma região importante para a penetração de
membranas celulares. Duas dessas mudanças Q388K e N482D fizeram surgir a
possibilidade de uma interação iônica o que corrobora para uma maior estabilidade
nesta região, e tal como descrito anteriormente pode estar impedindo as alterações
conformacionais no trímero de µB necessárias ao eficiente processo de infecção viral.
Também não deve ser descartado que estas alterações podem estar envolvidas na
128
interação com a proteína σB, responsável pela proteção do vírion e que necessita ser
removida nos eventos iniciais de interação com a célula hospedeira.
Em relação a proteína σC também foram encontradas cinco alterações de
aminoácidos em relação a amostra S1133wt. Três alterações (T106R, T113I e T119A)
ganharam mais destaque em função da complexidade das mudanças observadas. Em
especial a alteração T106R cria um ambiente favorável para a formação de uma ponte
salina com o resíduo de aspártico 102. Este tipo de interação só é possível nas
amostras vacinais derivadas de S1133wt cujas seqüências também foram analisadas
nesse estudo. Em todas as outras 31 seqüências não existe a possibilidade de uma
interação como esta, pelo menos na mesma posição. Da mesma maneira que para a
proteína µB este tipo de interação entre os aminoácidos nos leva a acreditar que
novamente estejam sendo criadas contribuições negativas ao processo infeccioso
viral. Nesse caso afetando uma eficiente trimerização da espícula viral responsável
pelo primeiro contato com os receptores celulares.
A obtenção de um clone expressando a proteína His-p17 foi alcançada com
sucesso. Esse clone foi caracterizado por seqüenciamento e provou ser funcional nos
experimentos de expressão realizados nesta tese. O próximo passo nesse sentido será a
produção em maior escala da proteína His-p17, a purificação da mesma e sua
utilização em experimentos para determinação estrutural.
129
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