abszorpciós fotometria fluoreszcencia...
Post on 27-May-2019
217 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Abszorpciós fotometria
Fluoreszcencia spektroszkópia.
Huber Tamás
PTE ÁOK Biofizikai Intézet2010. október 19.
A fény
A fény
x
B
hullámhosszE
x
elektromos térerısség-
vektor
Az elektromos és a mágneses térerısség vektorai
merılegesek egymásra, valamint a haladási irányra! Transzverzális
hullám
A fény kettıs természete:
Hullám(terjedéskor)
• Elhajlás (diffrakció)• Interferencia• Polarizáció
Részecske(kölcsönhatáskor)
• Fotoeffektus• Compton-effektus
Sir Isaac Newton (1642–1727)
� vonalas (atomok (magas hımérséklető, ritka gázok))széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemeza spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzıek (kémiai összetevık, koncentráció)
�sávos (molekulák)sok, egymáshoz közeli vonalmegjelenésük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotóatomok vibrációival (rezgéseivel) kapcsolatos
� folytonos (hevített anyagok)a folytonos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, és a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerőintenzitásváltozások
A spektrumok megjelenési formái
Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyelési) színképek
Magas
hımérsékleten izzó
szilárd és
folyékony anyagok
Izzó gázok
emissziós
spektruma
Izzó gázok
abszorpciós
spektruma
http://astro-canada.ca/_en/a3300.html
Joseph von Fraunhofer
(1787–1826)
Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a
szoláris kromoszférában lévı elemeknek
a Nap forró belsejérıl kibocsátott látható sugárzás
bizonyos hullámhosszain történı abszorpciója okoz.
Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma
Ar
He
Ne
A spektrum• Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása
alkotó frekvenciáira.
• Egy intenzitás-jellegő mennyiség ábrázolva egy energia-
jellegő mennyiség függvényében.
λ (nm)
absz
orp
cióintenzitás, beütésszám (pl. radioaktivitás
mérése), fotonszám, transzmittancia,
abszorbancia (extinkció, OD)
energia és azzal arányos
mennyiségek (pl. frekvencia,
hullámhossz, hullámszám)
Fény és anyag kölcsönhatása
• Kvantált energiafelvétel (foton)• Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható
elektromágneses sugárzás:• visszaverıdhet (reflexió) • elnyelıdhet (abszorpció) • áthaladhat (transzmisszió)
a biológiai hatás létrejöttének feltétele!
A fényabszorpció
A beesı fénynyaláb elektromos tere az útjába esıkis részecskék töltéseit rezgésre kényszerítiapró oszcillátorok vagy „rádióadók”
elektromágneses hullámokat bocsátanak kiHa ez a rezonanciafrekvencia: a rezgési amplitúdó
megnı, „belsı súrlódás” lép felaz oszcillátor energiája lecsökkenaz anyag részlegesen elnyeli a sugárzást
Gerjesztı fény
f rezonancia
Atomi/molekuláris
rendszer
Fényintenzitás-változás
I0 I
Transzmisszió
mintafényforrás detektor
T = I / I0
Általában százalékban (%) adjuk meg.
I0 I
I = I0.10-ε(λ) x c
εεεε(λλλλ): az extinkciós koefficiens (anyagi minıségtıl függ),
c: a minta koncentrációja, x: az optikai úthossz
Lambert-Beer
törvény
Abszorpció Az abszorpció …
Megjegyzés: a transzmittancia nem additív: ha az egyik komponens
átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettı együtt NEM 90%-
ot fog átengedni!
E ≈ OD ≈ A = lg (I0/I) = ε(λ) . c . x
Miért ε(λ) és nemcsak ε?
λλλλ (nm)
absz
orpc
ió
Mert az abszorpció λ függı, így az ε is az kell hogy legyen!
Hogyan mérjük az abszorpciót?
fényforrás minta detektormonokromátor
Egy fotométer egyszerő sémája:
fotometria = abszorpciós spektroszkópia
mőanyag, üveg,
kvarc küvettákban
Folytonos fényő, pl.: halogén,
deutérium, xenon, stb. lámpa
Prizma vagy optikai
rács + rés
Egy- és két-utas fotométerek
Az emisszió és az abszorpció mérése
emisszió Tér bármely irányából!
abszorpció Csak lineáris
elrendezésben!
A fotométer linearitása;
“stray light effect”
Várható tendencia
koncentráció
absz
orpc
ió
Meredekség: ε
A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok!
Optikai rács
Második, harmadik, stb. felharmónikusokmegjelenése!
A fotométer linearitása;
“stray light effect”
mintaI0 I
99% λkiválasztott
és
1% λfelharmónikus
89% λkiválasztott
és
1% λfelharmónikus
Kicsi abszorpció mellett
mintaI0 I
99% λkiválasztott
és
1% λfelharmónikus
1% λkiválasztott
és
1% λfelharmónikus
Nagy abszorpció mellett
Ezt is érzékeli a detektor!!!
Fényszórás
• Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a „stray light effect” mellett!
minta
Az abszorpciós fotometria alkalmazásai
• Különbözı oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása
• híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévımolekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit)
• Idıfüggı változások nyomon követése
• Elektroforetikus minták kiértékelése
A fehérjék abszorpciójának értelmezése
Idıfüggı mérések
Anyagi,
minıségbeli,
szerkezeti
változások
követése (pl.
kémiai reakciók
hatására)
0 1000 2000 3000 4000
-0,4
-0,2
0,0
0,2
Absz
orpc
ió
idõ (s)
Abszorpció egyéb alkalmazásaSDS-PAGE minták kiértékelése
Lumineszcencia alapjelensLumineszcencia alapjelenséégek, gek, paramparamééterekterek
Lumineszcencia: a fényt kibocsátó rendszer nem a magas hımérséklet miatt világít („hideg emisszió”).Molekulákból vagy ionokból: molekuláris lumineszcencia.
Alapjelenségeit a Jablonski-féle séma szerint értelmezzük.
Az energiaszintek Az energiaszintek felhasadnak:felhasadnak:VibrVibráácicióóssszintekre szintekre (atommagok rezg(atommagok rezgıımozgmozgáása)sa)Ezek tovEzek továább bb rotrotáácicióós s szintekre szintekre (atommagok (atommagok tengely ktengely köörrüüli li forgforgáássáábbóól)l)
Gerjesztés módjaiofotonabszorpció (fotolumineszcencia)okémiai reakció (kemilumineszcencia)obiokémiai reakció (biolumineszcencia)oradioaktív bomlás energiája (radiolumineszcencia)
Lumineszkáló molekulák szerkezete: konjugált kettıs kötéseket tartalmazógyőrőkkel rendelkeznek
1,51,5--IAEDANSIAEDANS
o Ha S0 alapállapotú molekulát E= h*n energiával gerjesztünk, 10-15
s alatt S1 gerjesztett állapotba kerül (igen ritkán: S2 állapotba)
o A foton-abszorpció során az elektron spin állapota nem változik meg
o A rendszer alapállapotra törekszik:A molekula olyan vibrációs szinten van, ami nem felel meg a környezettel való termikus egyensúlynak
• S2-S1 átalakulás: 10-12 s alatt• S1-S0 átalakulás: 10-8 s alatt
Termikus relaxáció:
A „forró” molekula és a környezete közti hıcsere
(Vibrációs relaxáció: a vibrációs energia hıvé alakul)
Fotoemisszió:
A gerjesztett molekula alapállapotba kerül egy foton kisugárzása révén
Kasha-szabály:
A fluoreszcencia-emisszió az elsı gerjesztett állapot legalacsonyabb vibrációs
szintjérıl történik
Bizonyíték: bármilyen hullámhosszú foton elnyelésével kerül a molekula
gerjesztett állapotba, az emissziós spektrum alakja nem változik
SS11--SS00 nem nem spintiltottspintiltott((internalinternal
conversionconversion=IC)=IC)
SS11--TT11
áátalakultalakuláás: s: spintiltottspintiltottfolyamatfolyamat((spinvspinvááltltóóáátmenet, tmenet, intersystemintersystemcrossingcrossing=ISC)=ISC)
A rendszer többféle úton adhatja le az energiát fény formájában:
a. FluoreszcenciaAz elektron a termikus relaxáció után egy lépésben tér vissza azalapállapotbaLecsengése: nanoszekundumos (10-9) nagyságrendő
b. FoszforeszcenciaS1 állapotú molekula sugárzás nélküli átmenettel T1 triplettállapotba kerül ebbıl sugárzási energia kibocsátásával kerül S0 alapállapotba (tiltott spin átmenet miatt kisebb valószínőséggel)Lecsengése: 10-6-10 s
c. Késleltetett fluoreszcenciaT1 állapotból termikus gerjesztéssel S1 állapotba, majd onnan S0-ba(„magas hımérséklető foszforeszcencia”)
Az S1-S0 átmenet
A lumineszkA lumineszkáállóó anyagot jellemzi:anyagot jellemzi:
AbszorpciAbszorpcióóss--, fluoreszcencia, fluoreszcencia--, , foszforeszcenciafoszforeszcencia gerjesztgerjesztéési si éés s emissziemisszióós spektrumas spektruma
SugSugáárzrzáás kvantumhats kvantumhatáásfokasfoka
Gerjesztett Gerjesztett áállapot llapot éélettartamalettartama
EmissziEmisszióó polarizpolarizáácicióófoka (anizotrfoka (anizotróópipiáája)ja)
Az emissziós spektrum
A kisugárzott fény teljesítménysőrőségének hullámhossztól valófüggését kifejezı függvény:
∆∆∆∆JE / ∆λ (λ)∆λ (λ)∆λ (λ)∆λ (λ)
Azt a sugárzási intenzitást jelöli, mely egy adott hullámhossz ∆λ∆λ∆λ∆λkörnyezetében mérhetı.A ∆λ∆λ∆λ∆λ intervallumot a rés szélessége határozza meg.
Fluoreszcencia emissziós spektrum
Az elsı szingulett gerjesztett állapot legalsó vibrációs szintjérıl az alapállapot valamely vibrációs szintjére való átmenetkor keletkezik.
Információt ad az alapállapot vibrációs szintrendszerérıl.
Foszforeszcencia emissziós spektrum
Az elsı triplett gerjesztett állapotból a szingulett állapotba valóátalakuláskor keletkezik.
Szobahımérsékleten csak kristályos anyagokon (oldatban: kioltók pl. O2) figyelhetı meg.
A fluoreszcencia sávhoz képest a vörös felé eltoldódott.
Gerjesztési spektrumo Egy rögzített emissziós hullámhosszon detektálunk.o Az intenzitást a gerjesztési hullámhossz függvényében mérjük.o Függvényalakja az abszorpciós spektruméval egyezik meg, de
csak az adott hullámhosszon emittáló komponensre jellemzı.
Stokes-eltolódás A mérés alapelvei
Legfontosabb probléma: a gerjesztı fény és az általa okozott lumineszcencia fény elkülönítése
I. Fluoreszcencia mérésénél:A gerjesztési és észlelési irányok célszerő megválasztásaHárom elrendezés
1. Az észlelés iránya merıleges a gerjesztés irányára
2. Az gerjesztés és az észlelés iránya „párhuzamos”
A minta elülsı oldaláról kilépıfluoreszcenciát érzékeljük
3. A minta gerjesztéssel ellenkezıirányú, hátsó oldaláról detektálunk
!! Fényszőrık, monokromátorok!!
II. Foszforeszcencia mérésénélA gerjesztı fény a foszforeszcenciafénytıl idıben elkülönüljönAz intenzitás idıbeli változása is mérhetı legyenFoszforoszkóp alkalmazása:A mintát gerjesztés után optikai ernyıvel eltakarjuk Ekkor juthat a detektorhoz az emittált fény
Az az idı, amely a gerjesztés befejezése és a megfigyelés kezdete között eltelik: függ a forgási sebességtılfügg a nyílások számától
Gyakorlatilag elérhetı legrövidebb idı: 10-5 s nagyságrendőMindig alacsony hımérsékleten kell mérni
A forgó átlátszatlan henger résén a gerjesztı fény áthatol, de a foszforeszcencia a henger falán nem jut át
Negyedfordulat után a gerjesztıfény útja záródik el, a foszforeszcencia a detektorhoz jut a henger másik részén
Köszönöm a figyelmet!
top related