8. enzimas 1

Enzimas

Concepto de enzima• Los enzimas son generalmente proteínas

o asociaciones de proteínas y otras moléculas orgánicas e inorgánicas que actúan catalizando los procesos químicos que se dan en los seres vivos.

• ¿Qué es catalizar?– Acelerar las reacciones químicas– Disminuir la energía de activación

“Energía de activación” Es la energía necesaria para que una sustancia A se transforme en otra B

Para que una reacción se lleve a cabo las moléculas deben alcanzar un estado energético determinado (energía de activación).Puede conseguirse esta energía, de dos formas:

B) CON ENZIMAS

Aumentando la temperatura. Sin embargo, las enzimas se desnaturalizan a esa T. Además, esa energía debe proceder de otra reacción, lo que aumenta el gasto energético.

Con enzimasLas enzimas rebajan la energía de activación

PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN

– De 106 a 1012 veces vs sin enzima.– Aún más rápido que los catalizadores químicos.

• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5– Presión atmosférica normal

• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato– Por concentración de enzima– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)– Por inhibidores no competitivos (no semejantes al sustrato)– Por regulación alostérica

• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato– No hay productos colaterales

Características de las Enzimas

1. Especificidad. Cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

2. No forman nunca parte del producto o productos.

3. No se consumen.

4. Son necesarios, por tanto, sólo en una pequeña cantidad.

Ene

rgía

Progreso de la reacción

Variación de la energía

Energía de activación con la enzima

Energía de activación sin la enzima

Energía de los productos

Energía de los reactivos

Las enzimas actúan como un catalizador:

Disminuyen la energía de activación.

No cambian el signo ni la cuantía de la variación de energía libre.

No modifican el equilibrio de la reacción.

Aceleran la llegada del equilibrio.

Al finalizar la reacción quedan libres y pueden reutilizarse.

Mecanismo de la acción enzimática1.- se forma un complejo enzima- sustrato2.- los restos de los aminoácidos que configuran el

centro activo catalizan el proceso. Para ello debilitan los enlaces necesarios para que la reacción química se lleve a cabo a baja temperatura y no se necesite una elevada energía de activación.

3.- los productos se separan del centro activo y la enzima se recupera intacta para nuevas cataísis

Centro activo: Región del enzima que se une al sustrato y donde se realiza la catálisis

• Es un bolsillo o hendidura tridimensional compuesto por residuos de aminoácidos de diferentes partes de la molécula que producen un microambiente específico.

• Es relativamente pequeño en comparación con el volumen total del enzima.

• Los sustratos se unen mediante múltiples interacciones débiles. Las interacciones proveen de la energía necesaria para reducir la energía de activación.

• Proporciona la especificidad a la enzima.

Enzima (E)Sustratos (S)

Complejo enzima-sustrato (ES)

Enzima (E)

Productos (P)

Esquema general de la reacción enzimática

E + S ES E + P

Modelo de Llave y CerraduraModelo de Llave y Cerradura (Emil Fischer) (Emil Fischer)

Substrato y enzima se acoplan de forma estereospecífica,de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.

Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera insuficiente al no explicar algunos fenómenos de la inhibición enzimática

Sustrato

Enzima

Complejo enzima- sustrato

Modelo de Ajuste InducidoModelo de Ajuste Inducido (Koshland) (Koshland)

Tanto la enzima como el substrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión.

Está mucho más de acuerdo con todos los datos experimentales conocidos hasta el momento.

Sustrato

Enzima

Complejo enzima- sustrato

• Nomenclatura histórica:– SUSTRATO + ACTIVIDAD + SUFIJO(asa)

(v.g. glucoquinasa)– SUSTRATO + SUFIJO(asa)

(v.g. ureasa)– DONADOR + ACEPTOR + ACTIVIDAD + SUFIJO(asa)

(v.g. oxalacetilaminotransferasa)

• Nomenclatura IUB (1972): 6 grupos según la reacción catalizada. Código numérico encabezado por las letras EC( enzyme commission). Cuatro números separados por puntos

Nomenclatura

EC 1.x OxidorreductasasEC 2.x TransferasasEC 3.x HidrolasasEC 4.x LiasasEC 5.x IsomerasasEC 6.x Ligasas

Clasificación de enzimas por Grupos

Sin transferencia de hidrógenos

1. OXIDORREDUCTASAS

• Regulan reacciones REDOX

• Existen dos tipos esenciales:

• Con transferencia de hidrógenos

• Sin transferencia de hidrógenos

Con transferencia de hidrógenos

AH2 + B A + BH2

2. TRANSFERASAS • Transfieren grupos funcionales

3. HIDROLASAS •Rotura de enlaces por medio de agua

4. LIASAS •Rotura o formación de moléculas sin intervención de agua.

•Suele producirse adición a dobles enlaces: C=C, C=O, C=N

5. ISOMERASASCambio de posición de grupos dentro de la molécula

6. LIGASAS O SINTETASAS Formación de enlaces con rotura de ATP

Pepsina Tripsina

Cada enzima actúa a un pH óptimo. Cada enzima tiene una temperatura óptima para actuar.

pH óptimo Tª óptimapH óptimo

Los cambios de pH alteran la estructura terciaria y por tanto, la actividad de la enzima.

Las variaciones de temperatura provocan cambios en la estructura terciaria o cuaternaria, alterando la actividad del enzima.

Influencia del pH y la temperatura en la actividad enzimática

Factores que influyen en la actividad enzimática

Efecto del pH

Todas las enzimas presentan un pH óptimo de actividad. El pH puede afectar de varias maneras:

El centro activo puede contener aminoácidos con grupos ionizados que pueden variar con el pH.

El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.

Algunas enzimas presentan variaciones peculiares. La pepsina del estómago, presenta un óptimo a pH=2, y la fosfatasa alcalina del intestino un pH= 12

Efecto de la temperatura

• Influye en la actividad. El punto óptimo representa el máximo de actividad.

• A temperaturas bajas, las enzimas se hallan "muy rígidas" y cuando se supera un valor considerable la actividad cae bruscamente porque, como proteína, la enzima se desnaturaliza.

Factores que influyen en la actividad enzimática

Algunas enzimas requieren la presencia de una molécula no proteica para la catálisis: son las proteínas CONJUGADAS u HOLOENZIMAS

APOENZIMA: parte proteica

COFACTOR: parte no proteica

Según la complejidad de la porción no proteica:

• Ión

• Coenzima

• Grupo prostético

Cinética de la reacción enzimática

La velocidad de una reacción enzimática aumenta de forma lineal hasta alcanzar un máximo en el que se produce la saturación de la enzima

Baja concentración de sustrato

ALTA concentración de sustratoSATURACION

v

[s]

Efecto de la concentración de substrato

..

. . . . . .

Representación directa

s0 20 40 60 80 100

v

0

20

40

60

80

100

Km

Vmax

vV sK s

mx

m

1 1 1v

KV s V

m

m x m x -1/Km

1/Vmax

Representación Lineweaver-Burke

La concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima es la constante de Michaelis (Km).El valor de Km también indica la afinidad de la enzima por el sustrato o eficacia catalítica

Cálculo de Actividad Enzimática

• La velocidad de reacción catalizada por 0,1ml de una dilución 1:100 de Fosfatasa Alcalina es 0,3umoles / min. de producto. ¿Cuál es su actividad enzimática?

• 0,1ml-------- 0,3umoles producto / min. 1,0ml------------3,0umoles producto / min. dil 1:100-------------300umoles producto / min. Respuesta: 300U/ml

Inhibición enzimática

Inhibidor:

Efector que hace disminuir la actividad enzimática, a través deinteracciones con el centro activo u otros centros específicos(alostéricos).

Esta definición excluye todos aquellos agentes que inactivan ala enzima a través de desnaturalización de la molécula enzimática

De esta forma, habrá dos tipos de inhibidores:

I. Isostéricos: ejercen su acción sobre el centro activo

II. Alostéricos: ejercen su acción sobre otra parte de la molécula, causando un cambio conformacional con repercusión negativa en la actividad enzimática.

Inhibición enzimática isostérica

Los inhibidores isostéricos pueden ser de dos tipos:

1. Inhibidor reversible: establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-substrato o con ambos:

E + I EI

2. Inhibidor irreversible: modifica químicamente a la enzima:

E + I E’

ES + I ESI

Inhibición reversible

(a) El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del substrato: Inhibición Competitiva

(b) El inhibidor se fija a la enzima independientemente de que lo haga o no el substrato; el inhibidor, por tanto, no impide la fijación del substrato a la enzima, pero sí impide la acción catalítica: Inhibición No Competitiva

(c) El inhibidor se fija únicamente al complejo enzima-substrato una vez formado, impidiendo la acción catalítica; este tipo se conoce como Inhibición Anticompetitiva

Inhibición Competitiva

Inhibidores Competitivos

• Compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima

• Se une solo a la enzima libre• V máx no se altera y K M cambia

Inhibición competitiva

Al aumentar la cantidad Al aumentar la cantidad de SUSTRATO el de SUSTRATO el inhibidor competitivo es inhibidor competitivo es desplazado y se forma desplazado y se forma productoproducto

E ES

EI

I

SE + P

Características:- Las fijaciones de substrato e inhibidor son mutuamente exclusivas- A muy altas concentraciones de substrato desaparece la inhibición- Por lo general, el inhibidor competitivo es un análogo químico del substrato.- El inhibidor es tan específico como el substrato

Se define una constante deequilibrio de disociación delinhibidor:

Ki = [E] [I]

[EI]

En condiciones de equilibrio rápido, llamando y a la concentración del complejo EI, para la inhibición competitiva obtenemos el siste-ma de ecuaciones

vV s

KiK

s

m x

mi

1

Ke x y s

x

Ke x y i

y

m

i

( )

( )

0

0

Que resuelto para x nos da

xe s

KiK

smi

0

1

De donde

Por tanto, en la inhibición competitiva,

1. El efecto cinético del inhibidor es el aumento aparente de la Km, que aparece multiplicada por el factor (1 + i/Ki)

2. La Vmax no aparece modificada; para concentraciones muy altas del substrato, v = Vmax, igual que en ausencia de inhibidor

3. Cuanto más pequeño sea el valor de Ki mayor será la potencia del inhibidor competitivo.

KmSin

inhibidor

Kmcon

inhibidor

Sin inhibidor

Con inhibidor

El inhibidor competitivo aumenta la Km

1/s-0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

1/v

0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

-1/Km

-1/(Km(1 + i/Ki))

1/Vmax

Inhibición competitiva - Representación recíproca doble

Ejemplo Inhibidor Competitivo

• Ácido succínico + FAD == ácido fumárico + FADH2

• El inhibidor competitivo es el ácido malónico

• Es un análogo estructuralmente parecido al ácido succínico

Ácido Fólico y Sulfanilamida• La sulfanilamida es un análogo estructural

del ácido p - aminobenzoico (PABA)• PABA es el punto de partida para la síntesis

de ácido fólico en las bacterias• El ácido fólico es una vitamina esencial para

la proliferación (división) bacteriana• Sulfanilamida se usa en el tratamiento

algunas infecciones

Metotrexato y Dihidrofolato• El ácido fólico en sus formas de dihidro y

tetrahidrofolato es coenzima de la reacción catalizada por la dihidrofolato reductasa

• Esta reacción es parte del metabolismo de los nucleótidos para la síntesis de DNA

• Metotrexato se usa en la terapia de algunos cánceres, inhibiendo la síntesis de DNA

Inhibidor competitivosu estructura es similar a la del sustrato

No se forma producto

Inhibición No Competitiva

Inhibidor No Competitivo

• Se une a un lugar diferente del sitio activo la enzima

• Se une a la enzima libre y también al complejo enzima-sustrato

• Por acción del inhibidor disminuye la Vm pero el valor de Km no se altera

Inhibición NO competitivaInhibición NO competitiva

Inhibidor NO competitivoInhibidor NO competitivoEl inhibidor NO competitivo se une a la enzima en un

sitio diferente del sitio activo

E ES

EI

I

SE + P

I

ESI

SInhibición

No Competitiva

El inhibidor se fija indistintamente a la enzima libre Ey al complejo enzima-substrato ES; ni el complejo EIni el complejo ESI son productivos

Inhibición Anticompetitiva o Incompetitiva

Inhibidor IncompetitivoEn este tipo de inhibición el inhibidor se enlaza al centro activo pero solo después de que el sustrato lo haya hecho y, por tanto, inhibidor y sustrato no compiten. De esta manera, aunque todo el sustrato esté saturando la enzima y toda la enzima esté como complejo ES, el inhibidor puede enlazarse produciendo un complejo inactivo ESI.

Como I solo se une a ES estimula la formación de ES y, por tanto, incrementa la unión del sustrato a la enzima, disminuyendo Km . Sin embargo, el complejo ESI no conduce a productos y Vm disminuye.

Inhibidor Incompetitivo

• Se une a un lugar diferente del sitio activo de la enzima

• Se une sólo al complejo enzima-sustrato

• Los efectos que tiene: disminuye el valor de Km y también el de Vmáx

E ESS

E + PI

ESIInhibición

Anticompetitiva

El inhibidor sólo puede fijarse al complejo ES;el complejo ESI no es productivo

Modelo Kap Vap

Inh comp Km(1+i/Ki) Vm

Inh no comp total Km Vm/(1+i/Ki)

Inh anticomp Km/(1+i/Ki) Vm/(1+i/Ki)

Determinación de parámetros cinéticos de inhibición

Inhibición Irreversible- Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de la enzima, modificándola covalentemente

- Su acción no se describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una constante de velocidad ki:

E + I E’

- A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.

- Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente tóxicos.

Inhibidores Irreversibles

• Producen inactivación permanente de la actividad enzimática

• Se interfiere con el normal desarrollo de una reacción o vía metabólica

• Ejemplos: p-cloromercuribenzoato, yodoacetato, diisopropilfluorfosfato

Algunos tipos de inhibidores irreversibles

1. Reactivos de grupos -SH

2. Organofosfóricos

3. Ligandos de metales

4. Metales pesados

Inhibición enzimática alosterica

Enzimas Alostéricas• Son enzimas cuya estructura proteica está formada

de varias subunidades• No se rigen por la cinética de M - M• Además del sitio o centro activo tienen sitios

alostéricos o de regulación• Sitio activo/sustratos; • Sitio alostérico/moduladores o reguladores• La relación entre la velocidad de reacción y la

concentración de sustrato sigue cinética sigmoídea

Enzimas alostéricas• Las enzimas alostéricas

presentan estructura cuaternaria.

• Tienen diferentes sitios activos, unen mas de una molécula de sustrato

• La unión del sustrato es cooperativa

• la curva de velocidad presenta una forma sigmoidal

Concepto de Cooperatividad• La unión de los sustratos al sitio activo de

una subunidad produce un cambio conformacional que por contacto físico se transmite a las subunidades vecinas, facilitando las interacciones

• Modelos de unión: secuencial y concertado• Ejemplos: unión Hb-O2, enzimas alostéricas

y sus sustratos

Moduladores Alostéricos

• También reciben el nombre de efectores y pueden ser positivos o negativos

• Se unen al sitio alostérico que puede estar en la misma subunidad que tiene al sitio activo o en las subunidades regulatorias

• Su unión produce un cambio conformacional que afecta al sitio activo

Aspartato Transcarbamilasa• Ác L-asp + Carbamil-P === Carbamil-

asp + Pi . Primera reacción en la síntesis de pirimidinas

• Efector positivo: CTP Efector negativo: ATP

• Tiene dos subunidades catalíticas para los sustratos y tres subunidades regulatorias para los efectores

Modificación covalente de las enzimas. En los enzimas de vías degradativas la forma fosforilada es más activa que la desfosforilada. En los procesos biosintéticos ocurre exactamente lo contrario.

Rutas metabólicas

Tipos de sistemas multienzimáticos:

Isoenzimas o Isozimas• Son formas moleculares diferentes de una

misma enzima• Catalizan la misma reacción• Ejemplo: Lactato deshidrogenasa• Lactato + NAD ==== Piruvato + NADH• M4, M3H1, M2H2, M1H3 y H4

• Se diferencian por su movilidad electroforética• Usadas en clínica: sueros normales y sueros

con alguna patología

• EXCEPCIÓN: RIBOZIMAS. En 1982, Thomas Cech, y Sidney Altman las descubrieron. No eran proteínas, sino ARN.

En 1989 les concedieron el premio Nobel de Química