Генетика и селекция на индустриални...
Post on 14-Sep-2019
18 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Генетика и селекция на
индустриални микроорганизми
Мутационно-селекционен подход за подобряване на
индустриални щамове микроорганизми
• Води до промени в генотипа в резултат на мутация или генетична
рекомбинация
Геномни мутации: промени в броя на хромозомите
Хромозомни мутации: промени в подредбата на гените върху
хромозомата
Точкови мутации: замени в нуклеотидната последователност на
гените
• Успехът на процеса зависи от оптималното приложение на мутагенния
фактор в комбинация с използването на ефективна система за селекция на
високопродуктивни щамове
Мутационно-селекционен подход за подобряване на
индустриални щамове микроорганизми
Основни мутагенни фактори:
• Мутагенеза чрез облъчване:
Облъчване с UV лъчи с дължина на вълната 200-300 nm, с оптимум
при 254 nm (абсорбционния максимум на ДНК).
Основния продукт от действието на UV лъчите е получаването на
димери (тимин-тимин, тимин-цитозин и цитозин-цитозин) между
съседно стоящи пиримидини или пиримидини на комплементарните
вериги. UV лъчите основно предизвикват транзиции, трансверзии,
мутации с изместване рамката на четене (frameshift) или делеции.
NH
N N
N
R R
O O
O NH2
CH3
• Мутагенеза с химични агенти:
Мутационно-селекционен подход за подобряване на
индустриални щамове микроорганизми
N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин – един от най-
ефективните химични мутагени. 90% от мутациите
предизвикани от нитрозогуанидин са GC -->AT транзиции;
рядко но може да предизвика и появата на делеции или на
“frameshift” мутации
етилен
етил метил сулфонат
Други фактори оказващи влияние върху мутационно-селекционния подход:
избор на подходящ мутаген за дадения щам
система за скрининг
избор на подходящи условия за култивиране
HN = C – N – NO2
O = N – N – CH3
Мутационно-селекционен подход за подобряване на
индустриални щамове микроорганизми
Етапи мутационно-селекционния подход:
Мутационна биосинтеза
• Блокиране чрез мутация на определена стъпка от биосинтезата
на даден антибиотик
• Добавяне в хранителната среда на различни естествени или
синтетични прекурсори
• Синтез на нов антибиотик
А
С
В
D
DB
DE
E
a
Мутационна биосинтеза
Примери за мутационна биосинтеза:
Оригинален антибиотик Нов антибиотик Микроорганизъм продуцент
Пиролнитрин 4-флуоропоролнитрин Pseudomonas aureofaciens
Дауномицин Адриамицин W Streptomyces peuceticus
Рифамицин В Рифамицини Nocardia mediterranei
Сизомицин Мултамицини Micromonospora inyoensis
Стрептомицин Стрептомутин Streptomyces griseus
Пеницилин N 6-(D)-(2-амино-2-карбокси)
етилтиоацетамидо-пеницилин Acremonium chrysogenium
Гентамицин Хидрокси и деокси-
гентамицин Micromonospora purpurea
Дерегулация на метаболитни пътища
Блокиране или промяна в регулацията на даден метаболитен
път – изолиране на ауксотрофни или регулаторни мутанти
• свръхпродукция на аминокиселини
Asp Asp-P Asp-CHO Hse Met
Lys Thr
инхибиране
Аспартат киназа
S-(2-аминоетил) – L цистеин
Дерегулация на метаболитни пътища
• свръхпродукция на нуклеотиди –
блокирането на аденил синтетаза
нуклеозидаза
свръхпродукция на
инозин
пролин
глутамат
аргинин
бацитрацин
орнитин
• свръхпродукция на други метаболити
Сливане на протопласти
Основна техника за въвеждане на генетична рекомбинация при
про- и еукариотни микроорганизми
• Грам (+) – третиране с лизозим
• Грам (-) – комбинирано третиране с лизозим, ЕДТА и изотоничен разтвор на
захароза
• Гъби
дрожди – третиране с ензими, разграждащи глюко-манановия комплекс
и хитина /хеликаза, зимолиаза/
плесенни гъби – третиране с по-сложен езимен комплекс /глюканаза,
хитиназа, целулаза или литичен комплекс, получен от Streptomycetes/
Сливане на протопласти
Регенериране на протопласти
осъществява се при
• бактерии: в осмотично стабилизирани агаризирани среди
• гъби: в осмотично стабилизирани твърди или течни среди
честота на реверсия: силно варира във вида и между различните видове
Детекция на рекомбинантни щамове
• хранителна комплементация на ауксотрофни мутанти
• специфична устойчивост към токсични агенти
• комбинация от двете
Сливане на протопласти
Сливане на протопласти
• Brevibacterium glutamicum – повишаване синтезата на Lys и
съкращаване с 2/3 времето за култивиране
• Cephalosporium acremonium – висока скорост на растеж,
повишена спорулация, синтез на цефалоспорин от неорганичен
сулфат, 40% увеличена антибиотикопродукция
• Streptomyces rimosus var. kanamyceticus и Streptomyces
kanamyceticus – синтез на неомицин
• Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccaromyces pombe –
ензимни системи и на двата родителски вида
Приложение
Насочена мутагенеза
• Цел
насочена промяна в определени базови двойки в
нуклеотидната последователност
случайна промяна в oпределен ДНК регион
Този метод позволява въвеждане на промени във всеки един
участък на гена от интерес и последващо проследяване на ефекта
на тези промени върху функциите и активността на кодирания от
него белтък.
добро познаване на нуклеотидната последователност на
гена от интерес, или
информация за структурата на кодирания белтък и
значението на изграждащите го аминокиселини за
каталитичния акт
• Основа
третиране с химични агенти на изолирани ДНК региони
(метоксамин)
грешно инкорпориране на нуклеотиди (error-prone PCR)
олигонуклеотид насочена мутагенеза
• Подходи
Насочена мутагенеза
алкална фосфатаза – замяна на Lys222 с Ala222
увеличена устойчивост на 1М Н2О2;
с 50% по-висока ензимна активност
• Примери
Насочена мутагенеза
• Примери
въвеждане на дисулфидни мостове – увеличена Т0 и pH
стабилност
Т4 лизозим –
родителски щам: полуживот 11 min на
670С и pH 8.0
мутантен щам: полуживот 6 h на 670С и
pH 8.0
триозофосфат изомераза – замяна на двата Asp
остатъка, дезаминиращи се при термична денатурация
с два Thr остатъка
2 пъти по-висока термостабилност
ДНК рекомбинация in vitro - стратегия
Техника подходяща за случаите, когато броят на гените, участващи
в синтезата на даден продукт, е относително малък.
1. Избор на белтък, чийто ген ще бъде
клониран
2. Избор на ДНК, съдържаща подходящия
ген
3. Избор на подходящ вектор
4. Рекомбинация между векторната и
донорната ДНК
5. Трансформация
6. Селекция на клетки, съдържащи
рекомбинантната ДНК
7. Изолиране на амплифицираната ДНК и
характеризиране
8. Генна модификация
9. Инсерция на модифицираните гени в
съвместим експресионен вектор
10. Трансформация
11. Култивиране на клетките, изолиране и
характеризиране на плазмида
12. Култивиране на клетките, продуциращи
желания продукт
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
Подготовка и клониране на ДНК фрагментите
• PCR амплификация на желания ДНК фрагмент, или
• получаване на кДНК (RT-PCR)
• срязване на ДНК фрагмента и избрания вектор с подходящи
ендонуклеазни ензими
• лигазна реакция
Бактериални вектори
• плазмидни вектори
ori за репликация
маркер за селекция
(антибиотична резистентност)
единични сайтове за рестрикция
Бактериални вектори
• фагови вектори – получават се бактериофаги на E. coli и С31
актинофага на Streptomyces lividans
клониране на токсични за клетката гостоприемник продукти
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
Въвеждане на ДНК
• трансформация
естествена трансформация
получаване на протопласти
електропорация
“gunshot” метод
• конюгация
• трансдукция
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
• космидни вектори
клониране на дълги фрагменти от ДНК
получаване на геномни библиотеки
• совалкови вектори
Бактериални вектори
Детекция на клона, съдържащ желания ДНК фрагмент
• въз основа на получения белтък
- комплементационен тест, антранилат синтаза (trpE)
- детекция със специфични антитела
• въз основа на ДНК
последователността
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
Експресия на клонираните гени - използване на експресионни вектори
• силни конститутивни промотори – води до загуба на плазмид
• индуцируеми промотори (pLac; pTrp; pL и pR)
• формиране на инклузионни тела – силно редуцираща цитоплазма и
невъзможност за правилно нагъване и формиране на S-S мостове
Експресия на клонирани гени
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
• изолиране на инклузионни тела, денатурация (8М урея или 6М
гуанидин хидрохлорид) и ренатурация (внезапно, стъпаловидно или
постепенно отнемане на денатуриращия агент) на белтъка
• предотвратяване формирането на инклузионни тела
понижаване на температурата на растеж
свръхекспресия на E. coli шаперони (DnaK)
сливане с гена за тиоредоксин на E. coli
• секреторни вектори
ДНК рекомбинация in vitro при бактерии
Експресия на клонирани гени
IGF-1 IgG свързващия домен
на белтък А
Лидерен пептид
на белтък А
• експресия на слети белтъци
IgG свързващ домен на белтък А на Staphylococcus aureus
глутатион S трансфераза
6 His остатъка
периплазмена малтоза
ДНК рекомбинация in vitro при дрожди
Терапевтични продукти получени от дрожди
Животински продукти: хрудин; свински интерферон; интерлевкин;
трипсинов инхибитор
Човешки хормони: инсулин; паратироиден хормон; растежен
хормон, хорионов гонадотропин
Човешки растежни
фактори: IGF1; NGF; EGF; тъканен фактор; CSF; GM-CSF;
TNF
Човешки кръвни
белтъци: хемоглобин; фактори VIII и XIII; алфа-1-
антитрипсин; анти-тромбин III; серумен албумин
Прокариотни продукти: фрагмент C на токсина за тетанус; стрептокиназа
Повърхностни антигени
на вируси: хепатит B; СПИН; инфлуенца; полио;
полиома; Епщайн-Бар; онкогенни ретровируси
Малариен антиген -
други: Различни човешки ензими; CFTR; естрогенен
рецептор; INF-алфа; INF-бета1
ДНК рекомбинация in vitro при дрожди
Подготовка и клониране на ДНК фрагментите
Използват се методи, аналогични на тези при бактериите
Дрождеви вектори
• интегративни YIp вектори
• епизомални YEp вектори
• репликативни YRp вектори
• центромерни YCp вектори
Плазмид YIp YEp YRp YCp
________________________________________________________________________
E. coli гени или сегменти
ori, bla; tet + + + +
Дрождеви гени или сегменти
URA3; HIS3; LEU2; TRP1; LYS2; и др. + + + +
leu2-d 0 + + 0
2 m; 2 m-ori REP3; 0 + 0 0
ARS1; ARS2; ARS3; и др. 0 0 + +
CEN3; CEN4; CEN11; и др. 0 0 0 +
Меркери на гостоприемника (дрожди)
ura3-52; his3- 1; leu2- 1; trp1- 1; lys2-201; и др. + + + +
Стабилност ++ + + +
________________________________________________________________________
Компоненти на стандартните дрождеви вектори
ДНК рекомбинация in vitro при дрожди
ДНК рекомбинация in vitro при дрожди
Въвеждане на ДНК
• трансформация
Гени от особено значение в рекомбинантните технологии с дрожди
URA3 и LYS2 (оротидин -5’фосфат декарбоксилаза и -аминоадипат
редуктаза)
ADE1 и ADE2 (фосфорибозиламино-имидазол-сукцинокарбозамид
синтетаза и фосфорибозиламино-имидазол-карбоксилаза)
GAL1 промотор
AOX и MOX промотори
LAC4 промотор
ДНК рекомбинация in vitro при дрожди
Хетероложна експресия при дрожди
GRAS статус (не синтезират екзотоксини)
По-висока активност на ензимите в сравнение с тази на
експресираните в бактерии
Пост-транслационни модификации (N-крайно
ацетилиране, миристилизиране и протеолитично
срязване )
Коректно нагъване на белтъците и формиране на S-S
мостове
Възможност за секреция
Възможност за сплайсинг
Предимства и недостатъци на различните експресионни
системи
Escherichia coli
• най-добре проучените прокариоти относно биохимия и генетика
• добре развити технологии за култивиране
• добре установен последващ процесинг
• продуцира ендотоксини, които могат да замърсят продукта
• задържа извънклетъчните белтъци в периплазменото пространство
• формира инклузионни тела
Bacillus subtilis
• не е потенцилен патоген и не продуцира ендотоксини
• секретира белтъците в средата
• разработени са подходящи експресионни вектори
• лесно се трансформира
• много висока плазмидна нестабилност
Saccharomyces cerevisiae
• Получените продукти се приемат благосклонно от обществото
• Не са патогенни и притежават GRAS статус
• Най-добре проучените еукариоти относно биохимия и генетика
• Добре развити технологии за култивиране
• Добре установен последващ процесинг
• Наличност на голям брой лесно усвоими и нескъпи въглеродни източници
• Стабилни към индустриален стрес
• Относително малък геном, податлив на модификации
• Съществуват стабилни мутанти, които увеличават производителността
• Наличност на маркери за селекция на полиплоидни щамове
• Липса на вируси, които да провалят ферментационните процеси
• Съдържат плазмид (напр. 2 m плазмид);
• Възможност за автономна и интегративна трансформация
• Осъществяват пост-транслационни модификации
• Ефикасна и контролируема секреция на белтъци
• Често изрязват интроните от гените на бозайниците
• РНК полимеразара разпознава много животински промотори
Предимства и недостатъци на различните експресионни
системи
Candida maltosa
• усвояват n-алкани и мастни киселини
• контролираната екпресия на хетероложни протеини е с промотор P450
• продукция на целевите белтъци в специфични клетъчни органели
(ЕПР или пероксизоми)
• използват се за биотрансформация на хидрофобни органични съединения.
Hansenula polymorpha
• много висока генна експресия при използване на промоторите на
метанолоксидазата (MOX) или на формиат дехидрогеназата
• стабилна и в многокопийна интеграция на чужда ДНК
• синтеза на клетъчни белтъци при температура от 450C.
• голям набор от ауксотрофни щамове (ura-, leu- и др.)
• синтеза на белтъци, които не са хипергликозилирани
• възможност за секреция на целевите протеини или акумулирането им в
пероксизомите, когато тези белтъци са токсични.
Предимства и недостатъци на различните експресионни
системи
Род Kluyveromyces
• GRAS статус
• усвояват и ферментират лактоза
• имат подходящи плазмиди - Kl. lactis линейните килър плазмиди и кръговия
pKD1 плазмид, който е подобен на 2 m плазмид
Schwanomyces occidentalis
• усвояват нишесте
• могат да секретират белтъци по-големи от 140 кDa.
Род Pichia (Pichia pastoris и Pichia methanolica)
• индуцируем с метанол промотор за алкохол оксидаза (AOX)
• лесно се получават високоплътностни популации
• имат ефикасна секреция (> 1 g / L) на хетероложни протеини
• белтъците не са хипергликозилирани
Предимства и недостатъци на различните експресионни
системи
Yarowia lipolytica
• притежават ефикасна и прецизна интегративна трансформация
• ефикасна секреторна система, разпознаваща сигналните
последователности на висшите еукариоти
• използват ефикасно n-парафини като единствен въглероден източник.
Schizosaccharomyces pombe
• коректно изрязват интроните на бозайниците
• галактозилират белтъците както висшите еукариоти
• разстоянието от TATA-бокса до мястото за начало на транскрипцията
наподобява това при висшите еукариоти
• изолирането на хетероложни белтъци се улеснява от клетъчния лизис
Предимства и недостатъци на различните експресионни
системи
top related