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Aluna:Flávia Costa LeonardoOrientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante PereiraCo-orientador: Prof. Dr. Fernando Ferreira Costa
Estudo do cupim Coptotermes gestroi: Análise da base genética da
diferenciação de castas e busca de genes de importância biotecnológica
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CUPIM
• Filo – Arthropoda • Ordem – Isoptera• Mais de 2.700 espécies descritas
• Insetos Eussociais:-sobreposição de gerações -interdependência-divisão de tarefas com indivíduos estéreis trabalhando em benefício dos férteis
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CASTAS
• OPERÁRIOS
• SOLDADOS
• REPRODUTORES
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Ciclo de vida de uma colônia de Isoptera
Reprodutores alados(♂ ou ♀)
Rei e Rainha (reprodutores
primários)
Ovos
Jovens
Ninfas
Reprodutores suplementares ou de
substituição(♂ ou ♀)
OperáriosSoldados
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• Ciclagem de nutrientes• Degradação da madeira• Benefícios para o solo
– Entretanto algumas espécies causam prejuízos...
BENEFÍCIOS DOS CUPINS
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• 1986 – tratamentos de edificações infestadas por cupins foram estimados em US$ 2 bilhões.
(Edwards & Mill, 1986)
• 1994 – Na cidade de São Paulo tratamentos de 240 edificações foram estimados em US$ 3,5 milhões. (Lelis, 1994)
PREJUÍZOS CAUSADOS POR ESSES INSETOS
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• Principais pragas de edificações nas regiões tropicais e subtropicais do mundo.
(Su & Scheffrahn, 1998)
• + de 2.700 espécies 113 espécies são pragas, 80% das espécies
de importância econômica são do gênero Coptotermes. (Edwards & Mill, 1986)
CUPINS SUBTERRÂNEOS
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Coptotermes gestroi
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Coptotermes gestroi
• Hábito xilófago, contudo danificam uma variedade de materiais na busca de alimento (plástico, borracha, metal, cabos elétricos e telefônicos, isopor, tecido, betume, gesso)
• Principal praga urbana na região sudeste
• Espécie introduzida, originaria do sudeste Asiático
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NINHO SUBTERRÂNEO
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DESENVOLVIMENTO
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIO
HJ
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Operários C.gestroiCabeça de operário
C.gestroi
Biblioteca de EST
Contigs e Singletons
Seqüências de interesse
biotecnológico
celulases
CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECA DE cDNA
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RESULTADOS
1
10
100
1000
> 10050 - 100
40 - 50
31 - 40
21 - 30
11 - 20
6 - 102 - 5
1
# EST in unigene
# U
nige
ne (l
og s
cale
)
2332- sequencias777 unigenes
406 Hits 371 No Hits 33 Contaminação98 Ribossomal
178 Hits GO92 No Hits GO Fig1. Histograma da constituição das sequencias
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RESULTADOS
• Contaminação-9 Fungos do solo-3 Protozoários – possível endossimbionte-Bactérias – 2 solo
8 solo/endossimbiontes 5 Wolbachia-6 Plantas –hábitos alimentares
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29%
29%10%
9%
6%
4%
3%2%2%2%2%2%
Apis mellifera Tribolium castaneum Aedes aegypti Anopheles gambiae Drosophila Strongylocentrotus purpuratus Potamophilinus sp. Bos taurus Gallus gallus Heterotermes longiceps Tetraodon nigroviridis Wolbachia endosymbiont
Fig. 2. Distribution of assembled Coptotermes gestroi ESTs, after manual annotation. The best match result was listed according organism category
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Table 2 - Gene Ontology classification of C. gestroi cDNA library sequences
Gene Ontology Number of genes
Biological Process
cellular physiological process 184
metabolism 140
localization 31
cell communication 18
regulation of cellular process 13
regulation of physiological process 12
others 29
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Endo –β-1,4 glucanase β glucosidase
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DIGESTÃO E ABSORÇÃO DA MADEIRA
• Digestão da celulose e simbiontes• 74 – 99% degradação da celulose
Celulose
CO2
Glicose
NH3 Acetato
Piruvato
Piruvato N2 NH3
Acetil CoA Acetato
CO2 CH4
Celulose
Acetato
Piruvato GlicoseXilose
Co2 + H2 Xilan
ProtistaCupim
Bactéria
Celulose
CO2
Glicose
NH3 Acetato
Piruvato
Piruvato N2 NH3
Acetil CoA Acetato
CO2 CH4
Celulose
Acetato
Piruvato GlicoseXilose
Co2 + H2 Xilan
ProtistaCupim
Bactéria
Celulose
CO2
Glicose
NH3 Acetato
Piruvato
Piruvato N2 NH3
Acetil CoA Acetato
CO2 CH4
Celulose
Acetato
Piruvato GlicoseXilose
Co2 + H2 Xilan
ProtistaCupim
Bactéria
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CUPIM
Sistemática do grupo
• Cupins inferiores: Mastotermitidae, Kalotermitidae, Hodotermitidae, Termopsidae, Rhinotermitidae e Serritermitidae
• Cupins superiores: Termitidae
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CELULOSE
www.genomics.energy.gov
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MECANISMO DE AÇÃO DAS CELULASES
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SISTEMA DIGESTIVO
S – Glândulas salivaresOe – EsôfagoF – Intestino anteriorM – Intestino médioMs – segmento mistoMp – túbulos de MalpighiH – Intestino posteriorP1 – 1º Seg proctodealP2 – Válvula entéricaP3 – PançaP4 – Cólon P5 - Reto
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CELULASES EM CUPINS INFERIORES
Estudos moleculares das enzimas dos simbiontes são escassos1997 – Nature – Primeira descrição de uma celulase endógena em R. speratus.2002 – Descrição da - glucosidase em Neotermes koshunensis
2002 – Descrito o sistema digestivo duplo do C. formosanus (celulases endógenas + simbiontes).
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PROJETO CELULASES
• Aumentar as sequencias
• Testes para avaliar a eficiência enzimática
• Teste comparativo dos níveis de atividade enzimática nas diversas regiões do trato digestivo
• Método semi-quantitativo (RT-PCR) para verificar a expressão das celulases
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OBJETIVOS
Compreender a base molecular da determinação de castas de Coptotermes gestroi
• objetivos específicos :
- identificar os aspectos da biologia da espécie através de estudos de expressão gênica casta específica
- utilizar alguns dos genes encontrados como possíveis alvos para o controle da espécie.
- isolar e caracterizar enzimas que possam ter emprego biotecnológico.
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MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS CUPINS C. gestroi
Operários, ninfas e soldadosforrageiros de C. gestroiforam coletados em armadilhas celulósicas,distribuídas na cidade de Rio Claro-SP.
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BIBLIOTECAS SUBTRATIVAS
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIO
HJ
X
X
X
X
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LARVA X OPERÁRIO+SOLDADO
Redundancia biblioteca subtrativa
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40
50
60
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
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Num
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REAL TIME PCR E MICROARRAY
OVOS
LARVA
PRÉ – SOLDADO SOLDADONINFA
ALADOS PRÉ – REPRODUTOR NEOTÊNICOREI E RAINHA
LINHAGEM IMAGINAL LINHAGEM NEUTRA
OPERÁRIO
HJ
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Obrigado!