aluna: mirian mariko tsutsumi orientador :prof. dr. gonçalo a. g. pereira co- orientador : dr....

Aluna: Mirian Mariko Tsutsumi

Orientador :Prof. Dr. Gonçalo A. G. PereiraCo- Orientador : Dr. Jorge M. C. Mondego

Modelagem computacional da cinética enzimática de vias metabólicas de Moniliophthora perniciosa

Apresentação do projeto

Motivação

Etapas do projeto

Cura de vias metabólicas

Resultados e Conclusão

Perspectivas

http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01100.html

Motivação

Motivação

Systems Biology

Kitano, H.(2002)

Softwares disponíveisJWS Online - Online Cellular Systems Modelling

Complex Pathway Simulator

Motivação

JDesigner: A Biochemical Network Layout Tool

a modeling tool for biochemical networks

Power Law Analysis and Simulation tool

Virtual Cell- Internet simulation server at NRCAM

E-Cell- project

web server for modeling and simulation of cellular systems

Biochemical Kinetics Simulator

Genoma de M. perniciosa no LGE

+/- 16.000genes 2304 genes foram

hibridizados 189 genes diferencialmente

expressos 4595 ESTs foram agrupados

1534 unigenes (522 clusters

e 1012 singlets)

Motivação

(http: //www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura)

(Rincones et al. 2008)

Dado de de microarraysmicroarrays híbrido de DNA híbrido de DNA

Diagramas estáticos

de metabolismo no do LGE

•1751 reações enzimáticas

Motivação

•2139 enzimas

•367 vias metabólicas(Karp, 2005)

(http://www.lge.ibi.unicamp.br/biocyc/MP/).

http://www.lge.ibi.unicamp.br/biocyc/MP/

Vias metabólicas de interesse para M. perniciosa

Porque escolhemos estas vias metabólicas

Motivação

Uréia

Metanol

Glicerol

GABA

Comportamento bioquímico no processo doença do patógeno ao cacau

Scarpari et al., (2005)

Metabolismo do Metanol

Assimilação de formaldeído III (ciclo de dihidroxiacetona);

Oxidação do metanol a formaldeído

Oxidação de formaldeído II (Glutationa-dependente);

Biotrófica>>>maior expressão do gene de álcool oxidase necrotrófico (Rincones et al., 2008).

Ela oxida derivados de metanol na degradação de pectina , assim, pode sobreviver como única fonte de carbono (Rincones et al., 2008).

Presença de genes codificadores das proteínas formaldeído dehidrogenase e formato dehidrogenase, responsáveis pelo catabolismo do metanol (Rincones et al., 2008; Mondego et al., 2008)

Metabolismo do Glicerol

Degradação de glicerol I Degradação de glicerol IV

Somente essa fonte de carbono é capaz de manter in vitro o organismo na fase biotrófica (Meinhardt et al., 2005; Rincones et al., 2008)

Sustentação rítmica do crescimento deste fungo (Meinhardt et al., 2005).

Patogênese fúngica pois está envolvido na aderência e penetração (Yoder,1996)

Modificação do conteúdo de ácidos graxos quando muda de fase

Metabolismo do GABA

Degradação de 4-aminobutirato I

Degradação de 4-aminobutirato II(sendo que o primeiro GABA I exclui Ciclo TCA e Complexo dehidrogenase piruvato);

Privação do fungo a fontes de nitrogênio >>> manutenção da fase biotrófica (Rincones et al., 2008; Mondego et al., 2008).

Expressão de um gene homólogo a CLNR1 (do fungo hemibiotrófico Colletotrichum lindemuthianum )ativa as enzimas e os transportadores, que permitem absorção e catabolismo de nitrogênio de fontes secundárias (Pellier et al., 2005)

Metabolismo da Uréia

Ciclo da uréia.

Resultados agropecuários mostraram que a adição de compostos nitrogenados (uréia) às árvores de cacau infectadas resulta no controle da vassoura de bruxa (http://globoruraltv.globo.com/GRural/0,27062,LTO0-4370-3168801,00.html )

Altas concentrações de uréia (logo convertido em amônia ) promove a rápida mudança de fase

http://globoruraltv.globo.com/GRural/0,27062,LTO0-4370-3168801,00.html




Motivação

Etapas do projeto



Perspectivas

Etapas do projeto

(1)Catalogaçãoe

avaliação dados

(2)Revisão ferramentas

MODELO

(3)Aplicaçãoda

Modelagem

(4)Análise Sensibilidade

(5)ComparaçãoModelos

(6)Refinamentodo

Modelo

‘Systems biology in practice. Concepts, implementation, and application’ de Klipp, E. et al (2005)

Coleta de dados cinéticos de organismos próximos filogeneticamente (Mondego, et al, 2008)

Laccaria bicolorCryptococus neoformansUstilago maydisCoprinopsis cinereaPhanerochaete chrysosporium

Etapas do projeto- (1 ) Catalogação & Avaliação

Etapas do projeto- (1 ) Catalogação & Avaliação

http://www.brenda-enzymes.org

Constante de Michaelis Menten (Km); Turnover (kcat); pH ótimo e faixa de pH; possíveis co-fatores e inibidores, temperatura ótima e faixa de temperatura

http://www.brenda-enzymes.org/

Etapas do projeto- (2) Revisão de ferramentas

Modelagem deterministica versus estocástica

Avaliação de Softwares disponíveis

(Lee, et.al.,2008; Alves, et. al., 2006; Gilbert, et.al.,2006)

Documentação

Interfaces gráfica

Funcionalidade

Aplicativos adicionais

Compatibilidade em SBML

Teoria de Cinética química enzimática

Sistema dinâmico contínuo Equações diferenciais ordinárias(ODEs).

Legenda para o gráfico

1) Aceleração da reação enquanto [ES] está aumentando

2) A duração deste período depende da concentração inicial do substrato e as propriedades da enzima

3) Fase relacionada com o pressuposto de estado estacionário ([ES] é constante)

4) As concentrações de ES e E são amplificadas, em relação ao [S]o, são quase desprezíveis

Fase 1: Pré-estado estacionário

Fase 2: Estado estacionário

Fase 3: Esgotamento do substrato

Comportamento da concentração dos componentes em relação ao tempo da reação de catálise enzimática.

oM

o

oM

oTcato SK

SVSKSEk

v

max

Dinâmica da reação –Michaels Menten

Etapas do projeto- (2) Revisão de ferramentas

(Cornish-Bowden,1979, Dixon,1979)

Vizualizar a plotagem gráfica das concentracoes das substâncias em relacao ao tempo

Etapas do projeto- (3)Aplicação da modelagem e (4) Análise de sensibilidade

Dependência dos resultados do modelo quando há mudança no valor dos parâmetros.

Análise da sensibilidade

Voit, O. “Computational Analysis of Biochemical Systems” 2005

Modelagem computacional

Eleger o modelo matemático mais adequado

Simulação do metabolismo do organismo

Inserir dados de parâmetros cinéticos

Explicacao detalhada no exemplo da via modelada

Literatura e banco de dados de vias metabólicas já modeladas

Etapas do projeto

•JWS Oline:http://jjj.biochem.sun.ac.za/

(5)Comparação de modelos e (6) Refinamento do modelo

•BioModels

Comparação

Refinamento

Atualizacao de dados a partir da revisao bibliográfica

Sanar equívocos e erros conceituais da modelagem


Motivação

Etapas do projeto



Perspectivas

Contig da enzima da via de

metabolismo do BioCyc

Consulta do Genome Browser

da vassoura

Anotação manual dos dados

atualizados de Microarray e ESTs

Número de EC da enzima que não foi

identificado um Contig pelo BioCyc

Consulta do BRENDA da seqüência de aminoácidos

Busca via tBlastn em sequência de

Vassoura

Anotação manual do Contig EST ou

Singlet candidato

Exemplo de via metábólica para cura (A) e (B)


Pipeline A e B para cura de vias metabólicas

Validar e complementar os dados gerados automaticamente pelo BioCyc relação às informações de ORFs


Contig da enzima no bioCyc

Gbrowser da Vassoura

Anotação das vias com dados atualizados de microarray e estsBlast da Vassoura

Anotação das enzimas candidatas

Procurar sequências próximas

Para todas as enzimas...

Para os buracos ...


Motivação

Etapas do projeto



Perspectivas

Catalogação das enzimasResultados

EC number Nome da enzima Via metabólica

11.1.1.284

S-(hidroximetil)glutatione dehidrogenase Metanol

Oxidação de formaldeído II (glutatione-dependente)

2 1.1.3.13 Álcool oxidase MetanolOxidação de metanol para formaldeído

31.1.99.5

Glicerol-3-fosfate dehidrogenase Glicerol Degradação glicerol I e IV

4 1.2.1.2 Formato dehidrogenase MetanolOxidação de formaldeído II (glutatione-dependente)

5 1.2.1.12Gliceraldeíide-3-fosfato dehidrogenase Metanol

Assimilação de formaldeído III (ciclo dihidroxiacetone)

6 1.2.1.16

Sucinato-semialdeíde dehidrogenase (NAD(P)(+)) GABA

4- degradação aminobutirato I e II(GABA)

7 1.2.1.24Succinato-semialdeide dehidrogenase GABA

4- degradação aminobutirate I(GABA)

8 1.11.1.6 Catalase MetanolOxidação de metanol para formaldeído

9 1.4.1.2 Glutamate dehidrogenase GABA

4- degradação aminobutirato II(GABA)

10 2.1.3.3Ornitine carbamoiltransferase

ciclo de uréia

11 2.2.1.1 Transketolase Metanol


12 2.2.1.3 Formato dehidrogenase Metanol


13 2.6.1.194-aminobutirate transaminase[2] GABA

4- degradação aminobutirato I e II(GABA)

14 2.7.2.3 fosfoglicerato quinase Metanol


15 2.7.1.29 Glicerone quinase. Metanol


EC number Nome da enzima Via metabólica

16 2.7.1.30 Glicerol quinase GlicerolDegradação glicerol I e IV

17 3.1.2.12S-formilglutationa hidrolase Metanol

Assimilação de formaldeído II (ciclo dihidroxiacetone)

18 3.1.3.11 Frutose-bisfosfatase Metanol


19 3.1.4.46 Glicerofosfodiester fosfodiesterase Glicerol Degradação glicerol I

20 3.5.3.1 Arginase.ciclo de uréia

21 4.1.2.13 Frutose-bifosfato aldolase Metanol


22 4.3.2.1 Argininosucinato liaseciclo de uréia

23 4.4.1.22 S-(hidroximetil)glutationa sintase Metanol

Assimilação de formaldeído II(ciclo dihidroxiacetone)

24 5.1.3.1Ribulose-fosfato 3-epimerase Metanol


25 5.3.1.1 Triose-fosfato isomerase Metanol


26 5.3.1.6Ribose-5-fosfate isomerase Metanol


27 6.3.4.5Argininosuccinate sintase.

ciclo de uréia

28 6.3.4.16 Carbamoil-fosfate sintase (amônia).

ciclo de uréia

Fonte: BRENDA

Fonte: BRENDA

Quantidade de dados cinéticos das enzimas para organismos filogeneticamente próximos a M. perniciosa ainda deixa a desejar

Resultados

há poucos estudos e publicações públicas de experimentos em relação a fungos, principalmente filamentosos

Uso de dados cinéticos de eucariontes

Banco de dados individual do projeto

Avaliação

Enzima Contig SingletsMicroarray ESTs BestModelSv1 E-value

3.5.3.1

Contig11026_GV6_G1 - -

EST_CP02-EC-001-005-B09-UE.F

gi|164650645|gb|EDR14886.1| arginase [Laccaria bicolor S238N-H82] 6,00E-37

4.1.2.13

Contig14043_SV2_G1 -

Amarelo FoldChange B/NC:-1.24

-

gi|164640807|gb|EDR05071.1| fructose 1,6-bisphosphate aldolase [Laccaria bicolor S238N-H82] 6,00E-34

Contig12493_AV9_G1 -

Amarelo FoldChange B/NC:1.31 -

gi|46849403|dbj|BAD17911.1| fructose-bisphosphate aldolase C [Amia calva] 1,00E-31

CP02-S2-032-448-A11-UC.F_Gv6_g1 - - -

gi|164640807|gb|EDR05071.1| fructose 1,6-bisphosphate aldolase [Laccaria bicolor S238N-H82] 3,00E-21

4.3.2.1Contig2687_AV9_G1 - -

EST_CP03-EB-001-002-F02-UE.F

gi|164650003|gb|EDR14244.1| argininosuccinate lyase [Laccaria bicolor S238N-H82] 2,00E-66

Resultados

Cura das vias : Anotação manual das enzimas

Oito enzimas não possuíam ORF nas vias metabólicas em estudo

A anotação manual anterior para o BestModel anterior pode ter inserido tal dado ao final da lista de hits de forma que a leitura automática do BioCyc não pode ler e assimilar este ORF para a enzima.

Enzima Via metabólicaContig BestModel Organismo

E-value organismo

1.2.1.24 GABA I Contig8459 - Pan troglodytes 1,00E-51

6.3.4.16

Ciclo da uréia

Contig9915

gi|116508372|gb|EAU91267.1| predicted protein [Coprinopsis cinerea okayama7#130] E-value = 1e-60 Mus musculus 0.0

2.2.1.3Oxidação de formaldeído II Contig6922 -

Pichia angusta; Candida boidinii 1E-91; 2e-98

3.1.2.12Ciclo de dihidroxiacetona Contig9496 -

Saccharomyces cerevisiae 1,00E-42

E-values baixos>>>indica alta similaridade entre o predito de M. perniciosa e o gene descrito no banco de dados

Correção da via metabólica de degradação de 4-aminobutirato II (GABA)Enzima Nome

Contig OrganismoE-value organismo

1.1.1.61

4-hydroxybutyrate dehydrogenase

Contig13320

Clostridium kluyveri (strain ATCC 8527 / DSM 555 / NCIMB 10680) 6,00E-04

5.3.3.3

vinylacetyl-CoA DELTA-isomerase No hits Clostridium aminobutyricum -

1.3.99.2butyryl-CoA dehydrogenase Contig7202 Pongo pygmaeus 4,00E-51

2.8.3.8acetate CoA-transferase Contig8771 Haemophilus influenzae 3,00E-08

Resultados

E-value muito alto para definir a predição confiável de ORF

Exceto fungo (Pongo pygmaeus), todos os outros alinhamentos dá melhor hit contra bactérias, procariontes

Pacote software

Stand alone Web

SiteDeterminística Estocástica Documentação

1 BASIS x x -2 CellDesigner x x3 CellWare x x4 Gepasi/

COPASI x x

5 Dizzy/ Gillespie x x

6 Dynetica x7 E-Cell x x8 JWS Online x x -9 JDesigner/

Jarnac x x -

10 Twain x x11 PLAS x x12 PyBioS x x -13 Sycamore x x x14 WebCell x x x15 VirtualCell x x -

Pacote software Interfacesgráficas

Funcionalidade Aplicativosadicionais

Erros na compatibilidade

em SBML1 BASIS x x2 CellDesigner x3 CellWare x x4 Gepasi/

COPASIx x

5 Dizzy/ Gillespie x6 Dynetica x*7 E-Cell8 JWS Online x x9 JDesigner/

Jarnacx x

10 Twain11 PLAS12 PyBioS x x x13 Sycamore x x x14 WebCell x x x15 VirtualCell x x* PARA DYNETICA NÃO SE USA SBML

Revisão de pacotes de softwares simuladores

Resultados

Pacote software Disponível em:BASIS https://www.basis.ncl.ac.uk/

CellDesigner http://www.celldesigner.org/CellWare http://www.cellware.org/

Gepasi/COPASI http://www.copasi.org/Dizzy/ Gillespie http://magnet.systemsbiology.net/software/Dizzy/

Dynetica http://www.duke.edu/~you/Dynetica_page.htmE-Cell http://www.e-cell.org/

JWS Online http://jjj.biochem.sun.ac.za/JDesigner/Jarnac http://sbw.kgi.edu/software/jdesigner.htm

JSim http://nsr.bioeng.washington.edu/PLN/Software/Twain http://sbw.sourceforge.net/sbw/software/PLAS http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/aferreira/plas.html

PyBioS http://pybios.molgen.mpg.de/ Sycamore http://sycamore.eml.orgWebCell http://www.webcell.org/

VirtualCell http://www.nrcam.uchc.edu/

Resultados

Comparação entre simuladores em websites e stand-alone, análise da usabilidade de interfaces, funcionalidade e suporte para documentação e ferramentas de matemática.

Para tais características tem-se: Sycamore e WebCell entre os melhores para servidores na internet, já para o stand-alone elegemos CellDesigner , JDesigner e Copasi.

http://sycamore.eml.org/

Modelagem matemática da Degradação de glicerol IV

Glicerol+ ATP=glicerol-3-fosfato+ ADP (1)

iATPmATPiGlic

mGlicADP

iGlicmADP

eqinv

dir

mGliciGlicmGlicPiG

eqdir

KATPPG

KKATPKKADP

KGlicPGK

KVV

ATPKKGlicKKPGATPGlic

KADPPGATPGlicV

v

1.3..1.1.3.

.

..31..

.3..

11

1

3

11

iNADmNADPiG

PmGDHAP

PiGmNADH

eqinv

dir

PmGPiGPmGiDHAP

eqdir

KNADNADH

KKNADK

KNADKPGDHAPK

KVV

NADKKPGKKDHAPNADPG

KNADHDHAPNADPGV

v

1...

1.31...

.3.1..3

..3.

3

3

322

2

333

22

Glicerol -3-fosfato+ aceptor =glicerona fosfato+aceptor reduzido (2)

Mecanismo ordenado Bi-biglicerol quinase EC 2.7.1.30Candida mycoderma (1) eglicerol -3- fosfatase EC 1.99.5Jaculus orientalis (2)

Resultados

WebSite do Sycamore para a modelagem da cinética enzimática

(http://sycamore.eml.org)

Resultados

http://sycamore.eml.org/

Um exemplo de simulação para t=0s com [ATP]=[ADP]=[NAD]=[NADH2]=10,0M , [G3P]=8,0M e [Glic]=5,0M é apresentado no Gráfico 1.

Exemplo de simulação da via de Degradação de glicerol IV

0

2

4

6

8

10

12

14

0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400

Tempo (s)

Con

cent

raçã

o fin

al (M

)

G3P

NAD

DHAP

NADH

Glic

ATP

ADP

Depois de 300s curvas horizontais paralelas ao eixo das abscissas

Concentrações não irão variar em relação ao tempo

E nosso estudo se limita ao tempo zero a t=300s.

Estudo da análise de sensibilidade de parâmetros cinéticos

duas velocidades V1 e V2 (V1=V_dir_1=V_inv_1 e V2=V_dir_2=V_inv_2); e três concentrações iniciais, [Glic], [G3P] e [DHAP].

Para o primeiro caso, a exemplo no gráfico 2, além das concentrações dos co-fatores fixos temos [G3P] e [DHAP] fixas, enquanto variamos de 0 a 10M a concentração do glicerol

Resultados

A aplicação da análise de sensibilidade consiste em avaliar o quanto o modelo cinético proposto é dependente dessas variáveis

Cinco incógnitas:

Para limite de t=300s, coletou-se a concentração dos metabólitos ao final desse tempo em função da variação da concentração inicial de um único metabólito.

Análise de Sensibilidade para Glicerol

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Concentração inicial de Glicerol (M)

Con

cent

raçã

o fin

al (M

)

G3P

DHAP

Glic

Análise de Sensibilidade de Glicerol-3-fosfato

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Concentração inicial de Glicerol-3-fosfato (M)

Con

cent

raçã

o fin

al (M

)

G3P

Glic

DHAP

Análise da Sensibilidade para Dihidroxiacetonafosfato

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Concentração inicial de Dihidroxiacetonafosfato (M)

Con

cent

raçã

o fin

al (M

)

G3P

Glic

DHAP

Gráfico 2:curvas G3P e DHAP nítida inclinação

Gráfico 4: curvas GLIC e G3P sutil declividade

A modificação da concentração inicial de GLIC provoca uma alteração maior nas concentrações finais das demais substâncias em comparação com a modificação da concentração de DHAP

Resultados

Análise da Sensibilidade para Velocidades de cada reação da via metabólica

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

0.1 0.2 0.3 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 10.0

Razão entre V1 e V2

Conc

entra

ção

final

(M)

G3P

DHAP

Glic

Quando V1/V2 < 0, 5, o sistema é robusto e as curvas das concentrações dos metabólicos possuem pouca inclinação e são paralelas entre si

No entanto, para V1/V2 >0,5, teremos as curvas com coeficientes angulares altos..

A partir da proporção 1:2 entre as velocidades da primeira e da segunda reação ,teremos diminuição de dihidroxiacetonafosfato.

É crescente para GLIC e G3P, ao decorrer do tempo de 10s, e decresce para o DHAP

Glicerol quinase (GK) é reversível.

Resultados

G3P pode também dar origem a triacilgliceróis pela via do ácido fosfatídico. Supondo que G3P dehidrogenase tenha uma expressão muito menor que GK (V2<V1), haverá acúmulo de G3P, que então seria convertido a triacilgliceróis ou a glicerol pela ação de GPP.

glicerol fosfatase, GPP exerce a “reversão” da fosforilação efetuada pela GK.

GK e GPP teriam as mesmas propriedades cinéticas, gerando um equilíbrio entre glicerol e G3P.

No nosso modelo biológico (infecção de M. perniciosa no cacaueiro), ocorre acúmulo de glicerol (Scarpari et al., 2005)

Esse glicerol “em excesso” provavelmente é convertido rapidamente a G3P. A partir desse ponto, G3P pode ser utilizado para a produção de DHAP que no fim do processo gerará G3P, metabólito da via glicolítica.

Análise do comportamento da via modelada no contexto do metabolismo lipídico


Motivação

Etapas do projeto



Perspectivas

Ampliar o número de vias metabólicas modeladas e refinar todos os nossos modelos para que possa ser possível avaliar a metodologia aplicada e realizar a interpretação bioquímica da patogênese

Perspectivas

Indicar futuros experimentos funcionais no laboratório

Trabalho atual....

Modelagem do Metabolismo Central de Nitrogênio (CNM)

α-cetoglutarato Glutamato Glutamina

NAD+NADH + NH4

+

GOGAT (-2,11)

GS (-2,08)NADPH-GDH

NAD-GDH (3,6)

NH4+ + ATP

ADP + Pi

Legenda:

Reprimido biotrófico

Via metabólica do CNM

Induzido biotrófico

Dúvidas ?

aluna: mirian mariko tsutsumi orientador :prof. dr. gonçalo a. g. pereira co- orientador : dr....

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