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ANNA BOLIVAR VICTOR COSTA

ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA E NA ESTEROIDOGÊNESE TESTICULAR DE

RATOS ADULTOS EXPOSTOS AO HERBICIDA ATRAZINA

Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais

2010

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ANNA BOLIVAR VICTOR COSTA

ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA E NA ESTEROIDOGÊNESE TESTICULAR DE

RATOS ADULTOS EXPOSTOS AO HERBICIDA ATRAZINA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular do Departamento de Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial para a obtenção do titulo de Mestre em Ciências. Área de concentração: Biologia Celular Orientadora: Dra. Cleida Aparecida de Oliveira

Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais

2010

Esta dissertação foi realizada no Laboratório de Biologia da Reprodução, do Departamento de

Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais, sob a

orientação da Profa. Dra. Cleida Aparecida de Oliveira, e contou com auxílio parcial da Coordenação

de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq) e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG).

A minha querida Orientadora, Dra. Cleida Aparecida de Oliveira, exemplo de profissionalismo, dedicação e determinação.

AGRADECIMENTOS

À minha exemplar Orientadora, Dra. Cleida Aparecida de Oliveira, pela oportunidade, compreensão

e pelos ensinamentos durante todos estes anos essenciais para minha formação.

Ao Prof. Dr. Germán Arturo Bohórquez Mahecha, pela atenção e ensinamentos em todos os âmbitos

do conhecimento, inclusive na culinária.

À minha família pelo suporte, carinho, e amor incondicional, especialmente a minha mãe por não

medir esforços, a cada dia, para me oferecer todo o necessário à minha formação, e ao meu pai pelo

incentivo aos estudos.

Ao amor da minha vida, Júnior, pelo carinho, cumplicidade, companheirismo e paciência. Por me

aconselhar nos momentos difíceis e me propiciar e compartilhar bons momentos.

Aos antigos (Rubem, Patrícia, Polyanna, Fernanda, Carolina, Mariana, Simone, Joyce e Thiago) e

atuais colegas do LABRE (André, Jackson, Regiana, Mônica, Diego, Lílian, Pollyana e Cristiano)

pela amizade e colaboração, e especialmente ao André por ter contribuído desde o inicio da minha

jornada científica com ensinamentos e ajudas diversas.

À Mônica Morais Santos e Pollyana Rabelo Nunes Campos pelo apoio técnico.

A todos os colegas da Pós-Graduação em Biologia Celular, em especial a Paula pela amizade e por

termos percorrido este caminho juntas desde a graduação.

Aos queridos colegas da comissão organizadora da II Semana de Biologia Celular–Prof. José Carlos

Nogueira, por fazer prazerosos os momentos de trabalho árduo e por ter a brilhante idéia de

homenagear este grande mestre da ciência e da vida.

À adorável secretária do programa de Pós-Graduação em Biologia Celular, Sibele das Graças

Guilherme Abreu, por ser tão prestativa e atenciosa.

A todos os professores e funcionários do Departamento de Morfologia do ICB/UFMG.

SUMÁRIO

Página

I - INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA 1

1. Sistema Genital Masculino 2

2. Testículo 2

2.1 Morfologia Testicular 2

2.2 Espermatogênese 3

2.3 Regulação Hormonal Testicular 4

3. Papel dos Andrógenos no Testículo 6

3.1 Receptor de Andrógeno 6

3.2 Localização e Função dos Receptores de Andrógeno no Testículo 7

3.3 Modelos Animais com Inativação de AR 8

4. Esteroidogênese 9

4.1 3β - Hidroxiesteróide Desidrogenase (3β-HSD) 14

4.1.1 Expressão de 3β-HSD na Adrenal e no Testículo 14

5. Desreguladores Endócrinos 15

5.1 Desordens Reprodutivas Causadas pelos Desreguladores Endócrinos 17

5.2 Atrazina 19

II - JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 22

1. Justificativa 23

2. Objetivos 24

2.1 Objetivo Geral 24

2.2 Objetivos Específicos 24

III - ARTIGO PUBLICADO 25

IV- DISCUSSÃO E CONCLUSÃO 35

V- PERSPECTIVAS 37

VI - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 40

RESUMO

A importância dos desreguladores endócrinos tem sido amplamente investigada em face às

crescentes evidências sobre a relação entre a exposição a tais compostos e o aumento das desordens

reprodutivas masculinas. A atrazina é um herbicida utilizado mundialmente e tem sido considerado

um potente desregulador endócrino, causando efeitos adversos na função reprodutiva de ambos os

sexos de várias espécies de mamíferos e não mamíferos. Potenciais riscos de atrazina a saúde

reprodutiva masculina incluem redução no número e motilidade dos espermatozóides,

hermafroditismo em anfíbios, alteração na razão sexual em peixes, atraso na maturação sexual e

redução no peso da próstata e das vesículas seminais. Apesar dos efeitos conhecidos da atrazina

como um desregulador endócrino que interfere no sucesso reprodutivo animal, pouco se sabe sobre

sua ação no sistema genital masculino, especialmente de indivíduos adultos. No presente trabalho

avaliamos os efeitos da atrazina (50mg/kg, 200mg/Kg and 300mg/Kg) na via esteroidogênica,

analisando a expressão da enzima 3β-HSD, nos níveis plasmáticos e testiculares de estrógeno e

testosterona e na expressão do receptor de andrógeno, bem como, alterações morfofisiológicas nos

testículos de ratos adultos. A exposição à atrazina nas doses maiores que 50mg/Kg resultou na

redução do peso corporal, aumento do peso da adrenal e aumento transitório no peso dos testículos,

seguido de atrofia testicular. Foi observada ainda redução nos níveis plasmáticos e testiculares de

testosterona e aumento nos níveis de estradiol, enquanto a expressão de receptores de andrógenos se

manteve sem maiores alterações. Por fim, demonstramos pela primeira vez que a expressão de 3β-

HSD testicular reduz após exposição ao atrazina, enquanto na adrenal essa expressão não é alterada.

Estes resultados confirmam os efeitos da atrazina como importante desregulador endócrino e

sugerem que a inibição da 3β-HSD pode representar um mecanismo alternativo através do qual esse

herbicida afeta a androgênese testicular, levando a alterações na espermatogênese.

ABSTRACT

The importance of endocrine disrupting chemicals has been largely investigated in

face of the growing evidences regarding the relationship between exposure to these

compounds and the increase in male reproductive disorders. Atrazine is an herbicide widely

used worldwide, which has been considered as an endocrine disruptor, causing adverse

effects on reproductive function in both genders of several mammalian and non-mammalian

species. Potential risk of Atrazine for male health include reduction in number and motility of

sperm, hermaphroditism in frogs, change in sex ratio in fish and amphibian, delayed sexual

maturation and reduction in prostate and seminal vesicle weights. Despite the known effects

of Atrazine as an endocrine disruptor that interferes in animal reproductive success, little is

known about its action on the male genital system, especially in adults. In this work we

evaluated the possible effects of Atrazine (50mg/kg, 200mg/Kg and 300mg/Kg) in the

steroidogenic pathway by analyzing the 3β-HSD expression, plasmatic and testicular estrogen

and testosterone levels, and expression of androgen receptor, as well as morphophysiological

changes in testes of adult rats exposed to the herbicide. Atrazine at doses higher than

50mg/Kg resulted in decreased body weight, increased adrenal weight and transient increase

in testis weight, followed by testis atrophy. A reduction in plasmatic and testicular

testosterone but increase in estradiol levels was observed, while the androgen receptors

expression remained without major changes. We showed for the first time that testicular 3β-

HSD protein was decreased, whereas in the adrenal it was unchanged. These results confirm

the effects of Atrazine as an important endocrine disruptor and suggest that 3β-HSD

inhibition may represent an alternative mechanism through which this herbicide affects the

testicular androgenesis, leading to changes in spermatogenesis.

I• INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1

Introdução e Revisão de Literatura

2

I – INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA

1. Sistema Genital Masculino

O sistema genital masculino de mamíferos eutérios é constituído pelos testículos,

vias genitais, glândulas genitais anexas e órgão copulador, sendo responsável pela

produção contínua, nutrição e estocagem temporária dos gametas masculinos, além da

síntese e secreção de hormônios, principalmente os andrógenos (Setchell & Breed,

2006).

Os testículos são responsáveis por duas funções reprodutivas essenciais: síntese e

secreção de andrógenos e produção dos gametas masculinos, os espermatozóides, que

são transportados pelas vias espermáticas (Russel, 1990; Hess & França, 2007). Estas

vias compreendem os túbulos retos, rede testicular, dúctulos eferentes, epidídimos,

ductos deferentes e uretra. Elas servem como vias de transporte para os espermatozóides

e são essenciais para que importantes eventos ocorram, dentre os quais a maturação dos

gametas nos epidídimos, o que é imprescindível para garantir a fertilidade (Dym, 1976;

Cornwall, 2009).

Além dessas estruturas, há as glândulas genitais anexas, dentre elas as vesículas

seminais, as glândulas bulbouretrais e a próstata. Estas glândulas são responsáveis pela

formação do plasma seminal que fornece nutrientes aos espermatozóides a serem

ejaculados, funcionando também como um veículo de lançamento dos gametas no

sistema genital feminino, o que é feito através do pênis (Mann, 1974; Risbridger &

Taylor, 2006).

2. Testículo

2.1 Morfologia Testicular

O testículo é envolto por uma espessa cápsula de tecido conjuntivo denso,

denominada túnica albugínea da qual partem septos fibrosos para o interior do

parênquima testicular, dividindo o órgão em lóbulos. Entre as espécies, existe uma

considerável variação na quantidade de tecido conjuntivo que se extende a partir da

túnica albugínea (Russell et al., 1990; Kerr et al., 2006). Os túbulos seminíferos

dispõem-se na forma de alças no interior dos lóbulos testiculares com suas extremidades

voltadas para o mediastino, onde se conectam via túbulos retos à rede testicular. A rede

testicular consiste de uma série de canais anastomosados, que conduzem os

espermatozóides para os dúctulos eferentes (Kerr et al., 2006). A organização estrutural

do testículo é altamente preservada entre os vertebrados, sendo composto por dois


3

compartimentos principais: o compartimento tubular e o compartimento intertubular ou

intersticial. O compartimento tubular não é inervado nem vascularizado e constitui a

maior parte do órgão na maioria das espécies, sendo formado pelos túbulos seminíferos.

Os túbulos seminíferos são compostos pelo epitélio seminífero apoiado por uma

membrana basal espessa, envolta pela túnica própria. O epitélio seminífero é formado

pelas células de Sertoli e células espermatogênicas em íntimo contato (Russel et al.,

1990; França & Russell, 1998; Kerr et al., 2006). A túnica própria é constituída de

componentes celulares e acelulares (Bustos-Obregon, 1976; Christl, 1990). Os

componentes acelulares da túnica própria incluem fibras colágenas e elásticas e

substância fundamental amorfa, enquanto os componentes celulares compreendem as

células peritubulares mióides que formam uma ou mais camadas, dependendo da

espécie, e uma camada limitante de fibroblastos (Dym, 1988; Christl, 1990). Já no

compartimento intertubular estão localizadas as células de Leydig, produtoras de

esteróides, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos essenciais para o tráfego de hormônios

e nutrientes, além de fibroblastos, fibras do tecido conjuntivo e um pequeno número de

células leucocitárias como macrófagos, linfócitos e, ocasionalmente mastócitos (Fawcett

et al., 1973; Hedger, 1997; O’Donnell et al., 2001).

2.2 Espermatogênese

Nos túbulos seminíferos ocorre a espermatogênese, que é um complexo processo

cíclico altamente organizado, que envolve a transformação de uma célula tronco

indiferenciada em células altamente diferenciadas, os espermatozóides (França &

Russell, 1998; O’Donnell et al., 2001). Este processo pode ser dividido em três fases:

proliferativa ou espermatogonial, meiótica ou espermatocitária e de diferenciação ou

espermiogênica. Na fase proliferativa, as espermatogônias sofrem sucessivas divisões

mitóticas, se auto-renovando para manter o contínuo processo espermatogênico ou

originando células comprometidas com a diferenciação em espermatócitos. Na fase

meiótica, os espermatócitos sofrem meiose originando as espermátides arredondadas

onde o material genético é duplicado, recombinado e segregado. E na última fase,

espermiogênica, as espermátides sofrem modificações morfológicas originando células

especializadas para a fertilização, os espermatozóides (França & Russell, 1998; Kerr et

al., 2006). Neste processo as células de Sertoli são responsáveis pelo aporte hormonal,

nutricional e também pelo suporte físico das células germinativas, movendo-as do

compartimento basal para o lúmen do túbulo seminífero no decorrer da


4

espermatogênese. Desta forma os diferentes tipos de células germinativas estão em

estreita associação com as células de Sertoli, ou mesmo inseridas em seu citoplasma.

O desenvolvimento da espermatogênese ocorre através de uma sucessão de

fases, nas quais cada etapa envolve uma determinada e constante associação celular

entre as células germinativas e as células de Sertoli, sendo tais etapas denominadas

estádios (Leblond & Clermont, 1952; Clermont, 1972). Com o decorrer do tempo, estes

estádios se sucedem numa determinada área do túbulo seminífero, sendo que o intervalo

compreendido entre a ocorrência de um determinado estádio e o seu reaparecimento

num mesmo local do túbulo é denominado ciclo do epitélio seminífero (Russell et al.,

1990; O’Donnell et al., 2001). A duração do ciclo do epitélio seminífero é variável entre

as espécies, mas sabe-se que aproximadamente 4,5 ciclos são necessários para que o

processo espermatogênico se complete. Nos mamíferos eutérios, tal processo dura cerca

de 30 a 75 dias (Russell et al., 1990; França & Russel, 1998).

2.3 Regulação Hormonal Testicular

A função gonadal é comandada pelo eixo hipotálamo-hipofisário (Fig.1). O

hormônio hipotalâmico é o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH), e os

hormônios da parte distal da adenohipófise são os hormônios folículo estimulante (FSH)

e o hormônio luteinizante (LH) (Gnessi et al., 1997). O GnRH é secretado no sangue

portal hipotálamo-hipofisário chegando em altas concentrações na parte distal da

adenohipófise, onde estimula as células gonadotróficas a secretarem FSH e LH, que irão

agir nos testículos estimulando suas funções espermatogênicas e endócrinas (Amory &

Bremner, 2003). A liberação de GnRH, por sua vez, é controlada via sinalização por

kisspeptinas, que são peptídeos recentemente descobertos (Roux et al., 2003; Seminara

et al., 2003) e que atuam como ligantes naturais para o receptor órfão acoplado a

proteína G, conhecido como gpr-54 em ratos (Lee et al., 1999) e AXOR12 em humanos

(Muir et al., 2001). As kisspeptinas estimulam a liberação de GnRH (Han et al., 2005;

Sun et al., 2007; Keen et al., 2008) e também atuam no feedback negativo e positivo do

eixo hipotálamo-hipofisário-gonadal (Navaro et al., 2004; Smith et al., 2005; Roa et al.,

2009). Comprovando a relevância fisiológica da sinalização de kisspeptina no controle

da secreção de gonadotrofinas, animais Knockout tanto para grp-54 quando para o gene

KiSS-1 são inférteis, apresentam atraso na maturação sexual, testículos reduzidos,

interrupção na espermatogênese e baixos níveis de gonadotrofinas e de esteróides


5

sexuais (Seminara et al., 2003; d’Anglemont de Tassigny et al., 2007; Roseweir &

Mullar, 2009).

O FSH atua via receptores específicos localizados nas células de Sertoli,

estimulando a produção de inibina, activina e proteína de ligação a andrógenos (ABP),

dentre outros. A inibina exerce efeito feedback negativo na liberação de FSH, enquanto

a activina tem efeito oposto (Gnessi et al., 1997). A ABP é uma glicoproteína que se

liga aos andrógenos sendo responsável pelo transporte e proteção dos mesmos contra a

degradação, facilitando sua captação pelo sistema genital masculino (Bardin et al.,

1981; Jeyaraj et al., 2005). O FSH controla ainda a proliferação das células de Sertoli

durante o período perinatal e consequentemente é o principal determinante para a

capacidade espermatogênica do testículo adulto (Means et al., 1980).

O LH estimula as células de Leydig a sintetizarem testosterona. Juntamente com o

FSH, a testosterona é considerada o hormônio mais importante para o controle da

espermatogênese, sendo essencial para a iniciação e manutenção desse processo, além

de exercer efeito feedback negativo na liberação de LH e GnRH (Amory & Bremner,

2003).

Figura 1: Representação esquemática do eixo Hipotálamo-Hipofisário-Gonadal. Arc = núcleo arqueado;

AVPV = núcleo periventricular anteroventral do hipotálamo. Feedback negativo (-) e feedback positivo

(+). Adaptado de UpToDate (http://www.uptodate.com/online/content/images/endo_pix/HPG_axis.jpg).


6

3. Papel dos Andrógenos no Testículo

Os andrógenos são hormônios esteróides primariamente secretados pelos testículos e

adrenais, os quais possuem um importante papel no desenvolvimento e na função

reprodutiva masculina, bem como na determinação dos caracteres sexuais secundários.

Os dois andrógenos fisiologicamente mais importantes são a testosterona e a

diidrotestosterona (DHT) (Hipakka & Liao, 1998; Stocco & McPhaul, 2006), os quais

exercem suas ações através da ligação com o receptor de andrógeno (AR) (Roy et al.,

2001; Centenera et al., 2008).

3.1 Receptor de Andrógeno

O receptor de andrógeno é um fator de transcrição dependente de ligante,

pertencente à superfamília de receptores nucleares, produzido a partir de um gene

localizado no cromossomo X (Claessens et al., 2008). No humano, o gene codificador

do AR está organizado em 7 introns e 8 exons dos quais todos contribuem para a

sequência codificadora da proteína (Roy et al., 2001). Como todos os membros da

família de receptores nucleares, o AR apresenta 6 regiões morfofuncionais denominadas

de A a F, em geral agrupados como: domínio A/B ou N-terminal (NTD), domínio C ou

de ligação ao DNA (DBD), domínio D ou região de dobradiça e o domínio E/F ou de

acoplamento ao ligante (LDB) (Fig.2).

O domínio NTD é responsável por controlar a ativação transcricional. Este domínio

possui a função ativadora 1 (AF-1) que participa da interação com o LBD e do

recrutamento de coreguladores transcricionais. O NTD é o domínio menos conservado

entre os diferentes tipos de receptores nucleares, tanto no tamanho quanto na sequência

de aminoácidos (Lavery et al., 2005; Claessens et al., 2008).

O domínio DBD é responsável pelo reconhecimento de regiões específicas do DNA

denominadas elementos responsivos aos andrógenos (AREs) e pela dimerização do

receptor, estabilizando a ligação do receptor ao DNA. O DBD é o domínio mais

conservado entre os receptores nucleares e está localizado entre os domínios NTD e

LBD (Claessens et al., 2008).

A região de dobradiça compreende um segmento flexível que conecta o DBD com o

LBD, a qual ainda contém o sinal de localização nuclear (NSL), importante para

translocação intracelular do AR (Claessens et al., 2008).

O domínio LDB é responsável pela ativação do receptor através da interação com o

ligante. Após ligar ao andrógeno, este domínio induz a mudança conformacional do


7

receptor e aumenta sua afinidade pelo DNA. Além disso, o LBD estabiliza a

homodimerização e coordena a interação do receptor com outros reguladores. Possui

também a função ativadora-2 (AF-2) (Danielian et al., 1992), que serve como local de

encaixe para coativadores e medeia a interação entre LBD e NTD necessária para a

ativação transcricional (Claessens et al., 2008).

Figura 2: Estrutura molecular do receptor de andrógeno. Adaptado de Beato & Klug, 2000

Na ausência de andrógenos o AR possui localização citoplasmática nas células alvo,

onde se encontra ligado a um complexo multiprotéico de chaperonas como Hsp90,

Hsp70 e Hsp56. Após a ativação pelo ligante ocorrem alterações conformacionais no

AR facilitando sua dissociação do complexo multiprotéico e sua homodimerização.

Desta forma o sinal de localização nuclear fica disponível para ligação das importinas e

ocorre sua translocação para o compartimento nuclear (Tyagi et al., 2000). No núcleo o

AR se liga aos elementos responsivos aos andrógenos (AREs) na região promotora de

genes alvo. Em seguida o AR ativa a transcrição gênica através do recrutamento de

coreguladores e outros fatores da maquinaria transcricional gerando assim a resposta

desejada (Roy et al., 2001).

3.2 Localização e Função dos Receptores de Andrógeno no Testículo

Os receptores de andrógenos estão presentes nas células de Leydig, células de

Sertoli e células mióides, nos testículos (Bremmer et al., 1994; Vornberger et al., 1994).

As células germinativas não expressam AR. Dessa forma, a regulação da

espermatogênese pelos andrógenos é mediada indiretamente pelas células de Sertoli e

células mióides. As células de Sertoli são as mais prováveis a desempenharem este

papel, uma vez que interagem diretamente com as células germinativas em

desenvolvimento. A intensidade de expressão de AR nas células de Sertoli é dependente

do estádio do ciclo espermatogênico, sendo moderadamente expresso no estádio I e

negativo ou ligeiramente positivo nos estádios II - IV. A intensidade da expressão

aumenta a partir do estádio V e o pico de expressão de AR nas células de Sertoli

acontece nos estádios VII – VIII (Bremner et al., 1994; Vornberger et al., 1994; Oliveira

et al., 2009).


8

As células mióides representam outro sítio de ação dos andrógenos, pois estas

células interagem intimamente com as células de Sertoli e com espermatogônias

situadas na base do compartimento tubular. Além disso, evidências sugerem que sob

influência de andrógenos, as células mióides produzem fatores parácrinos que modulam

funções das células de Sertoli (Verhoeven et al., 2000), bem como o transporte dos

espermatozóides por contrações dos túbulos seminíferos, via células mióides (Maekawa

et al., 1996; Romano et al., 2005).

A presença de AR nas células de Leydig está relacionada com a função autócrina

dos andrógenos, os quais podem regular a atividade e diferenciação destas células

(Vornberber et al., 1994; Shan et al., 1997). Nesse sentido, os andrógenos inibem a

produção de testosterona pelas células de Leydig e estimulam sua diferenciação (Hales

et al., 1987; Hardy et al., 1990).

3.3 Modelos Animais com Inativação de AR

Para melhor esclarecer o papel dos andrógenos sobre a espermatogênese e para

definir com mais precisão o papel de cada célula somática como alvo direto para a ação

dos andrógenos, vários estudos veem utilizando camundongos geneticamente

modificados como os knockout para AR (ARKO) (Yeh et al., 2002; De Gendt et al.,

2004), bem como camundongos knockout seletivos para células de Sertoli (SCARKO)

(Chang et al., 2004; De Gendt et al., 2004), células mióides (PM-AR-/y) (Zhang et al.,

2006) e células de Leydig (L-AR-/y) (Xu et al., 2007).

Os animais ARKO apresentam redução testicular e dos níveis de testosterona,

interrupção da espermatogênese em fase inicial de meiose (Yeh et al., 2002),

criptorquidismo e alterações nas células somáticas testiculares, sendo que o número de

células de Sertoli é reduzido e as células mióides aparecem em múltiplas camadas (De

Gendt et al., 2004). Em contraste com os ARKOs, os SCARKOs possuem as vias

urogenitais e descência testicular normais (De Gendt et al., 2004). No entanto, a partir

da puberdade, os testículos do SCARKO exibem interrupção da espermatogênese

na fase tardia, com redução do peso testicular e do número de espermatócitos e

espermátides. Estas mudanças são associadas com um aumento de apoptose das células

germinativas e redução da expressão de genes específicos para o desenvolvimento

tardio de espermatócitos e espermátides (De Gendt et al., 2004). Análises mais

detalhadas nos testículos de SCARKO revelaram que os AR possuem papel importante

também na manutenção do contato célula-célula entre as células de Sertoli e as células


9

germinativas em desenvolvimento (Denolet et al., 2006). Tais estudos indicam que a

ação de andrógenos mediada pela célula de Sertoli é um requisito para permitir o

desenvolvimento das células germinativas e garantir a espermatogênese completa.

O knockout seletivo para AR das células mióides possui fertilidade normal, mas

apresenta redução do tamanho testicular e do número total de células germinativas,

oligospermia epididimária, além de alteração da expressão gênica de células de Sertoli e

defeito na contratilidade das células mióides, revelando que AR funcional nessas células

é necessário para assegurar a espermatogênese normal e a liberação dos

espermatozóides testiculares (Zhang et al., 2006). Por outro lado, o knockout seletivo

para AR das células de Leydig resultou em testículos atróficos, redução dos níveis de

testosterona e elevação dos níveis de gonadotrofinas. O camundongo LAR-/y é infértil e

sua espermatogênese é bloqueada predominantemente no estágio de espermátides

arredondadas (Xu et al., 2007).

A partir dos resultados obtidos através dos modelos citados anteriormente pode

se concluir que os ARs têm funções específicas nos diferentes tipos de células somáticas

do testículo, desempenhando importante papel na espermatogênese e esteroidogênese,

ambos os processos essenciais para manter a fertilidade masculina (KerkHofs et al.,

2009).

4. Esteroidogênese

Os hormônios esteróides são derivados do colesterol e sintetizados em uma

variedade de tecidos, principalmente nas gônadas e nas glândulas adrenais. A estrutura

química básica dos esteróides é composta por um núcleo de quatro anéis de carbono, o

núcleo ciclopentanoperidrofenantreno, e uma cadeia lateral a partir do caborno 17 (Fig.

3).

Figura 3: Estrutura Básica de um Esteróide: núcleo ciclopentanoperidrofenantreno (A-D) + cadeia lateral.

Retirado de Moss et al., 1989 - Nomenclature of Steroids.


10

A esteroidogênese compreende o conjunto de reações pelas quais os hormônios

esteróides são produzidos e requer a ação de várias enzimas que modificam a cadeia

lateral e o núcleo ciclopentanoperidrofenantreno dos esteróides precursores. A

maquinaria esteroidogênica é composta por (Fig. 4):

(1) Proteínas que participam da aquisição de colesterol pelas células;

(2) Os citocromos P450s que catalisam a clivagem das cadeias laterais de carbono

do núcleo esterol, introduz grupos hidroxilas e converte o anel esterol A em uma

estrutura aromática;

(3) As oxido-redutases ou hidroxiesteróide-desidrogenases, as quais catalisam a

oxidação ou redução de alcoóis e cetonas;

(4) As redutases de dupla ligação que reduzem irreversivelmente os carbonos ∆4-5 do

anel esterol A;

(5) As enzimas sulfotransferases e sulfatases que participam, respectivamente, da

inativação dos hormônios esteróides e da liberação de hormônios ativos ou de

precursores pela remoção do grupo sulfato (Strauss & Penning, 1999).

Enzimas Esteroidogênicas Nome Comum Nome Antigo Nome Atual

Enzima de clivagem da cadeia

lateral do colesterol ou Desmolase P450scc CYP11A1

3β- hidroxiesteróide desidrogenase, ∆5-∆4 isomerase 3β - HSD 3β - HSD

17α – hidroxilase ou 17,20 liase P450c17 CYP17

21 - hidroxilase P450c21 CYP21A2

11β - hidroxilase P450c11 CYP11B1

Aldosterona sintase P450c11AS CYP11B2

Aromatase P450aro CYP19

5α –redutase, 3-oxo-5α-esteroide Δ 4-

desidrogenase α

5α –redutase 5α –redutase

Figura 4: Nomenclatura das Enzimas Esteroidogênicas.

A taxa de produção dos hormônios esteróides é determinada de duas maneiras.

Primeiro pela disponibilidade de colesterol para ação da primeira enzima da via


11

esteroidogênica, a CYP11A que é a enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol

(P450scc – side chain cleavage). A disponibilidade de colesterol é regulada por

modificações pós-transcricionais que aumentam a atividade de proteínas envolvidas na

mobilização e translocação de colesterol para a membrana interna da mitocôndria, como

a proteína StAR (steroidogenic acute regulatory protein) (Christenson & Strauss, 2000;

Stocco, 2000). A segunda maneira de determinação da taxa de produção dos esteróides

é o nível e atividade das enzimas da maquinaria esteroidogênica, o que é regulado

através da estimulação da transcrição de genes codificadores destas enzimas por um

fator de transcrição comum, o fator esteroidogênico 1 (SF-1) (Payne & O’Shaughnessy,

1996; Strauss & Penning, 1999). Tais vias de controle da esteroidogênese são

desencadeadas pelo sistema de sinalização cAMP, o qual pode ser amplificado ou

atenuado por vários hormônios, fatores de crescimento e citocinas (Strauss & Penning,

1999).

Uma vez que o colesterol é transferido para dentro da mitocôndria pela proteína

StAR, ele é convertido a pregnenolona via ação da enzima CYP11A (também chamada

de colesterol-desmolase, 20,22-liase ou P450ssc) que situa-se na face interna da

membrana mitocondrial interna. A pregnenolona não é considerada um hormônio, mas é

o precursor imediato para a síntese de todos os hormônios esteróides.

Os hormônios esteróides são classificados em cinco grupos, baseado nos tipos de

seus receptores:

• Glicocorticóides

• Mineralocorticóides

• Andrógenos

• Estrógenos

• Progestógenos

As principais vias da esteroidogênese, representativas de todas as classes de

hormônios esteróides estão esquematizadas a seguir (Fig.5):


12

Figura 5: Principais vias da esteroidogênese. Adaptado de Bowen, 2001.

Na adrenal, a pregnenolona pode seguir três diferentes vias: (1) ela pode

permanecer como C21,17-deoxiesteróide levando à via de produção de

mineralocorticóides; (2) ela pode sofrer 17α-hidroxilação e seguir na via de formação

de glicocorticóides; (3) após 17α-hidroxilação ela pode sofrer clivagem pela CYP17

levando a formação de andrógenos (DHEA e androstenediona) (Simard, 2005). Os


13

andrógenos produzidos nas adrenais não se ligam a AR, mas podem ser metabolizados

em tecidos alvo levando a formação de testosterona e estrógenos ativos.

Nos testículos, a síntese dos esteróides sexuais pelas células de Leydig ocorre

através de duas possíveis vias, variando com a espécie considerada: a via Δ4

(colesterol→pregnenolona→progesterona→androstenediona→testosterona) é a que

ocorre em roedores, enquanto a via Δ5 (colesterol→pregnenolona→

hidroxipregnenolona→DHEA→androstenediona→testosterona) ocorre em homens,

outros primatas, cães, coelhos e porcos (Stocco & McPhaul, 2006). A conversão de

pregnenolona a progesterona ocorre por meio da ação da enzima 3β-hidroxiesteróide

desidrogenase (3β-HSD). A progesterona, por sua vez, é convertida a 17α-hidroxi-

progesterona, e em seguida a androstenediona, pela ação da CYP17 (P450c17 ou 17α-

hidroxilase/C17-20 liase). Da mesma forma, na via Δ5, a ação da CYP17 está

envolvida na conversão de pregnenolona a hidroxipregnenolona e desta para DHEA,

enquanto sob ação da 3β-HSD a DHEA é convertida a androstenediona. Em ambos os

casos, a androstenediona é convertida a testosterona, através da ação da 17β-

hidroxiesteróide desidrogenase (17β-HSD) (Fig. 5).

A testosterona pode ainda ser metabolizada transformando-se em outros esteróides

ativos. Pela ação da 5α-redutase, a testosterona é convertida em diidrotestosterona

(DHT), um andrógeno mais potente que a testosterona. A DHT também pode sofrer

ação da enzima 3β-HSD originando o metabólito 5α-androstane-3β,17β-diol (3β-diol).

Diversas evidências veem comprovando que o 3β-diol não é apenas um metabólito

inerte da DHT, e sim um hormônio ativo (Picciarelli-Lima et al., 2006; Oliveira et al.,

2007; Frye et al., 2008; Handa et al., 2009). A testosterona além de servir como fonte

de DHT pode também ser metabolizada em estradiol (E2) pela enzima P450 aromatase

(CYP19). Sabe-se hoje que estrógenos atuam em diversos órgãos do sistema genital

masculino e são essenciais para manutenção da fertilidade masculina, tendo um

importante papel na regulação do fluido intraluminal e manutenção da estrutura dos

dúctulos eferentes, além de participar na espermatogênese e na maturação espermática,

dentre outros (Robertson et al., 1999; Oliveira et al., 2001 e 2002; Hess, 2003; Carreau

et al., 2008).


14

4.1 3β - Hidroxiesteróide Desidrogenase (3β-HSD)

A 3β-HSD é uma enzima chave para a esteroidogênese sendo responsável por etapas

essenciais para a formação de todas as classes de hormônios esteróides, motivo que a

faz reconhecida como um marcador para as células secretoras de esteróides (Simard,

2005). No nível subcelular, essa enzima é encontrada associada à membrana

mitocondrial interna e ao retículo endoplasmático liso (Pelletier et al., 2001; Simard,

2005).

Várias isoenzimas de 3β-HSD tem sido clonadas de diversas espécies demonstrando

que a família do gene da 3β-HSD é conservada entre os vertebrados. A expressão de

múltiplas isoformas da 3β-HSD foi primeiramente estudada em ratos. Nestes animais

foram descritas quatro isoformas para a 3β-HSD que apresentam distribuição tecido

específica. A 3β-HSD tipo I e II são expressas na adrenal, gônadas, rim, útero, placenta

e tecido adiposo e apresentam 93.8% de homologias. A enzima tipo III apresenta 80%

de homologia quando comparada aos tipos I e II, e é exclusivamente expressa no fígado

de machos, o que é um marcante dimorfismo sexual resultante da repressão gênica em

fígados de fêmeas. A proteína tipo IV apresenta 90.9%, 87.9% e 78.8% de homologias

com os tipos I, II e III, respectivamente e seu RNAm é detectado na placenta e pele.

Em humanos, a 3β-HSD apresenta duas isoformas, a 3β-HSD tipo I, que é

encontrada na placenta e tecidos periféricos como a pele, glândula mamária e próstata, e

a tipo II, que é predominantemente expressa na adrenal e nas gônadas. As duas

isoformas são codificadas pelos genes HSD3B1 e HSD3B2, respectivamente. O gene

humano HSD3B2 tem mais homologia com o gene tipo I do rato (Simard et al., 2005).

4.1.1 Expressão de 3β-HSD na Adrenal e no Testículo

A adrenal de mamíferos constitui-se de duas regiões embriológica, morfológica e

funcionalmente distintas, que são o córtex e a medula. No adulto, o córtex da adrenal

consiste em três zonas distintas: a zona glomerular (ZG) que está localizada logo abaixo

da cápsula, a zona fascicular (ZF) que é a zona intermediária e a zona reticular (ZR) a

mais interna, próximo à medula. Baseado na diferença de expressão das enzimas

esteroidogênicas as três zonas corticais são consideradas funcionalmente distintas,

sendo responsáveis pela produção de aldosterona, cortisol e DHEA-S, respectivamente.

Considerando a participação de 3β-HSD na síntese de todos esses esteróides, células

positivas para 3β-HSD são homogeneamente distribuídas por todo o córtex da adrenal


15

(Simard et al., 2005; Schulte et al., 2007), excetuando, portanto, a medula e a cápsula

conjuntiva (Dupont et al., 1991a).

No testículo, a expressão de 3β-HSD ocorre nas células de Leydig, sendo

considerada um importante marcador para a diferenciação das mesmas. Dessa forma, a

aquisição da enzima 3β-HSD marca a diferenciação das células precursoras de Leydig

em células progenitoras de Leydig, e à medida que as células de Leydig prosseguem em

sua diferenciação para células adultas, a intensidade da imunomarcação para 3β-HSD

aumenta (Mendis-Handagama & Ariyaratne, 2001). No último passo, para a

diferenciação das células de Leydig adultas imaturas em células de Leydig maduras

ocorre aumento do volume celular e da capacidade de secreção de testosterona, em

conseqüência ao aumento do volume das organelas, como o retículo endoplasmático

liso, e o aumento da atividade das enzimas esteroidogênicas, dentre elas a 3β-HSD

(Mendis-Handagama & Ariyaratne, 2001).

Apesar do local predominante para a expressão de 3β-HSD nos testículos ser as

células de Leydig, existem evidências para positividade nas células de Sertoli em

algumas espécies de primatas (Liang et al., 1999).

5. Desreguladores Endócrinos

Diversos compostos utilizados em nosso cotidiano, tais como detergentes, produtos

farmacêuticos, produtos de higiene pessoal, policarbonatos plásticos presentes em

enlatados, resinas dentais, tintas, além de inseticidas e herbicidas, possuem o potencial

de desregular a homeostase da fisiologia endócrina. Tais compostos exógenos são

denominados desreguladores endócrinos por interferirem na síntese, armazenamento,

metabolismo, distribuição ou eliminação dos hormônios endógenos, bem como, na ação

dos hormônios ligando a seus receptores e funcionando como agonistas ou antagonistas

(Toppari 2008). Desregulador endócrino é então definido como uma substância exógena

ou uma mistura destas que altera a função do sistema endócrino e consequentemente

causa efeitos adversos na saúde de um organismo ou sua progênie, podendo afetar em

uma maior escala até mesmo populações diversas (Degen & Bolt, 2000; Diamanti-

Kandarakis et al., 2009).

Os desreguladores endócrinos compreendem substâncias químicas sintéticas,

introduzidas no meio ambiente por ações antropogênicas, ou compostos naturais

derivados de plantas, como os fitoesteróides, ou de animais, como os hormônios sexuais

ou seus metabólitos liberados na ambiente através, por exemplo, da urina (Cartinella et


16

al., 2006; Hotchkiss et al., 2008). Os desreguladores endócrinos atuam principalmente

como antiandrógenos, andrógenos, estrógenos, antiestrógenos, inibidores da síntese de

hormônios esteróides, substâncias antitireóide e agonistas retinóides (Hotchkiss et al.,

2008; Toppari, 2008; Diamanti-Kandarakis et al., 2009). As principais classes de

desreguladorres endócrinos são representadas por compostos organometálicos,

organoclorados, organofosforados, carbamatos, ftalatos, triazines e fitoesteróides

(Mckinlay et al., 2009). Os fitoesteróides mais comuns são os fitoestrógenos, os quais

mimetizam ou antagonizam as ações dos estrógenos endógenos. Os fitoestrógenos

incluem compostos como flavonóides (genisteina, daidzen), cumestrans (cumestrol) e

ligninas (lactonas, enterolactonas) (Chapin et al., 1996).

A exposição aos desreguladores endócrinos ocorre principalmente através do

contato ocupacional, em setores que fazem uso rotineiro de pesticidas, como agricultura

e controle de pragas. Não só os trabalhadores, mas também as pessoas que vivem

próximas a estas áreas possuem alto risco de contaminação, como demonstrado por um

estudo no qual, crianças de famílias que trabalham na agricultura ou vivem perto de

áreas de cultivo de soja ou milho apresentaram concentrações de metabólitos

organofosforados na urina cinco vezes maior (0,05 vs 0,01 mg / ml) do que crianças de

familias não-agrícolas (Lu et al., 2000). Além desta, podemos citar outras importantes

rotas de exposição aos desreguladores endócrinos como, o uso de pesticidas no

ambiente doméstico, o contato prolongado com fármacos utilizados no controle de

ectoparasitas e fungicidas e a ingestão de alimentos e água contaminados (Mckinlay et

al., 2009).

A exposição aos desreguladores endócrinos através de alimentos e água são vias

crônicas de exposição que podem afetar toda uma população. Atualmente resíduos

destas substâncias encontrados em alimentos é considerada a via mais importante de

exposição, mesmo sendo os níveis de resíduos presentes nos alimentos mais baixo do

que os níveis máximos de resíduos permitidos por lei (De Jong & De Snoo, 2001). Isso

se justifica pelo fato de tais compostos terem efeitos aditivos, de forma que mesmo

quando cada composto está presente em baixa concentração uma mistura destes

produtos químicos, atuando em conjunto, pode atingir atividade hormonal elevada

provocando efeitos adversos (Kortenkamp, 2008; Toppari, 2008).

Apesar dos baixos níveis de contaminação encontrados na água potável, o ambiente

aquático tem sido o destino final para o despejo de esgotos e compostos químicos

fabricados pelo homem. Os desreguladores endócrinos já foram detectados em água


17

doce, estuários e ambientes marinhos, o que se reflete no impacto causado a fauna

nestes ambientes (Mills & Chichester, 2005). Diversos estudos vêm correlacionando a

ocorrência de desreguladores endócrinos no meio ambiente com perturbações na vida

selvagem em geral, tais como: distúrbios na embriogênese, atraso na maturação sexual,

redução no sucesso reprodutivo, promoção de hermafroditismo, alteração na razão entre

os sexos e declínio de populações (Gray et al., 1994; Guo et al., 1995; Jobling et al.,

2002; Reeder et al., 2005; Hotchkiss et al., 2008; McCoy et al., 2008).

Dados epidemiológicos também relacionam a exposição aos desreguladores

endócrinos ao aumento na incidência de alterações endócrinas em humanos, como

desordens metabólicas (ex: obesidade e diabetes tipo 2), alergias, doenças autoimunes,

aumento na taxa de abortamento, declínio na qualidade do sêmen, aumento de defeitos

embriológicos e aumento na incidência de câncer (Mills, 1998; Payne et al., 2001; Swan

et al., 2006; Hotchkiss et al., 2008; Swedenborg et al., 2009; Winchester et al., 2009).

Diversos estudos experimentais tanto in vitro quanto in vivo veem confirmando esta

correlação com os dados epidemiológicos, demonstrando que a exposição à

desreguladores endócrinos é capaz de induzir alterações celulares e moleculares no

sistema endócrino provocando efeitos adversos, principalmente desordens reprodutivas

(Sharpe et al., 1995; Heneweer et al., 2004; Clark & Snedeker, 2005; Hotchkiss et al.,

2008; Rey et al., 2009).

5.1 Desordens Reprodutivas Causadas pelos Desreguladores Endócrinos

O interesse sobre a ação dos desreguladores endócrinos tornou-se grande, desde que

vários estudos demonstraram um aumento na incidência de desordens reprodutivas tanto

em animais quanto no homem (Kniewald et al., 2000; Skakkebaek et al., 2001; Hayes et

al., 2002; Hayes et al., 2006; Toppari, 2008; Diamanti-Kandarakis et al., 2009). Dentre

estas incluem desordens na diferenciação sexual, aumento na incidência de

criptorquidismo, câncer testicular e hipospadia, além do declínio na concentração e

qualidade espermática e da fertilidade de diversas espécies, incluindo o homem (Carlsen

et al., 1992; Sharpe et al., 1995; Virtanen et al., 2005; Swan, 2006; Toppari, 2008).

Todos estes problemas da saúde reprodutiva humana, que aparecem estreitamente

interligados em estudos epidemiológicos, normalmente possuem origem comum que

reside no desenvolvimento testicular desde a vida uterina e, portanto, foi sugerido um

novo conceito para este conjunto de sintomas: a Síndrome da Disgenesia Testicular

(TDS - Testicular Dysgenesis Syndrome) (Fig. 6) (Skakkebaek et al., 2001; Virtanen et


18

al., 2005). Em estudos experimentais pode-se observar que animais expostos a

desreguladores endócrinos desenvolvem desordens reprodutivas similares a dos

humanos com a Síndrome da Disgenesia Testicular (Skakkebaek et al., 2001; Fisher,

2004).

Figura 6: Representação esquemática dos eventos patogênicos relacionados à Sindrome da

Disgenesia Testicular. Adaptado de Skakkebaek et al., 2001.

Os efeitos dos desreguladores endócrinos são variáveis ao longo do ciclo de vida de

um individuo e são particularmente severos quando a exposição ocorre durante o

período embrionário ou perinatal. Desta forma, na maioria dos estudos experimentais

que avaliam a ação dos desreguladores endócrinos a exposição a estas substâncias é

feita in utero ou no período de aleitamento (Parks et al., 2000; Mckinnell et al., 2001).

Alguns trabalhos, porém veem demonstrando que estes compostos também são capazes

de interferirem na fisiologia endócrina de animais pré-púberes ou adultos levando a

quadros tão graves quanto aos de indivíduos expostos no início do desenvolvimento

(Hess, 1998; Hotchkiss et al., 2008; Diamanti-Kandarakis et al., 2009). Nestes animais

pré-púberes ou adultos são observadas diversas disfunções no sistema genital

principalmente alteração nas concentrações hormonais, redução na libido, nas glândulas

sexuais anexas, diminuição na motilidade e número de espermatozóides, além da

desorganização estrutural nos testículos e, finalmente, infertilidade (Gray, 1998; Hess,

1998; Degen & Bolt 2000; Hess & Nakai, 2000; Heneweer et al., 2004; Fisher, 2004;

Betancourt et al., 2006; Hotchkiss et al., 2008; Diamanti-Kandarakis et al., 2009).


19

5.2 Atrazina

A atrazina (2-cloro-4-etilamino-6-isopropilamino-S-triazina) (Fig.7) é um

componente ativo de herbicidas mundialmente utilizados para o controle de ervas

daninhas de folhas largas e algumas gramíneas, especialmente em culturas de milho,

cana-de-açúcar, soja e sorgo (United States Environmental Protection Agency, 2003). O

uso de atrazina na agricultura foi introduzido em 1958 e desde então se tornou um dos

herbicidas mais utilizados no mundo. Tal fato pode ser ilustrado com dados sobre seu

uso nos Estados Unidos que é de aproximadamente 34,5 milhões de quilos do composto

ativo aplicados a cada ano (United States Environmental Protection Agency, 2006).

Figura 7: Estrutura química da atrazina.

O Brasil ocupa hoje a primeira posição no ranking de exportadores agrícolas, uma

conquista que correlaciona com um aumento de mais de 100% no uso de agrotóxicos

nos últimos 10 anos (Correia et al., 2007). Nesse contexto, as culturas que se destacam

pelo uso de atrazina, ou seja, soja, milho e cana-de-açúcar, merecem atenção não

somente pela aplicação intensiva de agrotóxicos por unidade de área cultivada, mas

também por ocuparem áreas extensas do território nacional: 22, 12,6 e 6,2 milhões de

hectares no país, respectivamente (IBGE, 2007).

Apesar de seu sucesso na agricultura, a atrazina é motivo de preocupação crescente

no que se refere à saúde humana e de animais silvestres, sendo o produto considerado

potente desregulador endócrino, relacionado com distúrbios reprodutivos marcantes em

espécies representantes de todas as classes de vertebrados, além de indução de

patologias graves como câncer de mama e próstata, em humanos e roedores (Wetzel et

al., 1994; Mills, 1998). Um agravante é que esse herbicida é um contaminante comum

encontrado em diversas fontes de água potável, incluindo rios, lagos e lençóis freáticos,


20

em níveis superiores ao permitido para consumo humano (0,5µg/L na Europa; 2,0µg/L

no Brasil; 3,0µg/L nos EUA). Com base nos efeitos adversos da atrazina e considerando

os altos índices de contaminação encontrados em águas destinadas ao consumo humano,

a União Européia baniu o uso da atrazina em seu território, desde outubro de 2003 (Sass

& Colangelo, 2006). Nos Estados Unidos, a United Nations Environmental Protection

Agency (EPA) aprovou a continuação do uso do herbicida, porém de forma

grandemente restrita e com a garantia de continuar suas pesquisas sobre o produto. Por

outro lado, no Brasil, o papel de destaque do país no consumo de agrotóxicos, e em

particular a atrazina, não tem a contrapartida necessária em pesquisa e precauções

ambientais existentes nos demais países (Traghetta et al., 1996).

A atrazina é hoje um reconhecido fator de risco na desregulação endócrina de

diversas espécies animais, sendo que estudos em peixes, anfíbios, répteis, aves e

mamíferos, todos sugerem que o herbicida possa alterar o sistema endócrino

(Friedmann et al., 2002; Hayes et al., 2002; Stoker et al., 2002; Bringolf et al., 2004;

Spanó et al., 2004; Stoker et al., 2008). Estudos diversos indicam que atrazina é

causador de inúmeras desordens reprodutivas masculinas, dentre elas promoção de

hermafroditismo em anfíbios (Hayes et al., 2002), alteração na razão entre sexos em

peixes (Suzawa & Ingharam, 2008), atraso na maturação sexual (Stoker et al., 2000;

Trentacoste et al., 2001; Ashby et al., 2002), redução do número e motilidade de

espermatozóides (Kniewald et al., 2000; Betancourt et al., 2006; Swan et al., 2006) e

redução nos pesos da próstata e vesícula seminal (Kniewald et al., 2000; Trentacoste et

al., 2001; Stoker et al., 2002).

O mecanismo de ação da atrazina não foi completamente determinado, mas vários

experimentos in vitro têm demonstrado que a atrazina induz a expressão e atividade da

enzima citocromo P450 aromatase (Sanderson et al., 2001; Heneweer et al., 2004; Fan

et al., 2007a; Holloway et al., 2007). O efeito da atrazina na aromatase talvez possa

explicar o aumento nos níveis de estrógeno (Stoker et al., 2000; Spanó et al., 2004) e

redução nos níveis de testosterona, descritos em várias espécies (Stoker et al., 2000;

Trentacoste et al., 2001; Friedmann, 2002; Hayes et al., 2002; Spanó et al., 2004; Rey et

al., 2009). Um dos prováveis mecanismos de ação da atrazina é sua capacidade de se

ligar e ativar o fator de transcrição SF1 (Steroidogenic Factor 1), que é indutor da

síntese de aromatase (Fan et al., 2007 A e B; Suzawa & Ingharan, 2008). SF1 possui

expressão tecido-específica e há indícios de que os tecidos que expressam esse fator são

especialmente sensíveis aos efeitos de atrazina na indução de aromatase (Suzawa &


21

Ingharan, 2008). Outros experimentos in vitro demonstram que a atrazina ainda age

como inibidor da 5α-redutase, a enzima que converte testosterona em DHT (Kniewald

et al., 1995; Sanderson et al., 2001; Hayes et al., 2002). Dessa forma, além de aumentar

os níveis de estradiol, a atrazina reduz a formação de DHT, o que pode afetar alvos tão

importantes como epidídimo e próstata (Friedmann et al., 2002).

Considerando o perigo potencial da atrazina para a saúde animal, como acima

exposto, torna-se imprescindível esclarecer a inocuidade ou toxicidade do produto e

determinar seu mecanismo de ação através de modelos experimentais in vivo,

contribuindo de maneira geral para facilitar as investigações sobre esse e outros

potenciais desreguladores endócrinos nos machos.

II• JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

22

Justificativa e Objetivos

23

II – JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

1. Justificativa

Os compostos químicos potencialmente capazes de interferirem na fisiologia

endócrina veem sendo largamente estudados devido às crescentes evidências que

demonstram uma relação direta entre a exposição aos desreguladores endócrinos e o

aumento nas desordens reprodutivas masculinas. O número de tais compostos

encontrados no meio ambiente se mantém crescente e pouco tem sido feito para

controlar esta expansão. Grande parte dos países em desenvolvimento possui uma

legislação omissa quanto a esse assunto, uma vez que permitem a presença destas

substâncias em águas utilizadas para consumo humano, mesmo que em baixas

concentrações.

O Brasil encontra-se hoje entre os oito países que mais consomem agrotóxicos,

chegando a 3,5 kg por hectare (SINDAG, 2007). Do total desses agrotóxicos vendidos

para a agricultura, os herbicidas representam cerca de 46%. Vale ressaltar que as vendas

de herbicidas estão voltadas, principalmente, para soja, milho e cana-de-açúcar, culturas

que se destacam pelo uso de atrazina.

A atrazina é um herbicida mundialmente utilizado e tem sido considerado um

potente desregulador endócrino, causando efeitos adversos na função reprodutiva de

ambos os sexos em uma ampla gama de espécies. Apesar dos efeitos adversos no

sucesso reprodutivo animal, pouco se sabe sobre a ação de atrazina no sistema genital

masculino de mamíferos, especialmente em indivíduos adultos e em modelos

experimentais in vivo. Dessa forma, faz-se necessário e urgente investigar os efeitos

desse herbicida sobre o perfil hormonal de indivíduos a ele expostos e sobre os órgãos

reconhecidamente alvos de testosterona ou seus metabólitos, estrógenos e DHT, dentre

os quais destacam-se os testículos.

Justificativa e Objetivos

24

2. Objetivos

2.1 Objetivo Geral

O presente estudo tem como objetivo avaliar os possíveis efeitos da atrazina na

morfofisiologia, perfil hormonal e esteroidogênese dos testículos de ratos Wistar

adultos.

2.2 Objetivos Específicos

Sempre comparando animais controles e expostos à atrazina, pretende-se:

• Determinar o peso corporal e o peso relativo dos testículos e adrenais;

• Determinar os níveis plasmáticos e testiculares de estradiol e testosterona;

• Investigar possíveis alterações histopatológicas nos testículos;

• Avaliar possíveis variações na expressão da enzima esteroidogênica 3β-HSD

(nas adrenais e testículos) e receptor de andrógeno (nos testículos),

utilizando imunohistoquímica e Western blotting.

III• ARTIGO PUBLICADO

25

Please cite this article in press as: Victor-Costa AB, et al. Changes in testicular morphology and steroidogenesis in adult rats exposed to Atrazine.Reprod Toxicol (2010), doi:10.1016/j.reprotox.2009.12.006

ARTICLE IN PRESSG Model

RTX-6342; No. of Pages 9

Reproductive Toxicology xxx (2010) xxx–xxx

Contents lists available at ScienceDirect

Reproductive Toxicology

journa l homepage: www.e lsev ier .com/ locate / reprotox

Changes in testicular morphology and steroidogenesis in adult ratsexposed to Atrazine

Anna Bolivar Victor-Costa, Simone Miranda Carozzi Bandeira, André Gustavo Oliveira,Germán Arturo Bohórquez Mahecha, Cleida Aparecida Oliveira ∗

Department of Morphology, Federal University of Minas Gerais, Cx. Postal 486, CEP 31.270-901, Belo Horizonte, MG, Brazil

a r t i c l e i n f o

Article history:Received 22 October 2009Received in revised form10 December 2009Accepted 18 December 2009Available online xxx

Keywords:AtrazineTestisAdrenal3�-HSDAndrogen receptorEndocrine disruptor

a b s t r a c t

Atrazine is an herbicide considered as a potent endocrine disruptor, causing adverse effects on both gen-der of mammalian and non-mammalian species. Despite the known adverse effects of Atrazine, little isknown about its action on male genital system, especially in adults. We evaluated the effects of Atrazine(50 mg/kg, 200 mg/kg and 300 mg/kg) in the 3�-hydroxysteroid dehydrogenase (3�-HSD) expression,plasmatic and testicular estrogen and testosterone levels, androgen receptor expression and morpholog-ical changes in adult rat testes. Atrazine at doses higher than 50 mg/kg resulted in decreased body weight,increased adrenal weight and transient increase in testis weight, followed by testis atrophy. A reductionin testosterone but increase in estradiol levels was observed. We showed for the first time that testicular3�-HSD protein was decreased, whereas in the adrenal it was unchanged. The results suggest that 3�-HSD inhibition may represent an alternative mechanism through which Atrazine affects the testicularandrogenesis, leading to changes in spermatogenesis.

© 2010 Published by Elsevier Inc.

1. Introduction

The importance of endocrine disrupting chemicals has beenlargely investigated in face of the growing evidences regardingthe relationship between exposure to these compounds and theincrease in male reproductive disorders. Atrazine (2-chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-s-triazine) is an herbicide widelyused worldwide, which has been considered as an endocrinedisruptor, causing adverse effects on reproductive function inboth genders of several mammalian and non-mammalian species[1–10]. Potencial risk of Atrazine for male health includes reduc-tion in number and motility of sperm [2,11–13], hermaphroditismin frogs [4], change in sex ratio in fish [8] and amphibian [6], delayedsexual maturation [3,14] and reduction in prostate and seminalvesicle weights [2,3,13,14].

The mechanism of Atrazine action is not completely deter-mined but several in vitro experiments have shown that Atrazineinduces the expression and activity of the cytochrome P450 aro-matase [15–18]. Aromatase is a key enzyme that participates in thesteroidogenic cascade promoting the bioconversion of androgens

∗ Corresponding author at: Av. Antônio Carlos, 6627, CEP 31.270-901, Belo Hori-zonte, MG, Brazil. Tel.: +55 31 3409 2795; fax: +55 31 3409 2771.

E-mail address: [email protected] (C.A. Oliveira).

into estrogens. The effect of Atrazine on aromatase may explainthe increase in estrogen [3,5] and reduction in testosterone levelsdescribed in a variety of species [3–5,9,14,19]. However, evidencefor the interference of Atrazine in the androgen receptor expres-sion or in the androgen–estrogen balance in vivo adult rat is notestablished.

Studies using other organochlorine compounds, similar toAtrazine, indicated that they cause inhibitory effects on testicu-lar steroidogenesis by reducing the expression and activity of theenzyme 3�-hydroxysteroid dehydrogenase (3�-HSD) [20–22]. Thisenzyme is responsible for various stages of the steroidogenic path-way, including the synthesis of androstenedione, the testosteroneprecursor. Therefore the interference of such pollutants in steroido-genesis results in reduced testosterone production by the Leydigcell, compromising the spermatogenic process and maintenance ofsecondary sexual functions. It is not known whether Atrazine alsoaffects this important step in the steroid biosynthetic pathway.

Despite the known effects of Atrazine as an endocrine disrup-tor that interferes in animal reproductive success, little is knownabout its action on the male genital system, especially in adults. Inthis work we propose to evaluate the possible effects of Atrazinein the steroidogenic pathway by analyzing the 3�-HSD expres-sion, plasmatic and testicular estrogen and testosterone levels, andexpression of androgen receptor, as well as morphophysiologicalchanges in testes of adult rats exposed to the herbicide.

0890-6238/$ – see front matter © 2010 Published by Elsevier Inc.doi:10.1016/j.reprotox.2009.12.006

dx.doi.org/10.1016/j.reprotox.2009.12.006

http://www.sciencedirect.com/science/journal/08906238

http://www.elsevier.com/locate/reprotox

mailto:[email protected]





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2. Materials and methods

2.1. Animal

The present study was performed in adult (120 days of age) male Wistar ratshoused in the Animal Facility at the Instituto de Ciências Biológicas (CEBIO), Uni-versidade Federal de Minas Gerais, Brazil. The rats were maintained under constantlight cycle (12 h of light/12 h of darkness) and temperature (22 ◦C), receiving waterand peletized chow as diet (Nuvital Nutrientes S.A., Colombo, PR, Brazil) ad libitum.The principles of research involving animals followed the protocol published bythe Universidade Federal de Minas Gerais (http://www.ufmg.br/coep/cetea.html).The experimental procedures were approved by the institutional Ethical Committeefor Animal Experimentation of the Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA),Brazil.

2.2. Treatment

Atrazine is an herbicide commercialized in Brazil under the name of Gesaprim®

(Ciba Geigy, Syngenta, São Paulo, Brazil). This commercial formulation consistsof 500 g/l of Atrazine and 500 g/l of other inert ingredients. In the present study,the rats were exposed to a daily gavage of Atrazine at final dose of 50 mg/kg,200 mg/kg and 300 mg/kg. The herbicide was suspended in corn oil and given ata volume of 2 ml. Rats were treated for 7 days (300 mg/kg), 15 days (50 mg/kgand 200 mg/kg) or 40 days (200 mg/kg). Control animals were given the vehicleat the same volume and frequency. The dosages and treatment periods were cho-sen based in previous studies showing adverse effects in the male genital system[3,14,19].

2.3. Tissue preparation

After the treatment periods, rats were weighted, anaesthetized (i.p. sodium pen-tobarbital 80 mg/kg BW and ketamine chloridrate 10 mg/kg of body weight), andperfused intracardially with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4or 10% (v/v) neutral buffered formalin (NBF). After fixation, the testis and adrenalglands were removed and weighed. The relative organ weights were calculated per100 g of body weight. Fragments of testis fixed in glutaraldehyde were embeddedin glycolmethacrylate, sectioned at 3 �m, stained with hematoxylin and eosin orperiodic acid Schiff (PAS) counterstained with hematoxylin, and used for histolog-ical studies. Fragments of testis and adrenal gland fixed in NBF were embedded inparaffin, sectioned at 5 �m and mounted on glass slides for immunohistochemicalstudies. For ultrastructural studies fragments of testis fixed in glutaraldehyde 2.5%were used. These fragments were post fixed in osmium tetroxide 1% in phosphatebuffer, dehydrated in increasing series of ethanol and acetone and embedded in Eponresin. Semi-thin sections (1 �m) were analyzed under light microscope for selectionof the best fields to be investigated. Ultra-thin sections (90 nm) were obtained fromthe selected areas, which were contrasted with uranyl acetate and 2% lead citrate.The material was observed under a transmission electron microscope Tecnai G2-20of the Center for Microscopy of UFMG, Belo Horizonte, MG, Brazil.

2.4. Immunohistochemistry

Changes in the expression of 3�-HSD enzyme and androgen receptor (AR) wereinvestigated by immunohistochemistry following protocol previously described[23]. For comparison between steroidogenic tissues, adrenal gland was also inves-tigated for the 3�-HSD immunodetection. Tissue sections were deparaffinized in

Fig. 1. Effects of Atrazine on body, testis and adrenal weights. (A) Except for 50 mg/kg, the exposure to the herbicide caused significant decrease in body weight. (B)Comparative testicular size. (C and D) Atrazine 300 mg/kg/7 days and 200 mg/kg/15 days caused a significant increase in the relative and absolute testis weight, whereasat 200 mg/kg/40 days there was a reduction in relative and absolute weight. The 50 mg/kg dose of Atrazine did not alter the testis weight. (D) A significant increase in theadrenal weight was observed after treatment with Atrazine at all dosages, except 50 mg/kg. Bar in B = 1 cm; n = 4–7; *P ≤ 0.05.


http://www.ufmg.br/coep/cetea.html




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xylene, rehydrated through a graded series of ethanol, washed with phosphatebuffer saline (PBS) and then blocked for endogenous peroxidase by incubationwith 0.6% H2O2 in methanol for inactivation of endogenous peroxidase. Aftermicrowaving for antigen retrieval, endogenous biotin activity was blocked by usingavidin and biotin blocking solution (avidin/biotin blocking kit—Vector Laboratories,Burlingame, USA). For blocking non-specific antibody binding, the sections weretreated with 10% normal rabbit serum (for 3�-HSD) or 10% normal goat serum (forAR). Following, the sections were incubated with the primary antibody goat anti-human 3�-HSD (P-18, SC-30820, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)diluted 1:500, or rabbit anti-human AR (PG21, Upstate, Lake Place, NY, USA) diluted1:500, at 4 ◦C. For negative controls, the sections received phosphate buffer saline(PBS) in place of the primary antibody. After washing in PBS, the sections wereexposed for 1 h to a biotinylated secondary antibody rabbit anti-goat (for 3�-HSD)or goat anti-rabbit (for AR) (both Dako, Carpinteria, USA), used at 1:100 dilution.After this step the sections were incubated with the avidin–biotin complex (Vec-tastain Elite ABC kit—Vector Laboratories, Burlingame, USA) for 30 min and theimmunoreaction was visualized using diaminobenzidine containing 0.01% H2O2 in0.05 M Tris–HCl buffer, pH 7.6. Sections were slightly counterstained with Delafield’shematoxylin. For semiquantification of the immunostaining tissue section from con-trol and all experimental groups were ran in parallel and stained in triplicate sets toconfirm results.

2.5. Immunohistochemical quantification

Immunostaining intensity was quantified by computer-assisted image analysis,based on previously reported protocols [24]. AR staining was quantified in 30 inter-stitial Leydig cells as well as 30 Sertoli cells lining seminiferous epithelium at stagesVII or VIII, per animal, except for those treated with Atrazine 200 mg/kg/40 days inwhich the testis were atrophic and the stages of the seminiferous epithelium cyclecould not be identified. In this case, the Sertoli cell positivity was measured in ran-domly observed tubules. For AR quantification, pictures from different areas of thetestis were taken by using a Nikon Eclipse E600 microscope (Nikon Corp., Melville,NY, USA) and a 40× objective and a Nikon Coolpix digital camera (Nikon Corp.,Melville, NY, USA). Digital images were processed using Adobe Photoshop (AdobeSystems, Mountain View, CA, USA). The pictures were converted to the grayscalemode and inverted. The images were then exported to Image-Tool software (Version3.00; University of Texas Health Sciences Center, San Antonio, TX, USA), for quanti-

tative analysis. The stained nucleus were traced and measured and pixel intensitywas determined for the traced areas. Background intensity was determined by trac-ing an unlabeled area adjacent to the measured cells and subtracted from valuesdetected in the labeled regions.

2.6. Hormone measurements

2.6.1. RadioimmunoassayImmediately after the animals reached a surgical plane of anaesthesia, blood

samples were collected by cardiac puncture. The plasma was separated by centrifu-gation and stored at −20 ◦C for subsequent hormone assays, as previously described[25]. Plasma testosterone and estradiol were measured by radioimmunoassay, usingcommercial kits (Testosterone MAIA and Estradiol MAIA kits—Adaltis, Rome, Italy).The limit of testosterone detection was 0.07 ng/ml and the assay coefficient of vari-ation was 4.7%. The antibody used for testosterone radioimmunoassay (RIA) hadlow cross reactivity to dihydrotestosterone (DHT) (5%) and other androgens (lessthan 0.01%). The sensitivity of the estradiol assay was 15 pg/ml and the intra- andinter-assay coefficient of variation was 4.3% and 5.6%, respectively. All samples weremeasured in duplicate.

2.6.2. Enzyme linked immuno sorbent assay—ELISABesides the RIA, it was performed the dosage of estradiol and testosterone in

the testis tissue and plasma by using commercial ELISA kits. Liquid nitrogen frozentestes were macerated in dry ice and the samples of tissue (100 mg) were homog-enized and sonicated (60 s in 250 �l of PBS, pH 7.4). After homogenization, lipidextraction and enrichment was performed on the samples with diethylether to cir-cumvent protein matrix effects and to obtain an appropriate concentration range,as described by Hany et al. [26]. ELISA measurements were performed accordingto the manufacturer’s instructions (Testosterone and Estradiol Interkit—Bio Check,Foster City, USA). The detection limit for testosterone and estradiol was 0.05 ng/mland 1 pg/ml, respectively. All samples were measured in duplicate.

2.7. Western blotting

Western blotting assays were performed in order to determine the specificity ofthe used antibodies and to investigate changes in the expression of 3�-HSD enzymein testis and adrenal and androgen receptor (AR) in testis of treated groups. Fol-

Fig. 2. Effects of Atrazine on plasma and testicular hormone levels. (A) Plasma testosterone levels were drastically reduced in the animals treated with Atrazine. (B) Testicularlevel of testosterone was also reduced after Atrazine exposure. (C) Plasma levels of estradiol showed a significant increase after treatment with Atrazine 200 mg/kg/15 days.(D) Testicular levels of estradiol also showed a significant increase. n = 4–7; *P ≤ 0.05.






lowing dissection, testis and adrenal from Atrazine 200 mg/kg/15 days treated andcontrol rats (n = 5) were isolated and frozen in liquid nitrogen. After maceration usingdry ice, tissue was thawed and total protein was extracted by addition of 1% sodiumdodecyl sulfate (SDS), 30 mM Tris–HCl pH 6.8, 2-mercaptoethanol, 12% (v/v) glyceroland bromophenol blue. Proteins were then subjected to continuous electrophoresisusing 10% SDS–PAGE and transferred to nitrocellulose membranes. The membraneswere blocked with 10% normal rabbit serum (for 3�-HSD) or 10% normal goat serum(for AR), for 1 h at room temperature and then incubated with the primaries anti-bodies: goat anti-human 3�-HSD (P-18, SC-30820, Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA) diluted 1:500, or rabbit anti-human AR (PG21, Upstate, Lake Place, NY,USA) diluted 1:1000, for 1 h at room temperature. After washing with PBS–Tween0.05% (PBST), the blots were incubated with secondary rabbit anti-goat (for 3�-HSD) diluted 1:1000 or goat anti-rabbit (for AR) antibodies (Dako, Carpinteria, CA,USA) diluted 1:2000. After several washes in PBST, the reaction was developed bythe addition of 0.1% 3,3′diaminobenzidine in PBS containing 0.05% chloronaphtol,16.6% methanol and 0.04% H2O2. The reaction was stopped with deionized water. Allprotein assays were triplicated and the density of the bands obtained was estimatedby using Scion Image software (http://www.scioncorp.com).

2.8. Statistical analysis

Differences in the body weight, relative testis and adrenal weights, hormonemeasurement, immunohistochemical staining, morphometrical data, and West-ern blot assays of control and treated animals were analyzed by Student’s t-test.

Groups with more than two variables were analyzed using multiple analysis ofvariance (ANOVA) followed by post hoc Student–Newman–Keuls test. Differenceswere considered statistically significant when P ≤ 0.05. Data were expressed asmean ± standard error of the mean.

3. Results

3.1. Body, testis and adrenal gland weights

Atrazine 200 mg/kg (15 days and 40 days) and 300 mg/kg (7days) caused a significant decrease in body weight of 35% and38%, respectively (Fig. 1A). A significant increase in the relativeand absolute weight of the testis was observed after treatmentwith Atrazine 200 mg/kg/15 days (80% and 16%) and 300 mg/kg/7days (83% and 14%). On the other hand, exposition to Atrazine200 mg/kg for 40 days caused a reduction of 41% and 60% in therelative and absolute testis weight, respectively (Fig. 1B–D). In ani-mals treated with Atrazine at 200 mg/kg (15 days and 40 days) and300 mg/kg (7 days) there was a significant increase in the adrenalrelative weight of 64%, 104% and 41%, respectively (Fig. 1E). The

Fig. 3. Effects of Atrazine on testis morphology. (A and B, E and F) Compared to control, Atrazine exposure caused dilation of seminiferous tubules (double arrow) at dosesof 200 mg/kg/15 days (A and B) and 300 mg/kg/7 days (E and F). (C and D) Atrazine 200 mg/kg/40 days resulted in testis atrophy. Insert in D = giant multinucleated body. Barin E = 200 �m.


http://www.scioncorp.com/





50 mg/kg dose of Atrazine did not alter the body, testis or adrenalweights.

3.2. Plasma and testis hormone concentration

Plasma testosterone levels were drastically reduced in the ani-mals treated with Atrazine at all dosages used (65% for 50 mg/kg;85% for 200 mg/kg/15 days; 86% for 200 mg/kg/40 days and 87% for300 mg/kg), as revealed by RIA assays (Fig. 2A). The ELISA assayconfirmed this testosterone reduction (data not shown). Testic-ular level of testosterone was also reduced (32%) after Atrazine200 mg/kg/15 days treatment (Fig. 2B). Conversely, plasma and tes-ticular levels of estradiol showed a significant increase of 33% and38%, respectively, after treatment with Atrazine 200 mg/kg/15 days(Fig. 2C and D). At all other dosages of Atrazine exposure, the plasmaestradiol concentration was similar to control (Fig. 2C).

3.3. Testis morphology

Testis morphology was altered by Atrazine exposition, whichwas mainly evidenced by dilation of seminiferous tubules at dosesof 200 mg/kg/15 days and 300 mg/kg/7 days (Fig. 3A and B, Eand F). Some dilated tubules appeared irregular in form. In mostspecimens, there was coexistence of dilated tubules with thoseappearing normal. Few seminiferous tubules were atrophic. Con-sidering these variable appearances of the tubules, the alterationsin the testis were not measured. On the other hand, the testis ofrats treated with Atrazine 200 mg/kg/40 days were characterizedby atrophy and great reduction in the seminiferous tubules lumen(Fig. 3 C and D). On this group most of the seminiferous tubules wereSertoli cell only. Giant multinucleated bodies and a large number ofapoptotic cells were also frequent within the seminiferous tubules.

Changes in Leydig cells and macrophages ultrastructure as wellas in their interaction were also observed in animals exposed to theherbicide (Fig. 4). In treated animals, the Leydig cells were pleomor-phic, usually smaller than controls and presenting irregular nuclei,frequently with greater amount of peripheral heterochromatin. TheLeydig cells were not as closely associated as in the controls. Infact, the Leydig cell cytoplasmic protrusions were shorter and the

intercellular space was larger, presenting greater amounts of colla-gen fibers. The interactions between Leydig cells and macrophageswere also looser. In addition, macrophages of animals treated withAtrazine showed fewer lysosomes, irregular nuclei, commonly withdeep folds and prominent nucleoli.

3.4. Detection of androgen receptor

Positivity for AR was found in the nuclei of Leydig cells, Sertolicells and peritubular myoid cells (Fig. 5A). The intensity of Ser-toli cells AR staining was stage-dependent, reaching the strongestpositivity in stages VII–VIII. There was no difference in AR pro-tein level when animals treated with Atrazine 200 mg/kg/15 daysand controls were compared by Western blotting assay (Fig. 5B).Confirming the Western blotting results, quantification of the ARimmunopositivity in specific cell types after exposure to Atrazineat the same dosage (200 mg/kg/15 days) revealed equal AR inten-sity in Sertoli cells and Leydig cells compared to controls (Fig. 5Cand D). Treatment with higher dose of Atrazine (300 mg/kg/7days) resulted in decreased AR intensity in both Sertoli and Ley-dig cells, whereas after longer period of exposition to the herbicide(200 mg/kg/40 days) the AR staining was decreased in Sertoli cellsbut increased in Leydig cells (Fig. 5C and D). It is important to high-light that in the rats treated for 40 days the testis was atrophic andmost of the tubules presented AR-positive Sertoli cells, althoughstaining intensity was reduced.

3.5. Detection of 3ˇ-HSD

In control animals, the expression of 3�-HSD in the testisshowed homogeneous intensity and distribution in the Leydig cellscytoplasm (Fig. 6A). In treated animals at all doses, most of the Ley-dig cells presented weakly stained or negative for 3�-HSD. Thesedata were confirmed by Western blotting, in which the animalstreated with Atrazine 200 mg/kg/15 days showed significant reduc-tion (40%) in the intensity of 3�-HSD-positive bands in the testis(Fig. 6B). The expression of 3�-HSD was found in cells of the threezones of the adrenal cortex (Fig. 6C). The pattern of distribution andintensity of the 3�-HSD immunoreaction was similar in both, con-

Fig. 4. Effects of Atrazine on the ultrastructure of testes interstitial cells. (A–C) Control testes showed Leydig cells (L) and macrophages (M) with close interactions and intensecytoplasmic protrusions (*) in Leydig cells. (D–F) Atrazine exposure resulted in pleomorphic Leydig cells (L) with irregular nuclei and a greater amount of heterochromatin(insert in D), besides intercellular space presenting greater amounts of collagen fibers (arrows). Macrophages (M) were characterized by fewer lysosomes (compare C withF).






Fig. 5. Effects of Atrazine on testis androgen receptor immunoexpression. (A) Immunopositivity for AR was detected in Leydig cells (L), Sertoli cells (S) and Myoid cells(arrow) of both treated and control rats. Exposure to Atrazine promoted a reduction of AR staining in Sertoli cells in groups treated with 200 mg/kg/40 days and 300 mg/kg/7days. (B) Representative Western blotting and respective graphical representation of image analysis of the androgen receptor assays. (C) Graphical representation of imageanalysis for immunohistochemical staining of androgen receptor in Sertoli cells and (D) in Leydig cells. Insert in A represents the negative control of the immunostaining.Bar in A = 50 �m; n = 5; *P ≤ 0.05.

trol and treated animals. In agreement, Western blotting showedthat the 3�-HSD protein was not altered in adrenal of treated ani-mals when compared with controls (Fig. 6D).

4. Discussion

The present study adds information about the effects of Atrazineas an endocrine disruptor by demonstrating that this herbicideaffects the expression of testicular 3�-HSD protein, which is a keyenzyme in the androgen biosynthetic pathway. The herbicide alsoaltered testosterone and estradiol levels in the plasma and testis ofadult male rats, resulting in histopathological effects in the testisarchitecture.

In agreement with our findings, it is consensual in the literaturethat treatment with Atrazine at doses higher than 50 mg/kg causesreduction in the body weight [2,3,13,14,19]. However, data relatedto testis weight have been controversial, as some earlier studieshave not found difference [2,3], whereas others found significant

increase in testicular weight [13]. In the current study there wasa transient increase in the testis weight after short-time exposureto Atrazine (200 mg/kg/15 days and 300 mg/kg/7 days), followedby a significant reduction after longer treatment (200 mg/kg/40days). The reduction in testis weight correlated the organ atrophy,as revealed by the morphological studies showing that most of theseminiferous tubules were Sertoli cell only. On the other hand, theincrease in testis weight correlated with the larger lumen of theseminiferous tubules. The transient increase in the testis weightwas similar to that described for several toxicants that affect themale tract [27,28], as well as estrogen receptor disruption [29] andexposure to estrogen/antiestrogen [30–33]. As shown in previousstudies, a possible explanation for the seminiferous tubules lumi-nal dilation is fluid accumulation. A likely reason for this alterationmay be disturbance in the efferent ductules which are highly sen-sitive to unbalance in estrogen/estrogen receptor levels [29,32,34].It is known that disturbance in the efferent ductules fluid reab-sorption leads to luminal accumulation and backflow to the testis,






Fig. 6. Effects of Atrazine on testis and adrenal 3�-HSD immunoexpression. (A) In control animals, 3�-HSD positivity was found in the Leydig cells (L) cytoplasm. AfterAtrazine exposure, there was a great reduction in Leydig cells 3�-HSD immunoreactions. (B) Representative Western blotting and respective graphical representation ofimage analysis of the 3�-HSD assays in the testis. (C) 3�-HSD was detected in the three zones of adrenal cortex of both, control and treated animals, without changes in thestaining pattern and intensity. (D) Representative Western blotting and respective graphical representation of image analysis of the 3�-HSD assays in the adrenal. Insert inA and D represent the negative control of the immunostaining; Bar in A = 50 �m; Bar in C = 200 �m; n = 5; *P ≤ 0.05.

resulting in testicular swelling followed by atrophy [29]. Consider-ing the significant increase in testicular estrogen level found afterAtrazine exposure, investigation of alteration in the male genitaltract downstream the testis is warranted to clarify whether or notthe long-term effects on the testis are primary to Atrazine expo-sition. However, the possibility remains that some of the adverseeffects on the testis are resultant of changes in Leydig cells andtestosterone withdrawal.

At all doses tested there was a large decrease in plasma testos-terone levels after Atrazine treatment. Reduction in testosteronelevels has been found by several studies in mammals [14,19], as wellas reptiles [35], amphibians [4] and fish [5] species, revealing thatthis is a consistent effect of the herbicide in vertebrates. Supportingearlier data [14], we found that reduction in plasma testosterone

paralleled the intratesticular reduction of this steroid, suggestingeffect in Leydig cells production and/or metabolism. This point ofview is supported by the present data showing alterations in themorphology of Leydig cells as well as reduction in the 3�-HSDexpression. Differing from our findings, a recent study using in vitroLeydig cells obtained from peripubertal rats exposed to Atrazineshowed downregulation of several genes involved in steroidoge-nesis, except 3�-HSD [36]. The difference between results of thepresent in vivo study and the previous in vitro study may be dueto differences in the age of the animals, as well as experimentalconditions. However, as in the latter study the effect of Atrazineon 3�-HSD protein level was not determined, one cannot rule outthe possibility that the changes in 3�-HSD could be due to otherposttranscriptional or translational events. Interestingly, adrenal






3�-HSD expression was unchanged, demonstrating that this effectof Atrazine was restricted to the testis.

Although Atrazine did not show significant alteration in 3�-HSDprotein expression in adrenal tissue, there was a great increase inthe gland weight following exposure to the herbicide. Our find-ing is in line with Pogrmic et al. [36] that also found reductionin androgen-dependent organ weights, but an increase in rela-tive adrenal weight promoted by Atrazine. The increase in adrenalweight may be explained by recent evidence that Atrazine inducescorticosterone and progesterone release in an ACTH-dependentway [37,38]. The lack of effect of Atrazine on adrenal 3�-HSD asopposed to testicular 3�-HSD highlight that the mechanism ofthe Atrazine action on steroidogenesis may vary depending on thecell–tissue considered. These data are not surprising, consideringthat different mechanism of regulation of 3�-HSD expression haslong been described for adrenal and testicular tissue, as adrenal3�-HSD is more responsive to ACTH whereas LH and androgens arethe main regulators of 3�-HSD expression in Leydig cells [39]. How-ever, the significance of the adrenal results is enormous consideringthat corticoids have effects in multiple organic systems, includ-ing hypothalamus–pituitary–gonadal axis. Therefore, it is possiblethat the Atrazine effects on reproductive function may be causednot only by direct effect on testicular steroidogenesis but also byindirect effect via hypothalamus–pituitary–adrenal axis [38].

Besides decreasing testosterone concentration, Atrazine alsocaused a significant increase in the levels of estradiol in bothplasma and testicular tissue. In spite of numerous reports point-ing out that Atrazine induces estrogen formation in several invitro experiments, this is the first study demonstrating that testos-terone/estradiol ratios are altered in adult rat testis in vivo. Similarincrease in estradiol plasma concentration that was Atrazine dose-related (200 mg/kg) was previously reported for pubertal rats [3],but the intratesticular level of this steroid was not considered inthat study. The present results corroborate the current hypoth-esis that the mechanism of Atrazine action involves inductionof aromatase expression and activity. It has been proposed thatthe aromatase stimulating effect is established by the increasedcAMP levels promoted by inhibition of phosphodiesterase activ-ity [15,40–42]. The Atrazine induced transcription of aromatasegene occurs via promoter II (ArPII) in a manner dependent on thesteroidogenic factor 1 [43]. Considering the fact that the aromataseexpression in adult rat Leydig, Sertoli and germ cells is exactlyunder control of promoter ArPII [44,45], we can infer that a similarmechanism of action may occur in the present in vivo model. It islikely that the resultant local imbalance between testosterone andestradiol may be responsible for some of the reproductive effectsinduced by Atrazine.

It has been demonstrated that the effects elicited by Atrazine arenot mediated by androgen or estrogen receptors, due to the lack ofaffinity of the herbicide for these receptors [42,46,47]. However,no relevant data on AR expression have been reported for in vivomodel. We found that the overall expression of testicular AR proteinwas not altered by the Atrazine exposition. Conversely, results ofquantitative immunohistochemical on a cell-type specific mannerrevealed that Sertoli cell AR-positivity was lower in groups treatedwith Atrazine at 200 mg/kg/40 days and 300 mg/kg/7 days. How-ever, the decrease in AR found was not as dramatic as expected afterthe severe drop in plasma testosterone. Also, in the group treatedwith 200 mg/kg/15 days there were no alteration in AR immunos-taining. The maintenance of evident AR expression may, therefore,be attributed to the residual intratesticular testosterone (68% ofcontrol). In contrast with the Sertoli cells, the intensity of Leydigcell AR expression varied depending on the dose and time periodof Atrazine exposition, irrespective of the testosterone level. Theseresults are in agreement with previous reports indicating that ARlevels in the adult rat Sertoli cells mainly depends on circulating

testosterone, whereas in adult Leydig cells the androgen depen-dency is more limited [48,49].

In summary, we have demonstrated for the first time thatAtrazine decreases 3�-HSD protein and testosterone but increasesestrogen concentration in adult rat testis. Unlike the testis, expres-sion of adrenal 3�-HSD was not affected by Atrazine. The 3�-HSDinhibition may represent an alternative mechanism through whichAtrazine affects the testicular androgenesis on adult rodent, leadingto changes in spermatogenesis.

Conflict of interest statement

The authors declare that there are no conflicts of interest.

Acknowledgments

We thank Dra. Adelina M. Reis and Janine Costa Ivo for assis-tance with the RIA and Mônica Morais Santos and PollyanaRabello Nunes Campos for technical assistance. The author alsothanks the Microscopy Center of the UFMG for technical sup-port with electron microscopy. This research was supported bythe Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tec-nológico, CNPq/Brazil (MAPA/SDA process no. 578429/2008-0)and Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de MinasGerais—PRPq/UFMG (Grants to C.A.O.). Research fellowship toC.A.O., doctoral fellowship to A.G.O. and technician fellowship weresupported by CNPq; Master fellowship to A.B.V.C. was supportedby Coordenacão de Aperfeicoamento de Pessoal de Nível Superior,CAPES; S.M.C.B. received a PROBIC scholarship from Fundacão deAmparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais—FAPEMIG/Brazil.

References

[1] Tennant MK, Hill DS, Eldridge JC, Wetzel LT, Breckenridge CB, Stevens JT. Pos-sible antiestrogenic properties of chloro-s-triazines in rat uterus. J ToxicolEnviron Health 1994;43:183–96.

[2] Kniewald J, Jakominic M, Tomljenovic A, Simic B, Romac P, Vranesic D, et al.Disorders of male rat reproductive tract under the influence of atrazine. J ApplToxicol 2000;20:61–8.

[3] Stoker TE, Laws SC, Guidici DL, Cooper RL. The effect of atrazine on puberty inmale wistar rats: an evaluation in the protocol for the assessment of pubertaldevelopment and thyroid function. Toxicol Sci 2000;58:50–9.

[4] Hayes TB, Collins A, Lee M, Mendoza M, Noriega N, Stuart AA, et al.Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide atrazineat low ecologically relevant doses. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:5476–80.

[5] Spano L, Tyler CR, van Aerle R, Devos P, Mandiki SN, Silvestre F, et al.Effects of atrazine on sex steroid dynamics, plasma vitellogenin concentrationand gonad development in adult goldfish (Carassius auratus). Aquat Toxicol2004;66:369–79.

[6] Oka T, Tooi O, Mitsui N, Miyahara M, Ohnishi Y, Takase M, et al. Effect of atrazineon metamorphosis and sexual differentiation in Xenopus laevis. Aquat Toxicol2008;87:215–26.

[7] Stoker C, Beldomenico PM, Bosquiazzo VL, Zayas MA, Rey F, Rodriguez H, etal. Developmental exposure to endocrine disruptor chemicals alters follicu-lar dynamics and steroid levels in Caiman latirostris. Gen Comp Endocrinol2008;156:603–12.

[8] Suzawa M, Ingraham HA. The herbicide atrazine activates endocrine gene net-works via non-steroidal NR5A nuclear receptors in fish and mammalian cells.PLoS ONE 2008;3:e2117.

[9] Rey F, Gonzalez M, Zayas MA, Stoker C, Durando M, Luque EH, et al.Prenatal exposure to pesticides disrupts testicular histoarchitecture andalters testosterone levels in male Caiman latirostris. Gen Comp Endocrinol2009;162:286–92.

[10] Shibayama H, Kotera T, Shinoda Y, Hanada T, Kajihara T, Ueda M, et al. Col-laborative work on evaluation of ovarian toxicity. (14) Two- or four-weekrepeated-dose studies and fertility study of atrazine in female rats. J ToxicolSci 2009;34(Suppl. 1):SP147–55.

[11] Betancourt M, Resendiz A, Fierro EC. Effect of two insecticides and two herbi-cides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semenanalysis (CASA) in vitro. Reprod Toxicol 2006;22:508–12.

[12] Swan SH. Semen quality in fertile US men in relation to geographical area andpesticide exposure. Int J Androl 2006;29:62–8 [discussion 105–8].

[13] Abarikwu SO, Adesiyan AC, Oyeloja TO, Oyeyemi MO, Farombi EO. Changes insperm characteristics and induction of oxidative stress in the testis and epi-didymis of experimental rats by a herbicide, Atrazine. Arch Environ ContamToxicol, doi:10.1007/s00244-009-9371-2.


http://dx.doi.org/10.1007/s00244-009-9371-2





[14] Trentacoste SV, Friedmann AS, Youker RT, Breckenridge CB, Zirkin BR. Atrazineeffects on testosterone levels and androgen-dependent reproductive organs inperipubertal male rats. J Androl 2001;22:142–8.

[15] Sanderson JT, Letcher RJ, Heneweer M, Giesy JP, van den Berg M. Effects ofchloro-s-triazine herbicides and metabolites on aromatase activity in varioushuman cell lines and on vitellogenin production in male carp hepatocytes.Environ Health Perspect 2001;109:1027–31.

[16] Heneweer M, van den Berg M, Sanderson JT. A comparison of human H295Rand rat R2C cell lines as in vitro screening tools for effects on aromatase. ToxicolLett 2004;146:183–94.

[17] Fan W, Yanase T, Morinaga H, Gondo S, Okabe T, Nomura M, et al. Atrazine-induced aromatase expression is SF-1 dependent: implications for endocrinedisruption in wildlife and reproductive cancers in humans. Environ HealthPerspect 2007;115:720–7.

[18] Holloway AC, Anger DA, Crankshaw DJ, Wu M, Foster WG. Atrazine-inducedchanges in aromatase activity in estrogen sensitive target tissues. J Appl Toxicol2008;28:260–70.

[19] Friedmann AS. Atrazine inhibition of testosterone production in rat males fol-lowing peripubertal exposure. Reprod Toxicol 2002;16:275–9.

[20] Saradha B, Vaithinathan S, Mathur PP. Single exposure to low dose of lindanecauses transient decrease in testicular steroidogenesis in adult male Wistarrats. Toxicology 2008;244:190–7.

[21] Vaithinathan S, Saradha B, Mathur PP. Transient inhibitory effect of methoxy-chlor on testicular steroidogenesis in rat: an in vivo study. Arch Toxicol2008;82:833–9.

[22] Kumar V, Chakraborty A, Kural MR, Roy P. Alteration of testicular steroido-genesis and histopathology of reproductive system in male rats treated withtriclosan. Reprod Toxicol 2009;27:177–85.

[23] Oliveira CA, Mahecha GA, Carnes K, Prins GS, Saunders PT, Franca LR, et al.Differential hormonal regulation of estrogen receptors ERalpha and ERbetaand androgen receptor expression in rat efferent ductules. Reproduction2004;128:73–86.

[24] Oliveira AG, Telles LF, Hess RA, Mahecha GA, Oliveira CA. Effects of the herbicideroundup on the epididymal region of drakes Anas platyrhynchos. Reprod Toxicol2007;23:182–91.

[25] Picciarelli-Lima P, Oliveira AG, Reis AM, Kalapothakis E, Mahecha GA, Hess RA,et al. Effects of 3-beta-diol, an androgen metabolite with intrinsic estrogen-likeeffects, in modulating the aquaporin-9 expression in the rat efferent ductules.Reprod Biol Endocrinol 2006;4:51.

[26] Hany J, Lilienthal H, Sarasin A, Roth-Harer A, Fastabend A, Dunemann L, etal. Developmental exposure of rats to a reconstituted PCB mixture or aroclor1254: effects on organ weights, aromatase activity, sex hormone levels, andsweet preference behavior. Toxicol Appl Pharmacol 1999;158:231–43.

[27] Nakai M, Hess RA, Moore BJ, Guttroff RF, Strader LF, Linder RE. Acute andlong-term effects of a single dose of the fungicide carbendazim (methyl 2-benzimidazole carbamate) on the male reproductive system in the rat. J Androl1992;13:507–18.

[28] Hess RA. Effects of environmental toxicants on the efferent ducts, epididymisand fertility. J Reprod Fertil Suppl 1998;53:247–59.

[29] Hess RA, Bunick D, Lee KH, Bahr J, Taylor JA, Korach KS, et al. A role for oestrogensin the male reproductive system. Nature 1997;390:509–12.

[30] Aceitero J, Llanero M, Parrado R, Pena E, Lopez-Beltran A. Neonatal exposure ofmale rats to estradiol benzoate causes rete testis dilation and backflow impair-ment of spermatogenesis. Anat Rec 1998;252:17–33.

[31] Fisher JS, Turner KJ, Brown D, Sharpe RM. Effect of neonatal exposure to estro-genic compounds on development of the excurrent ducts of the rat testisthrough puberty to adulthood. Environ Health Perspect 1999;107:397–405.

[32] Oliveira CA, Carnes K, Franca LR, Hess RA. Infertility and testicular atrophy inthe antiestrogen-treated adult male rat. Biol Reprod 2001;65:913–20.

[33] Oliveira CA, Zhou Q, Carnes K, Nie R, Kuehl DE, Jackson GL, et al. ER func-tion in the adult male rat: short- and long-term effects of the antiestrogen ICI182,780 on the testis and efferent ductules, without changes in testosterone.Endocrinology 2002;143:2399–409.

[34] Hess RA. Oestrogen in fluid transport in efferent ducts of the male reproductivetract. Rev Reprod 2000;5:84–92.

[35] Crain DA, Guillette Jr LJ, Rooney AA, Pickford DB. Alterations in steroidogenesisin alligators (Alligator mississippiensis) exposed naturally and experimentallyto environmental contaminants. Environ Health Perspect 1997;105:528–33.

[36] Pogrmic K, Fa S, Dakic V, Kaisarevic S, Kovacevic R. Atrazine oral exposureof peripubertal male rats downregulates steroidogenesis gene expression inLeydig cells. Toxicol Sci 2009;111:189–97.

[37] Powers Fraites MJ, Cooper RL, Buckalew A, Jayaraman S, Mills L, Laws SC. Char-acterization of the hypothalamic–pituitary–adrenal axis response to atrazineand metabolites in the female rat. Toxicol Sci 2009;112:88–99.

[38] Laws SC, Hotchkiss M, Ferrell J, Jayaraman S, Mills L, Modic W, et al. Chloro-triazine herbicides and metabolites activate an ACTH-dependent release ofcorticosterone in male wistar rats. Toxicol Sci 2009;112:78–87.

[39] Simard J, Ricketts ML, Gingras S, Soucy P, Feltus FA, Melner MH. Molecularbiology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerasegene family. Endocr Rev 2005;26:525–82.

[40] Sanderson JT, Seinen W, Giesy JP, van den Berg M. 2-Chloro-s-triazineherbicides induce aromatase (CYP19) activity in H295R human adreno-cortical carcinoma cells: a novel mechanism for estrogenicity? Toxicol Sci2000;54:121–7.

[41] Sanderson JT, Boerma J, Lansbergen GW, van den Berg M. Induction andinhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticidesin H295R human adrenocortical carcinoma cells. Toxicol Appl Pharmacol2002;182:44–54.

[42] Roberge M, Hakk H, Larsen G. Atrazine is a competitive inhibitor of phosphodi-esterase but does not affect the estrogen receptor. Toxicol Lett 2004;154:61–8.

[43] Fan W, Yanase T, Morinaga H, Gondo S, Okabe T, Nomura M, et al. Herbicideatrazine activates SF-1 by direct affinity and concomitant co-activators recruit-ments to induce aromatase expression via promoter II. Biochem Biophys ResCommun 2007;355:1012–8.

[44] Lanzino M, Catalano S, Genissel C, Ando S, Carreau S, Hamra K, et al. Aro-matase messenger RNA is derived from the proximal promoter of the aromatasegene in Leydig, Sertoli, and germ cells of the rat testis. Biol Reprod 2001;64:1439–43.

[45] Carreau S, Lambard S, Delalande C, Denis-Galeraud I, Bilinska B, Bourguiba S.Aromatase expression and role of estrogens in male gonad: a review. ReprodBiol Endocrinol 2003;1:35.

[46] Connor K, Howell J, Chen I, Liu H, Berhane K, Sciarretta C, et al. Failure ofchloro-S-triazine-derived compounds to induce estrogen receptor-mediatedresponses in vivo and in vitro. Fundam Appl Toxicol 1996;30:93–101.

[47] Danzo BJ. Environmental xenobiotics may disrupt normal endocrine functionby interfering with the binding of physiological ligands to steroid receptors andbinding proteins. Environ Health Perspect 1997;105:294–301.

[48] Shan LX, Zhu LJ, Bardin CW, Hardy MP. Quantitative analysis of androgen recep-tor messenger ribonucleic acid in developing Leydig cells and Sertoli cells byin situ hybridization. Endocrinology 1995;136:3856–62.

[49] Zhu LJ, Hardy MP, Inigo IV, Huhtaniemi I, Bardin CW, Moo-Young AJ. Effectsof androgen on androgen receptor expression in rat testicular and epididy-mal cells: a quantitative immunohistochemical study. Biol Reprod 2000;63:368–76.


IV• DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

35

Discussão e Conclusão

36

IV – DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

O presente estudo contribui com informações importantes sobre o efeito do

herbicida atrazina como desregulador endócrino, demonstrando que este composto é

capaz de interferir na fisiologia endócrina não só de indivíduos em crescimento, mas

também de indivíduos adultos. Nossos experimentos evidenciam pela primeira vez o

efeito da atrazina na via esteroidogênica, levando a redução da expressão testicular de

3β-HSD, enzima chave para produção dos esteróides sexuais. Ao contrário do testículo,

a expressão da 3β-HSD na adrenal não foi afetada pela atrazina.

Constatamos que a redução nos níveis plasmáticos de testosterona em paralelo à

redução intratesticular deste esteróide, sugere efeitos na produção e/ou metabolismo das

células de Leydig. Este ponto de vista é corroborado pelos presentes dados mostrando

alterações na ultraestrutura das células de Leydig, bem como redução na expressão da

enzima 3β-HSD. Apesar de numerosos relatos apontarem a atrazina como indutor da

formação de estrógeno em experimentos in vitro, este é o primeiro estudo que

demonstra que o balanço entre testosterona/estradiol é alterado no testículo de ratos

adultos in vivo. Os resultados corroboram a hipótese de que o mecanismo de ação da

atrazina envolve indução da expressão e da atividade da enzima aromatase. É provável

que o desequilíbrio local entre testosterona e estradiol possa ser responsável por alguns

dos efeitos sobre o sistema genital induzidos pela atrazina. Tais efeitos acarretam em

alterações histopatológicas nos testículos comprometendo o processo espermatogênico.

De fato, os testículos de animais expostos ao herbicida sofrem um aumento de peso

transitório, correlacionado com dilatação luminal dos túbulos seminíferos, seguido por

marcante atrofia testicular, como revelado pelos estudos morfológicos.

Em suma, estes resultados confirmam os efeitos da atrazina como importante

desregulador endócrino e sugerem que a inibição da 3β-HSD pode representar um

mecanismo alternativo através do qual esse herbicida afeta a androgênese testicular,

levando a alterações na espermatogênese.

V• PERSPECTIVAS

37

Perspectivas

38

V- PERSPECTIVAS

Inúmeros experimentos in vitro apontam a atrazina como indutor da expressão e

atividade da enzima aromatase (Sanderson et al., 2001; Heneweer et al., 2004; Fan et

al., 2007a; Holloway et al., 2008), enzima chave para o balanço entre os níveis de

andrógenos e estrógenos. Nossos dados corroboram com esta hipótese demonstrando

que o balanço entre testosterona/estradiol foi alterado em ratos adultos expostos a

atrazina. O desequilíbrio neste balanço pode levar a infertilidade, ressaltando assim a

importância de se esclarecer através de experimentos in vivo o verdadeiro envolvimento

de atrazina na indução desta enzima.

O desequilíbrio nos níveis de estradiol e testosterona pode estar relacionado com

as alterações histopatológicas observadas nos testículos, como o aumento transitório de

peso correlacionado com a dilatação dos túbulos seminíferos, seguido por grande

redução no peso testicular em paralelo a uma completa atrofia do órgão. A razão para

estas alterações pode ser um distúrbio na fisiologia dos dúctulos eferentes, os quais são

altamente sensíveis ao desequilíbrio nos níveis de estrógenos/receptores de estrógenos

(Hess et al., 1997; Hess et al., 2000; Oliveira et al., 2001). Sabe-se que o distúrbio na

reabsorção de fluido pelos dúctulos eferentes leva à acumulação de fluido no lúmen e

consequentemente no refluxo para o testículo, resultando na dilatação testicular seguida

de atrofia (Hess et al., 1997). Desta forma, para melhor entender a ação da atrazina

nestes processos histopatológicos desencadeados nos testículos seria de grande

importância investigar as possíveis alterações morfológicas nas vias espermáticas, além

da expressão de receptores de estrógenos, para esclarecer se os efeitos testiculares a

exposição ao atrazina são primários ou decorrentes da disfunção dos dúctulos eferentes.

Dentre as alterações morfológicas observadas nos testículos estão túbulos

seminíferos constituídos apenas por células de Sertoli, presença de corpos gigantes

multinucleados, grande número de células germinativas em apoptose e células de

Leydig pleomórficas com núcleo irregular e grande quantidade de heterocromatina na

periferia. Tais alterações sugerem a ocorrência de processos relacionados ao

desequilíbrio entre proliferação e morte celular. De fato, há indícios de que atrazina

afeta a proliferação/morte celular comprometendo a manutenção da homeostase tecidual

(Manske et al., 2004; Lenkowski et al., 2008), mas até o momento esses eventos não

foram descritos em órgãos do sistema genital que são os alvos mais prováveis da

atrazina.

Perspectivas

39

Portanto, temos como perspectivas analisar possíveis alterações morfológicas

nas vias espermáticas e no padrão de expressão de marcadores de proliferação e morte

celular, receptores de estrógeno e enzimas chaves para o balanço estrógeno/andrógeno

(aromatase e 5α-redutase) nos órgãos alvo de animais adultos expostos a atrazina.

VI• REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

40

Referências Bibliográficas

41

VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abarikwu, S. O., Adesiyan, A. C., Oyeloja, T. O., Oyeyemi, M. O., & Farombi, E. O.

(2009). Changes in Sperm Characteristics and Induction of Oxidative Stress in

the Testis and Epididymis of Experimental Rats by a Herbicide, Atrazine. Arch

Environ Contam Toxicol, DOI 10.1007/s00244-009-9371-2, in press.

Aceitero, J., Llanero, M., Parrado, R., Pena, E., & Lopez-Beltran, A. (1998). Neonatal

exposure of male rats to estradiol benzoate causes rete testis dilation and

backflow impairment of spermatogenesis. Anat Rec, 252(1), 17-33.

Amory, J. K., & Bremner, W. J. (2003). Regulation of testicular function in men:

implications for male hormonal contraceptive development. J Steroid Biochem

Mol Biol, 85(2-5), 357-361.

Ashby, J., Tinwell, H., Stevens, J., Pastoor, T., & Breckenridge, C. B. (2002). The

effects of atrazine on the sexual maturation of female rats. Regul Toxicol

Pharmacol, 35(3), 468-473.

Bardin, C. W., Musto, N., Gunsalus, G., Kotite, N., Cheng, S. L., Larrea, F., et al.

(1981). Extracellular androgen binding proteins. Annu Rev Physiol, 43, 189-198.

Betancourt, M., Resendiz, A., & Fierro, E. C. (2006). Effect of two insecticides and two

herbicides on the porcine sperm motility patterns using computer-assisted semen

analysis (CASA) in vitro. Reprod Toxicol, 22(3), 508-512.

Bremner, W. J., Millar, M. R., Sharpe, R. M., & Saunders, P. T. (1994).

Immunohistochemical localization of androgen receptors in the rat testis:

evidence for stage-dependent expression and regulation by androgens.

Endocrinology, 135(3), 1227-1234.

Bringolf, R. B., Belden, J. B., & Summerfelt, R. C. (2004). Effects of atrazine on

fathead minnow in a short-term reproduction assay. Environ Toxicol Chem,

23(4), 1019-1025.

Bustos-Obregon, E. (1976). Ultrastructure and function of the lamina propria of

mammalian seminiferous tubules. Andrologia, 8(3), 179-185.

Carlsen, E., Giwercman, A., Keiding, N., & Skakkebaek, N. E. (1992). Evidence for

decreasing quality of semen during past 50 years. Bmj, 305(6854), 609-613.

Carreau, S., de Vienne, C., & Galeraud-Denis, I. (2008). Aromatase and estrogens in

man reproduction: a review and latest advances. Adv Med Sci, 53(2), 139-144.


42

Carreau, S., Lambard, S., Delalande, C., Denis-Galeraud, I., Bilinska, B., & Bourguiba,

S. (2003). Aromatase expression and role of estrogens in male gonad: a review.

Reprod Biol Endocrinol, 1, 35.

Cartinella, J. L., Cath, T. Y., Flynn, M. T., Miller, G. C., Hunter, K. W., Jr., &

Childress, A. E. (2006). Removal of natural steroid hormones from wastewater

using membrane contactor processes. Environ Sci Technol, 40(23), 7381-7386.

Centenera, M. M., Harris, J. M., Tilley, W. D., & Butler, L. M. (2008). The contribution

of different androgen receptor domains to receptor dimerization and signaling.

Mol Endocrinol, 22(11), 2373-2382.

Chang, C., Chen, Y. T., Yeh, S. D., Xu, Q., Wang, R. S., Guillou, F., et al. (2004).

Infertility with defective spermatogenesis and hypotestosteronemia in male mice

lacking the androgen receptor in Sertoli cells. Proc Natl Acad Sci U S A,

101(18), 6876-6881.

Chapin, R. E., Stevens, J. T., Hughes, C. L., Kelce, W. R., Hess, R. A., & Daston, G. P.

(1996). Endocrine modulation of reproduction. Fundam Appl Toxicol, 29(1), 1-

17.

Christenson, L. K., & Strauss, J. F., 3rd. (2000). Steroidogenic acute regulatory protein

(StAR) and the intramitochondrial translocation of cholesterol. Biochim Biophys

Acta, 1529(1-3), 175-187.

Christl, H. W. (1990). The lamina propria of vertebrate seminiferous tubules: a

comparative light and electron microscopic investigation. Andrologia, 22(1), 85-

94.

Claessens, F., Denayer, S., Van Tilborgh, N., Kerkhofs, S., Helsen, C., & Haelens, A.

(2008). Diverse roles of androgen receptor (AR) domains in AR-mediated

signaling. Nucl Recept Signal, 6, e008.

Clark, H. A., & Snedeker, S. M. (2005). Critical evaluation of the cancer risk of

dibromochloropropane (DBCP). J Environ Sci Health C Environ Carcinog

Ecotoxicol Rev, 23(2), 215-260.

Clermont, Y. (1972). Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium

cycle and spermatogonial renewal. Physiol Rev, 52(1), 198-236.

Connor, K., Howell, J., Chen, I., Liu, H., Berhane, K., Sciarretta, C., et al. (1996).

Failure of chloro-S-triazine-derived compounds to induce estrogen receptor-

mediated responses in vivo and in vitro. Fundam Appl Toxicol, 30(1), 93-101.


43

Cornwall, G. A. (2009). New insights into epididymal biology and function. Hum

Reprod Update, 15(2), 213-227.

Correia, F. V., Macrae, A., Guilherme, L. R., & Langenbach, T. (2007). Atrazine

sorption and fate in a Ultisol from humid tropical Brazil. Chemosphere, 67(5),

847-854.

Crain, D. A., Guillette, L. J., Jr., Rooney, A. A., & Pickford, D. B. (1997). Alterations

in steroidogenesis in alligators (Alligator mississippiensis) exposed naturally

and experimentally to environmental contaminants. Environ Health Perspect,

105(5), 528-533.

d'Anglemont de Tassigny, X., Fagg, L. A., Dixon, J. P., Day, K., Leitch, H. G.,

Hendrick, A. G., et al. (2007). Hypogonadotropic hypogonadism in mice lacking

a functional Kiss1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(25), 10714-10719.

Danielian, P. S., White, R., Lees, J. A., & Parker, M. G. (1992). Identification of a

conserved region required for hormone dependent transcriptional activation by

steroid hormone receptors. Embo J, 11(3), 1025-1033.

Danzo, B. J. (1997). Environmental xenobiotics may disrupt normal endocrine function

by interfering with the binding of physiological ligands to steroid receptors and

binding proteins. Environ Health Perspect, 105(3), 294-301.

De Gendt, K., Swinnen, J. V., Saunders, P. T., Schoonjans, L., Dewerchin, M., Devos,

A., et al. (2004). A Sertoli cell-selective knockout of the androgen receptor

causes spermatogenic arrest in meiosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 101(5), 1327-

1332.

De Jong, F. M., & De Snoo, G. R. (2001). Pesticide residues in human food and wildlife

in The Netherlands. Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet,

66(2b), 815-822.

de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C., Matsuda, F., Chaussain, J. L., & Milgrom, E.

(2003). Hypogonadotropic hypogonadism due to loss of function of the KiSS1-

derived peptide receptor GPR54. Proc Natl Acad Sci U S A, 100(19), 10972-

10976.

Degen, G. H., & Bolt, H. M. (2000). Endocrine disruptors: update on xenoestrogens. Int

Arch Occup Environ Health, 73(7), 433-441.

Denolet, E., De Gendt, K., Allemeersch, J., Engelen, K., Marchal, K., Van Hummelen,

P., et al. (2006). The effect of a Sertoli cell-selective knockout of the androgen


44

receptor on testicular gene expression in prepubertal mice. Mol Endocrinol,

20(2), 321-334.

Diamanti-Kandarakis, E., Bourguignon, J. P., Giudice, L. C., Hauser, R., Prins, G. S.,

Soto, A. M., et al. (2009). Endocrine-disrupting chemicals: an Endocrine Society

scientific statement. Endocr Rev, 30(4), 293-342.

Dupont, E., Rheaume, E., Simard, J., Luu-The, V., Labrie, F., & Pelletier, G. (1991).

Ontogenesis of 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4 isomerase

in the rat adrenal as revealed by immunocytochemistry and in situ hybridization.

Endocrinology, 129(5), 2687-2692.

Dym, M. (1976). The mammalian rete testis--a morphological examination. Anat Rec,

186(4), 493-523.

Dym, M. (1988) The Male Reproductive System. In: Cell and Tissue Biology – A

Textbook of Histology (Weiss, L. Eds.) Baltimore, Urban & Schwarzenberg,

931-972.

Fan, W., Yanase, T., Morinaga, H., Gondo, S., Okabe, T., Nomura, M., et al. (2007).

Herbicide atrazine activates SF-1 by direct affinity and concomitant co-

activators recruitments to induce aromatase expression via promoter II. Biochem

Biophys Res Commun, 355(4), 1012-1018.

Fan, W., Yanase, T., Morinaga, H., Gondo, S., Okabe, T., Nomura, M., et al. (2007).

Atrazine-induced aromatase expression is SF-1 dependent: implications for

endocrine disruption in wildlife and reproductive cancers in humans. Environ

Health Perspect, 115(5), 720-727.

Fawcett, D. W., Neaves, W. B., & Flores, M. N. (1973). Comparative observations on

intertubular lymphatics and the organization of the interstitial tissue of the

mammalian testis. Biol Reprod, 9(5), 500-532.

Fisher, J. S. (2004). Environmental anti-androgens and male reproductive health: focus

on phthalates and testicular dysgenesis syndrome. Reproduction, 127(3), 305-

315.

Fisher, J. S., Turner, K. J., Brown, D., & Sharpe, R. M. (1999). Effect of neonatal

exposure to estrogenic compounds on development of the excurrent ducts of the

rat testis through puberty to adulthood. Environ Health Perspect, 107(5), 397-

405.


45

França, L. R. & Russel, L. D. (1998) The Testis of domestic mammals. In: Male

Reproduction (Matínez-García, F. & Regadera, J. Eds.) Madrid, Churchill

Communications Europe España, 197-219.

Friedmann, A. S. (2002). Atrazine inhibition of testosterone production in rat males

following peripubertal exposure. Reprod Toxicol, 16(3), 275-279.

Frye, C. A., Koonce, C. J., Edinger, K. L., Osborne, D. M., & Walf, A. A. (2008).

Androgens with activity at estrogen receptor beta have anxiolytic and cognitive-

enhancing effects in male rats and mice. Horm Behav, 54(5), 726-734.

Gnessi, L., Fabbri, A., & Spera, G. (1997). Gonadal peptides as mediators of

development and functional control of the testis: an integrated system with

hormones and local environment. Endocr Rev, 18(4), 541-609.

Gray, L. E., Jr. (1998). Xenoendocrine disrupters: laboratory studies on male

reproductive effects. Toxicol Lett, 102-103, 331-335.

Gray, L. E., Jr., Ostby, J. S., & Kelce, W. R. (1994). Developmental effects of an

environmental antiandrogen: the fungicide vinclozolin alters sex differentiation

of the male rat. Toxicol Appl Pharmacol, 129(1), 46-52.

Guo, Y. L., Lambert, G. H., & Hsu, C. C. (1995). Growth abnormalities in the

population exposed in utero and early postnatally to polychlorinated biphenyls

and dibenzofurans. Environ Health Perspect, 103 Suppl 6, 117-122.

Hales, D. B., Sha, L. L., & Payne, A. H. (1987). Testosterone inhibits cAMP-induced de

Novo synthesis of Leydig cell cytochrome P-450(17 alpha) by an androgen

receptor-mediated mechanism. J Biol Chem, 262(23), 11200-11206.

Han, S. K., Gottsch, M. L., Lee, K. J., Popa, S. M., Smith, J. T., Jakawich, S. K., et al.

(2005). Activation of gonadotropin-releasing hormone neurons by kisspeptin as

a neuroendocrine switch for the onset of puberty. J Neurosci, 25(49), 11349-

11356.

Handa, R. J., Weiser, M. J., & Zuloaga, D. G. (2009). A role for the androgen

metabolite, 5alpha-androstane-3beta,17beta-diol, in modulating oestrogen

receptor beta-mediated regulation of hormonal stress reactivity. J

Neuroendocrinol, 21(4), 351-358.

Hany, J., Lilienthal, H., Sarasin, A., Roth-Harer, A., Fastabend, A., Dunemann, L., et al.

(1999). Developmental exposure of rats to a reconstituted PCB mixture or

aroclor 1254: effects on organ weights, aromatase activity, sex hormone levels,

and sweet preference behavior. Toxicol Appl Pharmacol, 158(3), 231-243.


46

Hardy, M. P., Kelce, W. R., Klinefelter, G. R., & Ewing, L. L. (1990). Differentiation of

Leydig cell precursors in vitro: a role for androgen. Endocrinology, 127(1), 488-

490.

Hayes, T. B., Case, P., Chui, S., Chung, D., Haeffele, C., Haston, K., et al. (2006).

Pesticide mixtures, endocrine disruption, and amphibian declines: are we

underestimating the impact? Environ Health Perspect, 114 Suppl 1, 40-50.

Hayes, T. B., Collins, A., Lee, M., Mendoza, M., Noriega, N., Stuart, A. A., et al.

(2002). Hermaphroditic, demasculinized frogs after exposure to the herbicide

atrazine at low ecologically relevant doses. Proc Natl Acad Sci U S A, 99(8),

5476-5480.

Hedger, M. P. (1997). Testicular leukocytes: what are they doing? Rev Reprod, 2(1), 38-

47.

Heneweer, M., van den Berg, M., & Sanderson, J. T. (2004). A comparison of human

H295R and rat R2C cell lines as in vitro screening tools for effects on

aromatase. Toxicol Lett, 146(2), 183-194.

Hess, R. A. (1998). Effects of environmental toxicants on the efferent ducts, epididymis

and fertility. J Reprod Fertil (Suppl), 53, 247-259.

Hess, R. A. (2000). Oestrogen in fluid transport in efferent ducts of the male

reproductive tract. Rev Reprod, 5(2), 84-92.

Hess, R. A. (2003). Estrogen in the adult male reproductive tract: a review. Reprod Biol

Endocrinol, 1, 52.

Hess, R. A., Bunick, D., Lee, K. H., Bahr, J., Taylor, J. A., Korach, K. S., et al. (1997).

A role for oestrogens in the male reproductive system. Nature, 390(6659), 509-

512.

Hess, R. A., & Nakai, M. (2000). Histopathology of the male reproductive system

induced by the fungicide benomyl. Histol Histopathol, 15(1), 207-224.

Hess, R. A. & França, L. R. (2007) Spermatogenesis and Cycle of the Seminiferous

Epithelium. In: Molecular Mechanisms in Spermatogenesis, (Cheng, C.Y. Eds).

Landes Bioscience.

Hiipakka, R. A., & Liao, S. (1998). Molecular mechanism of androgen action. Trends

Endocrinol Metab, 9(8), 317-324.

Holloway, A. C., Anger, D. A., Crankshaw, D. J., Wu, M., & Foster, W. G. (2008).

Atrazine-induced changes in aromatase activity in estrogen sensitive target

tissues. J Appl Toxicol, 28(3), 260-270.


47

Hotchkiss, A. K., Rider, C. V., Blystone, C. R., Wilson, V. S., Hartig, P. C., Ankley, G.

T., et al. (2008). Fifteen years after "Wingspread"--environmental endocrine

disrupters and human and wildlife health: where we are today and where we

need to go. Toxicol Sci, 105(2), 235-259.

IBGE,(2007) Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística; Levantamento Sistemático

da Produção Agrícola.

Jeyaraj, D. A., Grossman, G., & Petrusz, P. (2005). Altered bioavailability of

testosterone in androgen-binding protein-transgenic mice. Steroids, 70(10), 704-

714.

Jobling, S., Beresford, N., Nolan, M., Rodgers-Gray, T., Brighty, G. C., Sumpter, J. P.,

et al. (2002). Altered sexual maturation and gamete production in wild roach

(Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents. Biol

Reprod, 66(2), 272-281.

Keen, K. L., Wegner, F. H., Bloom, S. R., Ghatei, M. A., & Terasawa, E. (2008). An

increase in kisspeptin-54 release occurs with the pubertal increase in luteinizing

hormone-releasing hormone-1 release in the stalk-median eminence of female

rhesus monkeys in vivo. Endocrinology, 149(8), 4151-4157.

Kerkhofs, S., Denayer, S., Haelens, A., & Claessens, F. (2009). Androgen receptor

knockout and knock-in mouse models. J Mol Endocrinol, 42(1), 11-17.

Kerr, J. B., Loveland, K. L., O'Bryan, M. K., Kretser D. M. (2006) Cytology of the

Testis and Intrinsic Control Mechanisms. In: Knobil and Neill's Physiology of

Reproduction (Neill, J. D., Plant, T. M., Pfaff, D. W., Challis, J. R.G., F.R.S.C.,

Kretser, D.M., A.O., Richards, J. S., and Wassarman, P. M., Eds) New York,

Raven Press, 827-947.

Kniewald, J., Jakominic, M., Tomljenovic, A., Simic, B., Romac, P., Vranesic, D., et al.

(2000). Disorders of male rat reproductive tract under the influence of atrazine. J

Appl Toxicol, 20(1), 61-68.

Kortenkamp, A. (2008). Low dose mixture effects of endocrine disrupters: implications

for risk assessment and epidemiology. Int J Androl, 31(2), 233-240.

Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., & Roy, P. (2009). Alteration of testicular

steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated

with triclosan. Reprod Toxicol, 27(2), 177-185.

Lanzino, M., Catalano, S., Genissel, C., Ando, S., Carreau, S., Hamra, K., et al. (2001).

Aromatase messenger RNA is derived from the proximal promoter of the


48

aromatase gene in Leydig, Sertoli, and germ cells of the rat testis. Biol Reprod,

64(5), 1439-1443.

Lavery, D. N., & McEwan, I. J. (2005). Structure and function of steroid receptor AF1

transactivation domains: induction of active conformations. Biochem J, 391(Pt

3), 449-464.

Laws, S. C., Hotchkiss, M., Ferrell, J., Jayaraman, S., Mills, L., Modic, W., et al.

(2009). Chlorotriazine herbicides and metabolites activate an ACTH-dependent

release of corticosterone in male Wistar rats. Toxicol Sci, 112(1):78-87.

Leblond, C. P., & Clermont, Y. (1952). Definition of the stages of the cycle of the

seminiferous epithelium in the rat. Ann N Y Acad Sci, 55(4), 548-573.

Lee, D. K., Nguyen, T., O'Neill, G. P., Cheng, R., Liu, Y., Howard, A. D., et al. (1999).

Discovery of a receptor related to the galanin receptors. FEBS Lett, 446(1), 103-

107.

Lenkowski, J. R., Reed, J. M., Deininger, L., & McLaughlin, K. A. (2008). Perturbation

of organogenesis by the herbicide atrazine in the amphibian Xenopus laevis.

Environ Health Perspect, 116(2), 223-230.

Liang, J. H., Sankai, T., Yoshida, T., Cho, F., & Yoshikawa, Y. (1999). Localization of

immunoreactive testosterone and 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-

delta4 isomerase in cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) testes during

postnatal development. J Med Primatol, 28(2), 62-66.

Lu, C., Fenske, R. A., Simcox, N. J., & Kalman, D. (2000). Pesticide exposure of

children in an agricultural community: evidence of household proximity to

farmland and take home exposure pathways. Environ Res, 84(3), 290-302.

Maekawa, M., Kamimura, K., & Nagano, T. (1996). Peritubular myoid cells in the

testis: their structure and function. Arch Histol Cytol, 59(1), 1-13.

Mann, T. (1974). Secretory function of the prostate, seminal vesicle and other male

accessory organs of reproduction. J Reprod Fertil, 37(1), 179-188.

Manske, M. K., Beltz, L. A., & Dhanwada, K. R. (2004). Low-level atrazine exposure

decreases cell proliferation in human fibroblasts. Arch Environ Contam Toxicol,

46(4), 438-444.

McCoy, K. A., Bortnick, L. J., Campbell, C. M., Hamlin, H. J., Guillette, L. J., & St

Mary, C. M. (2008). Agriculture alters gonadal form and function in the toad

Bufo marinus. Environ Health Perspect, 116(11), 1526-1532.


49

McKinlay, R., Plant, J. A., Bell, J. N., & Voulvoulis, N. (2008). Calculating human

exposure to endocrine disrupting pesticides via agricultural and non-agricultural

exposure routes. Sci Total Environ, 398(1-3), 1-12.

McKinnell, C., Atanassova, N., Williams, K., Fisher, J. S., Walker, M., Turner, K. J., et

al. (2001). Suppression of androgen action and the induction of gross

abnormalities of the reproductive tract in male rats treated neonatally with

diethylstilbestrol. J Androl, 22(2), 323-338.

Means, A. R., Dedman, J. R., Tash, J. S., Tindall, D. J., van Sickle, M., & Welsh, M. J.

(1980). Regulation of the testis Sertoli cell by follicle stimulating hormone.

Annu Rev Physiol, 42, 59-70.

Mendis-Handagama, S. M., & Ariyaratne, H. B. (2001). Differentiation of the adult

Leydig cell population in the postnatal testis. Biol Reprod, 65(3), 660-671.

Mills, L. J., & Chichester, C. (2005). Review of evidence: are endocrine-disrupting

chemicals in the aquatic environment impacting fish populations? Sci Total

Environ, 343(1-3), 1-34.

Mills, P. K. (1998). Correlation analysis of pesticide use data and cancer incidence rates

in California countries. Arch Environ Health, 53(6), 410-413.

Muir, A. I., Chamberlain, L., Elshourbagy, N. A., Michalovich, D., Moore, D. J.,

Calamari, A., et al. (2001). AXOR12, a novel human G protein-coupled

receptor, activated by the peptide KiSS-1. J Biol Chem, 276(31), 28969-28975.

Nakai, M., Hess, R. A., Moore, B. J., Guttroff, R. F., Strader, L. F., & Linder, R. E.

(1992). Acute and long-term effects of a single dose of the fungicide

carbendazim (methyl 2-benzimidazole carbamate) on the male reproductive

system in the rat. J Androl, 13(6), 507-518.

Navarro, V. M., Castellano, J. M., Fernandez-Fernandez, R., Barreiro, M. L., Roa, J.,

Sanchez-Criado, J. E., et al. (2004). Developmental and hormonally regulated

messenger ribonucleic acid expression of KiSS-1 and its putative receptor,

GPR54, in rat hypothalamus and potent luteinizing hormone-releasing activity

of KiSS-1 peptide. Endocrinology, 145(10), 4565-4574.

O'Donnell, L., Robertson, K. M., Jones, M. E., & Simpson, E. R. (2001). Estrogen and

spermatogenesis. Endocr Rev, 22(3), 289-318.

Oka, T., Tooi, O., Mitsui, N., Miyahara, M., Ohnishi, Y., Takase, M., et al. (2008).

Effect of atrazine on metamorphosis and sexual differentiation in Xenopus

laevis. Aquat Toxicol, 87(4), 215-226.


50

Oliveira, A. G., Coelho, P. H., Guedes, F. D., Mahecha, G. A., Hess, R. A., & Oliveira,

C. A. (2007). 5alpha-Androstane-3beta,17beta-diol (3beta-diol), an estrogenic

metabolite of 5alpha-dihydrotestosterone, is a potent modulator of estrogen

receptor ERbeta expression in the ventral prostrate of adult rats. Steroids,

72(14), 914-922.

Oliveira, A. G., Telles, L. F., Hess, R. A., Mahecha, G. A., & Oliveira, C. A. (2007).

Effects of the herbicide Roundup on the epididymal region of drakes Anas

platyrhynchos. Reprod Toxicol, 23(2), 182-191.

Oliveira, C. A., Carnes, K., Franca, L. R., & Hess, R. A. (2001). Infertility and testicular

atrophy in the antiestrogen-treated adult male rat. Biol Reprod, 65(3), 913-920.

Oliveira, C. A., Mahecha, G. A., Carnes, K., Prins, G. S., Saunders, P. T., Franca, L. R.,

et al. (2004). Differential hormonal regulation of estrogen receptors ERalpha and

ERbeta and androgen receptor expression in rat efferent ductules. Reproduction,

128(1), 73-86.

Oliveira, C. A., Zhou, Q., Carnes, K., Nie, R., Kuehl, D. E., Jackson, G. L., et al.

(2002). ER Function in the Adult Male Rat: Short- and Long-Term Effects of

the Antiestrogen ICI 182,780 on the Testis and Efferent Ductules, without

Changes in Testosterone. Endocrinology, 143(6), 2399-2409.

Oliveira, R. L., Oliveira, A. G., Mahecha, G. A., Nogueira, J. C., & Oliveira, C. A.

(2009). Distribution of estrogen receptors (ERalpha and ERbeta) and androgen

receptor in the testis of big fruit-eating bat Artibeus lituratus is cell- and stage-

specific and increases during gonadal regression. Gen Comp Endocrinol, 161(2),

283-292.

Parks, L. G., Ostby, J. S., Lambright, C. R., Abbott, B. D., Klinefelter, G. R., Barlow,

N. J., et al. (2000). The plasticizer diethylhexyl phthalate induces malformations

by decreasing fetal testosterone synthesis during sexual differentiation in the

male rat. Toxicol Sci, 58(2), 339-349.

Payne, J., Scholze, M., & Kortenkamp, A. (2001). Mixtures of four organochlorines

enhance human breast cancer cell proliferation. Environ Health Perspect,

109(4), 391-397.

Payne, A. H. & O’Shaughnessy (1996) Structure, Function and Regulation of

Steroidogenic Enzymes in the Leydig Cell. In: The Leydig Cell (Payne, A. H.,

Hardy, M. P., Russel, L. D. Eds.) Cache River Press, 259-286.


51

Pelletier, G., Li, S., Luu-The, V., Tremblay, Y., Belanger, A., & Labrie, F. (2001).

Immunoelectron microscopic localization of three key steroidogenic enzymes

(cytochrome P450(scc), 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase and cytochrome

P450(c17)) in rat adrenal cortex and gonads. J Endocrinol, 171(2), 373-383.

Picciarelli-Lima, P., Oliveira, A. G., Reis, A. M., Kalapothakis, E., Mahecha, G. A.,

Hess, R. A., et al. (2006). Effects of 3-beta-diol, an androgen metabolite with

intrinsic estrogen-like effects, in modulating the aquaporin-9 expression in the

rat efferent ductules. Reprod Biol Endocrinol, 4, 51.

Pogrmic, K., Fa, S., Dakic, V., Kaisarevic, S., & Kovacevic, R. (2009). Atrazine oral

exposure of peripubertal male rats downregulates steroidogenesis gene

expression in Leydig cells. Toxicol Sci, 111(1), 189-197.

Powers Fraites, M. J., Cooper, R. L., Buckalew, A., Jayaraman, S., Mills, L., & Laws,

S. C. (2009). Characterization of the Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis

Response to Atrazine and Metabolites in the Female Rat. Toxicol Sci, 112(1):88-

99.

Reeder, A. L., Ruiz, M. O., Pessier, A., Brown, L. E., Levengood, J. M., Phillips, C. A.,

et al. (2005). Intersexuality and the cricket frog decline: historic and geographic

trends. Environ Health Perspect, 113(3), 261-265.

Rey, F., Gonzalez, M., Zayas, M. A., Stoker, C., Durando, M., Luque, E. H., et al.

(2009). Prenatal exposure to pesticides disrupts testicular histoarchitecture and

alters testosterone levels in male Caiman latirostris. Gen Comp Endocrinol,

162(3), 286-292.

Risbridger G. P., & Taylor R. A. (2006). Physiology of the Male Accessory Sex

Structures: The Prostate Gland, Seminal Vesicles, and Bulbourethral Glands. In:

Knobil and Neill's Physiology of Reproduction (Neill, J. D., Plant, T. M., Pfaff,

D. W., Challis, J. R.G., F.R.S.C., Kretser, D.M., A.O., Richards, J. S., and

Wassarman, P. M., Eds) New York, Raven Press, 1149-1172.

Roa, J., Castellano, J. M., Navarro, V. M., Handelsman, D. J., Pinilla, L., & Tena-

Sempere, M. (2009). Kisspeptins and the control of gonadotropin secretion in

male and female rodents. Peptides, 30(1), 57-66.

Roberge, M., Hakk, H., & Larsen, G. (2004). Atrazine is a competitive inhibitor of

phosphodiesterase but does not affect the estrogen receptor. Toxicol Lett, 154(1-

2), 61-68.


52

Robertson, K. M., O'Donnell, L., Jones, M. E., Meachem, S. J., Boon, W. C., Fisher, C.

R., et al. (1999). Impairment of spermatogenesis in mice lacking a functional

aromatase (cyp 19) gene. Proc Natl Acad Sci U S A, 96(14), 7986-7991.

Romano, F., Tripiciano, A., Muciaccia, B., De Cesaris, P., Ziparo, E., Palombi, F., et al.

(2005). The contractile phenotype of peritubular smooth muscle cells is locally

controlled: possible implications in male fertility. Contraception, 72(4), 294-

297.

Roseweir, A. K., & Millar, R. P. (2009). The role of kisspeptin in the control of

gonadotrophin secretion. Hum Reprod Update, 15(2), 203-212.

Roy, A. K., Tyagi, R. K., Song, C. S., Lavrovsky, Y., Ahn, S. C., Oh, T. S., et al.

(2001). Androgen receptor: structural domains and functional dynamics after

ligand-receptor interaction. Ann N Y Acad Sci, 949, 44-57.

Russel, L. D., Ettlin, R. A., Hikim, A. P. S., Clegg, E. D. (1990) Mammalian

Spermatogenesis. In: Histological and Histopathological Evaluation of the Testis

(Eds) Cache River Press, 1-40.

Sanderson, J. T., Boerma, J., Lansbergen, G. W., & van den Berg, M. (2002). Induction

and inhibition of aromatase (CYP19) activity by various classes of pesticides in

H295R human adrenocortical carcinoma cells. Toxicol Appl Pharmacol, 182(1),

44-54.

Sanderson, J. T., Letcher, R. J., Heneweer, M., Giesy, J. P., & van den Berg, M. (2001).

Effects of chloro-s-triazine herbicides and metabolites on aromatase activity in

various human cell lines and on vitellogenin production in male carp

hepatocytes. Environ Health Perspect, 109(10), 1027-1031.

Sanderson, J. T., Seinen, W., Giesy, J. P., & van den Berg, M. (2000). 2-Chloro-s-

triazine herbicides induce aromatase (CYP19) activity in H295R human

adrenocortical carcinoma cells: a novel mechanism for estrogenicity? Toxicol

Sci, 54(1), 121-127.

Saradha, B., Vaithinathan, S., & Mathur, P. P. (2008). Single exposure to low dose of

lindane causes transient decrease in testicular steroidogenesis in adult male

Wistar rats. Toxicology, 244(2-3), 190-197.

Sass, J. B., & Colangelo, A. (2006). European Union bans atrazine, while the United

States negotiates continued use. Int J Occup Environ Health, 12(3), 260-267.


53

Schulte, D. M., Shapiro, I., Reincke, M., & Beuschlein, F. (2007). Expression and

spatio-temporal distribution of differentiation and proliferation markers during

mouse adrenal development. Gene Expr Patterns, 7(1-2), 72-81.

Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E., Thresher, R. R., Acierno, J. S., Jr.,

Shagoury, J. K., et al. (2003). The GPR54 gene as a regulator of puberty. N Engl

J Med, 349(17), 1614-1627.

Setchell, B. P. & Breed, W.G. (2006) Anatomy, vasculature and innervation of the male

reproductive tract. In: Knobil and Neill's Physiology of Reproduction (Neill, J.

D., Plant, T. M., Pfaff, D. W., Challis, J. R.G., F.R.S.C., Kretser, D.M., A.O.,

Richards, J. S., and Wassarman, P. M., Eds) New York, Raven Press, 771-825.

Shan, L. X., Zhu, L. J., Bardin, C. W., & Hardy, M. P. (1995). Quantitative analysis of

androgen receptor messenger ribonucleic acid in developing Leydig cells and

Sertoli cells by in situ hybridization. Endocrinology, 136(9), 3856-3862.

Sharpe, R. M., Fisher, J. S., Millar, M. M., Jobling, S., & Sumpter, J. P. (1995).

Gestational and lactational exposure of rats to xenoestrogens results in reduced

testicular size and sperm production. Environ Health Perspect, 103(12), 1136-

1143.

Shibayama, H., Kotera, T., Shinoda, Y., Hanada, T., Kajihara, T., Ueda, M., et al.

(2009). Collaborative work on evaluation of ovarian toxicity. 14) Two- or four-

week repeated-dose studies and fertility study of atrazine in female rats. J

Toxicol Sci, 34 Suppl 1, SP147-155.

Simard, J., Ricketts, M. L., Gingras, S., Soucy, P., Feltus, F. A., & Melner, M. H.

(2005). Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-

delta4 isomerase gene family. Endocr Rev, 26(4), 525-582.

SINDAG, (2007) Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Defesa Agrícola ,

Dados de Mercado.

Skakkebaek, N. E., Rajpert-De Meyts, E., & Main, K. M. (2001). Testicular dysgenesis

syndrome: an increasingly common developmental disorder with environmental

aspects. Hum Reprod, 16(5), 972-978.

Smith, J. T., Dungan, H. M., Stoll, E. A., Gottsch, M. L., Braun, R. E., Eacker, S. M., et

al. (2005). Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids

in the brain of the male mouse. Endocrinology, 146(7), 2976-2984.

Spano, L., Tyler, C. R., van Aerle, R., Devos, P., Mandiki, S. N., Silvestre, F., et al.

(2004). Effects of atrazine on sex steroid dynamics, plasma vitellogenin


54

concentration and gonad development in adult goldfish (Carassius auratus).

Aquat Toxicol, 66(4), 369-379.

Stocco, D. M. (2000). The role of the StAR protein in steroidogenesis: challenges for

the future. J Endocrinol, 164(3), 247-253.

Stocco, D. M., McPhaul, M. J. (2006) Physiology of Testicular Steroidogenesis. In:

Knobil and Neill's Physiology of Reproduction (Neill, J. D., Plant, T. M., Pfaff,

D. W., Challis, J. R.G., F.R.S.C., Kretser, D.M., A.O., Richards, J. S., and

Wassarman, P. M., Eds) New York, Raven Press, 977-1016.

Stoker, C., Beldomenico, P. M., Bosquiazzo, V. L., Zayas, M. A., Rey, F., Rodriguez,

H., et al. (2008). Developmental exposure to endocrine disruptor chemicals

alters follicular dynamics and steroid levels in Caiman latirostris. Gen Comp

Endocrinol, 156(3), 603-612.

Stoker, T. E., Guidici, D. L., Laws, S. C., & Cooper, R. L. (2002). The effects of

atrazine metabolites on puberty and thyroid function in the male Wistar rat.

Toxicol Sci, 67(2), 198-206.

Stoker, T. E., Laws, S. C., Guidici, D. L., & Cooper, R. L. (2000). The effect of atrazine

on puberty in male wistar rats: an evaluation in the protocol for the assessment

of pubertal development and thyroid function. Toxicol Sci, 58(1), 50-59.

Strauss, J. F., & Penning, T. M. (1999) Synthesis of the sex steroid hormones:

molecular and structural biology with applications to clinical practice. In:

Molecular Biology in Reproductive Medicine (Fauser, B. C. J. M. Eds) New

York, Parthenon Publishing, 201-232

Sun, Y., Tian, Z., Zhao, H., Wong, S. T., & Chen, B. (2007). Characteristic of

hypothalamic kisspeptin expression in the pubertal development of precocious

female rats. Neurosci Lett, 420(1), 12-17.

Suzawa, M., & Ingraham, H. A. (2008). The herbicide atrazine activates endocrine gene

networks via non-steroidal NR5A nuclear receptors in fish and mammalian cells.

PLoS ONE, 3(5), e2117.

Swan, S. H. (2006). Semen quality in fertile US men in relation to geographical area

and pesticide exposure. Int J Androl, 29(1), 62-68; discussion 105-108.

Swedenborg, E., Ruegg, J., Makela, S., & Pongratz, I. (2009). Endocrine disruptive

chemicals: mechanisms of action and involvement in metabolic disorders. J Mol

Endocrinol, 43(1), 1-10.


55

Tennant, M. K., Hill, D. S., Eldridge, J. C., Wetzel, L. T., Breckenridge, C. B., &

Stevens, J. T. (1994). Possible antiestrogenic properties of chloro-s-triazines in

rat uterus. J Toxicol Environ Health, 43(2), 183-196.

Toppari, J. (2008). Environmental endocrine disrupters. Sex Dev, 2(4-5), 260-267.

Traghetta, D.G., Vaz, C.M.P., Machado, S.A.S., Crestana, S., Vieira, E.M., Martin-

Neto, L. (1996). Mecanismos de Sorção da Atrazina em Solos: Estudos

Espectroscópicos e Polarográficos. Comunicado Técnico EMBRAPA, No 14, 1-

7.

Trentacoste, S. V., Friedmann, A. S., Youker, R. T., Breckenridge, C. B., & Zirkin, B.

R. (2001). Atrazine effects on testosterone levels and androgen-dependent

reproductive organs in peripubertal male rats. J Androl, 22(1), 142-148.

Tyagi, R. K., Lavrovsky, Y., Ahn, S. C., Song, C. S., Chatterjee, B., & Roy, A. K.

(2000). Dynamics of intracellular movement and nucleocytoplasmic recycling of

the ligand-activated androgen receptor in living cells. Mol Endocrinol, 14(8),

1162-1174.

Vaithinathan, S., Saradha, B., & Mathur, P. P. (2008). Transient inhibitory effect of

methoxychlor on testicular steroidogenesis in rat: an in vivo study. Arch Toxicol,

82(11), 833-839.

Verhoeven, G., Hoeben, E., & De Gendt, K. (2000). Peritubular cell-Sertoli cell

interactions: factors involved in PmodS activity. Andrologia, 32(1), 42-45.

Virtanen, H. E., Rajpert-De Meyts, E., Main, K. M., Skakkebaek, N. E., & Toppari, J.

(2005). Testicular dysgenesis syndrome and the development and occurrence of

male reproductive disorders. Toxicol Appl Pharmacol, 207(2 Suppl), 501-505.

Vornberger, W., Prins, G., Musto, N. A., & Suarez-Quian, C. A. (1994). Androgen

receptor distribution in rat testis: new implications for androgen regulation of

spermatogenesis. Endocrinology, 134(5), 2307-2316.

Wetzel, L. T., Luempert, L. G., 3rd, Breckenridge, C. B., Tisdel, M. O., Stevens, J. T.,

Thakur, A. K., et al. (1994). Chronic effects of atrazine on estrus and mammary

tumor formation in female Sprague-Dawley and Fischer 344 rats. J Toxicol

Environ Health, 43(2), 169-182.

Winchester, P. D., Huskins, J., & Ying, J. (2009). Agrichemicals in surface water and

birth defects in the United States. Acta Paediatr, 98(4), 664-669.


56

Xu, Q., Lin, H. Y., Yeh, S. D., Yu, I. C., Wang, R. S., Chen, Y. T., et al. (2007).

Infertility with defective spermatogenesis and steroidogenesis in male mice

lacking androgen receptor in Leydig cells. Endocrine, 32(1), 96-106.

Yeh, S., Tsai, M. Y., Xu, Q., Mu, X. M., Lardy, H., Huang, K. E., et al. (2002).

Generation and characterization of androgen receptor knockout (ARKO) mice:

an in vivo model for the study of androgen functions in selective tissues. Proc

Natl Acad Sci U S A, 99(21), 13498-13503.

Zhang, C., Yeh, S., Chen, Y. T., Wu, C. C., Chuang, K. H., Lin, H. Y., et al. (2006).

Oligozoospermia with normal fertility in male mice lacking the androgen

receptor in testis peritubular myoid cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 103(47),

17718-17723.

Zhu, L. J., Hardy, M. P., Inigo, I. V., Huhtaniemi, I., Bardin, C. W., & Moo-Young, A.

J. (2000). Effects of androgen on androgen receptor expression in rat testicular

and epididymal cells: a quantitative immunohistochemical study. Biol Reprod,

63(2), 368-376.

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