31.03.2017

1

ØRJAN SAMUELSEN, PROF. PHDNASJONAL KOMPETANSETJENESTE FOR PÅVISNING AV ANTIBIOTIKARESISTENS (K-res)

UNIVERSITETSSYKEHUSET NORD-NORGEFORSKNINGSGRUPPE I MIKROBIELL FARMAKOLOGI OG POPULASJONSBIOLOGI (MICROPOP)

UIT – NORGES ARKTISKE UNIVERSITETE-post: orjan.samuelsen@unn.no

HELGENOMSEKVENSERING/HURTIGDIAGNOSTIKK – PÅVISNING AV ANTIBIOTIKARESISTENS

BIOINGENIØRDAGEN 2017: ANTIBIOTIKARESISTENS

TROMSØ 29.03.2017

AGENDA

• Hvorfor hurtigdiagnostikk?

• Mulige tilnærmingsmåter:

• Ny teknologi

• Endret bruk av dagens teknologi

• Helgenomsekvensering

31.03.2017

2

• Tidlig effektiv antibiotikabehandling viktig for overlevelse

• Redusert/bedre bruk av antibiotika

HVORFOR?

Kumar A et al. Crit Care Med 2006

Sterling SA et al. Crit Care Med 2015

http://ec.europa.eu/research/horizonprize/index.cfm?prize=better-use-antibiotics

Smalspektredevs.

bredspektrede

DAGENS ARBEIDSFLYT

31.03.2017

3

NY TEKNOLOGI?• Mikroskopi enkeltceller (3-4 timer)

Choi J et al. Sci Transl Med 2014

• Elektrokjemisk profilering/nanoteknologi (1 time)

Besant JD et al. Lab Chip 2015

DIREKTE/RASKERE RESISTENSTESTING?

18-24t 18-20t

8t?

6t?

10t?

31.03.2017

4

DIREKTE RESISTENSTESTING

• 98,9 % overenstemmelseMaelegheer K et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017 Sundqvist M et al. APMIS 2015

• Konfluerende vekst i 81 %

• “safe to use D-AST on samples with confluent growth of E. coli and K. pneumoniae”

MÅ VI INKUBERE 18-20 TIMER?

• Enterobacteriaceae

van den Bijllaardt et al. Int J Antimicrob Agents 2017

Jonasson E et al. ECCMID 2016 Poster P850

31.03.2017

5

UTFORDRING

GENETISK RESISTENSTESTING?

31.03.2017

6

GENOTYPI + FENOTYPI

• MALDI-TOF + PCR + direkte disk diffusjon (o.n inkubering)

• MALDI-TOF + direkte disk diffusjon (6 timer/o.n inkubering)

• Direkte disk diffusjon (overnatt inkubering)

Kommedal Ø et al. APMIS 2016

• -> Endret antibiotikabehandling hos 12 pasienter som ikke var dekt av empirisk

behandling 20-24 timer før disk diffusjons resultatene var tilgjengelig

HELGENOMSEKVENSERING

31.03.2017

7

PÅGÅENDE TEKNOLOGISK UTVIKLING

Mardis ER. Annu Rev Anal Chem 2013

MULIGE BRUKSOMRÅDER

ID

Surveillance/Molecularepidemiology

Biomarker /virulencedetection

Outbreakinvestigations

AST?

31.03.2017

8

Hasman H et al. J. Clin. Microbiol. 2014

FREMTIDENS ARBEIDSFLYT?

• Høyt samsvar mellom species

identifisering og predikert

følsomhet/resistens mellom

konvensjonelle metoder og

helgenomsekvensering bade

på dyrkede isolater og direkte

fra prøvemateriale

31.03.2017

9

OPPDRAG

• Litteraturgjennomgang

• Sensitivitet/spesifisitet: resistenstesting/helgenomsekvensering

• Bruk av helgenomsekvensering i kliniske mikrobiologiske laboratorier

• Epidemiologiske implikasjoner

• Kliniske implikasjoner for valg av antibiotikabehandling

• Hvordan skal helgenomsekvenserings resultater presenteres for kliniske brukere?

• Drivere og barrierer i forhold til runtinebruk av helgenomsekvensering

LITTERATURGJENNOMGANG

• S. aureus, M. tuberculosis

• Enterobacteriaceae (inkl. Salmonella)

• S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, P. aeruginosa,

A. baumannii, C. difficile

Bevis/samsvar

31.03.2017

10

S. aureus

Study # isolater # antibiotika Resultater

Holden MT et al. 2013 193 (all ST22) 18 99.8% concordance

Gordon NC et al. 2014 491 12 Sensitivity: 97%

Specificity: 99%

Bradley P et al. 2015 471 12 Sensitivity: 99.1%

Specificity: 99.6%

Holden MT. et al. Genome Res 2013; Gordon NC. et al. J Clin Microbiol 2014; Bradley P. et al. Nat Commun 2015

• 308 isolater

• 19 antibiotika

• Sammenlignet med ECOFF

� Genotypi vs. fenotypi:

� 98.6% samsvar (92.5 – 100%)

� Antibiotikaavhengig: amikacin – 92.5%

� Fenotypi vs. fenotypi:

� Staphylococcal Ref. Labs (SRLs) vs. EUCAST development Lab. (EDL):

� 97.8% samsvar (94.2 - 99.6%)

� “Genotypic prediction is at least as reliable as routine phenotypic testing”

� “Discrepancies just as likely represent inaccuracies in the phenotypic testing”

Aanensen DM. et al. mBio 2016

31.03.2017

11

M. tuberculosis complex

• Genomrapport: median tid på 9 dager

• 21 dager raskere enn ref. lab

• 93% samsvar species og resistensprofil

• Helgenomsekvensering 7% billigere/år

Positive Positive

MGIT

WGS

Routine/ref.

analysis

Pankhurst LJ et al. Lancet Respir Med 2016;

M. tuberculosis complex

• Sensitivitet: 82.6%; Spesifisitet: 98.5%

Bradley P. et al. Nat Commun 2015

31.03.2017

12

Enterobacteriaceae

• Helgenomsekvensering vs. Phoenix/M.I.C Evaluator

• 7 antibiotika; sammenlignet mot kliniske brytningspunkter

• E. coli

• Sens.: 99%

• Spes.: 96%

• K. pneumoniae:

• Sens.: 95%

• Spes.: 97%

• Species/antibiotikaavhengig

Stoesser N et al. J Antimicrob Chemother 2013

P. aeruginosa

• Meropenem/levofloxacin:

• Sensitivitet/spesfisitet: 91%/94%

• Amikacin:

• Genotypisk markør identifisert i 60% av I/R

isolater

• Genotypisk markør identifisert i 11% avfølsomme isolater

Kos VN. et al. Antimicrob Agents Chemother 2015

31.03.2017

13

MIC/sone diameter

Effluks β-laktamase(erværvet eller økt uttrykk av iboende β-laktamase)

PBP

Nedsatt følsomhet/resistens: komplekst samspill av flere faktorer– ikke bare tilstedeværelse/fravær av ett resistensgen/mutasjon

Permeabilitet

HVA SKAL MAN SAMMENLIGNE GENOMDATA MOT?

• Kliniske brytningspunkter: indikerer sannsynlighet for terapeutisk suksess

(S) eller behandlingssvikt (R) av antibiotikabehandling basert på

mikrobiologiske funn

• Utfordring: tilstedeværelse av resistensgen/mutasjon gir ikke alltid klinisk

resistens

• F.eks. ESBL-CARBA positive Enterobacteriaceae

R

Huang T-D. et al. J. Antimicrob. Chemother. 2014

31.03.2017

14

ECOFF

• ECOFF: (epidemiologisk brytningspunkt) differensierer villtype (WT) fra ikke-

villtype (NWT) med en erværvet resistensmekanisme

DATA KVALITET - QC

• Dårlig data → resistens gener/mutasjoner ikke detektert

• Hvilke QC parametere er viktig?:

• No. of reads, Average read length, No. of reads mapped to reference

sequence, Depth of coverage, Size of assembled genome, Total no. of contigs,

No. of contigs >500bp, N50 etc…

• Manglende internasjonale standarder

US-FDA

Technical University of Denmark

31.03.2017

15

DATABASER

• Utfordring: Oppdateringsfrekvens, nøyaktighet, tilgjengelighet, omfang

Xavier BB et al. J Clin Microbiol 2016

• Krav:

• Inneholde alle validerte resistensgener/mutasjoner

• Oppdateres regelmessig

• Overenstemmelse kriterier/standarder for å definere ett nytt resistensgen/mutasjon og varianter av disse

• Konsensus i forhold til nomenklatur og annotering av resistensgener/mutasjoner

• Mål: “Challenge database” for genotypi/fenotypi sammenligninger og for “kalibrering” av andre databaser og bioinformatiskeverktøy/tilnærminger

REFERANSE DATABASE

31.03.2017

16

BIOINFORMATISKE VERKTØY/ALGORITMER

• Kontinuerlig utvikling av bioinformatiske verktøy/algoritmer

for identifisering av resistensgener/mutasjoner

• Nødvendig å evaluere mot samme database

• ResFinder: Assembly/BLAST

• SRST2/KmerResistance: Mapping raw reads

Accuracy PerformanceFalse pos. fraction

True pos. fraction

Claussen PT et al. J Antimicrob Chemother 2016

ANTIBIOGRAM BASERT PÅ GENOTYPI?

• E. coli: blaOXA-48, blaCTX-M-14, blaTEM-1, aadA-5, aac(3)-Iid, gyrA S83L, parC S80I, dfrA-17, sul-1

• Genomisk data kan ikke predikere en reell MIC eller sone diameter.

• >50 år for å harmonisere brytningspunkter – hvor lang tid vil det ta for å harmonisere tolkning av genotypisk data?

Antibiotic Resistance genes Genotypic

Interpretation

Mecillinam OXA-48, CTX-M-14 R

Piperacillin/tazobactam OXA-48, CTX-M-14 R

Cefuroxime CTX-M-14 R

Cefotaxime CTX-M-14 R

Ceftazidime CTX-M-14 R

Ertapenem OXA-48 R

Meropenem OXA-48 R

Antibiotic Resistance genes Genotypic

Interpretation

MIC Interpretation

Mecillinam OXA-48, CTX-M-14 R 2 S

Piperacillin/tazobactam OXA-48, CTX-M-14 R 128 R

Cefuroxime CTX-M-14 R >256 R

Cefotaxime CTX-M-14 R 64 R

Ceftazidime CTX-M-14 R 2 I

Ertapenem OXA-48 R 1 I

Meropenem OXA-48 R 0.25 S

31.03.2017

17

OPPSUMMERING

• Resistenstesting: ny teknologi på vei?

• “Tid til resultat” med dagens teknologi kan reduseres

• Kombinasjon av genotypi/fenotypi

OPPSUMMERING HELGENOMSEKVENSERING

• “Tilgjengelig data/bevis for brukehelgenomsekvensering til å korrektpredikere bakteriers følsomhet/resistenser enten dårlig eller ikke-eksisterende”

• “Nær” fremtid:• M. tuberculosis?

• Erstatte resistenstesting i forbindelse med

overvåkning (S. aureus)

• Redusere bruk av resistenstesting i

referanselaboratorier.

• Unntak: veiledning i forbindelse med

behandling

• Species-antibiotika kombinasjoner med dårlig

korrelasjon mellom fenotypi/genotypi

• Nye midler

31.03.2017

18