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Submitted on 1 Jan 1993

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Activité protéolytique de souches de lactobacillesthermophiles isolées de levains et de Comté. I.Validation sur minifromages des techniques de

laboratoireY Bouton, P Guyot, A Dasen, R Grappin

To cite this version:Y Bouton, P Guyot, A Dasen, R Grappin. Activité protéolytique de souches de lactobacilles ther-mophiles isolées de levains et de Comté. I. Validation sur minifromages des techniques de laboratoire.Le Lait, INRA Editions, 1993, 73 (3), pp.265-279. �hal-00929339�

Lait (1993) 73, 265-279© Elsevier/INRA

Article original

Activité protéolytique de souches de lactobacillesthermophiles isolées de levains et de Comté.1. Validation sur minifromages des techniques

de laboratoire

y Bouton*, P Guyot*, A Dasen, R Grappin

Station de recherches en technologie et analyses laitières,INRA, BP 89, 39801 Poligny Cedex, France;

• Comité interprofessionnel du gruyère de Comté, avenue de la Résistance, 39800 Poligny;

(Reçu le 16 novembre 1992; accepté le 3 février 1993)

Résumé - Afin d'étudier les relations existant entre les mesures de l'activité protéolytique desouches de bactéries lactiques effectuées en laboratoire et celles observées sur fromages; 6souches de bactéries lactiques thermophiles isolées de levains et de fromages (Comté) ont été ca-ractérisées selon leur potentiel protéolytique évalué par 2 méthodes : mesure des groupements ami-nés libres par l'acide 2,4,6 trinitrobenzène sulfonique (TNBS) et détermination de l'activité leucine-aminopeptidase (Lap). Des essais en minifabrications de fromages, effectués soit en monosouchesoit en associations de souches, ne montrent aucune corrélation significative entre les tests de labo-ratoire et les mesures de protéolyse réalisées sur fromages avec les méthodes TNBS et Lap.

acide 2,4,6 trinitrobenzène sulfoniquel leucine-aminopeptldasel minifromagel lactobacillelprotéolyse

Summary - Proteolytic activity of Lactobacllll strains isolated from starters and Comté. 1.Validation of laboratory tests on mlni-cheeses. Fifty Lactobacillus (helveticus and delbrueckiisubsp lactis) strains, isolated from starters and cheeses (Comté), were purified, identified, and etes-sified, according to their acid production level and especially to their proteolytic activity evaluated bytwo different tests: free amino acids by 2,4,6 trinitrobenzenesu/fonic acid (TNBS) and leucine-aminopeptidase activity (Lap). Principal component analysis was used for strain grouping. Four Lac-tobacillus and 2 Streptococcus salivarius subsp thermophilus strains were chosen to study the rela-tionship between the proteolytic activity of lactic bacteria strains assessed with laboratory tests andthe nature and extent of proteolysis measured on cheeses. Experimental mini-eheeses were madewith single strain and strains associations. Cheeses were made from raw microfiltrated milk to elimi-nate the influence of original microflora. Sixteen mini-eheeses were made using the conventionalGruyère cheese process. Classification of streins, according to laboratory test results, did not showany significant correlation when the tests were carried out on single or mixed cultures. More data arenecessary to obtain a better understanding of the interaction between Streptococci and Lactobacilli.Different classifications of the proteolytic activity of Lactobacilli strains were also obtained when the

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characterization ~e TNBS and Lap methods) was made on mini-eheeses rather than with laboratorytests. Because the origin of the milk, as weil as the ripening conditions, may influence the overallcheese proteolysis, model cheeses will have to be developed to study the behaviour of starters.

2,4,6 trinltrobenzenesulfonlc acid / leuclne-aminopeptidase / mlni-cheese / Lactobacillus / pro-teolysls

INTRODUCTION

Le Comté est le principal débouché de laproduction agricole des zones de plateauxet de montagne de Franche-Comté. Avecune production annuelle de 38 000 t réali-sée par près de 250 ateliers de fabrication(ou fruitières), il se place au premier rangdes fromages d'appellation d'originecontrôlée. Ces fruitières travaillent defaçon traditionnelle, utilisant notammentdes ferments lactiques non sélectionnés,dits «sauvages", avec apport occasionnelde ferments commerciaux. La grande va-riabilité de la qualité de la matière pre-mière et des techniques de fabrication, as-sociée au manque de maîtrise desferments lactiques, a des répercussions di-rectes sur la qualité et la régularité du pro-duit. Par ailleurs, dans le contexte écono-mique actuel, le Comté doit prouver saspécificité aussi bien à travers ses qualitésorganoleptiques que par son attachementau terroir, justifiant son appellation d'ori-gine contrôlée. C'est dans ce contexte quela profession fromagère régionale a décidéde créer une collection de souches localesde bactéries lactiques qui soient sélection-nées d'après leurs aptitudes technologi-ques et organoleptiques, pour être utili-sées régulièrement en fabrication deComté.

On sait que la protéolyse est le méca-nisme le plus important de la plupart desfromages, car il affecte à la fois la textureet la flaveur (Fox, 1989). Or les levainslactiques, s'ils abaissent le pH du milieu entransformant le lactose en acide lactique,

contribuent également aux caractères or-ganoleptiques des fromages en libérantdes systèmes enzymatiques, en particulierprotéolytiques, qui participent aux princi-paux phénomènes de l'affinage (Thomaset Pritchard, 1987). En complétant l'actionde la présure et celle de la plasmine, lesenzymes protéolytiques des bactéries lacti-ques jouent un rôle fondamental dans lesfromages; cet équipement protéolytiqueimportant est actuellement bien décrit(Desmazeaud, 1990). Deux catégoriesd'enzymes peuvent être répertoriées : lesprotéinases qui scindent les protéines engros et moyens peptides, et les peptidasesqui dégradent les peptides issus de la dé-gradation des protéines en acides aminés.Ainsi, pour caractériser un système enzy-matique aussi complexe, on peut avoir re-cours soit à des techniques qui mesurentle degré de protéolyse en identifiant lesprotéines hydrolysées et les produits d'hy-drolyse, soit en mesurant une activité pro-téolytique spécifique de type exopeptidaseou endopeptidase, sur substrats synthéti-ques ou sur différentes caséines.

L'activité protéolytique globale, liée à laformation de groupements -NH2 libres, asouvent été mesurée, soit à l'aide du réac-tif à la ninhydrine, soit en utilisant des ré-actifs tels que l'ortho-phthaldialdehyde ouoPA (Oberg et al, 1991), l'acide 2,4,6 trini-trobenzènesulfonique ou TNBS (Mc Kellar,1981; Rollema et al, 1989). La chromato-graphie liquide haute performance a égaie-ment été utilisée pour caractériser l'activitéprotéolytique de souches (Oberg et al,1990). Pour mesurer de manière spécifi-

Souches de lactobacilles et protéolyse 267

que une activité protéolytique particulière,les substrats synthétiques choisis ont étécouplés à des groupements para-nitroanilide ou ~-naphtylamide (El Soda etDesmazeaud, 1982; Cholette et Mc Kellar,1990). Si ces techniques permettent demieux appréhender le potentiel protéolyti-que des souches cultivées sur lait ou mi-lieu synthétique, qu'en est-il dans le fro-mage? Peut-on, en effet, prévoir à partir.,des résultats observés au laboratoire si les·bactéries ont toujours la même activité surfromage?

Au cours de ce travail, nous avons donctenté, d'une part, d'établir les liens existantentre l'activité protéolytique de souches etassociations de souches de bactéries lacti-ques évaluée sur lait et milieu synthétiqueet le niveau de protéolyse des fromagesfabriqués à partir de ces mêmes soucheset, d'autre part, de préciser l'influence deslevains sur les caractéristiques physico-chimiques et sensorielles du Comté. Pourmesurer la protéolyse, deux techniquesont été choisies en raison de leur simplicitéde mise en œuvre sur cultures de soucheset sur fromages : le dosage des groupe-ments aminés (-NH2) qui est une mesureglobale de la protéolyse, par l'acide 2,4,6trinitrobenzènesulfonlque (TNBS), et unemesure d'activité peptidasique largementrépandue chez les bactéries lactiques(Bouillanne et Desmazeaud, 1980; Meyeret al, 1989 ; Khalid et Marth, 1990), l'activi-té leucine-aminopeptidasique (Lap) sursubstrat spécifique (Ieucine-paranitro-anilide).

Dans ce premier article, après une pré-sentation des techniques utilisées pourévaluer le potentiel protéolytique dessouches, nous comparerons les résultatsobtenus sur milieu lait ou synthétique auxrésultats obtenus sur minifromages. L'in-fluence des levains sur les caractéristiquesphysico-chimiques et sensorielles duComté sera donnée dans un second ar-ticle.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Souches de bactéries lactiques

Après avoir choisi des ateliers utilisant exclusi-vement des levains thermophilss sauvages etproduisant des fromages de haute qualité orga-noleptique, de bonne présentation et ayant unegrande aptitude à la conservation, le premier tra-vail a consisté à isoler, purifier et identifier lessouches de bactéries lactiques à partir de le-vains et de Comté; puis, dans un second temps,à les caractériser selon leur aptitude à l'acidifica-tion et surtout leur pouvoir protéolytique. Lesbactéries utilisées dans cette étude sont issuesde cette collection; il s'agit de 45 souches de Lhe/veticus, 5 souches de L de/brueckii subsp/actis et 2 souches de S salivarius subsp ther-mophilus (S69 et S48)..Nous disposons sur cessouches, en plus des mesures d'activité protéo-lytique présentées dans cet article, d'un en-semble d'informations portant sur leur potentielacidifiant (à 44·C et en cycle thermique), et surleurprofil biochimique déterminé à J'aidedes ga-leries API 50 CH (Bouton, 1992). Les souchessont conservées à -80·C dans un milieu synthé-tique M17 ou MRS (selon qu'il s'agisse de strep-tocoques ou de lactobacilles), additionné de gly-cérol stérile à la concentration de 15% (v/v).Avant chaque test, les souches ont été remisesen culture et repiquées 2 à 3 fois sur lait écréméstérile spray instantané, exempt d'antibiotique(ULN, Neuilly-sur-Seine, France), reconstitué à10% (Bouillanne et Desmazeaud, 1980).

L'évaluation du potentiel protéolytique a étéréalisée sur des monosouches (culture d'uneseule souche de bactérie) et sur des associa-tions de souches (cultures mixtes, composéesd'une souche de lactobacilles et d'une ou deuxsouches de streptocoques), afin d'assurer unemeilleure transformation du lactose en acide lac-tique et observer une éventuelle synergie surl'activité protéolytique.

Fabrications fromagères

Les fabrications fromagères ont été réaliséesdans un atelier comprenant 4 minicuves. Cha-que jour de fabrication, 4 fromages ont été fabri-qués à partir du même lait, chaque cuve étant

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ensemencée avec une souche ou une associa-tion de souches différente. Mis à part le facteursouche qui variait entre fromages, l'ensembledes opérations de fabrication et d'affinage étaitidentique. La comparaison physico-chimiquedes fromages (extrait sec, teneur en NaCI ettaux de matière grasse) fabriqués le même jour,très homogène (CV < 1%), indique que le pro-cessus de fabrication des fromages (coagula-tion, décaillage, synérèse et pressage) est bienmaîtrisé. Chaque souche a fait l'objet de 2 es-sais effectués avec des laits de traites diffé-rentes dont la composition physico-chimique etla qualité microbiologique pouvaient être légère-ment différentes. Afin d'éliminer en grande par-tie l'influence éventuelle de la flore originelle dulait, et pour se placer dans des conditions de fa-brication du Comté au lait cru, les essais en ate-lier expérimental ont été réalisés sur des laitsmicrofiltrés dont le niveau de flore était enmoyenne de 103 UFC/ml.

Le lait, stocké 12 ou 24 h à + 4°C, est collec-té dans une fromagerie proche de l'atelier expé-rimentaI. À son arrivée, il est écrémé puis micro-filtré à l'aide d'un appareil Bactocatch (Alfa-Laval, Les Clayes-sous-Bois, France) d'un débitde 600 I/h/m2. L'élimination des bactéries est ré-alisée à «froid» (35°C) par microfiltration tan-gentielle, la taille des pores et la surface de lamembrane étant respectivement de 1,4 urn et0,2 m2. Les rendements de microfiltration géné-ralement observés sont voisins de 99,5%. Lacrème recueillie est pasteurisée (85°C, 30 s) etréincorporée au lait microfiltré (standardisationen matière grasse à 30-31 g/I). Les fromagessont fabriqués à partir de 11 kg de lait. L'ense-mencement en levains thermophiles (additionde 0,12% de streptocoques et 0,08% de lacto-bacilles en association de souches et 0,10% enmonosouche) est réalisé pendant la maturationà 32,5°C, 30 min. L'emprésurage à 32,5°C esteffectué avec de la présure à 700 mg de chy-mosine/I (Granday, Beaune, France) ; la quanti-té d'enzyme à ajouter est déterminée par le testde Berridge, afin d'obtenir un temps de prisevoisin de 30 min. La coagulation est mesurée àl'aide d'une sonde thermique (CoagulomètreINRA, Brevet Fr 88-00803).

Le décaillage commence 5 min après la coa-gulation et dure 4 min. La température s'élèveensuite jusqu'à 54°C en 35 min et reste cons-tante pendant 25 min. Le soutirage se fait pargravité et le pressage (150 g/cm2, pendant 6 h)a lieu dans une enceinte thermostatée qui si-

mule le cycle thermique de refroidissement réelrencontré en industrie sur gros fromages. Afind'obtenir des conditions d'acidification normales,la température s'abaisse lentement (en 16 h)avant de se stabiliser à 31°C pendant 4 h. Lesalage est effectué à 13°C pendant 3 h, dansune saumure saturée en NaCl, d = 1 190, pH5,20. Les minifromages (diamètre 15 cm, masse950 g) sont ensuite recouverts de paraffine. L'af-finage est conduit dans 2 cellules dont la tempé-rature et l'hygrométrie sont régulées automati-quement (Cardenas et al, 1991a et b) ; toutd'abord en cave de préaffinage, à 14°C pendant3 semaines, où l'humidité relative est de 92 à94%, puis en cave chaude à 18°C pendant 9 se-maines (humidité relative> 94%).

Dosage de l'activité protéolytique

Dosage des groupements aminésà l'aide du TNBS

Sur cultures de souchesde bactéries lactiques

Le dosage des radicaux -NH2 libres est réaliséselon une technique adaptée de la méthode deMc Kellar (1981). Vingt ml de lait G (Prolait,Niort, France) reconstitué à 10%, ensemencés à1% (v/v) soit environ 2 106 UFC/ml, sont incu-bés à 44°C. Des prélèvements de 2 ml sont ef-fectués au bout de 0, 2, 4, 6, 8 et 24 h d'incuba-tion. À chaque prélèvement sont ajoutés 4 ml deTCA 0,72N. Après 20 min à température am-biante, le précipité est séparé du surnageant parcentrifugation à 1 200 9 pendant 10 min à 5°C,puis filtré sur papier whatman n042. À 100 III defiltrat sont ajoutés 1 ml de tampon borate de so-dium 0,1 mol/l, pH 9,5 et 400 III de solution deTNBS à 100 Ilg/ml (Sigma P2297). Après 1 hd'incubation à 37°C à l'abri de la lumière, la ré-action est stoppée par addition de 0,4 ml d'unesolution de phosphate/sulfite de sodium (respec-tivement 2 et 18 mmol/I), préparée extempora-nément. L'absorbance est mesurée à 420 nmaprès 15 min par référence à un blanc réaliséavec de l'eau distillée; les résultats sont expri-més en mmol d'équivalent glycine par litre delait (meq gly/I) à l'aide d'une gamme étalon desolutions de glycine de 0,01 à 0,5 mmol/l.

Les ensemencements à 1% (v/v) ont été réa-lisés dans le cas de monosouche à partir d'une

Souches de lactobacilles et protéolyse 269

seule culture mère, et dans le cas des associa-tions de souches à partir des différentes cul-tures mères composant cette association.

Sur fromages

Les échantillons de fromages prélevés après 12semaines d'affinage ont été emballés dans dupapier d'aluminium sulfurisé (l'aluminium étantdu côté du fromage, afin de limiter les transfertsde soluté lors de la congélation), puis congelésà -25°C. Le dosage est effectué sur des dilu-tions au 1/100 de préparation d'azote solubledans l'eau réalisée selon une technique adaptéede la méthode de Kuchroo et Fox (1982). Lesrésultats sont exprimés en équivalent glycine,converti en g d'azote, pour 100 g d'azote total(-NH2/NT). L'azote total est déterminé par la mé-thode Kjeldahl.

Détermination de l'activitéleucine-aminopeptidasique

Sur cultures de souchesde bactéries lactiques

La mesure de cette activité est réalisée selon latechnique de Rabier et Desmazeaud (1973) àpartir du substrat : L-Ieucine-paranitroanilide.Quatre-vingt ml de milieu synthétique M17 ouMRS, selon le cas, sont ensemencés à 2% (v/v), puis incubés à 44°C pendant 6 h pour lesstreptocoques ou 8 h pour les lactobacilles ;dans le cas des associations de souches, l'en-semencement à 2% est réalisé sur milieu Elli-ker, à partir des différentes cultures mères com-posant cette association; l'incubation à 44°Cdure 8 h. La culture est ensuite centrifugée à1 200 9 pendant 20 min à 5°C; le culot cellulaireest lavé 2 fois à l'aide d'une solution d'eau phy-siologique stérile. Le dosage est réalisé sur dessuspensions de cellules, ajustées à une absor-bance de 3, à 650 nm correspondant à uneconcentration d'environ 2 108 bactéries/ml (laconcentration cellulaire est déterminée par turbi-dimétrie, à l'aide d'un spectrophotomètre Beck-man DU 64). Pour chaque souche, 4 tubescontenant le milieu réactionnel suivant sont pré-parés : 100 ,.11 de suspension cellulaire (absor-bance = 3); 900 ld de tampon phosphate de so-dium 0,05 molli, pH = 7 et 50 J.llde substrat (6,5mg de L-Ieucine-p-nitroanilide, Sigma L9125,dans 1 ml de méthanol pur).

Après incubation à 3rC pendant 10, 20 et30 min, la réaction est stoppée par addition de250 J.lld'acide acétique à 30% (v/v). Après cen-trifugation à 1 200 9 pendant 5 min à 5°C, la va-riation d'absorbance est mesurée à 410 nm parréférence à un tube témoin, dans lequel la sus-pension cellulaire a été remplacée par de l'eauphysiologique. Les résultats d'activité aminopep-tidasique sont exprimés en J.lgde p-nitroanilinelibéré par heure, à l'aide d'une gamme étalon.

Sur fromages

Le substrat (leucine-p-nitroanilide) est dissousdans du diméthylformamide, puis dilué dans dutampon tris/acide maléique/soude (50 mmol/I,pH 5,~, de façon à obtenir une concentration de5 10- molli en substrat et de 10% en diméthyl-formamide (Linden et al, 1982). À 0,5 ml debroyat de fromage, réalisé dans de l'eau citratéeà 2%, sont ajoutés 1,5 ml de la solution de sub-strat. Après incubation, la lecture est réalisée auspectrophotomètre à 410 nm, après dissolutiontotale du milieu réactionnel par addition detransparisant (Prolabo, ref 27 357.232). Les ré-sultats sont exprimés en J.lgde p-nitroaniline li-béré par g de fromage et par heure.

Fidélité des mesures

Elle constitue un élément indispensable àconnaître avant d'entreprendre tout travail analy-tique. L'étude de la répétabilité et de la repro-ductibilité permet d'affecter à chaque valeur uneincertitude de mesure. La validité des résultatspeut ainsi être vérifiée lorsque les mesures sontpar exemple réalisées en double. Les calculsont été effectués selon la norme FIL (Anonyme,1985).

Technique TNBS

La répétabilité des mesures, ou plus exacte-ment de la réaction chimique, a été évaluée àpartir de filtrats analysés en double le mêmejour, provenant de 7 souches différentes. Pourévaluer la reproductibilité dans le temps, un do-sage des groupements aminés a été réalisé ensimple sur 3 séries de filtrats obtenus pendant 3jours différents, à partir des cultures en mono-souche (7 échantillons).

270 y Bouton et al

Aux écarts types de répétabilité (tableau 1),voisins de 0,01 meq gly/l de lait, sauf au tempsT24 où la valeur est de 0,063 meq gly/l de lait,correspondent des CV de 2%, pour desmoyennes ~ 0,500 meq gly/l de lait. Les CV dereproductibilité, qui incluent l'étape d'inoculationet d'incubation, sont de 4 à 10 fois plus élevésque les CV de répétabilité. La reproductibilitéest meilleure à T24, temps pour lequel le maxi-mum de protéolyse est observé; c'est ce tempsqui sera retenu pour comparer les souchesentre elles.

Technique Lap

La répétabilité des mesures, et plus précisé-ment de la réaction enzymatique, a été détermi-née à partir de 8 préparations issues de 8souches différentes analysées en double lemême jour. La reproductibilité a été estimée àpartir de 3 déterminations de l'activité amino-peptidasique, effectuées en simple pendant 3jours différents sur 10 monosouches (3 strepto-coques et 7 lactobacilles).

En répétabilité (tableau 1), le coefficient devariation obtenu est similaire à celui observé

par Linden et al (1982) sur le lait (N = 32, CVr =4,97%). En reproductibilité, le coefficient de va-riation de 14,6% est du même ordre de gran-deur que celui obtenu pour la mesure des grou-pements aminés par la technique du TNBSaprès une incubation de 8 h.

Traitements des résultats

Les analyses statistiques ont été effectuées àpartir du logiciel StaHTCF (Version 4, 1987) del'Institut technique des céréales et des four-rages.

Pour classer les souches bactériennes selonleur pouvoir protéolytique, nous avons employéune méthode d'analyse multidimensionnelle,l'analyse en composantes principales ou ACP(Zourari et al, 1991). La comparaison de la pro-téolyse observée sur souches et sur minifro-mages a été réalisée par analyse de variance.Lorsque le facteur souche s'est révélé significa-tif, le test de Newman-Keuls a été appliqué afinde classer les souches entre elles; ce classe-ment est basé sur la plus petite différence exis-tant entre les différentes moyennes.

Tableau 1. Répétabilité et reproductibilité dans le temps des techniques TNBS et Lap.Repeatability and between-day reproducibility of TNBS and Lap technics.

Répétabilité Reproductibilité

TNBS IN = 7) Lap TNBS IN = 7) LapIN = B) IN = 10)

T2 T4 T6 TB T24 T2 T4 T6 TB T24

x 0,103 0,193 0,531 0,859 3,359 21,86 0,07 0,16 0,41 0,90 3,29 22,86s 0,007 0,007 0,011 0,010 0,063 0,88 0,02 0,04 0,08 0,14 0,23 3,33CV 6,6 3,6 2,0 1,9 1,9 4,0 29,2 26,5 20,2 15,7 6,9 14,6

x: moyenne et s : écart type (TNBS : meq gly/l de lait; Lap : I1gp-nitroaniline/h); CV : coefficient devariation en %; N : nombre d'échantillons; T2, T4, T6, T8, T24 :mesures TNBS respectivement aubout de 2, 4, 6, 8 et 24 h d'incubation.x: mean and s : repeatability standard deviation (TNBS : meq glyll milk; Lap : jlg p-nitroanilinelh);CV: coefficient of variation in %; N: number of samples; T2, T4, T6, TB, T24: TNBS measurementsrespectively after 2, 4, 6, Band 24 h of incubation.

Souches de lactobacilies et protéolyse 271

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Caractérisation et choix des souches

L'ACP, réalisée à partir des mesuresTNBS et Lap, a permis de classer les 50souches de lactobacilles sur la base deleur potentiel protéolytique, sachant qu'iln'existe pas de corrélation entre les 2 tech-niques (r = 0,04). Les axes 1 et 2 expli-quent 100% de la variance ; la projectiondu nuage de points sur un plan est présen-tée sur la figure 1. Les différentes souchessont réparties selon 2 axes, décrits par lesvariables Lap et TNBS; les souches 116,111, 57, 75 et 72 sont celles qui présen-tent l'activité Lap la plus élevée (35,9 à 40Ilg de p-nitroaniline/h); à l'opposé, lessouches 131, 85,9,139 et 90 sont celles

139

131

113

qui ont des valeurs de Lap faibles (5,5 à12,7 Ilg p-nitroaniline/h).

De la même manière, des groupes desouches peuvent être constitués à partirdes résultats TNBS, même si la distinctionentre souches moyennes et souchesfaibles ou souches moyennes et souchesfortes n'est pas toujours aisée. Il ressortque les souches 16, 42, 40 et 27 sontcelles qui présentent avec les souches 90,72 et 75 les valeurs les plus hautes (3,65 à5,18 meq gly/l de lait), tandis qu'à l'opposése situent les souches 85, 131, 123, 99,137 et 113 présentant les valeurs les plusfaibles (0,86 à 1,74 meq gly/l de lait).

Afin de réaliser des fabrications froma-gères simultanément sur les souches sé-lectionnées, il a été décidé de retenir 4souches de lactobacilles, présentant des

TNBB

AXEe 48%, 90 /, /,,/

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4-A027, ////// ~~'," 4 4'

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Fig 1. Analyse en composantes principales pour les souches de Lactabacillus. TNBS : déterminationdes groupements aminés par la méthode TNBS: Lap: activité leucine-aminopeptidasique.Principal component analysis far Lactobacilius strains; TNBS : amina group determinatian by TNBSmethod; Lap : leucine-aminapeptidase activity.

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272 y Bouton et al

valeurs d'activité protéolytique extrêmes :L he/vetieus L72 qui présente des valeursélevées aux 2 activités, L de/brueekiisubsp lectis L85 qui présente au contrairede faibles valeurs, L he/vetieus L80 qui adonné des valeurs moyennes et L he/veti-eus L99 qui a donné une faible valeur audosage TNBS et un résultat moyen pourl'activité Lap. Nous avons vérifié que l'aci-dification de ces souches était correcte(pH voisin de 4,5 après 8 h d'incubation à44oC) et qu'elles présentaient égalementdes profils biochimiques différents, afind'éviter de prendre des souches identi-ques qui peuvent provenir de la mêmebactérie mère (tableau Il). Soulignons qu'iln'existe aucune relation entre l'origine deces souches (fromagerie, levain, fromage)et leurs caractéristiques protéolytiques.

Les 4 souches de lactobacilles ont étéassociées soit séparément, soit ensemble,à 2 souches de S salivarius subsp thermo-phi/us (S69 et S48) constituant ainsi 12 as-sociations différentes. Les souches destreptocoques utilisées présentent des va-leurs moyennes d'activité Lap (respective-ment 14,7 et 13,7 J.l.gp-nitroaniline/h). Lesrésultats des dosages TNBS furent sem-blables à ceux du témoin, suggérant que laprotéolyse produite par les streptocoquesest négligeable ou en tout cas trop limitéepour être mesurée par cette technique (ta-bleau III). Ces résultats sont en accordavec les observations faites par Gripon(1986). La souche S69 acidifie fortementau bout de 6 h de culture par rapport à lasouche S48 ; ces 2 souches présentent unprofil biochimique différent (tableau III).

LBD LBS

++ +++ +++ ++++ +++ +++ ++

++++ ++

++ ++++

4,62 4,643,73 3,986,23 6,484,51 4,39

Tableau Il. Profils biochimiques et potentiel acidifiant des souches de L helveticus (L72, L80, L99) etL delbrueckii subsp lactis (L85).Biochimical profiles and acidifying potential of L helveticus (L72, LBD, L99) and L delbrueckii subsplactis (LBS) strains.

Tous les autres composés des galeries 50 CH (Api-Biomérieux) étaient négatifs; (-) test négatif (++)test positif, (+)test faiblement positif. Les mesures de pH ont été obtenues après 8 et 24 h d'incubation dans le lait à 44°C ouaprès cycle thermique.Ali the other SOCH tests were negative; (-) negative test; (++) positive test, (+) weakly positive test. pH measure-ments are obtained after 8 and 24 h incubation in milk at 44°C or alter thermal cycle.

L99 L72

++ ++++ ++

+++ ++++ ++++ ++

GalactoseO-glucoseO-fructoseO-mannoseN-acétyl-glucosamineLactoseSaccharoseTréhalose

O-IactatesL-Iactates

++ ++++ ++

5,00 4,353,75 3,646,39 6,254,03 5,77

pH 8 h 44°CpH 24 h 44°CpH 8 h cycle thermiquepH 24 h cycle thermique

Souches de lactobacilles et protéolyse

Tableau III. Profils biochimiques, potentiel acidi-fiant et protéolytique des souches de Strepto-eoceus salivarius subsp thermophilus (S69,S48).Biochimieal profiles, aeidifying and proteolytiepotential of Streptococcus salivarius subsp ther-mophilus (569,548)strains.

569 548

Galactose ++D-glucose ++ ++D-fructose ++D-mannose ++N~acéthyl-glucosamineLactose ++ ++Saccharose ++ ++Tréhalose

D-IactatesL-Iactates ++ ++

pH 6 h 44°C 4,95 5,70pH 24 h44°C 4,46 4,68pH 6 h cycle thermique 6,12 6,55pH 24 h cycle thermique 4,90 5,62

TNBSI TO 0,13 0,14T2 0,11 0,12T4 0,13 0,12T6 0,13 0,15T8 0,12 0,15T24 0,13 0,14

Tous les autres composés des galeries 50CH (Api-Biomérieux) étaient négatifs; H test négatif, (H) testpositif, (+) test faiblement positif. (1) mesures TNBS enabsorbance; l'absorbance du témoin (lait non ensemen-cé) est de 0,13. Les mesures de pH ont été obtenuesaprès 8 et 24 h d'incubation dans le lait à 44°C ouaprès cycle thermique.Ali the other SOCH tests were negative; (-) negativetest, (++) positive test, (+) weakly positive test. (t)TNBS measurements in absorbance; the reference op-tical density (uninoculated milk) is 0.13. pH measure-ments are obtained after 8 and 24 h incubation in milkat 44°C or after thermal cycle.

273

Activité protéolytique des soucheset associations de souches

Nous considérerons les dosages TNBS etl'activité Lap effectués sur monosouches etassociations de souches, d'une part, surcultures au laboratoire et, d'autre part, surfromages à 3 mois pour le TNBS et à 20 hpour l'activité Lap. A partir de ces don-nées, une étude du facteur -lactobacllle » aété réalisée à l'aide d'une analyse de va-riance (tableau IV) selon un plan factorielcomportant 4 niveaux (souches)' et respec-tivement 3 répétitions pour les tests de la-boratoire et 2 répétitions pour les tests surfromages.

Comparaison de la protéolyse observéeau laboratoire sur cultures de soucheset associations de souches

D'une façon générale, l'activité protéolyti-que globale (valeurs TNBS) obtenue enassociation de souches est beaucoup plusfaible et plus homogène qu'en mono-souche. Le dosage sur cultures de mono-souche permet un classement en 3groupes: L72 (groupe a) > L80 (groupe b)> L85 et L99 (groupe c) ; en associations,la souche L72 est toujours la première(groupe a), les autres souches constituantun autre groupe homogène (groupe b) ; lasouche L80 se retrouve ainsi en associa-tion de souches, au même niveau que lessouches L85 ou L99, alors qu'elle expri-mait une protéolyse plus importante enmonosouche. Dans le dernier cas (mé-langes avec S69 et S48), les écarts typesde répétabilité calculés pour chacune desassociations n'étant pas identiques, il estimpossible de conclure. Toutefois, la hié-rarchie obtenue lors des 3 répétitions atoujours été la même, le mélange présen-tant la souche L72 restant le plus protéoly-tique. On voit donc que si les associationscontenant la souche L72 (souche forte-

274 y Bouton et al

Tableau IV. Analyse de variance des mesures de protéolyse (TNBS et Lap) effectuées sur soucheset minifromages de 3 mois.Analysis of variance of proteolysis measurements (TNBS and Lap) assessed on strains and mini-cheeses aged 3 months.

TNBS

L72 L80 L8S

Lap

L99 Facteur L72 L80 FacteurL8S L99

MonosouchesLaboxs

Froxs

+S48Labo

xs

Froxs

+S69Labo

xs

Froxs

+S48S69Labo

xs

Froxs

5,18a0,38

7,423,42

2,94a0,07

9,054,14

3,07b0,10

8,260,01

1,84b0,17

5,761,42

1,74C0,39

1,63C0,14

37,4a zs.o-4,3 3,7

5,06 4,52 5,610,67 0,39 0,42

0,260,04

5,210,95

4,300,08

11,150,44

207,2a 210,oa24,4 20,4

9,8b 27,9a0,9 6,4

23,Ob 187,oa8,1 12,2

6,1b 13,1a1,4 1,1

49,2b 198,6a11,7 28,5

9,4b n.o«0,8 0,7

51,8C 135,2b16,3 4,10

7,2b 12,2a0,2 2,0

37,4C 132,3b4,10 0,0

1,87b0,14

1,60b0,06

7,5b 8,4b0,3 1,2

3,930,61

NS 299,3a 293,5a24,4 48,9

x: moyenne; s : écart type; seuil de signification du facteur souche, non significatif (NS), significatif au seuil de 1%("), de 0,1% l"'); le test de Newman-Keuls conduit à un classement (décroissant) des souches en différentsgroupes homogènes symbolisés par les lettres a, b, c: (/) aucune conclusion n'a pu être donnée, les variances entretraitements n'étant pas identiques.x: mean; s : standard deviation; significant level of factor strain, non significant {NS}, significant P <O.Ot t'}, signifi-cant P < O.OOt t..};Newman-Keuls'test teeos to strains classification {decreasing proteolytic intensity} in differentgroups noted as a, b, c; {I} the variance between treatments being unhomogeneous, no conclusion can be drawn.

9,855,37

1,67a0,03

O,51b O,53b O,53b0,04 0,03 0,03

8,7b 8,4b0,6 0,0

6,611,23

1,460,24

6,260,65

NS 212,9a 227,3a24,5 4,10

0,370,04

0,510,02

14,3a 14,2a2,3 0,9

5,010,74

NS 207,2a 187,oa32,6 4,10

6,920,29

Souches de lactobacilles et protéolyse 275

ment protéolytique) sont bien 'celles quidonnent une activité protéolytique globaleplus élevée, la distinction n'est pas francheavec les mélanges dans lesquels lessouches L80, L85 et L99 sont présentes.En comparant les associations constituéesuniquement de 2 souches, il ressort queles associations dans lesquelles la souche848 est présente sont celles qui donnentune activité protéolytique globale plusforte.

Avec la technique Lap, on observe lemême type d'information en association desouches, à savoir des résultats plus faibleset un nivellement des valeurs. La soucheL72 par exemple, plus protéolytique que lasouche L80 en monosouche, ne se distin-gue plus guère des autres souches de lac-tobacilles lorsqu'elle est associée à desstreptocoques. Toutefois, avec la soucheL85, contrairement aux autres souches deLactobacillus, les variations des valeursLap observées entre monosouche et asso-ciation sont moins importantes. Les résul-tats des mesures Lap montrent que lesmélanges formés avec cette souche L85donnent généralement les valeurs les plusfaibles (sauf dans le cas du mélange L85869); en revanche, les associations danslesquelles la souche L72 est présente nedonnent pas toujours les résultats les plusélevés. On arrive ainsi à un classementdes souches de lactobacilles différent lors-qu'elles sont seules ou en associations ; lasouche L99 par exemple, est plus protéoly-tique en association de souches qu'en mo-nosouche.

Les résultats plus faibles observés surles cultures d'associations de souchespourraient s'expliquer par la techniquemême d'ensemencement, puisque celui-ciest toujours de 1% (v/v) quel que soit lenombre de souches mises en présence.Nous avons vu que la protéolyse dessouches de streptocoques mesurée par latechnique TNB8 était négligeable. Cettefaible action protéolytique a déjà été souli-

gnée chez les streptocoques lactiques mé-sophiles (Kikuchi et al, 1973) ; la vitesse àlaquelle s'effectue la protéolyse du lait se-rait insuffisante pour permettre un approvi-sionnement en acides aminés aux bacté-ries lactiques et obtenir ainsi un taux decroissance maximal (Juillard et Richard,1989). Ainsi, dans les associations où lapopulation de lactobacilles est plus faibleque dans les cultures de type mono-souche, il semblerait normal que la protéo-lyse soit moins élevée. Toutefois, si onconsidère que les lactobacilles sont seulscapables de produire une protéolyse vi-sible, les mélanges composés de 3souches, dont 2 de streptocoques, de-vraient présenter des valeurs encore plusfaibles ; or les mélanges L99 869 848 ouL72 869 848 par exemple, atteignent res-pectivement des mesures TNB8 similairesà celles des mélanges L99 869 ou L72869. Il semble donc que le type d'associa-tion mis en jeu doit être pris en compte. Ilexiste vraisemblablement des compétitionsplus ou moins importantes pour les acidesaminés libres et les petits peptides selon letype de souches mis en présence, commeJuillard et Richard (1989) le soulignentdans l'étude de l'interaction entre souchesprotéolytiques de streptocoques lactiques,mésophiles et leurs variants non protéolyti-ques.

Par ailleurs, nous avons vu que les as-sociations dans lesquelles la souche 848est présente sont celles qui donnent lesmesures TNB8 les plus fortes par rapportaux mélanges comportant la souche 869.Deux hypothèses peuvent être avancéespour expliquer cette différence. Nous pou-vons observer que la souche 848 acidifiepeu le lait au bout de 6 h de culture parrapport à la souche 869, sans doute parceque cette dernière, utilisant le galactose, aun taux de croissance plus rapide (fig 2);ainsi, l'évolution plus lente de la souche848 se traduisant par une consommationde substances azotées facilement assimi-

276 y Bouton et al

----------------,-,/," ....l .

1 ••••••

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•lemjlS (h)

Fig 2. Evolution sur lait des souches de Strep-tococcus salivarius subsp thermophilus 869(_0_) et 848 (00000).Evolution on milk of 8treptococcus salivariussubsp thermophilus strains 569 (_0_) and 548(0000.).

lables, plus faible, permet aux souches delactobacilles d'atteindre un taux de crois-sance maximal. Il est possible aussi que laprésence des 2 types de souches se tra-duise par un effet synergique notable surl'activité protéolytique, provoquant une élé-vation des mesures TNBS, au même titrequ'il existe un effet de synergie sur l'activi-té acidifiante avec les souches de S sali-varius subsp thermophilus et L delbrueekiisubsp bulgarieus (Zourari et al; 1992). Uneétude plus détaillée des phénomènes d'in-teraction entre souches devrait permettred'avancer sur ce problème très complexe,qui n'est pas sans importance en technolo-gie fromagère.

Comparaison de la protéolyse observéesur les cultures et sur les minifromages

Contrairement aux tests de laboratoire, leniveau moyen des résultats obtenus enassociations de souches est en général dumême ordre de grandeur que celui obser-vé en monosouches. Signalons que lesvaleurs de pH et d'extrait sec des diffé-

rentes fabrications en associations desouches sont restées stables et compa-rables. En revanche, les fromages typemonosouche, fabriqués avec la souche deL delbrueekii subsp laetis L85, présen-taient un pH plus faible que les autres fro-mages.

L'analyse de variance des mesuresd'activité protéolytique globale (TNBS),montre qu'il n'y a pas de différence signifi-cative au seuil de 5% entre fromages,qu'ils soient fabriqués avec les mono-souches ou avec les associations desouches. Nous pouvons observer dans lecas des monosouches, des écarts-typesentre essais différents d'une souche àl'autre, les 2 essais effectués avec lasouche L72 sont hétérogènes et rendent lacomparaison difficile. Des numérations ré-alisées sur lait et levains au cours de cetteétude n'ont pas montré de réelles diffé-rences, permettant d'expliquer cette varia-tion; la souche Ln semble donc être plussensible à la composition physico-chimique de la matière première. Lors-qu'on regarde la hiérarchie des souchesobtenue pour chacun des 2 essais, il estintéressant de noter que la souche L99 esttoujours la plus protéolytique et la soucheL85 la plus faible. Ce résultat obtenu avecla souche L99 ne concorde pas avec celuiobtenu en test de laboratoire qui la plaçaiten dernière position; par contre, la soucheL85, classée également dans le groupe c(faiblement protéolytique), donne bien surfromage une protéolyse faible; protéolysequi peut également s'expliquer par des va-leurs de pH plus faibles (Youssef, 1992).Avec les associations de souches, les ré-sultats des dosages, bien que non signifi-catifs, montrent néanmoins que la soucheL99 associée au streptocoque S48 ou aux2 streptocoques à la fois (S48 et S69) seretrouve au premier rang, comme dans lecas des fromages type monosouche. Avecle streptocoque S69, c'est la souche L72qui présente des valeurs plus élevées.

Souches de lactobacilles et protéolyse

L'analyse de variance des mesuresd'activité aminopeptidasique (l.ap) réali-sées sur monosouches conduit au mêmeclassement que celui obtenu avec les testsde laboratoire; le groupe a est constituédes souches L72, L80 et L99 et le groupeb de la souche L85. En association desouches, la hiérarchie obtenue est diffé-rente de celle observée en test de labora-toire. En effet, associée au streptocoque548, la souche L99 est classée dans legroupe a, au côté des souches L72 et L80,alors qu'en test de laboratoire, elle formaità elle seule le groupe a donnant les va-leurs d'activité aminopeptidasique les plusélevées; avec le streptocoque 569 seul ouen association avec 548 et 569, la soucheL99 est classée dans le groupe b, alorsqu'en test de laboratoire elle était classéedans le groupe a; seule la souche L85 pré-sente toujours une faible activité.

L'ensemble de ces observations indiquequ'il est difficile de prévoir, à partir destests de laboratoire, l'intensité de la protéo-lyse au niveau du fromage, même si leclassement de Newman-Keuls conduit auxmêmes groupes homogènes de mono-souches dans le cas de l'activité amino-peptidasique. En effet, en association desouches les résultats étant discordants, ilest possible que les souches de lactoba-cilles associées aux streptocoques déve-loppent sur lait et sur caillé des activitésLap différentes de celles observées en la-boratoire. Desmazeaud et Vassal (1979)ont montré que la capacité de synthèsedes dipeptidases de la souche S laetis 261(Le laetis subsp laetis) était meilleure lors-que cette souche était cultivée sur lait oucaillé plutôt que sur milieu de laboratoire.

Par ailleurs, si le substrat lait est diffé-rent, les conditions de température choi-sies peuvent influencer la lyse cellulaire etdonc la protéolyse. On sait que si les bac-téries lactiques, qui possèdent des sys-tèmes protéolytiques extracellulaires ouliés aux enveloppes, sont capables d'hy-

277

drolyser les caséines et les peptides enphase exponentielle de croissance, ellespossèdent également des systèmes pro-téolytiques intracellulaires qui sont libérésen phase de déclin lorsque les cellules selysent. L'importance de la lyse des cellulesdes levains dans le fromage jeune in-fluence donc la production d'acides ami-nés; or cette lyse, si elle est dépendantedes propriétés autolytiques des levains,est aussi dépendante des conditions dumilieu et d'affinage, en particulier ducouple temps-température, du niveaud'acide lactique et du taux de diffusion dusel dans le fromage (Youssef, 1992).

D'autre part, pour être active, une en-zyme doit être stable dans le fromage. Peude travaux ont été réalisés sur les facteursdéterminant la stabilité des enzymes pro-téolytiques des levains dans les conditionsd'affinage. Cependant, Law et al (1974)ont montré que des préparations de dipep-tidases de Le laetis subsp eremorisNCD0924 pouvaient être suffisammentstables pour persister dans le Cheddarpendant au moins 3 mois; de même, ElAbboudi et al (1992) ont mis en évidencela stabilité, pendant au moins 2 mois,d'une aminopeptidase dans le Cheddar.

Enfin, si le potentiel protéolytique deslevains contribue de façon non négligeableà la protéolyse du fromage, les enzymesnaturelles du lait (Humbert et Alais, 1979)peuvent également jouer un rôle dans ladégradation des protéines et expliquer lesdiscordances observées sur cultures desouches et sur fromages.

L'ensemble de ces résultats montrequ'en utilisant des tests simples de mesurede l'activité protéolytique de souches(TNB5 et Lap), on obtient des informationscontradictoires, selon que ces tests sontappliqués en laboratoire sur milieu lait ousynthétique ou sur fromages. Les tests delaboratoire n'ont comme intérêt que le clas-sement des monosouches; en revanche,

278 y Bouton et al

les minifabrications devraient permettreune meilleure approche du potentiel pro-téolytique des souches. Les minifabrica-tions type monosouche s'éloignant de latechnologie Comté où les levains sont tou-jours composés de 2 types de souches,streptocoques et lactobacilles, il n'apparaîtpas nécessaire de retenir ce test commecritère de classement des souches. Si lesminifabrications de type associations desouches utilisées au cours de ce travailapportent des informations utiles, cette ca-ractérisation des souches dans des condi-tions standard reste insuffisante. En effet,la matière première, la technologie de fa-brication ainsi que l'affinage agissent demanière significative sur la protéolyse dufromage. À partir de fromage modèle dé-veloppé par Noomen (1978), Youssef(1992) a montré que la production d'acidesaminés était améliorée lorsque le pH dufromage est élevé, le taux de sel bas et latempérature d'affinage haute. Il est vrai-semblable que le potentiel protéolytiquedes souches s'exprime de manière diffé-rente selon les conditions choisies; cet as-pect devrait être pris en compte pour la ca-ractérisation des souches. Il resteégalement à démontrer que les 2 tests quiont été choisis (TNBS et Lap), même lors-qu'ils sont appliqués sur minifromages,sont suffisamment appropriés et discrimi-nants pour que les résultats obtenussoient en relation étroite avec la nature etl'intensité de la protéolyse observée dansles fromages.

REMERCIEMENTS

Nous remercions JC Gripon et 0 Lebars de lastation de recherches laitières de l'INRA deJouy-en-Josas, pour leurs conseils sur les tech-niques de mesures de l'activité protéolytiquedes bactéries lactiques, A Berodier pour la miseau point du dosage de l'activité leucine-aminopeptidase sur fromage, et G Duboz pourla réalisation des fabrications fromagères.

Ce programme a reçu le soutien financier duComité interprofessionnel du gruyère de Comté,de l'Association pour le développement de la re-cherche dans l'industrie laitière et de l'Associa-tion nationale pour la recherche et la technolo-gie (bourse CIFRE de Y Bouton, conventionn012/89).

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