actividad antifúngica de metabolitos bacterianos frente a
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Universidad central “Marta Abreu” de Las Villas
Departamento de Biología
TESIS DE DIPLOMA
Actividad antifúngica de metabolitos bacterianos
frente a Mycosphaerella fijiensis Morelet
Autora: Eilyn Mena Méndez
Tutora: Dr.C. Yelenys Alvarado Capó
Consultante: MSc. Mileidy Cruz Martín
Santa Clara, 2012
Autora: Eilyn Mena Méndez
Tutora: Dr.C. Yelenys Alvarado Capó
Consultante: MSc. Mileidy Cruz Martín
Santa Clara, 2012
Actividad antifúngica de metabolitos bacterianos frente a Mycosphaerella fijiensis Morelet
TESIS DE DIPLOMA
Cuando quieras emprender algo, va haber un montón de gente que dirá que no lo hagas. Cuando vean que no te pueden detener, te dirán como lo tienes que hacer. Y cuando vean que finalmente lo has logrado, dirán que siempre han creído en ti.
John C. Maxwell
A mi tutora Yelenys Alvarado, por enseñarme a ver las cosas desde otro punto de
vista
A Mileidy Cruz, por su amistad y ayuda constante
A los compañeros del laboratorio: Cynthia, Michel, Mayra, Berkis y Yoandy
Al resto de los trabajadores del IBP que me brindaron su ayuda y apoyo
A mi novio Dany, por su paciencia y apoyo incondicional
A mi hermana (Evelyn), tía (Sabina), abuela (María) y padres (Idaimi y Eduardo), por
su colaboración
A los padres de mi novio (Cristina y Abel), por sus consejos
A todos los que han hecho posible la realización de esta investigación,
Muchas gracias.
Dedico este trabajo: A mi familia y a mi novio,
en especial a mi abuela María (Mima)
Resumen
RESUMEN
Las bacterias asociadas a cultivos han sido empleadas para incrementar la nutrición de la
planta y como fuentes de agentes de biocontrol, pero pocas son las investigaciones
relacionadas con la interacción Musa spp.-microorganismo-microorganismo. Por ello, este
trabajo tuvo como objetivo caracterizar la actividad antifúngica de metabolitos producidos por
bacterias frente a Mycosphaerella fijiensis. Con este fin se obtuvieron filtrados de cultivo a
partir de bacterias que inhibieron in vitro el crecimiento del patógeno y se evaluó su efecto
sobre la respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con este hongo. Así como también, se
caracterizó la actividad antifúngica de estos con respecto a la estabilidad ante variaciones de
la temperatura, el pH, susceptibilidad a la desnaturalización proteica por detergentes y
proteinasa K. Además, se semipurificó la fracción proteica mediante la precipitación con
sulfato de amonio (70%) y diálisis con membrana de 12kDa de exclusión. Los filtrados de
cultivo de las cepas, mostraron actividad antifúngica in vitro a partir de las 48 horas de
incubación y tuvieron efecto sobre la respuesta de plantas inoculadas con M. fijiensis en
casa de cultivo, en dependencia de la cepa bacteriana empleada y del momento de su
aplicación. La actividad antifúngica se vio afectada por la temperatura, el pH, así como, en
presencia de detergentes CTAB, Tritón x-100 y Tween-80 y la enzima proteinasa K en
dependencia de la cepa. Estos resultados sugirieron la posible naturaleza proteica de los
metabolitos con actividad antifúngica. Se comprobó que la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo frente a Mycosphaerella fijiensis estuvo relacionada con metabolitos de
naturaleza proteica presentes en su composición.
Palabras claves: actividad antagonista, metabolitos antifúngicos, metabolitos secundarios,
filtrados de cultivo, proteínas, bacterias epífitas.
Abstract
ABSTRACT
Bacteria associated to crop have been employed to increase the nutrition of plants and as
sources of biocontrol agent, but a few investigations are related the interaction Musa spp.-
microorganism- microorganism. For that reason, the aim of this work is to characterize the
antifungal activity of metabolites produced by bacteria against Mycosphaerella fijiensis. With
this objective were obtained cell-free culture filtrate from bacteria who inhibited the pathogen
growth in vitro and was evaluated their effect on the Musa spp. plants response
inoculated with this fungus. As well as, were characterized the antifungal activity of these with
respect to thermal and pH stability, susceptibility to protein denaturing detergents and
proteinase K. In addition, was half-purified protein fraction by means of ammonium sulphate
precipitation to achieve 70% saturation and dialysis with membrane of 12kDa shutting out.
Cell-free cultures filtrate from bacteria, showed antifungal activity in vitro from 48 hours of
incubation and had effect on the Musa spp. plants response
inoculated with this fungus in greenhouse, dependence of the strain bacterium employed and
the moment of its application. The antifungal activity look affected by temperature, pH, as well
as, in the presence of detergents CTAB, Triton x-100 and Tween-80 and enzyme proteinase
K in dependency of the strain. These results suggested the possible protein nature of the
metabolites with antifungal activity. In this study, was verified that the antifungal activity of
cell-free cultures filtrate against Mycosphaerella fijiensis was related with metabolites of
protein nature in its composition.
Keywords: antagonistic activity, antifungal metabolites, secondary metabolites, cell-free
cultures filtrate, proteins, endophytic bacteria.
Índice ÍNDICE Pág.
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………. 1
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA………………………………………………............... 4
2.1 Plátanos y bananos……………………………………………………………….. 4
2.2 Enfermedades del cultivo…………………………………………………………. 4
2.2.1 Mycosphaerella fijiensis…………………………………………………… 5
2.3 Control…………………………………………………………………………….. 7
2.3.1 Control biológico……………………………………………………………. 7
2.3.2 Antagonismo microbiano…………………………………………………. 9
2.3.2.1 Bacterias con actividad antifúngica……………………………. 11
2.4 Bacterias de la filosfera de Musa spp…………………………………………. 13
2.4.1 Bacterias de la filosfera de Musa spp. como agentes de control
biológico……………………………………………………………………
14
2.4.2 Aislamiento de bacterias de la filosfera…………………………………. 14
2.5 Metabolitos y filtrados de cultivo bacterianos…………………………………..
2.5.1 Caracterización de metabolitos con actividad antifúngica………………
2.5.2 Compuestos proteicos con actividad antifúngica………………………..
15
16
17
3. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………………. 19
3.1 Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con antifúngica in vitro frente
a M. fijiensis ………………………………………………………………..
20
3.2 Determinación del efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la
respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con M. fijiensis en casa de
cultivo……………………………………………………………
22
3.3 Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis ……………………..
25
3.3.1 Estandarización del método para evaluar el crecimiento de
M. fijiensis…………………………………….……………………………
26
3.3.2 Determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos…………………………………………….
27
3.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos……………………………………
27
3.3.2.2 Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos………………………………………………...
28
3.3.2.3 Efecto de detergentes sobre la actividad antifúngica de los
Índice filtrados de cultivo bacterianos………………………...………… 28
3.3.2.4 Efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos……………………………………………...
29
3.3.3 Caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis…………………………………….
29
3.3.3.1 Semipurificación de proteínas con sulfato de amonio………….. 29
3.3.3.2 Cuantificación de proteínas totales………………….……………. 30
3.3.3.3 Determinación del peso molecular………………………………... 30
3.3.3.4 Determinación de la actividad quitinasa en geles de agarosa… 30
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………………………………………. 33
4.1 Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con antifúngica in vitro frente
a M. fijiensis ………………………………………………………………………..
33
4.2 Determinación del efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la
respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con M. fijiensis en casa de
cultivo……………………………………………………………………………….
41
4.3 Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis …………………………………………..
51
4.3.1 Estandarización del método para evaluar el crecimiento de
M. fijiensis………………………………………………………… ……….
51
4.3.2 Determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos…………………………………………….
53
4.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos……………………………………
53
4.3.2.2 Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos………………………………………………...
56
4.3.2.3 Efecto de detergentes sobre la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos………………………...…………
59
4.3.2.4 Efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica de los
filtrados de cultivo bacterianos……………………………………………...
62
4.3.3 Caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis…………………………………….
64
4.3.3.1 Semipurificación de proteínas con sulfato de amonio………….. 64
4.3.3.2 Cuantificación de proteínas totales………………….……………. 65
4.3.3.3 Determinación del peso molecular………………………………... 65
Índice 4.3.3.4 Determinación de la actividad quitinasa en geles de agarosa… 66
5. CONCLUSIONES 73
6. RECOMENDACIONES 74
7. REFERENCIAS 75
Introducción
1
1. INTRODUCCIÓN
Los plátanos y bananos (Musa spp.) constituyen el cuarto cultivo económicamente
importante en la alimentación después del arroz (Oryza sativa L.), el trigo (Triticum aestivum
L.) y el maíz (Zea mays L.). La producción mundial anual de plátanos y bananos se
encuentra en el orden de 102 toneladas métricas y para Cuba es de 249 200, lo que
representa el 0,24 % (FAOSTAT, 2011).
Las plantaciones de este cultivo son afectadas por Mycosphaerella fijiensis Morelet
(anamorfo: Pseudocercospora fijiensis Deighton) que causa la Sigatoka negra. Esta
enfermedad es considerada la más perjudicial, ya que provoca una necrosis severa en la
hoja y es difícil de controlar (Churchill, 2010).
El control de la Sigatoka negra está dado principalmente por el manejo cultural y la
aplicación de fungicidas. El control basado sólo en las aplicaciones de fungicidas es posible,
pero a un costo muy elevado para los pequeños y medianos productores y con el riesgo de
generar resistencia en el hongo (Patiño et al., 2007). Por otra parte, el empleo de
agroquímicos no es sustentable, debido a que contaminan el ambiente y el patógeno se ha
hecho resistente a fungicidas como benomil, tiabendazol, azoxistrobina, trifloxistrobina,
propiconazol (Fu et al., 2010); además de estrobilurinas y los inhibidores de desmetilación
(Churchill, 2010). Por ello, se requiere la búsqueda de alternativas que permitan a los
pequeños productores controlar la enfermedad y continuar dentro de la actividad agrícola sin
afectar la sostenibilidad del medio ambiente.
El interés en la conservación del ambiente y la creciente demanda de consumir productos
naturales libres de compuestos químicos, ha impulsado investigaciones relacionadas con el
control biológico de la Sigatoka negra. Con vistas a lo anterior se han propuesto alternativas
como: el uso de microorganismos antagonistas, la adición de sustratos que permitan
incrementar las poblaciones bacterianas y la inducción de resistencia a patógenos (Riveros
et al., 2002).
Introducción
2
El empleo de bacterias antagonistas se centra principalmente en la búsqueda de candidatos
productores de enzimas hidrolíticas (glucanasas y quitinasas), que degraden las hifas del
patógeno. En correspondencia con ello se han realizado investigaciones en géneros
bacterianos productores de quitinasas tales como: Bacillus, Pseudomonas y Serratia; con el
objetivo de purificarlas para el control de hongos, insectos y artrópodos (Rao-Podile y
Neeraja, 2010). Sin embargo, el único producto biológico en el mercado ha sido Serenade®,
elaborado a partir de Bacillus subtilis para el control de hongos (Soffia, 2005).
Aunque se han logrado avances en la búsqueda para el control biológico, a partir de
bacterias nativas de la filosfera, contra Mycosphaerella fijiensis; aún es limitado el
conocimiento de las características de los metabolitos producidos por estas y su efecto sobre
el patógeno. Por ello, se requiere la caracterización de dichos metabolitos y analizar su
efecto antifúngico tanto in vitro como ex vitro. Todo ello, contribuirá a elaborar un bioproducto
menos agresivo al ambiente y al desarrollo de nuevas estrategias para el control de M.
fijiensis.
Teniendo en cuenta las razones expuestas anteriormente se estableció como hipótesis de
trabajo:
A partir de cepas con antagonismo in vitro frente a Mycosphaerella fijiensis y con el
empleo de técnicas bioquímicas y analíticas se podrá caracterizar la actividad antifúngica de
metabolitos presentes en filtrados de cultivo.
Con vistas a ello, este trabajo se propone el siguiente objetivo general:
Caracterizar la actividad antifúngica de metabolitos producidos por bacterias frente a
Mycosphaerella fijiensis.
Para dar cumplimiento a este se plantearon los siguientes objetivos de trabajo:
1. Obtener filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro frente a M.
fijiensis.
Introducción
3
2. Determinar el efecto de los filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de
plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA) inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo.
3. Caracterizar filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro frente a
M. fijiensis.
La tesis se estructuró en los siguientes acápites: Introducción, Revisión bibliográfica,
Materiales y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones, Recomendaciones y
Referencias Bibliográficas. Dentro del texto se intercalaron tablas y figuras.
Revisión Bibliográfica
4
2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1 Plátanos y bananos
Los plátanos y bananos agrupan un gran número de plantas herbáceas del género Musa,
tanto híbridos obtenidos horticulturalmente a partir de las especies silvestres Musa
acuminata y Musa balbisiana como cultivares genéticamente puros de estas especies. El
género Musa pertenece a la familia Musaceae, orden Zingiberales subclase Zingiberidae,
Clase Liliopsida, División Magnoliophyta, Reino Plantae (Simpson, 2006).
La variedad de cultivares de estas especies está dada por la distribución genómica de Musa
acuminata y Musa balbisiana, por lo que existen plantas diploides, triploides y tetraploides
(Roux et al., 2006). La diferencia existente entre plátanos y bananos no se basa en
características botánicas, sino en la forma de consumir la fruta. De forma general, las
bananas son más dulces y se ingieren de forma cruda y los plátanos se consumen cocidos,
generalmente verdes (López, 1989). Constituyen un alimento de alto consumo a nivel
mundial porque contienen una gran cantidad de potasio, además de vitaminas A, E, K, C, B y
aminas biogénicas como la dopamina y la serotonina. Este cultivo es utilizado también para
la producción de alcohol y la extracción de fibras (Simpson, 2006).
2.2 Enfermedades del cultivo
La diversidad genética existente en los plátanos y bananos hace que los patógenos no
ataquen uniformemente a todos los cultivares. Este cultivo es afectado por bacterias,
nemátodos, insectos, virus y hongos.
La bacteria Ralstonia solanacearum Smith, causa el hereque o moko bacteriano del banano.
Entre los nemátodos que atacan los rizomas y causan su podredumbre se encuentran: el
barrenador Radopholus similis Cobb; espirales como Helicotylenchus multicinctus Cobb y el
de la raíz Meloidogyne javanica Orley. Existen insectos como el picudo negro (Cosmopolites
sordidus German) que penetra la base suculenta del pseudotallo y se alimenta de la savia.
Revisión Bibliográfica
5
Además, el trips del banano (Chaetanaphothrips orchidii Haliday) afecta la cáscara de la
banana, por lo cual la pulpa se expone y descompone. También el ácaro del banano
(Tetranychus lambi Koch) afecta el fruto, lo que provoca quebraduras en la cáscara y el
marchitamiento prematuro. Por otra parte, el Virus del mosaico del pepino y Banana bunchy
top virus (BBTV), retrasan el crecimiento de las hojas e inhiben la formación de frutos. Entre
los hongos que afectan el cultivo se encuentra Fusarium oxysporum f. sp cubense Schltdl,
agente causal del mal de Panamá, que provoca el secado de las hojas y que el pseudotallo
se agoste por la muerte progresiva del sistema vascular. Además, Gloeosporium musarum
Cke. & Massee provoca antracnosis, forma lesiones negruzcas en la piel del pseudotallo y
ocasiona la desecación de los frutos (Agrios, 2005). Por otra parte, se encuentran
Mycosphaerella fijiensis Morelet, M. musicola Mulder y M. eumusae Crous, agentes causales
del complejo de enfermedades de la Sigatoka en el plátano. De ellos, M. fijiensis es
considerado el miembro más destructivo, causante de la Sigatoka negra. La enfermedad ha
sido diagnosticada en muchos países bananeros, hasta esparcirse por todo el mundo
(Churchill, 2010).
2.2.1 Mycosphaerella fijiensis
Mycosphaerella fijiensis, perteneciente a la división Ascomycota, es la forma sexual
(telemorfa) del hongo, descrito en 1969 por Morelet. A la forma asexual (anamorfa) se le
llama Pseudocercospora fijiensis descrita por Deighton. La Sigatoka negra destruye el área
foliar, ya que disminuye la capacidad de las hojas para fotosintetizar y como provoca la
maduración prematura del racimo, se reduce la calidad de la fruta. La diseminación de la
enfermedad se hace por medio de esporas (ascosporas para la forma sexual y
conidios para la forma asexual). Los conidios se forman en menor cuantía con respecto a
las ascosporas. Las ascosporas requieren de una película de agua para que ocurra la
diseminación, estas constituyen el primer medio de dispersión a largas distancias y durante
Revisión Bibliográfica
6
épocas lluviosas. Los peritecios maduran cuando los tejidos muertos de la hoja están
saturados con agua por aproximadamente 48 horas (Marín et al., 2003).
Los primeros síntomas de la Sigatoka negra son manchas cloróticas muy pequeñas que
aparecen en el envés de la tercera o cuarta hoja abierta, entre los 14 y 20 días después de la
infección. Las manchas crecen convirtiéndose en rayas de color marrón delimitadas por las
nervaduras. La coloración va haciéndose más oscura y visible en el haz. Cuando el grado de
severidad de la enfermedad es alto, grandes áreas de la hoja pueden ennegrecer y lucir
mojadas. El ciclo de M. fijiensis consiste de cuatro estados distintos que incluyen la
germinación de las esporas, penetración del hospedero, el desarrollo de síntomas y la
producción de esporas (Meredith y Lawrence, 1969).
En el patosistema Musa-M. fijiensis se observan dos tipos de interacciones: interacciones
compatibles, donde se ubican los fenotipos susceptibles y parcialmente resistentes; y las
interacciones incompatibles, donde están los fenotipos altamente resistentes. Las
interacciones compatibles se caracterizan por un desarrollo completo del ciclo infectivo del
patógeno (Figura 1), y las interacciones incompatibles se caracterizan por un bloqueo en el
desarrollo de los síntomas (Mourichon et al., 2000).
Figura 1. Ciclo de la enfermedad en el patosistema Musa-M.fijiensis (Bennett y Arneson, 2003)
Revisión Bibliográfica
7
2.3 Control
Mycosphaerella fijiensis tiene un alto impacto económico, social y ambiental, por lo que su
control ha atraído la atención de muchos investigadores. El manejo de la Sigatoka negra está
dado principalmente por medidas culturales, el uso de cultivares resistentes y el empleo de
productos agroquímicos y compuestos de origen natural.
El control químico se ha llevado a cabo con el uso de fungicidas protectores y sistémicos en
suspensión acuosa, en emulsiones de aceite y agua, o solo con aceite mineral, con
activadores de mecanismos de resistencia del hospedante. Entre los fungicidas más
utilizados se encuentran el mancozeb, mofolinas, estrobilurinas, triazoles (Pérez, 2006).
Según Fu et al. (2010) el control químico de M. fijiensis se basa en la aplicación de
estrobilurinas, triazoles, espiroketalaminas e imidazoles, ya que es resistente a fungicidas
como benomyl, thiabendazol, azoxystrobin, trifloxystrobin y propiconazol, siendo los triazoles
y el procloraz los más efectivos. Churchill (2010) informó la resistencia a estrobilurinas y los
inhibidores de desmetilación por parte de M. fijiensis.
El control empleando fungicidas es a un alto costo para los pequeños y medianos
productores y con el riesgo de generar resistencia en el hongo (Patiño et al., 2007). La
constante aplicación de productos químicos no solo ha hecho más resistente al hongo, sino
que ha alterado las concentraciones de nutrientes en los cultivos. Esto conjuntamente con el
alto costo y las alteraciones del equilibrio ambiental han provocado que el control químico no
sea sustentable. En este sentido, se requiere la búsqueda de alternativas que permitan a los
pequeños productores controlar la enfermedad y continuar dentro de la actividad agrícola sin
afectar la sostenibilidad del medio ambiente (Salazar et al., 2006).
2.3.1 Control biológico
En la agricultura, a nivel mundial, se han hecho cambios con el fin de reducir la
contaminación ambiental. Esto ha sido propiciado por la preferencia de los consumidores de
Revisión Bibliográfica
8
ingerir productos orgánicos de alta calidad. En este sentido, se ha puesto en práctica la
implementación de metodologías enfocadas al control biológico de las enfermedades y
plagas más comunes que afectan las cosechas de importancia económica.
El control biológico es un método del manejo integrado de plagas, enfermedades y malezas
que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de otro
organismo. Además, presenta una serie de ventajas como: el poco efecto nocivo, la rara
resistencia de las plagas, poseen un tiempo de eficacia relativamente largo y la relación
costo/beneficio es favorable (Pérez, 2006)
En adición, existen estrategias como: el uso de microorganismos antagonistas, la adición de
sustratos que permitan incrementar las poblaciones bacterianas, la aplicación de
microorganismos antagonistas que promuevan el crecimiento o induzcan resistencia a
patógenos (Riveros et al., 2002).
El control biológico de la Sigatoka negra es complejo y desafiante debido a la naturaleza
policíclica de la enfermedad. Este surgió como una alternativa, debido a la resistencia de M.
fijiensis a los fungicidas sistémicos y la creciente demanda por mantener un ambiente
seguro. La selección de microorganismos para el control de la Sigatoka negra está enfocado
principalmente en la búsqueda de bacterias capaces de secretar enzimas hidrolíticas para
degradar la pared celular del hongo, teniendo en cuenta además, el potencial para colonizar
la superficie foliar y formar estructuras resistentes que le permitan sobrevivir bajo
condiciones ambientales adversas (Marín et al., 2003).
Con el fin de aumentar las poblaciones nativas de bacterias con actividad lítica sobre M.
fijiensis se han realizado estudios a partir de la modificación de las condiciones físicas y
nutricionales de la filosfera de plátanos y bananos. En base a ello, Arango (2002) aplicó
sustratos como melaza+quitina+leche y quitina+glucano+nitrato de calcio sobre la filosfera
de banano. En este caso, el uso alternado de sustratos con los fungicidas tradicionales
permitieron reducir en un 40% la aplicación de químicos. De forma similar, Patiño et al.
Revisión Bibliográfica
9
(2007) incrementaron las poblaciones de bacterias quitinolíticas y glucanolíticas con
potencial biorregulador sobre M. fijiensis mediante la aplicación de sustratos foliares con
base en quitina coloidal, harina de cebada, urea y una solución mineral base.
Además, como alternativa de control biológico para la Sigatoka negra se han empleado
extractos vegetales con actividad antifúngica. Los extractos metanólicos y de diclorometano
de diferentes familias de plantas como Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae, Solanaceae
empleados por Niño et al. (2007) evidenciaron que algunos agentes protectores o inductores
de resistencia por su actividad antifúngica son: cumarinas, compuestos fenólicos,
flavonoides, saponinas y quinonas. Se determinó, además, que algunos de estos metabolitos
secundarios hacen parte del repertorio de las sustancias que sirven de defensa en las
plantas, como los alcaloides, terpenoides y fenilpropanoides. En esta misma línea de
investigación, estos autores para el 2009 determinaron que los extractos de plantas de las
familias Annonaceae, Apiaceae, Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Clusiaceae,
Costaceae, Euphorbiaceae, Lamiaceae, Malvaceae, Melastomataceae, Moraceae,
Passifloraceae y Urticaceae presentaban también actividad antifúngica. En ese estudio los
extractos de diclorometano más activos fueron los de Ureara ballotaefolia (UTP-150,
Urticaceae) y el de Costus sp. (UTP-187, Costaceae) y el más potente fue el extracto
metanólico de Topobea cf discolor (UTP-160, Melastomataceae) que inhibió el crecimiento
de M. fijiensis tanto en la fase sexual como en la sexual (Niño et al., 2009).
2.3.2 Antagonismo microbiano
El antagonismo microbiano no es más que el enfrentamiento entre dos o más
microorganismos. El control de patógenos mediante el empleo de microorganismos
constituye una línea de investigación a nivel mundial. Existe una interacción continua entre
los patógenos potenciales y sus antagonistas, de forma tal que estos últimos contribuyen a
que en la mayoría de los casos no se desarrolle la enfermedad. En condiciones naturales los
Revisión Bibliográfica
10
microorganismos están en un equilibrio dinámico en la superficie de las plantas (Fernández-
Larrea, 2001). Por ejemplo, Cain et al. (2000) demostraron que cepas pertenecientes al
género Burkholderia inhibían el crecimiento de otras bacterias, hongos, levaduras y
protozoos. En este caso la inhibición no estaba dada por el contacto celular o la presencia de
células vivas, sino por la actividad antimicrobiana que se produce por excreción de
compuestos extracelulares.
Otro ejemplo lo constituyen los hongos Trichoderma y Gliocladium. Ambos ejercen su acción
mediante varios mecanismos, entre los cuales tiene un rol importante el parasitismo. Son
antagonistas de patógenos de suelos como: Botrytis cinerea Whetzel, Rhizoctonia solani
Kühn, Sclerotium rolfsii Sacc y Sclerotium cepivorum Berk (Fernández-Larrea, 2001), entre
otros.
Varios antagonistas como Burkholderia cepacia (De Costa y Erabadupitiya, 2005),
Trichoderma harzianum (Alvindia y Natsuaki, 2008), Pichia anomala, Candida oleophila
(Williamson et al., 2008), Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomona fluorescens, P. syringae,
P. aeruginosa, P. aureofaciens, P. putida, P. pyrrocinia (Alvindia y Natsuaki, 2009), Pantoea
agglomerans y Flavobacterium sp. (Niroshini-Gunasinghe y Karunaratne, 2009) han sido
seleccionados para el control de enfermedades post cosecha en bananos.
Autores como Osorio et al. (2004), realizaron pruebas de antagonismo sobre ascosporas de
M. fijiensis, con bacterias quitinolíticas aisladas del filoplano de banano en un ensayo in situ
sobre discos de hojas también de esta planta, y encontraron que algunos de los aislados
inhibieron la germinación de las ascosporas o deformaron sus tubos germinativos, hasta en
un 40 y 85% respectivamente. Tal efecto, en parte, fue explicado por la actividad de las
enzimas quitinolíticas sobre la pared del patógeno.
Por otra parte, Arzate-Vega et al. (2006) evaluaron el efecto antagónico de cepas de
Trichoderma spp. sobre M. fijiensis in vitro y en invernadero, donde la inhibición del
crecimiento del patógeno se debió al contacto entre los hongos. Como principal resultado
Revisión Bibliográfica
11
obtuvieron una disminución de los porcentajes de infección en un 70 y 88% para el
experimento del invernadero.
Los antagonistas no tienen un único modo de acción y la multiplicidad de éstos es una
característica importante para su selección como agentes de control biológico. Si el
antagonista posee varios modos de acción reduce los riesgos de desarrollo de resistencia en
el patógeno (Fernández-Larrea, 2001).
El antagonismo de los microorganismos está dado por diferentes mecanismos de acción.
Entre ellos se encuentra la competencia por el nicho ecológico o sustrato, la producción de
antibióticos y la producción de metabolitos que afectan directamente el patógeno o inducen
resistencia sistémica en la planta (Hu et al., 2008; Lian et al., 2008). En este sentido, los
mecanismos de prevención y eliminación del efecto de los patógenos están dados por la
producción de sideróforos, cianuro de hidrógeno, reguladores del crecimiento (giberelina,
auxina, citoquinina, etileno, ácido abscísico), la síntesis de antibióticos o de enzimas que
degradan la pared celular, la solubilización de fosfatos y otros nutrientes (Hayat et al., 2010).
2.3.2.1 Bacterias con actividad antifúngica
Muchos géneros bacterianos han sido objeto de investigaciones por poseer actividad
antifúngica frente a patógenos de plantas. Los más estudiados han sido las bacterias
pertenecientes a los géneros Bacillus, Serratia y Pseudomonas (Marín et al., 2003). Estos
géneros se destacan por sintetizan un gran número de compuestos antimicrobianos, que
afectan el crecimiento de hongos patógenos, por lo que han utilizados tradicionalmente como
agentes de biocontrol tanto las propias bacterias como los metabolitos purificados.
Por ejemplo, ya existe en el mercado el biofungicida Serenade®, efectivo contra la Sigatoka
negra en programas integrados con fungicidas convencionales. Este funciona frente a M.
fijiensis por la acción biológica de la cepa Bacillus subtilis Cohn QST 173 en conjunto con los
lipopéptidos que esta bacteria produce. Estos pertenecen a tres clases específicas: iturinas,
Revisión Bibliográfica
12
plipastatinas y surfactinas (Soffia, 2005). Este producto fue desarrollado por AgraQuest
Inc., con los números de patentes para Estados Unidos 6.060.051; 6.103.228;
6.291.426 y 6.417.163 y con el número de Registro de la EPA 69592-7 (Ceballos,
2009).
La obtención de compuestos a partir del género Bacillus constituye una temática de
investigación en el área del control biológico. Esto se debe al amplio espectro de
microorganismos que puede controlar y a la diversidad de compuestos que producen con
actividad antifúngica. En este sentido, autores como Munimbazi y Bullerman (1998) refieren
cómo Bacillus pumilus Cohn inhibe el crecimiento de Aspergillus spp., Penicillium spp.,
Fusarium spp. y la producción por estos de aflatoxinas, ácido ciclopiazónico, ocratoxina A y
patulina. Además de otras bacterias de este género frente a Aspergillus flavus Link (Moyne
et al., 2001), Magnaporthe grisease Heber, Sclerotinia slerotirum Bary, Rhizoctonia solani,
Alternaria oleracea, A. brassicae y Botrytis cinerea (Liu et al., 2007) y A. solani (Hu et al.,
2008). Igualmente, Paenibacillus lentimorbus Ash NRRL B-30488 fue aislada de la leche de
vaca e inoculada posteriormente en plantas de maíz, pepino (Cucumis sativus L.), sorgo
(Sorghum bicolor L.), trigo y otros cultivos. El resultado fue un incremento en la masa seca,
la promoción del crecimiento de las plantas inoculadas en comparación con aquellas que no
fueron inoculadas con bacterias; además de mostrar competencia con los microorganismos
nativos. La interacción entre Fusarium oxysporum f. sp ciceri y B-30488 mostró que la
bacteria degradaba las hifas del hongo debido a la producción de enzimas hidrolíticas:
quitinasas y β-1,3-glucanasas (DasGupta et al., 2006). En correspondencia con ello, Rao-
Podile y Neeraja (2010) informaron la producción de quitinasas en géneros bacterianos tales
como: Aeromonas, Arthrobacter, Beneckea, Bacillus, Chromobacterium, Clostridium,
Klebsiella, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces y Vibrio. Los autores plantearon, además,
que en el género Bacillus la actividad quitinasa es eficiente y se han realizado estudios en
varias especies tales como: B. circulans, B. subtilis, B. alvei, B. lentus, B. cereus, B.
Revisión Bibliográfica
13
licheniformis y B. thuringiensis. Por otra parte, se han utilizado productos volátiles producidos
por B. megaterium Cohn para controlar el nemátodo Meloidogyne incognita (Huang et al.,
2009). Además, se han empleado lipopéptidos antibióticos de B. subtilis para el control de
enfermedades causadas por Fusarium graminearum en maíz y trigo (Chan et al., 2009).
2.4 Bacterias de la filosfera de Musa spp.
El término filosfera fue propuesto por Last en 1955 y Ruinen un año después, para describir
la superficie de las hojas de las plantas como un ambiente que es física, química y
biológicamente diferente del resto de la hoja o del ambiente exterior que lo rodea
(Riederer y Muller, 2006).
Las bacterias asociadas a la hoja pueden estar localizadas en el tejido laminar o
particularmente en las cámaras subestomáticas, en espacios intercelulares y en sitios
protegidos en la superficie de la hoja (Jacques y Morris, 1995). Los microorganismos
endófitos son aquellos que tienen todo o parte de su ciclo de vida invadiendo el tejido de la
planta. Las bacterias epifíticas son las representantes mayoritarias de las filosfera y su
densidad se ha sido estimada entre 106 y 107 unidades formadoras de colonia (UFC)/cm2 en
una hoja típica (Gnanamanickam e Immanuel, 2007).
Salazar (2005) realizó un análisis químico de la cantidad de minerales, carbohidratos y
proteínas existentes en la filosfera de diferentes cultivares de Musa spp. en Urabá,
Colombia. Para todos los cultivares evaluados, esta presentó pobreza en la mayoría de
los minerales, con excepción del sodio, potasio y fósforo. Según Salazar et al. (2006) el
contenido de carbohidratos y proteínas en la filosfera es inferior al 0,05%; por lo que
constituye un ambiente oligotrófico, donde las concentraciones de nutrientes son bajas. A
pesar de que constituye un microclima extremo con variabilidad en los parámetros climáticos
como la intensidad de la luz y la temperatura (Gnanamanickam e Immanuel, 2007) existen
bacterias capacitadas para vivir ahí, debido a sus estrategias de supervivencia.
Revisión Bibliográfica
14
Según Suda et al. (2009) las comunidades de microorganismos presentes en la filosfera,
fluctúan en dependencia del cultivo y del ambiente. A pesar de los estudios realizados, poco
es el conocimiento sobre la interacción entre la comunidad de hongos y bacterias en la
filosfera, en contraste con los conocimientos que se tienen acerca de la rizosfera.
2.4.1 Bacterias de la filosfera de Musa spp. como agentes de control biológico
Un método dentro del manejo integrado de plagas lo constituye la aplicación de agentes de
control biológico (Pérez, 2006). Se han realizado algunas investigaciones basadas en la
búsqueda de antagonistas nativos de la filosfera de musáceas. Por ejemplo, Osorio et al.
(2004), realizaron una selección de bacterias quitinolíticas nativas del Urabá antioqueño,
Colombia, con potencial antagonista contra M. fijiensis. De los aislados encontraron
algunas con capacidad para producir enzimas quitinolíticas y glucanolíticas, que afectaron la
germinación de las ascosporas del hongo en un 42% y deformaron sus tubos germinativos
en un 87%. Por otra parte, Salazar (2005) efectuó una determinación parcial de las
bacterias epífitas aisladas de la filosfera de Musa spp. En este proceso, se seleccionaron
80 cepas quitinolíticas y 15 glucanolíticas, con potencial biorregulador contra M. fijiensis. El
estudio mostró que se encontraron bacilos Gram negativos de forma predominante y bacilos
y cocos Gram positivos. Por su parte, Alvindia y Natsuaki (2009) lograron reducir
significativamente la incidencia de la podredumbre de la corona en bananos aplicando,
poscosecha, Bacillus amyloliquefaciens aislado de la superficie del fruto. Estos autores
demostraron así, que la microbiota nativa puede influir en el crecimiento de los patógenos y
reducir las enfermedades foliares de los cultivos.
2.4.2 Aislamiento de bacterias de la filosfera
Existen diversos métodos para aislar bacterias de la filosfera. Su selección adecuada está en
estrecha correspondencia con el fin de la investigación, ya que presentan ventajas y
Revisión Bibliográfica
15
desventajas. Según Jacques y Morris (1995) los métodos se clasifican en directos o
indirectos. Entre los directos se encuentran: la observación al microscopio de la superficie de
la hoja y el análisis sobre esta. Los indirectos consisten en la impresión de la hoja en medio
de cultivo agar nutriente y la posterior observación microscópica. Existen otros métodos
como la maceración o pulverización, la emulsión estomática, el lavado en un líquido y la
sonicación, con el fin de aislar los microorganismos adheridos a la superficie y cuantificar el
tamaño de las poblaciones microbianas asociadas a las hojas.
Para el método del lavado de las hojas en un líquido, es importante tener en cuenta la
composición de este, la intensidad y duración del proceso. Generalmente se utiliza solución
amortiguadora de fosfato de sodio estéril 0,1 M a pH=7 y la posterior agitación de las
muestras (Ceballos, 2009). Por otra parte, la maceración de tejido de la hoja, permite una
mayor recuperación de microorganismos ya que son liberados los endófitos también. Este
método tiene como desventaja la posible liberación del contenido celular de la planta,
pudiendo lisar o inhibir el crecimiento de algunos microorganismos (Jacques y Morris, 1995).
2.5 Metabolitos y filtrados de cultivo bacterianos
Los microorganismos utilizados para el control biológico han sido aplicados directamente
sobre la filosfera o a partir de ellos se han obtenido filtrados de cultivo o metabolitos para la
formulación de un bioproducto. La obtención de los metabolitos bacterianos está en
correspondencia con el tipo de molécula en cuestión y los diferentes métodos para la
extracción y purificación existentes. Mediante el uso de filtrados de cultivo bacterianos se ha
logrado la inhibición del crecimiento micelial de diferentes hongos fitopatógenos. Por
ejemplo, Munimbazi y Bullerman (1998) comprobaron la inhibición del crecimiento de:
Aspergillus, Penicillium y Fusarium, a partir del uso de filtrados de cultivo de B. pumilus. De
forma similar, han sido empleados a partir del género Bacillus frente al patógeno Curvularia
lunata (Basha y Ulaganathan, 2002), en un estudio de la cepa B.subtilis QM3 frente a
Revisión Bibliográfica
16
Alternaria solani (Hu et al., 2008) y en B. subtilis cepa B 106 contra la Sigatoka amarilla (Fu
et al., 2010).
Por otra parte, se han aislado y caracterizado metabolitos de naturaleza proteica con
actividad antifúngica lo que constituye un avance para la posterior elaboración de productos
de biocontrol. Un ejemplo es la producción de metabolitos difundidos por parte de B.
amyloliquefaciens RC2 (Hatakeda y Shirata, 2001) así como en la obtención de
bacillomycina D, una iturina contra Aspergillus flavus (Moyne et al., 2001) o de bacisubina, a
partir de la cepa B-916 de Bacillus subtilis, con actividad inhibitoria del crecimiento micelial
de Magnaporthe grisease, Sclerotinia sclerotioum, Rhizoctonia solani, Alternaria oleracea
Milbr, A. brassicae Berk y Botrytis cinerea (Liu et al., 2007).
2.5.1 Caracterización de metabolitos con actividad antifúngica
La caracterización de metabolitos con actividad antifúngica se realiza con el fin de determinar
su naturaleza química y su estabilidad ante factores abióticos, para la optimización en la
producción y el escalado en la elaboración de productos de biocontrol, así como, para la
dilucidación de los mecanismos por los que ejercen la actividad antifúngica. Para ello, se
analiza la pérdida o no de actividad antifúngica ante diferentes valores de pH y temperatura,
la degradación de estos por enzimas o detergentes, además de su solubilidad en solventes
orgánicos o inorgánicos. Por ejemplo, Munimbazi y Bullerman (1998) determinaron la
estabilidad de metabolitos antifúngicos producidos por B. pumillus a 121°C, además de
analizar la pérdida o no de actividad antifúngica ante diferentes valores de pH (2, 4, 6, 8 y
10). También, evaluaron la resistencia a la hidrólisis por enzimas, la sensibilidad ante
detergentes (aniónicos, catiónicos y no iónicos) y la solubilidad en solventes orgánicos. Los
autores determinaron que los metabolitos producidos por B. pumillus eran estables ante
variaciones de la temperatura, el pH, resistentes a la hidrólisis enzimática y a la acción de
algunos de los detergentes empleados.
Revisión Bibliográfica
17
De igual forma Lee et al. (2008) caracterizaron metabolitos antifúngicos producidos por
Paenibacillus lentimorbus respecto a la estabilidad térmica a 60°C y 121°C, a valores de pH
(2 y 13), la desnaturalización por detergentes y enzimas. Los resultados mostraron que solo
hubo pérdida de la actividad cuando los metabolitos fueron sometidos a 121°C, el detergente
CTAB y la lisozima. Por su parte, Hu et al. (2008) determinaron el efecto de la temperatura
(25, 60, 100 y 121°C) sobre la producción de compuestos por una cepa de B. subtilis, donde
solo se afectó la actividad a temperaturas altas. Por otra parte, Fu et al. (2010) analizaron el
efecto del tiempo, la temperatura, el pH y el crecimiento en diferentes medios de cultivo
sobre la actividad inhibitoria de la cepa B 106 de B. subtilis frente a Pseudocercospora
musae. Los autores, seleccionaron un tiempo de incubación, con una temperatura, pH y
medio de cultivo óptimo para potenciar la actividad antifúngica de esta cepa bacteriana.
Por otra parte, para la caracterización de metabolitos, se puede determinar su estructura por
resonancia magnética nuclear (NMR) y espectroscopia de masa (MS). Existen también
pruebas para analizar la actividad hidrolítica (celulasa, pectinasa, fosfatasa, proteolítica o
lipasa), la producción de ácido indol acético (AIA) y cianuro de hidrógeno (HCN), además de
la detección de genes que codifican para antibióticos, por PCR (del inglés: Polymerase Chain
Reaction) (Sunish Kumar et al., 2005). Además, los autores determinaron que el metabolito
producido por Pseudomona aeruginosa PUPa3 era fenazin-1-carboxamida según los
resultados de la NMR (del inglés: Nuclear Magnetic Resonance) y MS (del inglés: Mass
spectroscopy), además de la producción de AIA, sideróforos, fosfatasas y proteasas.
2.5.2 Compuestos proteicos con actividad antifúngica
Entre los metabolitos bacterianos con actividad antifúngica se destacan los de naturaleza
proteica, entre los que se encuentran enzimas líticas y péptidos antibióticos. Por ejemplo,
Lee et al. (2008) caracterizaron los metabolitos extracelulares de naturaleza proteica
Revisión Bibliográfica
18
producidos al final de la fase exponencial, previamente semipurificados, a partir de
Paenibacillus lentimorbus.
Estudios de péptidos antimicrobianos frente a M. fijiensis evidencian que estos son capaces
de inhibir procesos celulares específicos, causar formación anormal del tubo germinativo e
inhibir el crecimiento micelial del patógeno (Vásquez et al., 2009).
Las bacterias del género Bacillus han sido empleadas para el control biológico, debido a la
capacidad para producir metabolitos secundarios con un amplio espectro de actividad
antibiótica. B. subtilis sintetiza pequeños péptidos no ribosomales entre los que se
encuentran: iturina, surfactina, fengicina, plipastatina (Moyne et al., 2001) además de
bacisubina (Liu et al., 2007).
Entre los compuestos liberados al medio de cultivo por las bacterias con actividad
antifúngica, se encuentran enzimas que degradan la pared de ascomicetos y basidiomicetos.
Por ello, para el control de Mycosphaerella fijiensis entre los métodos más empleados se
encuentra el potenciamiento de la colonización de bacterias glucanolíticas o quitinolíticas,
nativas de la filosfera de banano, a través de sustratos foliares (Peláez et al., 2006).
Materiales y Métodos
19
3. MATERIALES Y MÉTODOS
El trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Aplicada del Instituto de Biotecnología
de las Plantas (IBP) de la Universidad Central ¨Marta Abreu¨ de Las Villas (UCLV), en el
período comprendido entre los años 2010-2012.
Aislado de Mycosphaerella fijiensis
El aislado de M. fijiensis empleado en todos los ensayos fue el CCIBP-Pf-83 perteneciente a
la Colección de Cultivos Microbianos del Laboratorio de Microbiología Aplicada del IBP. Para
su cultivo el aislado fue inoculado en Enlermeyers de 100 mL de volumen con 50 mL de
Caldo Papa Dextrosa (PDB) e incubado en agitación a 120 rpm y 28oC, durante 15 días.
Cepas bacterianas
Para el estudio se emplearon 19 cepas bacterianas pertenecientes a la Colección de Cultivos
Microbianos del IBP. Estas fueron aisladas de la filosfera de Musa spp. y se seleccionaron
previamente por poseer actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis (Poveda et al.,
2010). Además, se incluyó en todos los ensayos la cepa de Bacillus subtilis (CCIBP-M27),
aislada como contaminante del cultivo in vitro, con actividad antifúngica in vitro frente a este
patógeno (Cruz-Martín et al., 2010).
Material vegetal
Se utilizaron plantas de Musa spp., pertenecientes al cultivar ‘Grande naine’ (Musa AAA),
propagadas in vitro vía organogénesis según el protocolo descrito por Orellana (1994).
Procesamiento estadístico de los datos
El procesamiento estadístico de los datos de las variables evaluadas se realizó con el
paquete estadístico Statistic Package for Social Science (SPSS) versión 19,0 para Windows.
Las pruebas utilizadas para cada ensayo, previa comparación de normalidad y
heterogeneidad de varianza, se detallan más adelante.
Materiales y Métodos
20
3.1 Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro
frente a M. fijiensis
Para obtener filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro frente a M.
fijiensis se procedió como se describe a continuación:
a. Selección de cepas con mayor actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis
b. Curva de crecimiento en medio de cultivo líquido
c. Obtención de filtrados de cultivo y comprobación de la actividad antifúngica frente a
M. fijiensis.
Selección de cepas
Para comparar la actividad antifúngica de las cepas frente a M. fijiensis se empleó el método
de cultivo dual. Se prepararon placas de Petri (90,0 mm) para el cultivo dual como se
describe a continuación. En un Erlermeyer con 200 mL de Papa Dextrosa Agar (PDA)
(Duchefa) fundido a 40oC se añadieron 20 mL de una suspensión micelial de M. fijiensis
(para una concentración final de 5,0x105 fragmentos de micelio/mL). Se homogenizó la
mezcla y se vertió en las placas de Petri. Cuando las placas estuvieron secas, se añadieron
en el centro de la placa 7,0 µL de cada suspensión bacteriana (un cepa por placa de Petri)
ajustada a DO600=0,1 (Eppendorf Biophotometer), a partir de cultivos bacterianos de 24 horas
de crecidos en Agar Nutriente (AN). Como control se emplearon 7,0 µL de agua desionizada
estéril en lugar de la suspensión bacteriana. Las placas se incubaron a 28ºC durante 72
horas.
La evaluación se realizó mediante la medición del halo de inhibición (mm) del crecimiento del
patógeno a las 72 horas de incubación. Se emplearon tres réplicas por cada cepa bacteriana
y el ensayo se repitió tres veces. Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente
mediante las pruebas de Kruskal-Wallis y Mann Whitney, previa comprobación de los
supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.
Materiales y Métodos
21
Se clasificaron como positivas las cepas bacterianas que produjeron halo de inhibición del
crecimiento del patógeno. Además, se realizó observación microscópica de las hifas del
patógeno presentes en la zona de inhibición, para describir sus características.
A partir de los resultados de este acápite se seleccionaron cuatro cepas bacterianas para
continuar los experimentos.
Curva de crecimiento en medio de cultivo líquido
Para obtener un filtrado de cultivo con actividad antifúngica, se elaboró la curva de
crecimiento de las cepas en medio de cultivo Caldo Nutriente (CN) (BioCen).
Se empleó como inóculo 1,0 mL de suspensión bacteriana ajustada a DO600nm=0,1
(Eppendorf Biophotometer) (~ 109 ufc/mL) en Erlenmeyers con 100 mL de medio de cultivo.
Las muestras se incubaron a 30ºC, a 120 rpm durante 72 horas.
Cada ocho horas y hasta las 72 horas se midió la absorbancia a DO600nm con un
espectrofotómetro (Eppendorf Biophotometer). Como blanco se empleó el medio de cultivo
sin inocular. Se realizaron tres réplicas para cada una de las cepas y el experimento se
realizó dos veces. Las curvas de crecimiento (Absorbancia a DO600nm en función del tiempo),
se realizaron con el software Curvaexpert.
Obtención de filtrados de cultivo y comprobación de la actividad antifúngica frente a M.
fijiensis
Teniendo en cuenta la curva de crecimiento de las cepas a las 24 y 48 horas de incubación
los cultivos bacterianos se centrifugaron por 15 minutos a 4ºC y 10 000 rpm (Eppendorf
Centrifuge 5810 R). Para eliminar las células bacterianas, el sobrenadante fue filtrado (0,22
µm) y se conservó a 4ºC. El sobrenadante libre de células bacterianas se denominó filtrado
de cultivo bacteriano.
La actividad antifúngica in vitro de cada filtrado se comprobó mediante el método de dilución
en Agar (dilución 1:1). Para ello, se utilizó una placa de 96 pocillos en base a resultados
previos no mostrados. En cada pocillo se colocaron 125 µL de una suspensión micelial de M.
Materiales y Métodos
22
fijiensis en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (Duchefa) (para una concentración
final aproximada de 5,0x105 fragmentos de micelio/mL) y 125 µL de filtrado de cultivo estéril
de cada una de las cepas. En el control se aplicó, en lugar de los filtrados bacterianos, 125
µL de medio de cultivo CN. Las placas se incubaron a 28ºC y oscuridad durante 48 horas y
se colocaron ocho réplicas por tratamiento. Se informó que los filtrados tenían actividad
antifúngica si se observaba inhibición del crecimiento micelial con respecto al control, según
lo descrito por Poveda (2009).
Se seleccionó el tiempo de incubación (24 o 48 horas) de las suspensiones bacterianas de
las cepas seleccionadas, donde todos los filtrados de cultivo presentaron actividad
antifúngica.
3.2 Determinación del efecto de los filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta
de plantas de Musa spp. inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo
Con el objetivo de determinar el efecto de los filtrados de cultivo bacterianos, con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis, en plantas de ‘Grande naine’ (Musa AAA) inoculadas
con este patógeno en casa de cultivo se desarrolló este experimento. Los filtrados de cultivo
bacterianos para la inoculación se obtuvieron como se describió en el acápite anterior.
Se emplearon dos tratamientos para cada una de las cepas: 1) inoculación de los filtrados de
cultivo bacterianos de cada cepa tres días antes (A) de la inoculación con M. fijiensis y 2) la
aplicación de los filtrados de cultivo tres días posteriores (D) a la inoculación de M. fijiensis.
Para un total de nueve tratamientos, incluyendo el control.
Para este estudio se tuvo en cuenta el procedimiento descrito por Leiva-Mora et al. (2010)
que se describe brevemente a continuación.
Las plantas se colocaron en bolsas de polietileno con sustrato compuesto por 50% de humus
de lombriz, 30% de compost y 20% de zeolita a una razón de 5:3:2 (v/v). Se mantuvieron en
fase de aclimatización durante 45 días. Posteriormente, se transfirieron a macetas plásticas
Materiales y Métodos
23
de 20 cm de diámetro con 500 mL de capacidad con igual sustrato por 45 días hasta
alcanzar como mínimo 20 cm de altura y tres hojas activas.
En la casa de cultivo el riego se efectuó por aspersión tres veces al día y la iluminación fue
solar, con una media en la intensidad luminosa de 3 841 µmol.m2/s (medido con Extech
Light Meter 401025, USA).
La suspensión micelial de M. fijiensis se ajustó a 5,0x105 fragmentos de micelio/mL. La
inoculación se realizó por la parte abaxial de las hojas y con la ayuda de un pincel tanto para
la inoculación con M. fijiensis como para los filtrados de cultivo. Se inocularon las tres
primeras hojas de cinco plantas para cada uno de los tratamientos, (n=15). Se emplearon
como controles cinco plantas inoculadas con M. fijiensis y medio de cultivo CN. Las plantas
se ubicaron completamente al azar en la casa de cultivo.
La evaluación del desarrollo de la enfermedad se realizó cada siete días hasta los 70 días
posteriores a la inoculación (dpi). Para ello se utilizó la escala propuesta por Alvarado-Capó
et al. (2003) (Figura 2). Según lo propuesto por Leiva-Mora et al. (2010) en cada tratamiento
se determinó las variables epifitiológicas: período de incubación (PI) (días), tiempo de
evolución de los síntomas (TES) (días), tiempo de desarrollo de la enfermedad (TDE) (días) y
área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE). Esta última variable se calculó
de acuerdo con la fórmula propuesta por Shaner y Finney (1977):
Donde: Yi = expresa la severidad (en función del índice de infección acorde con la escala),
Xi =tiempo (días) a la i-ésima observación
y n = número total de observaciones.
El índice de infección (II) se calculó según la fórmula:
Materiales y Métodos
24
donde n= número de hojas en cada nivel de la escala
b= valor de la escala
N= 6 (grados de la escala)
T= número total de hojas evaluadas por plantas, y se utilizará la escala evaluativa que
aparece en la figura 2.
Período de incubación (PI): Tiempo entre la inoculación y la aparición de las primeras
lesiones puntiformes por el envés de la hoja (días).
Tiempo de evolución de los síntomas (TES): número de días entre la aparición de los
primeros síntomas (lesiones puntiformes) y la aparición de manchas necróticas con centros
secos.
Tiempo de desarrollo de la enfermedad (TDE): período entre la inoculación y la aparición
de lesiones maduras (manchas necróticas con centros secos).
Además, se evaluaron los componentes de la resistencia: número de lesiones necróticas y
área de la lesión. Se le determinó el área a 50 lesiones por tratamiento mediante la siguiente
fórmula para una elipse, a partir de mediciones obtenidas con una regla graduada:
donde a=largo de la lesión y b=ancho de la lesión
Materiales y Métodos
25
Figura 2. Descripción de los estados de desarrollo de los síntomas en plantas de Musa spp.
propagadas in vitro inoculadas con suspensión micelial de M. fijiensis de acuerdo con Alvarado-Capó
et al. (2003)
Los valores obtenidos fueron comparados con el control y analizados estadísticamente
mediante las pruebas de Kruskal-Wallis y Mann Whitney, previa comprobación de los
supuestos de normalidad y heterogeneidad de varianza.
3.3 Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in
vitro frente a M. fijiensis
Con el objetivo de caracterizar los filtrados de cultivo obtenidos previamente se desarrollaron
los siguientes experimentos.
Materiales y Métodos
26
3.3.1 Estandarización del método para evaluar el crecimiento de M. fijiensis
Con el objetivo de estandarizar un método que permitiera evaluar el crecimiento de M.
fijiensis en presencia de volúmenes reducidos de filtrado de cultivo bacterianos se comparó
el crecimiento de este patógeno en medio de cultivo líquido en frascos de 250 mL de
capacidad con 100 mL de medio de cultivo (Erlenmeyers) y placas de 96 pocillos. Se
realizaron las dos curvas de crecimiento de M. fijiensis, una a partir de las mediciones de
masa seca (g) del crecimiento micelial en los Erlenmeyer y la otra a partir de la medición de
la absorbancia a DO595nm en placas de 96 pocillos. Se compararon los valores de masa
seca del micelio y de absorbancia.
Para ello, en placas de 96 pocillos estériles, se inocularon por pocillo 250 μL de una
suspensión micelial de M. fijiensis en medio de cultivo cultivo Caldo Papa Dextrosa, pH 5,6;
(para una concentración final aproximada de 5,0x105 fragmentos de micelio/mL). Estas se
incubaron a 28ºC y oscuridad durante diez días. Simultáneamente se inocularon Erlenmeyer
(250 mL de volumen) con 100 mL medio de cultivo PDB, con una suspensión micelial de M.
fijiensis a igual concentración. Los frascos se colocaron en zaranda (Gerhardt), a 28ºC y 120
rpm durante diez días.
Para obtener los valores de masa seca se eliminó el medio de cultivo por filtración y el
micelio se secó en estufa a 60ºC, hasta obtener masa constante. Los valores de Absorbancia
a DO595nm fueron obtenidos mediante un espectrofotómetro (Thermo Labsystems Opsys MR).
Las mediciones se hicieron a los tres, cinco, siete y diez días de incubación.
Finalmente, se determinó la relación entre los valores de absorbancia con respecto a la
masa seca mediante un análisis de regresión lineal según el método propuesto por Broekaert
et al. (1990).
Materiales y Métodos
27
3.3.2 Determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Este ensayo se realizó con el objetivo de determinar la estabilidad de la actividad antifúngica
de los filtrados de cultivos bacterianos, de acuerdo con el efecto de la temperatura, el pH, y
la presencia de detergentes y proteasas. Se emplearon filtrados de cultivos estériles por
filtración, obtenidos de igual forma al acápite 3.1, de las cepas de estudio en el medio de
cultivo y tiempo de incubación seleccionado.
En todos los casos, para determinar la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
expuestos a los diferentes tratamientos, se empleó el método de microdilución en placas de
96 pocillos. Se utilizó una dilución [1:10]; 25 µL de filtrado de cultivo sometido a variaciones
de temperatura, pH y la presencia de detergentes y proteasa respectivamente y 225 µL una
suspensión micelial de M. fijiensis en medio de cultivo PDB (a una concentración de 5,0x105
fragmentos de micelio/mL). Se tomó como control CN estéril sometido a similares
condiciones. Además, incluyó un control de crecimiento, el cual consistía en 225 µL de medio
de cultivo PDB con suspensión micelial de M. fijiensis y 25 µL de CN.
Las placas se incubaron durante el tiempo seleccionado, a 28ºC y oscuridad. La evaluación
se realizó mediante la lectura de absorbancia a DO595nm, en espectrofotómetro (Thermo
Labsystems Opsys MR).
Los valores obtenidos para cada caso, fueron analizados estadísticamente mediante la
prueba de Kruskal-Wallis-Mann Whitney, previa comprobación de los supuestos de
normalidad y heterogeneidad de varianza.
3.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Para determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica, se tomaron 250 µL
de filtrado de cultivo estéril, proveniente de cada una de las cepas bacterianas, y se
Materiales y Métodos
28
colocaron a diferentes temperaturas (-80, 4, 28, 60 y 121ºC) durante 20 minutos. Pasado
este tiempo se inocularon y evaluaron los filtrados según lo descrito en el acápite 3.3.2. Se
utilizaron ocho réplicas por tratamiento.
3.3.2.2 Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
Para determinar el efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos se siguió el protocolo propuesto por Munimbazi y Bullerman (1998). Se
disolvieron los filtrados bacterianos en agua destilada estéril (en proporción 1:1), ajustada a
diferentes pH (2, 4, 6, 7 y 8) y se mantuvieron en estas condiciones durante 20 minutos.
Posteriormente, se mezclaron con la suspensión micelial de M. fijiensis. Se incubaron y
evaluaron según lo descrito en el acápite 3.3.2. Se realizaron cuatro réplicas por tratamiento.
3.3.2.3 Efecto de detergentes sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
Para determinar el efecto de los detergentes sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos se tomaron 100 µL de filtrado estéril y se les añadieron 4 µL de
detergente, para una concentración final de 1%. Los detergentes utilizados fueron: el
aniónico SDS (del inglés: Sodium Dodecyl Sulphate), el catiónico CTAB (del inglés:
Hexadecyltrimethyl Ammonium Bromide), además de los no iónicos Triton x 100 y Tween-80.
Las mezclas se incubaron a 28ºC y oscuridad, durante cuatro horas. Pasado este tiempo, se
mezclaron con la suspensión micelial de M. fijiensis. Se incubaron y evaluaron según lo
descrito en el acápite 3.3.2. Se realizaron tres réplicas por tratamiento.
Materiales y Métodos
29
3.3.2.4 Efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
Para determinar el efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica, se tomaron 950 µL de
filtrado de cultivo estéril, proveniente de cada una de las cepas bacterianas, y se les añadió
50 µL de proteinasa K de Engyodontium álbum (Sigma) (100 µg/mL). Las muestras se
colocaron a 37ºC, durante dos horas. Finalmente, se mezclaron con la suspensión micelial
de M. fijiensis. Se incubaron y evaluaron según lo descrito en el acápite 3.3.2. Además, se
incluyeron los filtrados de cultivo sin presencia de la proteasa. Se realizaron ocho réplicas
por tratamiento.
3.3.3 Caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad antifúngica
in Vitro frente a M. fijiensis
Con el objetivo de obtener metabolitos de la fase proteica de los filtrados, con actividad
antifúngica caracterizados, se realizaron los siguientes experimentos.
3.3.3.1 Semipurificación de proteínas con sulfato de amonio
Para obtener los metabolitos de naturaleza proteica semipuricados, se obtuvo el filtrado de
cultivo esterilizado, para cada una de las cepas bacterianas en estudio, de igual forma al
acápite 3.2.1. Este fue sometido a una precipitación con sulfato de amonio (70%) durante 24
horas en agitación a 4ºC, posteriormente fueron centrifugados a 4ºC por 15 min a 10 000
rpm (Eppendorf Centrifuge 5810 R).
El sobrenandante se desechó y los precipitados fueron resuspendidos en 2 mL de Solución
Amortiguadora (SA) fosfato de sodio (0,01 M, pH=7) (Sigma-Aldrich) y dializados
extensivamente mediante membranas de diálisis de 12 kDa contra la misma SA. Se chequeó
la actividad antifúngica en todas las etapas de purificación de los metabolitos (filtrado de
cultivo y las muestras dializadas) mediante el método de descrito en el acápite 3.3.2.
Materiales y Métodos
30
Además, se realizó observación microscópica de las hifas del patógeno incubadas
conjuntamente con los metabolitos semipurificados, para describir sus características.
3.3.3.2 Cuantificación de proteínas totales
Las proteínas totales semipurificadas fueron cuantificadas mediante el método de Bradford
(1976), respecto a una curva patrón a partir de concentraciones conocidas de BSA (del
inglés: Bovine Serum Albumin), utilizando el reactivo Coomassie Plus-Bradfod Assay
(Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en µg/ml de proteína.
Se emplearon tres réplicas por cada fracción de metabolitos semipurificados y se repitió dos
veces. Los valores obtenidos fueron analizados estadísticamente mediante las pruebas de
Kruskal-Wallis y Mann Whitney, previa comprobación de los supuestos de normalidad y
heterogeneidad de varianza.
3.3.3.3 Determinación del peso molecular
Se realizó una electroforesis de proteínas bajo condiciones desnaturalizantes en gel de
poliacrilamida (12%) (SDS-PAGE) de acuerdo con el procedimiento propuesto por Laemmli y
Favre (1973). Después de la electroforesis, el gel fue teñido con el reactivo Coomassie
brilliant blue (Spectrum). Para determinar el peso molecular de los metabolitos de naturaleza
proteica extraídos de los filtrados bacterianos se compararon las bandas de la corrida
electroforética con el marcador de peso molecular de proteínas proporcionado por
FERMENTA (11-170 kDa). Los resultados se muestran en las bandas obtenidas en la corrida
electroforética.
3.3.3.4 Determinación de la actividad quitinasa en geles de agarosa
Con el objetivo de caracterizar las proteínas presentes en las fracciones proteicas de los
diferentes filtrados bacterianos se determinó la actividad quitinasa. Se utilizó el método
Materiales y Métodos
31
propuesto por Velásquez y Hammerschmidt (2004) en geles de agarosa el cual se describe
brevemente. Se preparó una solución de agarosa al 1% en SA de fosfato de sodio (0,01 M,
pH=7) (Sigma-Aldrich) que se hirvió y posteriormente se le añadió un mililitro de glicolquitina
a 100 mL de la solución del agarosa, para una concentración final al 1%. Se homogenizó
bien la solución y se vertieron 50 mL por placa de Petri (15 cm de diámetro). La agarosa se
dejó solidificar por 20 minutos y en los geles se añadieron 5 µL de los metabolitos
previamente semipurificados. También se colocaron las soluciones de concentraciones
conocidas de quitinasa reactivo de Streptomyces griseus (Sigma) para ser utilizada como
patrón, esta se preparó en SA de fosfato de sodio (Sigma-Aldrich) a concentraciones finales
de 12,5; 25; 50; 100 y 200 µU/mL respectivamente. La placas se incubaron a 37ºC en un
baño de agua, por seis horas en la oscuridad. Después se agregaron 50 mL de SA Tris–HCl
(pH 8,9) a 0,5 M con 0,01% de Calcoflour brightener 28 y se incubó por 10 minutos para
deterner la reacción y teñir el gel. El gel fue lavado dos veces con agua destilada y se dejó
toda la noche en la oscuridad. Para la evaluación se analizó la presencia o no de halo
alrededor del orificio de aplicación de las muestras y se determinó el diámetro de este.
Un esquema general de trabajo se muestra en la figura 3.
Materiales y Métodos
32
Figura 3. Esquema general de trabajo para determinar el efecto de filtrados bacterianos con actividad
antifúngica en la interacción Musa sp.-M. fijiensis en casa de cultivo.
Determinación del efecto de los filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con M.
fijiensis en casa de cultivo
Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica
Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica
in vitro frente a M. fijiensis
Comparación de la actividad antifúngica de cepas bacterianas frente a M.fijiensis
Observación microscópica del micelio de M. fijiensis en la zona de inhibición
Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos
Estandarización de método de evaluación de actividad antifúngica por microdilución en caldo.
Estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos
Semipurificación de los metabolitos con naturaleza proteica con actividad antifúngica
Cuantificación de proteínas totales
Determinación del peso molecular
Determinación de la actividad quitinasa en gel de agarosa
temperatura pH detergentes proteinasa K
Resultados y Discusión
33
4. RESULTADOS y DISCUSIÓN
4.1 Obtención de filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro
frente a M. fijiensis
RESULTADOS
Selección de cepas
Las 19 cepas bacterianas aisladas de la filosfera de Musa spp. y CCIBP-M27 mantuvieron la
actividad antifúngica informada en trabajos previos (Poveda, 2009). El método de cultivo dual
permitió comparar la actividad antifúngica in vitro de las cepas bacterianas frente al aislado
CCIBP-Pf-83 de M. fijiensis (Figura 4).
Figura 4. Actividad antifúngica in vitro de diferentes aislados bacterianos frente a M. fijiensis en cultivo
dual en medio de cultivo PDA, después de 72h de incubación a 28ºC y oscuridad.
Se observaron halos de inhibición bien definidos a las 72 horas de incubación. Los
diámetros de los halos de inhibición fueron diferentes en dependencia de la cepa evaluada.
Estos oscilaron entre 11,2 y 42,0 mm. Las cepas CCIBP-M27, CCIBP-A4, CCIBP-B3 y
CCIBP-C4 produjeron los mayores halos de inhibición del crecimiento de M. fijiensis. Al
comparar el diámetro de los halos de inhibición obtenidos para cada una de las cepas
evaluadas se constataron diferencias significativas entre ellos (Tabla 1).
Control CCIBP-A1 CCIBP-B3 CCIBP-A4
Resultados y Discusión
34
Tabla 1. Actividad antifúngica in vitro de diferentes cepas bacterianas frente a Mycosphaerella fijiensis
(CCIBP-Pf83) en cultivo dual a las 72h de incubación.
Cepas bacterianas Diámetro del halo de inhibición (mm) Rangos medios
CCIBP-M27 41,2 144,4 b
CCIBP-B.1 29,5 78,7 ef
CCIBP-A1 29,1
74,2 f
CCIBP-A2 28,7
72,5 fg
CCIBP-A3 33,0
95,1 de
CCIBP-A4 38,2
138,1 bc
CCIBP-A5 32,0
92,4 de
CCIBP-A6 24,0
45,6 g
CCIBP-B1 29,4
88,2 def
CCIBP-B2 29,7
73,3 f
CCIBP-B3 40,6
155,8 ab
CCIBP-B4 34,5
119,7 bcd
CCIBP-B5 33,8
105,9 cd
CCIBP-C1 35,3
116,2 cd
CCIBP-C2 32,0
95,1 de
CCIBP-C3 36,3
116,2 cd
CCIBP-C4 42,0
165,1 a
CCIBP-C5 35,7
109,3 cd
CCIBP-C6 11,2
9,3 h
CCIBP-C7 36,3
115,3 cd
Valores de rangos medios con letras desiguales indican diferencias entre las medias según Kruskal-
Wallis y Mann Whitney para p <0,05.
Resultados y Discusión
35
Tal como se observó macroscópicamente, en la zona correspondiente al halo de inhibición
del crecimiento fúngico, el micelio no creció. Además, al observarlo al microscopio óptico
(400x), en las hifas se detectaron variaciones en su estructura. Entre ellas predominaron
hinchamiento en el extremo apical y encrespamientos (Figura 5). Esto difirió con lo
observado en el micelio de M. fijiensis sin presencia de crecimiento bacteriano (control).
a) b) c)
d) e) f)
Figura 5. Deformaciones del micelio de M. fijiensis en la zona de inhibición del crecimiento en
presencia de las cepas bacterianas a) Control, b) CCIBP-M27, c) CCIBP-B.1, d) CCIBP-B3, e) CCIBP-
A4 y f) CCIBP-C5. Aumento 400x
En base a los resultados anteriores se seleccionaron cuatro cepas bacterianas (CCIBP-M27,
CCIBP-B3, CCIBP-A4 y CCIBP-C5) con actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis para
CCIBP-B.1
CCIBP-C5
Control
CCIBP-B3 CCIBP-A4
CCIBP-M27
Resultados y Discusión
36
continuar los estudios. En el Anexo 1 y 2 se muestra una descripción de las cepas
empleadas y sus principales características según Poveda (2009).
Curva de crecimiento en medio de cultivo líquido
Las curvas de crecimiento obtenidas, para cada una de los cultivos de las cepas bacterianas,
se muestran en la figura 6 en donde se evidencian las diferentes fases de crecimiento.
a)
S = 0.01578950
r = 0.98945999
Tiempo (horas)
DO
60
0n
m
0.0 8.0 16.0 24.0 32.0 40.0 48.0 56.00.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
0.18
b)
S = 0.01686954
r = 0.95986233
Tiempo (horas)
DO
60
0n
m
0.0 8.0 16.0 24.0 32.0 40.0 48.0 56.00.00
0.02
0.04
0.06
0.08
y = -2.76e-006x3+0.00021x
2-0.0022x+0.0011
CCIBP-M27
y= -2.06e-006x3+0.0002x
2-0.0003x+0.0057
CCIBP-B3
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
Resultados y Discusión
37
c)
S = 0.00601936
r = 0.98283266
Tiempo (horas)
DO
60
0n
m
0.0 8.0 16.0 24.0 32.0 40.0 48.0 56.00.00
0.02
0.04
d)
S = 0.00488215
r = 0.99253130
Tiempo (horas)
DO
60
0n
m
0.0 8.0 16.0 24.0 32.0 40.0 48.0 56.00.00
0.02
0.04
0.06
Figura 6. Curvas de crecimiento de las cepas bacterianas seleccionadas crecidas en Caldo Nutriente e
incubadas a 30ºC y oscuridad a) CCIBP-M27, b) CCIBP-B3, c) CCIBP-A4 y d) CCIBP-C5
Se observaron diferencias entre las cepas en cuanto a la dinámica de crecimiento. En todos
los casos los cultivos bacterianos se encontraron en la fase exponencial de crecimiento a
partir de las 16 horas de incubación. A las 48 horas, los cultivos de las cepas CCIBP-M27,
y= -5.76e-007x3+3.34e-005x
2+0.0007x-0.0026
y= -1.067e-007x3+3.63e-005x
2-0.0007x+0.0008
Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
CCIBP-A4
CCIBP-C5
Resultados y Discusión
38
CCIBP-B3 y CCIBP-A4 se encontraban al final de la fase exponencial o principio de la
estacionaria mientras que CCIBP-C5, en este medio de cultivo y bajo estas condiciones de
crecimiento no alcanzó la fase estacionaria durante el periodo evaluado.
Obtención de filtrados de cultivo y comprobación de la actividad antifúngica frente a M.
fijiensis
A partir de la inoculación de las bacterias seleccionadas en medio de cultivo Caldo Nutriente
y se incubaron 30ºC y 120 rpm se lograron obtener filtrados de cultivo con actividad
antifúngica frente a M. fijiensis.
Los filtrados de cultivos de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-A4 ya a las 24 horas de
incubación, mostraron actividad antifúngica. A partir de las 48 horas de incubación, los
filtrados de cultivo de las cuatro cepas evaluadas inhibieron el crecimiento de M. fijiensis.
A partir de estos resultados se definió las 48 horas como tiempo de incubación de los
cultivos bacterianos de las cepas analizadas para la obtención de filtrados de cultivo con
actividad antifúngica in vitro frente a M. fijiensis.
DISCUSIÓN
El empleo de antagonistas nativos, aislados del mismo hábitat de donde se quiere erradicar
el patógeno, constituye una ventaja para el biocontrol efectivo, ya que están adaptados al
ambiente y les es más fácil colonizar la superficie. En relación con esto, Osorio et al. (2004) y
Salazar et al. (2006) refirieron presencia de bacterias epifitas con potencial biorregulador
contra M. fijiensis en la filosfera de plantaciones comerciales de banano y plátano en Costa
Rica y en Urabá, Colombia. Además, Alvindia y Natsuaki (2008) emplearon hongos nativos
epífitos, aislados de la superficie de frutos de banano, que controlaron patógenos pos
cosecha en este cultivo. Estos mismos autores, demostraron un año después, la actividad
antifúngica de dos cepas de Bacillus amyloliquefaciens, aisladas de la superficie de frutos de
Resultados y Discusión
39
banano frente a Lasiodiplodia theobromae, Thielaviopsis paradoxa, Colletotrichum musae y
Fusarium verticillioides.
La existencia de una zona de inhibición del crecimiento de M. fijiensis, alrededor de la cepa
bacteriana, puede estar dada por la liberación al medio de cultivo de sustancias con actividad
antifúngica producidas por estas. En tal sentido, Fu et al. (2010) determinaron que el posible
mecanismo de las cepas antagonistas para suprimir el crecimiento del organismo patógeno
puede estar dado por la producción de metabolitos excretados al medio. Por otra parte, las
diferencias en el diámetro del halo de inhibición entre las cepas bacterianas con actividad
antifúngica podría deberse a sus características particulares, a la concentración de los
metabolitos excretados o a los diferentes mecanismos de acción que presentan.
Las deformaciones observadas en las hifas de M. fijiensis en la zona de inhibición, en
presencia de las cepas bacterianas pudieran relacionarse con afectaciones de la pared
celular del patógeno, producto de la acción de los metabolitos bacterianos secretados al
medio de cultivo. Estos metabolitos podrían ser enzimas hidrolíticas (quitinasas y
glucanasas), que degradan la quitina y el β-1,3-glucano constituyente de la pared de los
ascomicetos. Por ejemplo, Riveros et al. (2002) demostraron alteraciones de las estructuras
de Mycosphaerella fijiensis por tratamiento con los filtrados de los cultivos líquidos de cepas
de Bacillus sp. y Serratia sp., aisladas de la filosfera de tomate y banano.
Similares daños en las hifas, han sido descritos por otros autores en el enfrentamiento de
microorganismos antagonistas frente a patógenos fúngicos. Por ejemplo, cepas de Bacillus
sp. frente a Curvularia lunata (Bahsa y Kandasamy, 2002) así como filtrados de cultivo de B.
subtilis frente de Fusarium graminearum (Chan et al., 2003). Estos autores atribuyeron las
deformaciones observadas a que probablemente los metabolitos antifúngicos actuaron en la
membrana celular del hongo y alteraron su permeabilidad. Por su parte, Liu et al. (2007)
determinaron deformaciones en la morfología del micelio de Rhizoctonia solani producto de
Resultados y Discusión
40
la acción de una bacisubina, previamente purificada a partir de Bacillus subtilis. Además,
Alvindia y Natsuaki (2009) observaron la formación y ruptura de abultamientos en el extremo
apical de las hifas de Lasiodiplodia theobromae, cuando fueron inoculadas conjuntamente
con Bacillus amyloliquefaciens DGA14 en medio líquido.
Autores como Moreno et al. (2006) observaron el daño y la degradación de la membrana
celular plasmática de Magnaporthe grisea al ser tratado con proteínas antifúngicas
purificadas de Aspergillus giganteus y determinaron que estas proteínas inducían
permeabilización y formación de un poro en la membrana plasmática, penetraban, se
adherían al núcleo y provocaban cambios en la estructura del ADN.
De igual forma, Fernández-Larrea (2001) y Hayat et al. (2010) han determinado que varios
mecanismos de acción pueden operar simultáneamente o la manifestación de un
mecanismo u otro puede estar en correspondencia con las condiciones ambientales. Esto es
importante para la selección de bacterias como agentes de control biológico, ya que la
variedad de estos mecanismos pudiera constituir un reforzamiento de las propiedades
antifúngicas.
La presencia de actividad antifúngica frente a M. fijiensis en el filtrado de cultivo bacteriano,
obtenido a las 48 horas, podría deberse a la producción de metabolitos secundarios, que son
liberados al medio de cultivo. Por ejemplo, Lee et al. (2008) determinaron que la cepa
bacteriana Paenibacillus lentimorbus WJ5 producía metabolitos antifúngicos al final de la
fase exponencial, en este caso la cinética de producción de los metabolitos fue similar que
para la producción de metabolitos secundarios. Durante la fase estacionaria del crecimiento
bacteriano la velocidad se hace cero, debido a la escasez de nutrientes y/o a la acumulación
de productos de desechos inhibitorios. Aunque no se produce crecimiento neto del cultivo,
se mantiene el metabolismo energético y ocurren algunos procesos biosintéticos, como el
Resultados y Discusión
41
metabolismo secundario, que garantiza los niveles energéticos de la célula mediante rutas
metabólicas alternativas (Madigan y Martinko, 2006).
En este sentido, autores como Poveda (2009) determinaron que cepas bacterianas aisladas
de la filosfera de Musa spp. tenían actividad antifúngica a partir de las 48 horas de
incubación. Además, Fu et al. (2010) incubaron la cepa B106 de 24 a 192 horas, a 28ºC, en
agitación y tomaron muestras cada para medir absorbancia a DO625 nm y su actividad
antifúngica. Estos autores, determinaron que el tiempo de incubación de las cepas para la
posterior obtención de los filtrados era de tres a cinco días, lo que estuvo en
correspondencia con la fase estacionaria de crecimiento.
4.2 Determinación del efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de
plantas de Musa spp. inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo
RESULTADOS
En presencia de los filtrados bacterianos aplicados tres días antes (A) o tres días después
(D) de la inoculación con Mycosphaerella fijiensis se observaron síntomas típicos de la
enfermedad en casa de cultivo según lo descrito previamente por Alvarado-Capó et al.
(2003). Sin embargo, se comprobó que la aplicación de estos, tuvieron efecto sobre la
respuesta de plantas inoculadas con M. fijiensis.
El efecto de los diferentes filtrados de cultivo sobre la respuesta de plantas de Musa
inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo a los 70 dpi con respecto al control dependió de
las cepas evaluadas así como del momento de su aplicación (Figura 7).
Resultados y Discusión
42
Figura 7. Efecto de filtrados de cultivo bacterianos sobre la respuesta de plantas de ‘Grande naine’
inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo a los 70 dpi. a) Control, b) CCIBP-M27 A, c) CCIBP-M27
D, d) CCIBP-B3 A, e) CCIBP-B3 D, f) CCIBP-A4 A, g) CCIBP-A4 D, h) CCIBP-C5 A e i) CCIBP-C5 D
a b c
d e
g f
h i
Resultados y Discusión
43
En las plantas del tratamiento control a los 70 dpi las lesiones coalescieron y las hojas se
observaron completamente necrosadas. Similar efecto fue observado en las plantas en
presencia de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-A4 (en ambos momentos de
inoculación) y CCIBP-B3 (aplicado tres días después de la inoculación con M. fijiensis). Sin
embargo, las plantas en presencia de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y
CCIBP-C5 en ambos momentos de inoculación y en la cepa CCIBP-B3 cuando fue aplicado
tres días antes de la inoculación con M. fijiensis se observó tejido verde. En el caso de los
filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 las lesiones se observaron de
forma aislada y nunca coalescieron.
El período de incubación para todas las plantas fue de 15 días. Las demás variables
epifitiológicas propuestas por Leiva-Mora et al. (2010), para los diferentes tratamientos
variaron respecto al control (Tabla 2).
Tabla 2. Variables epifitiológicas evaluadas en plantas de Musa inoculadas con M. fijiensis y filtrados
de cultivo bacterianos, en casa de cultivo
Tratamientos Tiempo de evolución de los síntomas
(TES) (días)
Tiempo de desarrollo de la enfermedad
(TDE) (días)
Control 27 42
CCIBP-M27A 55 70
CCIBP-M27D
M27D
48 63
CCIBP-B3 A 48 63
CCIBP-B3 D 48 63
CCIBP-A4 A 34 49
CCIBP-A4 D 27 42
CCIBP-C5 A 48 63
CCIBP-C5 D 55 70
Resultados y Discusión
44
En todos los casos el patógeno completó el ciclo la enfermedad, ya que se observaron
lesiones necróticas con centro seco en el período evaluado. Sin embargo, las plantas que
fueron inoculadas con los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27A y CCIBP-C5 D no
alcanzaron el estado de síntomas 5 (Hoja con manchas negras con centros secos grises, las
hojas pueden estar completamente necrosadas y colgar del pseudotallo, según escala
cualitativa propuesta por Alvarado-Capó et al., 2003) y se retardó en 28 días la aparición de
lesiones necróticas con centro seco respecto al control. Para el resto de los tratamientos el
TES se retrasó por 21 días, excepto para el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4. Este
aplicado antes de la inoculación de M. fijiensis se retardó una semana, mientras que aplicado
después no difirió con el control.
Cuando se determinó el área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE), se
observó que los valores difirieron en una misma cepa en dependencia del momento de
aplicación del filtrado de cultivo, excepto para la cepa CCIBP-A4 y CCIBP-B3 (Figura 8). Con
los filtrados de la cepa CCIBP-A4 se produjeron las mayores áreas bajo la curva del
progreso de la enfermedad, difiriendo significativamente del resto de los tratamientos. Es de
destacar que los valores más bajos se observaron en los tratamientos donde se aplicaron los
filtrados de las cepas CCIBP-M27antes y CCIBP-C5 después de la inoculación de M. fijiensis
y que difirieron significativamente del control.
Resultados y Discusión
45
Figura 8. Área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) para los diferentes tratamientos
aplicados en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo (Medias con
letras desiguales difieren según prueba de Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
En cuanto a la evaluación de los componentes de la resistencia, se observaron diferencias
significativas respecto al número y el área de las lesiones necróticas en plantas de Musa
spp. inoculadas con M.fijiensis al ser tratadas con filtrados de cultivo bacterianos.
En este caso también el efecto de los filtrados de cultivo se vio influenciado por el momento
de su aplicación. Fue encontrada una reducción significativa del número de lesiones
necróticas a los 49 dpi para todos los tratamientos con relación al control a excepción del
tratamiento con el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4 aplicado tres días después (Figura
9). Este último fue 59% superior al control. El menor número de lesiones necróticas se
observó en los tratamientos con filtrado de cultivo de las cepas CCIBP-M27 A y CCIBP-C5 D,
siendo 88 y 86% respectivamente menor respecto al control.
Resultados y Discusión
46
Figura 9. Número de lesiones necróticas por hojas en plantas de ‘Grande naine’ inoculadas con M.
fijiensis en casa de cultivo a los 49 dpi y con filtrados de cultivos bacterianos de cepas con actividad
antifúngica in vitro frente a M. fijiensis (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y
Mann Whitney para p< 0,05)
Aunque el número de lesiones necróticas por hoja inoculada disminuyó en las que se
aplicaron filtrados de cultivo bacterianos, excepto el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4
aplicado después de la inoculación con M. fijiensis, su área se mantuvo igual o se
incrementó significativamente excepto para el tratamiento con el filtrado de cultivo de CCIBP-
C5 aplicado antes de la inoculación con el patógeno (figura 10).
Resultados y Discusión
47
Figura 10. Área de las lesiones necróticas ocasionados por M. fijiensis en hojas de plantas de ‘Grande
naine’ (Musa AAA) inoculadas con diferentes filtrados de cultivo bacterianos en casa de cultivo a los
49 días después de la inoculación (dpi) (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y
Mann Whitney para p< 0,05)
En la tabla 3 se muestra un resumen de los resultados obtenidos para cada una de las
variables evaluadas en la determinación del efecto de los filtrados de cultivo de las cepas
bacterianas sobre la respuesta de plantas de Musa sp. inoculadas con M. fijiensis en casa de
cultivo.
a
d
ab a
b b c c
Resultados y Discusión
48
Tabla 3. Resumen de las variables epifitiológicas y del componente de la resistencia para las plantas
de ‘Grande naine’ (Musa AAA). inoculadas con M. fijiensis y filtrados de cultivo de cepas bacterianas
respecto al control (planta inoculada con M. fijiensis)
Variables CCIBP-M27 CCIBP-B3 CCIBP-A4 CCIBP-C5
Antes Después Antes Después Antes Después Antes Después
TES ++ + + + + = + ++
TDE ++ + + + + = + ++
ABCPE + = = = = = = +
Número de lesiones
necróticas
++ + + + + - + ++
Área de las lesiones
necróticas
- - - - + = + =
Respuesta relativa con respecto al control. Positiva (+), negativa (-), igual (=)
DISCUSIÓN
Los filtrados de cultivo bacterianos influyeron en la respuesta de las plantas inoculadas con
M. fijiensis y dependió de la cepa y del momento de su aplicación, posiblemente por los
mecanismos de acción sobre el patógeno (inhibición del crecimiento) o la planta (inducción
de resistencia). De esta manera se constató que las cepas con actividad antifúngica in vitro
también mostraron actividad in vivo. Es de destacar que los filtrados de cultivo bacterianos
aplicados no contenían preservantes, conservantes ni estabilizantes que los protegieran de
la acción de la luz, el sol, el agua de riego, entre otros factores ambientales a los que
estuvieron expuestos. En tal sentido, Chan et al. (2003) plantearon que la selección in vivo
Resultados y Discusión
49
permite observar la actividad del potencial biocontrolador en un medio similar al que se
desenvolverá en el campo.
Las variables epifitiológicas evaluadas, para el tratamiento con el filtrado de cultivo de la
cepa CCIBP-A4 no mostraron diferencias significativas respecto al control. Esto pudo estar
dado por la pérdida de la actividad antifúngica en casa de cultivo, a pesar de presentar
actividad antifúngica in vitro. Este comportamiento no se observó para ninguna de las otras
bacterias en estudio. Según Chan et al. (2003) los ensayos de difusión en agar son un
método de selección para microorganismos antagonistas, ya que es práctico para probar un
amplio número de aislados respecto a los ensayos en plantas. Sin embargo los ensayos en
planta son esenciales para verificar la efectividad del potencial candidato, ya que la actividad
in vitro puede no estar correspondida con el biocontrol in vivo. Esto puede estar relacionado
con la exposición de los compuestos antimicrobianos a factores bióticos como la
temperatura, el agua, la luz, entre otros.
El hecho de que las plantas tratadas con el filtrado de cultivo bacteriano de las cepas CCIBP-
M27 aplicado antes y CCIBP-C5 aplicado después de la inoculación con el patógeno, no
alcanzaron el estado de síntomas 5, pudo ser debido al mecanismo de inducción de la
resistencia. El análisis del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) indicó
que con excepción de los filtrados de cultivo bacterianos de las cepas CCIBP-M27 aplicado
antes y CCIBP-C5 aplicado después de la inoculación con el patógeno, el resto no mostró
diferencias significativas respecto al control. Estos resultados expresan la importancia del
ABCPE, para poder determinar el incremento temporal de la progresión de la enfermedad en
plantas de Musa inoculadas artificialmente con M. fijiensis en casa de cultivo y así poder
diferenciarlas ante diferentes tratamientos antifúngicos.
En este estudio se implementó por vez primera el ABCPE para evaluar cuantitativamente la
respuesta de plantas de Musa inoculadas artificialmente en casa de cultivo con M. fijiensis y
Resultados y Discusión
50
sometidas a diferentes tratamientos con filtrados de cultivo bacterianos, con actividad
antifúngica in vitro. Esta variable ha sido empleada con otros fines, por ejemplo, Jeger y
Viljanen-Rollinson (2001), mostraron el uso del ABCPE para evaluar la resistencia a
enfermedades causadas por varios patógenos fúngicos en diferentes cultivos económicos.
Estos autores concluyeron que esta variable es útil para determinar la resistencia cuantitativa
frente a diversas enfermedades en evaluaciones sucesivas. Comúnmente, el ABCPE se
utiliza para determinar la efectividad de fungicidas en el control de enfermedades foliares en
condiciones de campo, causadas por especies del género Mycosphaerella (Young et al.,
2006; Burke y Dunne, 2008), así como en la evaluación de la resistencia a enfermedades
fúngicas (Phillips et al., 2005; Eshraghi et al., 2007) y Leiva-Mora et al. (2010) la utilizó para
diferenciar genotipos en cuanto a la resistencia a este patógeno en casa de cultivo.
A los 70 días después de la inoculación con el patógeno, las plantas tratadas con los filtrados
de cultivo bacterianos de las cepas CCIBP-M27 (aplicado antes) y CCIBP-C5 (aplicado
después de la inoculación con el patógeno) y en menor grado el filtrado de cultivo bacteriano
de CCIBP-B3 (aplicado antes de la inoculación con el patógeno) mostraron tejido verde
fotosintético, lo que no sucedió con el resto de los filtrados de cultivo bacterianos. En estos
casos, fue evidente el potencial de estos filtrados de cultivo como control biológico de M.
fijiensis en casas de cultivo. Es probable, para estos casos, que los compuestos que se
liberan al medio de cultivo tengan acción inhibitoria directamente sobre el patógeno, como se
observó en los experimentos in vitro, pero además sean inductores de la resistencia al ser
inoculados sobre plantas.
Atendiendo a los resultados en la evaluación de los componentes de la resistencia, el menor
número de lesiones necróticas a los 49 dpi observado en las plantas inoculadas con el
filtrado de cultivo de CCIBP-M27 (aplicado antes) y CCIBP-C5 D (aplicado después) estuvo
en correspondencia con los resultados en las variables epifitiológicas, debido quizás a la
Resultados y Discusión
51
inducción de resistencia sistémica. En los tratamientos, el área de las lesiones necróticas a
los 49 dpi mayores respecto al control, pueden estar dadas por una respuesta de
hipersensibilidad en la planta. Al comparar este resultado con los obtenidos para el número
de lesiones necróticas, se evidenció de forma general que los tratamientos presentaban un
menor número de las lesiones pero con área mayor. Sin embargo, se requieren estudios
posteriores para confirmar este resultado.
La inducción de resistencia sistémica en plantas ha sido objeto de estudio de varias
investigaciones. Su aplicación es importante para combatir enfermedades difíciles de
controlar. Autores como, Ferreira et al. (2007) hicieron un estudio del papel de las proteínas
de defensa en las plantas en la patogénesis fúngica, donde se analizan cada una de las
proteínas antifúngicas involucradas; entre las que se encuentran las glucanasas y quitinasas.
Por otra parte, Pavlo et al. (2011) utilizaron bacterias endofíticas aisladas de la filosfera de la
papa en la inducción de resistencia en este cultivo, a partir de la inoculación del esqueje de
la planta con la suspensión bacteriana. En este caso el patógeno fue inoculado en la planta
tres semanas después y se redujo su crecimiento en un 50%.
4.3 Caracterización de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in
vitro frente a M. fijiensis
RESULTADOS
4.3.1 Estandarización del método para evaluar el crecimiento de M. fijiensis
Las curvas de crecimiento de M. fijiensis en medio de cultivo PDB, obtenidas a partir de los
valores de masa seca y absorbancia a DO595nm como medida del crecimiento del hongo, se
muestran en la figura 11. Se observó incremento en la masa del micelio y en la turbidez del
medio de cultivo a medida que transcurrió el tiempo.
Resultados y Discusión
52
a)
b)
Figura 11. Curvas de crecimiento de M. fijiensis en medio de cultivo líquido a) por medida de la
absorbancia a 595 nm b) a partir de valores de masa seca (g).
Se encontró una relación lineal entre la Absorbancia a 595 nm del crecimiento de M. fijiensis
en medio de cultivo respecto a la masa seca (g) (Figura 12). Existió una alta calidad de
ajuste, ya que R2 en la regresión lineal entre absorbancia y masa seca fue de un valor de
0,9993, cercano a la unidad.
Resultados y Discusión
53
Figura 12. Regresión lineal entre Absorbancia DO595nm vs. Masa seca (g) de la curva de crecimiento de
M. fijiensis en medio de cultivo líquido
4.3.2 Determinación de la estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Se logró determinar la estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos, atendiendo a variaciones de la temperatura y el pH, así como ante la presencia
de detergentes y proteasas.
4.3.2.1 Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo bacterianos
Se determinó que los filtrados de cultivo (fc) obtenidos después de 48 h de incubación, para
cada una de las cepas bacterianas en estudio excepto para CCIBP-M27, eran termoestables.
Esta cepa fue la más afectada por el efecto de la temperatura y presentó una mayor
Resultados y Discusión
54
actividad inhibitoria a 28ºC. La cepa CCIBP-A4 mostró una disminución de la actividad
antifúngica a 121ºC (Figura 13)
a)
b)
Resultados y Discusión
55
c)
d)
Figura 13. Efecto de la temperatura sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc)
bacterianos en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) CCIBP-M27, b) CCIBP-B3, c)
CCIBP-A4, d) CCIBP-C5 (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney
para p< 0,05)
Resultados y Discusión
56
En resumen, de los filtrados de cultivo en estudio, CCIBP-M27 fue el más afectado por la
variación de la temperatura.
4.3.2.2 Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
Se determinó que la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo, de cada una de las
cepas bacterianas en estudio, varió a diferentes valores de pH en dependencia de la cepa. A
pH = 7 se vio afectado el crecimiento de M. fijiensis.
Al someter el filtrado de cultivo (fc) bacteriano de la cepa CCIBP-M27 durante 20 minutos a
diferentes valores de pH, se afectó su actividad antifúngica excepto a pH=2 (Figura 14 a). En
el caso del filtrado de cultivo bacteriano de la cepa CCIBP-B3 la actividad antifúngica se
mantuvo solo a pH=6 (Figura 14 b). Para el filtrado de cultivo bacteriano de la cepa CCIBP-
A4 hubo efecto inhibitorio para todos los pH evaluados, siendo los valores más altos de
inhibición del crecimiento de M. fijiensis a pH=2 y 8 (Figura 14 c). En cuanto al filtrado de
cultivo bacteriano de la cepa CCIBP-C5 la variación de pH no afectó la actividad antifúngica
en todos los pH evaluados (Figura 14 d).
Resultados y Discusión
57
a)
b)
Resultados y Discusión
58
c)
d)
Figura 14. Efecto del pH sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacterianos en placas
de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) CCIBP-M27, b) CCIBP-B3, c) CCIBP-A4, d) CCIBP-C5
(Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
En resumen, a pH ácido igual a dos mostraron actividad antifúngica todos los filtrados de
cultivo, excepto el de la cepa CCIBP-B3 que solo tuvo actividad inhibitoria a pH=6. Sin
a
Resultados y Discusión
59
embargo, a pH básico igual a ocho solo mostraron actividad antifúngica los filtrados de
cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5.
4.3.2.3 Efecto de detergentes sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo, de las cepas bacterianas en estudio, no se
vio afectada ante la acción del detergente aniónico SDS (Figura 15 a). Sin embargo, las
cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 se afectaron ante la presencia del detergente catiónico CTAB
(Figura 15 b). Por otra parte, el detergente no iónico Triton X-100 afectó la actividad
inhibitoria de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 (Figura 15 c).
Además, el detergente no iónico Tween-80 afectó la actividad inhibitoria del filtrado de cultivo
de la cepa CCIBP-C5. Es importante destacar que este detergente afectó el crecimiento de
M.fijiensis, mientras que para el resto de los detergentes el crecimiento del hongo se
mantuvo igual o menor respecto al control (Figura 15 d).
Es importante destacar que el filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-B3 mantuvo su actividad
inhibitoria al ser expuesto a la acción de todos los detergentes empleados en el estudio
(SDS, CTAB, Triton X-100 y Tween-80).
Resultados y Discusión
60
a)
b)
a
c
b ab
bc
b
Resultados y Discusión
61
c)
d)
Figura 15. Efecto de los detergentes sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc)
bacteriano en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad a) SDS, b) CTAB, c) Triton X-100 y
d) Tween-80 (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p<
0,05)
Resultados y Discusión
62
En resumen, la actividad antifúngica no fue estable en ninguno de los filtrados de cultivo
bacteriano en presencia del detergente aniónico. La actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 se perdió ante la presencia del detergente
catiónico. En el caso de los detergentes no iónicos, Triton afectó la actividad antifúngica de
los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5 y Tween-80 afectó la actividad
antifúngica del filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-C5, pero también el crecimiento de M.
fijiensis.
4.3.2.4 Efecto de proteasas sobre la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo
bacterianos
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos en presencia de la proteinasa
K (100µg/mL) se vio afectada, excepto para la cepa CCIBP-B3 (Figura 16).
Figura 16. Efecto de las proteasas (pK) sobre la actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc)
bacteriano frente a M.fijiensis en placas de 96 pocillos incubadas 48 horas, a 30oC y oscuridad
(Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Resultados y Discusión
63
En la tabla 4 se muestra un resumen de los resultados en la determinación de la estabilidad
de la actividad antifúngica de filtrados de cultivo de las cepas bacterianas expuestos a
variaciones de la temperatura, el pH, la presencia de detergentes y proteasas.
Tabla 4. Estabilidad de la actividad antifúngica de filtrados de cultivo respecto al control de crecimiento
de M. fijiensis
Factores CCIBP-M27 CCIBP-B3 CCIBP-A4 CCIBP-C5
Temperatura (ºC) -80 - + + +
4 - + + +
28 + + + +
60 - + + +
121 - + +/- +
pH 2 + = + +
4 = = + +
6 = + + +
7 = = + +
8 = = + +
Detergentes Aniónico SDS + + + +
Catiónico CTAB = = - -
No iónico TritonX-100 - = + -
Tween-80 = + = -
Proteasa Proteinasa K = + - -
(+) indicador de estabilidad de la actividad antifúngica
(-) indicador de disminución de la actividad antifúngica
(=) No efecto. El crecimiento de M. fijiensis fue igual al control
Resultados y Discusión
64
4.3.3 Caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad antifúngica
in vitro frente a M. fijiensis
Se logró caracterizar los metabolitos semipurificados obtenidos de la fase proteica de los
filtrados de cultivo con actividad antifúngica.
4.3.3.1 Semipurificación de proteínas con sulfato de amonio
Se obtuvieron metabolitos de naturaleza proteica semipuricados con sulfato de amonio al
70%. La fracción de metabolitos semipurificados, de cada una de las cepas bacterianas en
estudio, ocasionó similar inhibición del crecimiento de M. fijiensis a los filtrados de cultivo sin
semipurificar (Figura 17).
Figura 17. Actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacterianos y de metabolitos de naturaleza
proteica semipurificados (s) frente a M. fijiensis, en placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y
oscuridad (Medias con letras desiguales difieren según Kruskal Wallis y Mann Whitney para p< 0,05)
Resultados y Discusión
65
Además, se observó similar daño en el micelio de M. fijiensis, respecto a los resultados
mostrados en el acápite 4.1.
4.3.3.2 Cuantificación de proteínas totales
Se logró cuantificar el contenido de proteínas totales presentes en cada uno de los filtrados
de cultivos bacterianos. Estas se encontraron entre 67,0 y 76,4 µg/ml (Tabla 5). Las
concentraciones de proteína fueron similares para todas las cepas, excepto para CCIBP-C5,
que fue aproximadamente 12% inferior respecto a la media entre el resto de las cepas.
Tabla 5. Cuantificación de proteínas totales (µg/ml) en filtrados de cultivo bacterianos, previamente
semipurificados
Filtrados de cultivo de
las cepas bacterianas
Concentración de proteínas (µg/ml) Rango de medias
CCIBP-A4 76,4 17,0 a
CCIBP-M27 75,5 15,5 a
CCIBP-B3 75,5 15,5 a
CCIBP-C5 67,0 6,3 b
Valores de rangos medios con letras desiguales indican diferencias entre las medias según Kruskal-
Wallis y Mann Whitney para p <0,05.
4.3.3.3 Determinación del peso molecular
La corrida electroforética realizada (Figura 18) evidenció la presencia de proteínas en las
fracciones de metabolitos previamente semipurificados. En todos los filtrados de cultivo
bacterianos se evidenció una banda de mayor intensidad de peso molecular entre los 33 y 40
kDa. El filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-A4 mostró un patrón de bandas diferente al resto
de las cepas.
Resultados y Discusión
66
Figura 18. Actividad antifúngica de filtrados de cultivo (fc) bacteriano, dializados y no dializados, en
placas de 96 pocillos incubadas a 30oC y oscuridad.
4.3.3.4 Determinación de la actividad quitinasa en geles de agarosa
Por medio de este método no fue posible determinar la presencia de quitinasas en geles de
agarosa.
DISCUSIÓN
M. fijiensis es un patógeno fúngico que en medio de cultivo sólido tiene lento crecimiento y
sus colonias son muy compactas (Cruz-Martín, 2004). Esto dificulta los estudios de
evaluación de la actividad antifúngica tanto de sustancias químicas como controles
biológicos. Por ello, contar con un método que facilite estos propósitos es muy importante.
La relación de linealidad que se determinó entre los valores de masa seca y absorbancia
permite utilizar esta última como medida del crecimiento fúngico de M. fijiensis en medio de
170 130 100 72 55 40 33 24
fc CCIBP-M27 fc CCIBP-B3 fc CCIBP-A4 fc CCIBP-C5
Resultados y Discusión
67
cultivo líquido. Este resultado posibilita minimizar los volúmenes finales requeridos en la
cuantificación del crecimiento de M. fijiensis, así como, en la determinación de la actividad
antifúngica de los filtrados de cultivo frente a este patógeno.
Para ello, se pueden emplear placas de 96 pocillos para la evaluación de la inhibición del
crecimiento, lo cual es importante cuando se cuenta con pequeños volúmenes del agente
antagonista.
Según Broekaert et al. (1990) si la absorbancia es un indicador de la biomasa del hongo en
curvas de crecimiento normal, entonces las medidas de absorbancia pueden ser utilizadas
como una herramienta para determinar las curvas de inhibición del crecimiento o hacer un
monitoreo de la biomasa fúngica. Estos autores, plantearon que el uso de microplacas
constituye una ventaja, ya que el ensayo puede montarse de forma fácil y rápida, se
requieren pocas cantidades de muestra, la detección se hace por medio de un instrumento
exacto y brinda la posibilidad de computarizar el procesamiento de los datos de forma
directa. Además, Peláez et al. (2006) utilizaron microplacas para medir la actividad
antifúngica de fungicidas sobre M. fijiensis. El empleo de este método les permite monitorear
la sensibilidad de varias cepas del patógeno a diferentes concentraciones del producto
químico de forma rápida y cuantitativa.
En este estudio se implementó por vez primera la relación lineal existente entre los valores
absorbancia a 595 nm y masa seca (g) para M. fijiensis, para cuantificar la biomasa del
patógeno y determinar así los valores de inhibición de su crecimiento, a partir de la
inoculación conjunta con filtrados de cultivo bacterianos con actividad antifúngica in vitro.
Para poder caracterizar la estabilidad de los filtrados de cultivo bacterianos con actividad
antifúngica se requiere someterlos al efecto de diferentes factores tales como temperatura,
pH, acción de detergentes, proteasas, etc.
En este estudio, de los filtrados de cultivo, el de la cepa CCIBP-M27 fue el más afectado por
la variación de la temperatura. Esto se debe, quizás, a que su mecanismo de acción está
Resultados y Discusión
68
dado por la producción de proteínas no termoestables, por lo que se afecta su composición.
Sin embargo, el filtrado de cultivo para las otras tres cepas CCIBP-B3, CCIBP-A4 y CCIBP-
C5 no se afectó por la variación de la temperatura, quizás porque produjeron compuestos
antifúngicos termoestables, solo se evidenció una disminución en la capacidad inhibitoria
cuando fueron expuestos a temperaturas altas (121ºC). Esto podría estar dado por alteración
de su composición. En tal sentido, Munimbazi y Bullerman (1998) realizaron un trabajo
donde determinaron que los metabolitos producidos por Bacillus pumilus eran estables a la
exposición de 121ºC, durante 15 minutos. Estos autores, concluyeron que la actividad
inhibitoria, quizás, estaba dada por un compuesto peptídico con una estructura cíclica.
Además, Lee et al. (2008) plantearon que la actividad de los metabolitos antifúngicos,
purificados de Paenibacillus lentimorbus WJ5 no fue afectada por la exposición de estos a
diferentes temperaturas (-80ºC, 60ºC y 121ºC respectivamente), solo la exposición a 121ºC
por cinco horas redujo la actividad antifúngica. Por lo que presentaban alta termoestabilidad
y la actividad antifúngica estaba dada por la presencia de pequeños péptidos. Por otra parte,
Hu et al. (2008) concluyeron que los compuestos con actividad antifúngica, presentes en el
sobrenadante del medio de cultivo de la cepa Bacillus subtilis QM3, eran termoestables; ya
que al ser sometidos a diferentes tratamientos térmicos, la actividad inhibitoria se redujo a
100ºC y se vio inhibida a altas temperaturas (121ºC, durante 20 minutos). Estos autores,
concluyeron que la actividad antifúngica estaba dada por un antibiótico perteneciente a la
familia de las iturinas.
El resultado de este experimento mostró que la actividad antifúngica de los filtrados de
cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 no se afectó ante la variación del pH. Sin
embargo, la actividad antifúngica del filtrado de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-B3
disminuyó excepto a pH=2 y pH=6 respectivamente. Esto pudiera estar dado por las
características específicas de cada una de las bacterias en estudio. Existen autores como
Munimbazi y Bullerman (1998) que determinaron la estabilidad de metabolitos bacterianos a
Resultados y Discusión
69
diferentes valores de pH. En este caso los metabolitos producidos por Bacillus pumilus eran
estables en el rango de 2 a 10, pero la mayor inhibición del patógeno se produjo a pH=2,
donde se observó un 99% inhibición del crecimiento de Aspergillus parasiticus y un 92 %
para pH con valores de 4 y 6. Por su parte Lee et al. (2008) concluyeron que los metabolitos
antifúngicos, producidos por Paenibacillus lentimorbus WJ5, eran activos en un amplio rango
de pH, ya que a valores de pH (2 y 13) no se afectó su actividad antifúngica. Por otra parte,
Fu et al. (2010) incubaron la cepa B106 a diferentes valores de pH (en el rango de 3 a 11,
con intervalos de 0.5), para optimizar las condiciones de cultivo donde se expresaba mayor
actividad antifúngica, y determinaron que esta era óptima a pH= 6.
La estabilidad de la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo, de las cepas bacterianas
en estudio, ante la acción del detergente aniónico SDS y la afectación de los filtrados de
cultivo de las cepas CCIBP-A4 y CCIBP-C5 ante la presencia del detergente catiónico CTAB
podría indicar la naturaleza aniónica de los metabolitos con actividad antifungica, presentes
en el filtrado de cultivo. Por otra parte, el detergente no iónico Triton X-100 disminuyó la
actividad inhibitoria de los filtrados de cultivo de las cepas CCIBP-M27 y CCIBP-C5.
Además, el detergente no iónico Tween-80 afectó la actividad inhibitoria del filtrado de cultivo
de la cepa CCIBP-C5. La disminución de la actividad ante detergentes no iónicos podría
estar en correspondencia con la presencia de grupos funcionales iónicos, responsables de la
actividad antifúngica de los metabolitos bacterianos.
El filtrado de cultivo de la cepa CCIBP-B3 mantuvo su actividad inhibitoria al ser expuesto a
la acción de todos los detergentes empleados en el estudio (SDS, CTAB, Tritón X-100 y
Tween-80). Esto podría sugerir que constituye un péptido cuyo grupo funcional no está
expuesto a la acción de los detergentes. Por ejemplo, Munimbazi y Bullerman (1998)
determinaron que de los detergentes utilizados (TritonX-100, Tween-20, Tween-80, Nonidet
P-40, SDS, CTAB y Deoxycholic acid) solo Tween-80 redujo la actividad antifúngica de los
Resultados y Discusión
70
metabolitos producidos por Bacillus pumilus y Nonidet P-40 la inhibió completamente. Estos
autores, concluyeron que la actividad inhibitoria estaba dada por un péptido de estructura
cíclica. Por su parte, Lee et al. (2008) determinaron que la exposición de los metabolitos
antifúngicos a los detergentes (SDS y Tween-80 al 1%) no afectó su actividad antifúngica,
sin embargo al exponerlos al detergente catiónico CTAB (1%), la actividad antagonista se vio
inhibida. En este caso, la inactivación de los metabolitos en CTAB, indicó la naturaleza
aniónica del metabolito o de un grupo funcional que es esencial para la actividad antifúngica.
La actividad antifúngica de los filtrados de cultivo bacterianos en presencia de la proteinasa
K se vio afectada respecto a su actividad sin la presencia de dicha proteasa, excepto para el
filtrado de cultivo de la cepa bacteriana CCIBP-B3. Estos resultados evidencian la naturaleza
proteica de los compuestos antifúngicos producidos por las cepas CCIBP-M27, CCIBP-A4 y
CCIBP-C5. En el caso del filtrado de cultivo que no fue afectado, se podía deber a su
composición peptídica o a la presencia en su estructura de aminoácidos cíclicos
responsables de su actividad inhibitoria. En este sentido, Munimbazi y Bullerman (1998)
determinaron que ninguna de las proteasas utilizadas (α-quimiotripsina, tripsina, proteinasa K
y pepsina) afectaron la actividad antifúngica de los metabolitos producidos por Bacillus
pumilus, por lo que estos eran resistentes a la hidrólisis enzimática. Estos autores,
plantearon que la falta de inactivación de metabolitos antifúngicos producidos por especies
del género Bacillus no es usual, pero que la presencia en su estructura de algunos
aminoácidos inusuales provoca la resistencia a la proteólisis enzimática y por último,
concluyeron que la actividad inhibitoria, quizás, estaba dada por un compuesto peptídico con
una estructura cíclica. Además, Lee et al. (2008) demostraron que la exposición de los
metabolitos antifúngicos, producidos por Paenibacillus lentimorbus WJ5, a la proteinasa K
(1mg/mL), no afectó su actividad antifúngica, y concluyeron que la naturaleza del compuesto
era peptídica, debido a la presencia de enlaces peptídidos, detectados por un análisis
espectrofotométrico de la transformación infrarroja de Fourier (FT-IR).
Resultados y Discusión
71
La caracterización de metabolitos de naturaleza proteica con actividad antifúngica permite
conocer sus particularidades a la vez que se pueden obtener lo más puros posibles. La
caracterización de dichos compuestos se realiza con el objetivo de producir un producto
biológico altamente eficiente frente a patógenos difíciles de controlar en condiciones de
campo.
La semipurificación de los metabolitos de la fase proteica se realizó empleando 70% de
sulfato de amonio, debido a resultados previos obtenidos en el laboratorio. Además, los
metabolitos pueden ser extraídos del filtrado de cultivo bacteriano mediante el método de
semipurificación con sulfato de amonio (Liu et al., 2007) o con acetona fría (Lee et al., 2008).
De estos el más empleado en la bibliografía consultada para la extracción de la fase proteica
desde el sobrenadante de un cultivo bacteriano, es el de precipitación con sulfato de amonio.
Por ejemplo, Moyne et al. (2001) hicieron precipitaciones secuenciales con sulfato de amonio
a diferentes porcentajes de saturación (20, 40, 60 y 80 respectivamente) para semipurificar la
fase proteica del sobrenadante del cultivo de la cepa Bacillus subtilis AU195. En este caso, la
mayor actividad antifúngica se observó en las proteínas extraídas con una saturación de
20% de sulfato de amonio. Además, Kim y Chung (2004) purificaron una proteína desde el
filtrado de cultivo de Bacillus amyloliquefaciens a partir de una saturación con 30% de sulfato
de amonio. La presencia de actividad antifúngica en las muestras después de ser
semipurificadas con sulfato de amonio, indicó la naturaleza proteica de los metabolitos
involucrados en el antagonismo frente a M. fijiensis.
La cuantificación de proteínas totales presentes en la fracción semipurificada de las
muestras, es una evidencia de la presencia de proteínas, las cuales están involucradas en la
actividad antifúngica. En la bibliografía consultada para determinar la concentración de
proteínas totales se emplea el método de Bradford (Moyne et al., 2001) o de Lowry (Liu et
al., 2007).
Resultados y Discusión
72
Los filtrados de cultivo dializados con membranas de 12 kDa mantuvieron su actividad
antifúngica. Ello podría ser indicativo de que la actividad antifúngica sea debida a la
presencia de metabolitos de naturaleza proteica. Aunque la concentración de proteínas fue
similar para los filtrados de cultivo de tres cepas, en la electroforesis se comprobó que el
patrón de bandas era diferente. Moyne et al. (2001), encontraron diferentes bandas en el
filtrado de cultivo de Bacillus subtilis, estos autores, purificaron una bacilomicina D de menos
de 6 kDa de peso molecular. Además, Kim y Chung (2004) obtuvieron bandas desde 11
hasta 110 kDa del filtrado de cultivo de Bacillus amyloliquefaciens y purificaron una proteína
de aproximadamente 40 kDa, que mostró actividad inhibitoria frente a Colletotrichum
lagenarium. Esta proteína poseía actividad glucanasa. Además, Lee et al. (2008), estos
obtuvieron dos bandas correspondientes a 11 y 28 kDa. Sin embargo, se requieren otros
estudios para purificar los metabolitos de naturaleza proteica con actividad antifúngica.
Aunque se observó daño en las hifas, con el método empleado no se logró detectar actividad
quitinasa. Esto pudiera estar dado por las bajas concentraciones de proteínas que tenían las
muestras, por lo que a simple vista no se detectó formación de halo alrededor de los orificios.
Conclusiones
73
5. CONCLUSIONES
Se obtuvieron filtrados de cultivo con actividad antifúngica in vitro frente a M.
fijiensis a partir de bacterias aisladas de la filosfera de Musa spp.
Los filtrados de cultivo de las cepas bacterianas tuvieron efecto sobre la respuesta
de plantas inoculadas con M. fijiensis en casa de cultivo. Este dependió de la cepa
bacteriana empleada y del momento de su aplicación respecto a la inoculación
con el patógeno. En presencia de los filtrados de cultivo de tres cepas se redujo el
número de lesiones necróticas, el tiempo de evolución de los síntomas y el tiempo
de desarrollo de la enfermedad.
Los filtrados de cultivo se caracterizaron por la presencia de metabolitos que
mostraron actividad antifúngica ante variaciones de la temperatura, el pH, la
presencia de detergentes y de proteasas en dependencia de la cepa.
Se comprobó que la actividad antifúngica de los filtrados de cultivo frente a
Mycosphaerella fijiensis estuvo relacionada con metabolitos de naturaleza
proteica presentes en su composición.
Recomendaciones
74
6. RECOMENDACIONES
Continuar el estudio de los mecanismos involucrados en la respuesta de las
plantas ante la presencia de filtrados de cultivo bacterianos.
Utilizar el método de microdilución en caldo, en placas de 96 pocillos, para evaluar
el crecimiento de M. fijiensis.
Extraer, purificar y comprobar la actividad antifúngica de los metabolitos de
naturaleza proteica presentes en los filtrados de cultivo bacterianos de las cepas
CCIBP-M27, CCIBP-B3 y CCIBP-C5.
Referencias bibliográficas
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Anexos
Anexo 1. Principales características de las cepas de la familia Bacillaceae aisladas de la filosfera de Musa sp.
Anexo 2. Principales características de otros bacilos Gram+ no formadores de esporas aislados de la filosfera de Musa sp.
Características CCIBP-A2 CCIBP-A3 CCIBP-B1 CCIBP-B2 CCIBP-B3 CCIBP-B4 CCIBP-B5 CCIBP-B.1
Color colonia en AN
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro Amarillo claro
Agrupación
Células
solas
Células
solas
Células
solas
Células
solas
Células
solas Parejas Células solas Células solas
Catalasa + + + + + + + +
Espora
Forma Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica Esférica
Posición Central Central Central Central Central Central Central Central
Deformación esporangio - - - - - - - -
Hugh y Leifson
oxidativo - - - - - - x -
fermentativo - - x x x x - x
Indol - - + + - - - -
Hidrólisis almidón - - - - - - + -
Hidrólisis caseína + + + + + - + -
Hidrólisis gelatina - - + + + + + -
Voges Proskauer - + - - - - - -
Metabolitos volátiles - + + + + - - -
Metabolitos difundidos + - - - + + + +
Anexos
Características CCIBP-A4 CCIBP-A6 CCIBP-C1 CCIBP-C2 CCIBP-C3 CCIBP-C4 CCIBP-C5
Color colonia (AN)
Amarillo
claro
Amarillo
oscuro
Amarillo
claro Rosado
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Amarillo
claro
Catalasa + + + + + + +
Hugh y Leifson
oxidativo - - - - - - -
fermentativo X X X X X X X
Indol - + + - + + +
Hidrólisis almidón + - - - - - -
Hidrólisis caseína + - + - + - +
Hidrólisis gelatina + - + + + - +
Voges Proskauer - - - - + - +
Metabolitos volátiles + + + - - + +
Metabolitos difundidos + - - + + - +