acidi nucleici terapeutici -...
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Michele Schlich
Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente Sezione di Scienze del Farmaco
Università degli Studi di CagliariVia Ospedale 72,
09124 Cagliari+39 070 675 8554
ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI
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“Farmaci intrinsecamente biologici in natura e realizzati
usando la biotecnologia” [AIFA]
Small molecules Biotecnologici
Anticorpi monoclonali, peptidi, ormoni, enzimi…PROTEINE
ACIDI NUCLEICIGeni, siRNA, aptameri, ribozimi, oligonucleotidi antisenso…
Altri…
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Nucleotidi
Fosfato + zucchero + base azotata
Ribosio (RNA)Deossiribosio(DNA)
AdeninaGuaninaTimina (DNA)CitosinaUracile (RNA)Complementarietà delle basi
A - T (oppure U) G - C
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Filamento singolo
Ibridazione
Doppio filamento
DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE
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DNA
Nucleo
Proteina
TraduzioneRibosomi
RNA
Trascrizione
Singolo filamento
Doppio filamento
Tutte le funzioni vitali per la cellula
(trasporto, struttura, metabolismo..)
PATOLOGIA CON BASI GENETICHE
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DNA
Nucleo
RNA
Trascrizione
Gene mutato!
• Nessun cambiamento•Funzione ridotta
• Funzione soppressa• Funzione alterata
Proteina
TraduzioneRibosomi
Diversa da quella normale!
ANEMIA FALCIFORME
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-GAG--CTC-
Nucleo
Gene mutato!
Gene sano
-GTG--CAC-
-GAG-
mRNA
Trascrizione
Trascrizione-GUG-
mRNA
TraduzionePRO GLUGLU
Emoglobina sana
TraduzioneVAL GLUPRO
Emoglobina mutata
HIV
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TERAPIA GENICA (GENE THERAPY)
Somministrazione di acidi nucleici specifici (DNA o RNA) per correggere difetti genetici responsabili di una patologia
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DNA
Nucleo
Proteina
TraduzioneRibosomi
RNA
Trascrizione
Singolo filamento
Doppio filamento
Gene
TERAPIA GENICA (GENE THERAPY)
Somministrazione di acidi nucleici specifici (DNA o RNA) per correggere difetti genetici responsabili di una patologia
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• Sequenza nota (gene)• Appaiamento di basi complementari• Particolare struttura secondaria
L’acido nucleico terapeutico induce/modifica/blocca l’espressione di
UN SOLO gene
ss = single strandedds = double stranded
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CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI
• Aptameri
• Oligonucleotidi antisenso
• siRNA, miRNA e shRNA
• Ribozimi
• Geni
- espressione genica
espressione genica+
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APTAMERI
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• RNA o DNA a singolo filamento (15-60 nucleotidi)• Struttura secondaria specifica Legame con proteina bersaglio
che permette
APTAMERI ANTICORPI MONOCLONALI
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• Acidi nucleici
• PM ≈ 8-25 kDa
• Non immunogenici
• Termostabili
• Sintesi chimica
• Proteine
• PM > 120 kDa
• Immunogenici
• Termolabili - denaturazione
• Produzione biotecnologica
• farmacocinetica poco conosciuta
• rapida degradazione (nucleasi)
• rapida eliminazione renale
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SELEXSYSTEMATIC EVOLUTION OF LIGANDS BY EXPONENTIAL ENRICHMENT
Libreria di ssDNA(1014 sequenze diverse)
Aptamerospecifico
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APTAMERS – MARKETED & CLINICAL TRIALS
MACUGEN
Pegaptanib (27 nucleotides, PEGylated)Approvato in EU (2006) e USA per degenerazione maculareTarget protein: VEGF
Phase IIIE10030 – Degenerazione maculareREG1 – Anticoagulante per angioplastica coronarica…
Phase IIAS1411 – Leucemia mieloideNOX-E36 – Diabete di tipo 2NOX-A12 – Leucemia linfocitica cronicaNOX-H94 – Anemia of chronic diseases…
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
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• DNA a singolo filamento (13-25 nucleotidi)• Sequenza nucleotidica specifica Ibridazione con mRNA bersaglio
che permette
Traduzione
mRNAAsODN
AS-ODN: EXON SKIPPING
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Splincingesoni
introni
trascritto primario mRNA
1 2 3 4 mRNA maturo
1 2 3 4
Splicing degli introni
DNA
Nucleo
Proteina
TraduzioneRibosomi
RNA
Trascrizione
Singolo filamento
Doppio filamento
AS-ODN: EXON SKIPPING
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trascritto primario mRNA
Splincing
1 2 4
1 2 3 4
AsODN
OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
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1978 – scoperta [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75 (1978) 285–288]
• accessibilità mRNA
• rapida degradazione (nucleasi)
• rapida eliminazione renale
• ingresso cellulare impedito
• elevata specificità
• costi di produzione ridotti
mRNA
http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/
ASODN – MARKETED
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VITRAVENE
FomivirsenApprovato in US (1998) e EU per retinite da citomegalovirus pazienti affetti da HIV. Ritirato(2002) in seguito a riduzione casi per HAART
KYNAMRO
MipomersenApprovato in US (2013) per ipercolesterolemia familiareAIC rifiutata dall’EMA (2013) per insufficiente valutazione eff. indesiderati a lungo termine
EXONDYS 51
Eteplirsen (30 morpholino nucleotides)Approvato in US (2016) per distrofia muscolare di Duchenne.$300.000 / patient / year
SPINRAZA
Nusinersen (chemically modified AsODN)Approvato in US (2016) per atrofia muscolare spinale.
ASODN – CLINICAL TRIALS
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Phase IIIAlicaforsen – ulcerative colitisAganersin – corneal neovascularizationCustirsen – non small cell lung cancerPlazomicin – bloodstream infections,
complicated urinary tract infections…Phase IIATL1102 – multiple sclerosis…
www.clinicaltrials.govwww.genetherapynet.com/clinicaltrialsgov.html
SIRNA – SHORT INTERFERING RNA
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• RNA a doppio filamento (19-22 coppie di basi)
• “Silenziamento” dell’espressione genica attraverso RNAi
“L’interferenza a RNA è un meccanismo naturale, conservato dal punto di vista
evolutivo, altamente efficiente e specifico attraverso il quale un RNA a doppio filamento
(dsRNA) media l’inibizione dell’espressione di un gene”
[Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 672–703]
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DNA
Trascrizione
pri-miRNA
Drosha
pre-miRNA
Exportin 5
Nucleo
pre-miRNADicer
miRNAAgo2
Guide strand
Passenger strand
mRNA
RISC
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DNATrascrizione
pri-miRNA
Drosha
pre-miRNA
Exportin 5
Nucleo
pre-miRNA Dicer miRNA Ago2
Guide strand
Passenger strand
mRNA
RISC
shRNA expressing plasmids siRNA
• DNA codificante per un pri-miRNA• silenziamento genico stabile nel tempo• azione nel nucleo• competizione con RNAi endogeno
• siRNA duplex• silenziamento genico transitorio• azione nel citosol• no competizione con RNAi
sh = short hairpinsi = small interfering
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shRNA expressing plasmids – viral vectors
• elevata efficienza• penetrazione delle barriere• tossicità• immunogenicità
siRNA
• elevata specificità• no competizione con RNAi endogeno• produzione per sintesi chimica• potenziale elevato
• accessibilità mRNA• rapida degradazione (nucleasi)• rapida eliminazione renale• rischio di off-target effects• ingresso cellulare impedito• durata del silenziamento transitoria
miRNA-like off target
A G C C U G A A G A C U U C A A G G G C
U G C C U G A A G C C G A C A A U G G C
U C G G A C U U C U G A A G U U C C C G
mRNAtarget
altro mRNA
siRNA
U C G G A C U U C U G AA G U U C C C G
silencing
miRNA-like silencing
seed region (nucleotidi 2-8)
siRNA
SIRNA – CLINICAL TRIALS & PERSPECTIVES
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No marketed products (May 2017)
Phase IICand5 – diabetic macular edemaSYL040012 – open angle glaucomaAtu027 – metastatic pacreatic cancer
Phase IIIPatisiran – amyloidosis (results expected in 2017)Revusiran – amyloidosisQPI-1002 - Prevention of Delayed Graft Function in Kidney TransplantQPI-1007 - Nonarteritic Anterior Ischemic Optic Neuropathy
“I think they are potentially superdrugs. The fact is that siRNAs can be developed tosilence any gene; can be developedincredibly fast; can have picomolar efficacyand can have an effect that lasts for weeks.”Judy Lieberman, Harvard Medical School
A naked siRNA, injected into the eye, couldblock angiogenesis in mouse models of age-related macular degeneration regardless of itssequenceNature 452 (2008) 591-597
GENI
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Introduzione di DNA che contiene un gene in grado diprodurre una versione funzionante della proteina danneggiata/mancante
Vettori viraliVettori non virali
GENI
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estrazione delle cellule
trasfezione del gene
impianto delle cellule che
esprimono il nuovo gene
EX VIVO GENE THERAPY
IN VIVO GENE THERAPY
GENE THERAPY – MARKETED
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GENDICINE
Approved in China (2003) for head and neck squamous cell carcinomaP-53 gene in adenoviral vector.In vivo gene therapy
ONCORINE
Approved in China (2005) for late stage refractory nasopharyngeal cancer
NEOVASCULGEN
Approved in Russia (2012) for peripheral arterial disease.VEGF gene in plasmid vector
GLYBERA
Approved in EU (2012) for lipoprotein lipase deficiencyLPL gene in adenoviral vector + immunosuppressive therapy
STRIMVELIS Approved in EU (2016) for adenosine deamidase deficiency (ADA-Scid)
1.100.000 € / treatment
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SVANTAGGI COMUNI
Instabilità in circoloDegradazione da parte delle nucleasiRapida eliminazione renale
Ingresso cellulare impedito Site specific delivery
Immunogenicità
CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI
• Aptameri
• Oligonucleotidi antisenso
• siRNA, miRNA e shRNA
• Geni
- espressione genica
espressione genica+
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Michele Schlich
Dipartimento di Scienze della Vita e dell’Ambiente Sezione di Scienze del Farmaco
Università degli Studi di CagliariVia Ospedale 72,
09124 Cagliari+39 070 675 8554
GENE DELIVERY
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Somministrazione EV
Stabilità in circolo
Distribuzione al tessuto bersaglio
Ingresso nella cellulaUscita dall’endosomaIngresso nel nucleo (se necessario)
Idealmente…
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Somm. EV Stabilità in circolo Distribuzione al tessuto Ingresso nella cellula Uscita dall’endosoma Ingresso nel nucleo
Barriere cinetiche• Interazioni con proteine del plasma e matrice
• Captazione da parte degli organi del MPS• Eliminazione renale
• Degradazione da parte di nucleasi
Barriere fisiche• Parete dei vasi
• Barriere d’organo (BBB)• Membrana cellulare
• Membrana dell’endosoma• Membrana nucleare
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Interazioni con proteine del plasma e matrice
Nanoparticella diAcido nucleico
Opsonine
OpsonineProteine plasmatiche (laminina, fibronectina, albumina…)Componenti della matrice (collagene tipo I…)Immunoglobuline (IgG, IgM…)
La opsonizzazione dipende dalle proprietà chimico fisiche della nanoparticella e influisce
pesantemente sulla sua distribuzione
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Captazione da parte degli organi del MPS
MPS = mononuclear phagocite system
Kuppfer cell
MPSMonociti e macrofagi nei linfonodi, nel tessuto connettivo e nella milzaCellule di Kuppfer nel fegatoMacrofagi alveolari nei polmoni…
Necessarie modifiche che impediscano l’opsonizzazione e
l’uptake da parte del MPS
Rapida eliminazione renale
Necessario aumentare le dimensioni per impedire il passaggio del filtro renale
Drug Metabolism and Disposition (2006) 34(8):1393-1397
A causa del basso PM e dell’assenza di trasportatori per il riassorbimento gli acidi nucleici corti vengono eliminati in <10 minuti
Degradazione da parte di nucleasi
A G C C U G A A G A C U U C A A G G G C EsonucleasiTaglio all’estremità del filamento
EndonucleasiTaglio all’interno del filamento
Nucleasi: enzimi capaci di rompere il legame fosfodiesteretra due nucleotidi
Degradazione da parte di nucleasi
Resistenza alle nucleasi: DNA>RNA
Ribonucleasi (RNAsi) selettive per RNA, molto più efficienti e difficili da inattivare
Necessario conferire resistenza alle nucleasi/proteggere gli acidi
nucleici
Preparazione formulazioni contenenti siRNALavoro in condizioni RNAse-free
Extravasazione e accumulo nel tessuto bersaglio
Gli acidi nucleici somministrati come tali vengono degradati e/o si accumulano nei reni, nel fegato e nel tessuto linfatico.
Targeting
Passivo – diretto agli organi del MPS, ai tumori per effetto EPR
Attivo – agenti direzionanti (anticorpi, peptidi, zuccheri, aptameri…)
Fisico – pH, temperatura, campo magnetico esterno…
Se non sono questi i tessuti bersaglio
Ingresso cellulare
Carica superficiale degli acidi nucleici a pH fisiologico
Ingresso cellulare
Membrana cellulare
Proteoglicani, eparan solfato(carichi -)
Inoltre:• No diffusione passiva• No trasportatori specifici
Necessario permettere uptakecellulare
Uptake impedito
Uscita dall’endosoma (endosome escape)
Caratteristica che devono possedere i carrier per gli acidi nucleici (es. nanoparticelle)
lisosoma
endosomeescape
endosoma
Necessarie caratteristiche che inducano la permeabilizzazionedell’endosoma o l’uscita del carico prima della sua degradazione
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Gene delivery ideale•Impedire l’opsonizzazione•Impedire uptake da parte del MPS•Rallentare eliminazione renale•Conferire resistenza alle nucleasi•Indurre extravasazione nel tessuto bersaglio•Permettere uptake cellulare•Indurre endosome escape
Approccio chimicoModifica della struttura dell’acido nucleicoConiugazione con un’altra molecola
Inclusione in un nanocarrierPolimericoLipidicoMisto
• Legame con una proteina
• Blocco traduzione
• Danno mRNA e blocco traduzione
• Espressione genica
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PER VALUTARNE L’EFFICACIA
CATEGORIE DI ACIDI NUCLEICI TERAPEUTICI
• Aptameri
• AsODN
• siRNA/shRNA
• Geni
- espressione genica
espressione genica+
Concentrazione proteinaWestern BlotImmunoistochimica
Attività proteinaSaggi enzimatici
Concentrazione mRNARNA extraction + RT-PCRIbridazione in situ
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Modifica della struttura dell’acido nucleico
Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasiRidurre immunogenicità
APPROCCIO CHIMICO
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PER VALUTARE LA RESISTENZA ALLE NUCELASI
1. Miscelare l’acido nucleico con RNAsi2. Fare dei prelievi dal mix a diversi minuti3. Disattivare le RNAsi per bloccare la degradazione4. Elettroforesi su gel di agarosio
0’ 2’ 6’ 0’ 2’ 6’ 10’ 20’
A-G-C-C-U-G-A-A-G-A-C-U-U-C-A-A-G-G-G-C
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Coniugazione con altre molecole
Mediante creazione di legami covalenti.
Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasiRidurre immunogenicitàProlungare emivita plasmaticaMigliorare uptake cellulareTargeting attivo
APPROCCIO CHIMICO
Coniugazioni possibili:• colesterolo o lipidi• anticorpi o aptameri• cell penetrating peptides• PEG
siRNA
cholesterol
cholesterol-siRNA conjugate
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Coniugazione con altre molecole - lipidi APPROCCIO CHIMICO
lipid-siRNA conjugate
+ uptake cellulare
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Coniugazione con altre molecole - lipidi APPROCCIO CHIMICO
=
+ uptake cellulare
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Coniugazione con altre molecole – targeting agent APPROCCIO CHIMICO
+ uptake cellulare+ targeting
J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 8848–8849
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Inclusione in un nanocarrier NANOCARRIER
+ polimero cationico
+ lipidi cationici
Acido nucleico
POLIPLESSO
LIPOPLESSO
Mediante attrazione elettrostatica, incapsulazione, interazioni supramolecolari…
Obiettivi:Incrementare la resistenza alle nucleasi Ridurre immunogenicitàProlungare emivita plasmatica Migliorare uptake cellulareTargeting attivo (agente direzionante)
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Inclusione in un nanocarrier NANOCARRIER
+ polimero cationico
+ lipidi cationici
Acido nucleico
POLIPLESSO
LIPOPLESSO
• Elevato uptake cellulare• Ottima incapsulazione degli acidi nucleici
• Rapida opsonizzazione e captazione da parte del MPS• Nessuna specificità tissutale• Tossicità
Nanoparticelle (NP) cationiche
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Nanocarriers polimerici NANOCARRIER
Polietilenimina (PEI)
Protamina
PAMAM dendimers
Chitosan
Micelle-forming co-polymers
Cyclodextrins
…
Caratteristiche importanti
Biocompatibilità
Peso molecolare
Carica
Possibilità di modifiche chimiche (PEGylazione, inclusione di un agente direzionante)
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NANOCARRIERSPOLIMERICI
POLIETILENIMINA
Linear polyethylenimine (LPEI) Branched polyethylenimine (BPEI)
• Carica del poliplesso dipendente da N/P ratio• Efficace protezione dalle nucleasi e ingresso cellulare• Endosome escape per proton sponge effect• BPEI associato a tossicità su alcune linee cellulari e in vivo
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Proton sponge effect
H+H+
H+
H+ H+
H+ H+
H+
H+H+
Il polimero maggiormente protonato dovrebbe avere un’affinità maggiore per l’acido nucleico
NANOCARRIERSPOLIMERICI
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NANOCARRIERSPOLIMERICI
POLIETILENIMINA
SNCA = α sinucleinasiSNCA = siRNA per α sinucleinasiNC = siRNA controllo negativoLipo = lipofectamine 2000 (potente agente di trasfezione usato come controllo positivo)
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NANOCARRIERSPOLIMERICI
PROTAMINA
• Proteine di origine naturale ricche in aminoacidi basici (Arg)• Carica netta positiva (a pH fisiologico le Arg sono protonate)
Sono in grado di condensare gli acidi nucleici
TS1/22 = anticorpo monoclonaleTS1/22-P = anticorpo legato alla protaminaCCR5 = gene da silenziare
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NANOCARRIERSPOLIMERICI
CHITOSANO
• Polisaccaride con gruppi amminici protonabili• Forma nanoparticelle con gli acidi nucleici• Buon uptake cellulare ma…
…nessun meccanismo di endosome escape.
CYS-HIS CYS-HIS CYS-HIS
CYS-HIS =
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NANOCARRIERSPOLIMERICI
CHITOSANO
CYS-HIS CYS-HIS CYS-HIS
Bafilomycin A1 = inibitore della pompa protonica sulla membrana degli endosomiChi-CH = chisosano modificato con Cisteina-Istidina Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1087–1095
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Nanocarriers lipidici NANOCARRIER
Fosfolipidi
Sfingolipidi
Lipidi anfifilici di sintesi
Colesterolo
…
Caratteristiche importanti
Biocompatibilità
Carica
Comportamento in ambiente acquoso (formazione di micelle, doppi strati…)
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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI
DNA : lipid ratio
DNA : lipid ratio DNA : lipid ratio
DNA : lipid ratio
Gene expression Toxicity
Journal of Controlled Release 66(2000) 255-269
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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI
Carica positiva
Cell uptakeSmall size
ToxicityAspecific
interactions
Per ridurre/mascherare la carica positiva:• Rivestimento con PEG• Mix con lipidi neutri
circulation lungs
liver tumour
Cationic lipoplexesPEGylated lipoplexes
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Nanocarriers lipidici NANOCARRIERSLIPIDICI
Alcune strategie di endosome escape per i nanocarriers lipidici
Helper lipidsDOPE
Fusogenic peptidesTAT, GALA, Penetratin…
Liang, Lam - Endosomal Escape Pathways for Non-Viral Nucleic Acid Delivery Systems (2012)
Random coil Alpha helix
H +
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