acciones anabólicas e inmunomoduladoras

LECTURAS SOBRE NUTRICIÓN (2004) 11 (2): 54-70

54

Acciones anabólicas e inmunomoduladoras

del factor de crecimiento similar a la

insulina - I durante estrés nutricional

Wilson Mejía Naranjo1, Rosalina Bernal2, Myriam Sánchez de Gómez3

1 Profesor asistente, Departamento de Nutrición y Bioquímica, Facultad de Ciencias Básicas, Pontificia Universidad

Javeriana. Bogotá, D.C.; 2 ND, Departamento de Nutrición y Bioquímica, Facultad de Ciencias Básicas, Pontificia Universi-

dad Javeriana. Bogotá, D.C.; 3 Profesor asociado, director Grupo de Investigación en Hormonas, Depto. de Química,

Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, D.C.

Palabras clave: IGF-I (factor de crecimiento similar a la insulina-1), GH (hormona de crecimiento), IGF-IR (receptor

para el factor de crecimiento similar a la insulina-1), GHR (receptor para la hormona de crecimiento), rhIGF-I (factor de

crecimiento similar a la insulina-1 recombinante humano), malnutrición proteica, sistema inmune.

Introducción

El sistema inmune y el sistema endo-

crino comparten un conjunto común de

ligandos y receptores. Las células del sis-

tema inmune secretan moléculas y poseen

receptores para una gran cantidad de hor-

monas y factores de crecimiento. De igual

forma, citoquinas como los interferones,

aunque se derivan de células inmunocom-

petentes, también tienen efectos hormo-

nales en una gran cantidad de órganos.

Esta observación sirve de base para am-

pliar el conocimiento bioquímico de cómo

y por qué hay una comunicación

bidireccional entre los sistemas inmune y

endocrino.

Un gran cuerpo de evidencia sugiere que

la hormona de crecimiento (GH), el factor

de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) y

sus receptores cumplen un papel importan-

te en la función y homeostasis del sistema

inmune (1, 2). La hipótesis original propues-

ta para responder a la pregunta sobre

cómo la hipófisis o pituitaria regula el cre-

cimiento somático, estableció que la GH

producida en la hipófisis estimulaba la sín-

tesis de IGF-I en el hígado y de allí era ex-

portado a la circulación para llegar a los

órganos blanco (3). El hígado es la fuente

primaria de IGF-I circulante, el cual fue

considerado como factor de importancia

crucial para el crecimiento posnatal y de-

sarrollo. Hace dos décadas se estable-

ció que la expresión del IGF-I no se

limitaba al hígado, y que la síntesis de GH

no se restringía a la hipófisis (4). Las inves-

tigaciones han demostrado que los órga-

nos linfoides como el timo, bazo y sangre

periférica producen y responden a la GH

sintetizando y liberando IGF-I. La presen-

cia de receptores para estas hormonas en

poblaciones linfocitarias, sugiere que,

adicionalmente al mecanismo tradicional

endocrino, existe un mecanismo local de

acción paracrino/autocrino para estas hor-

monas (5, 6).

La importancia de un mecanismo

paracrino/autocrino de acción del eje GH/

IGF-I ha cobrado mayor relevancia con el

Ganador Primer Premio Concurso “José Félix Patiño”

XIX Congreso Anual Avances en Metabolismo y Soporte Nutricional

Se ha sugerido que

los efectos

inmunomoduladores

de la hormona de

crecimiento (GH) y el

factor de crecimiento

similar a la insulina

(IGF-I) pueden ser

explicados en términos

de sus acciones

anabólicas/

somatogénicas y

moduladoras del estrés

en células del sistema

inmune. El déficit de

proteínas y calorías

induce un estado

catabólico o de estrés

nutricional, con efectos

deletéreos sobre el

sistema inmune. El

presente estudio

investigó los cambios

sobre el eje GH/IGF-I

esplénico inducidos por

la malnutrición proteica

y el efecto de la infusión

de rhIGF-I. Se utilizaron

ratas normales en

crecimiento alimenta-

das con dietas

isocalóricas que diferían

en el contenido de

proteína (0%, 4%, 12%

Lecturas sobre Nutrición Nº 45

55

reciente hallazgo de que ratones

“knockout” para el IGF-I hepático no difie-

ren en peso corporal y tamaño de sus res-

pectivos controles silvestres. Estos

estudios han demostrado que el hígado

produce la mayor cantidad del IGF-I cir-

culante (75% aproximadamente), pero

esta forma endocrina no es esencial para

el crecimiento posnatal y el desarrollo.

Además, sugiere que el IGF-I producido

localmente puede estar mediando los

efectos promotores de crecimiento (7). Esta

evidencia da soporte a la idea que la GH y

el IGF-I producidos localmente cumplen

varias funciones, incluyendo la regulación

del crecimiento corporal, mantenimiento,

función y reparación de tejidos específi-

cos, incluidos los del sistema inmune.

Varios estudios sugerían que el eje GH/

IGF-I tenía una función importante en el

control de la linfopoyesis y la función in-

mune. Experimentos realizados en anima-

les hipofisectomizados demostraron que

la función inmune humoral y celular esta-

ba deprimida, y sólo el tratamiento con

estas hormonas, recuperaba la función (8).

Sin embargo, el uso de modelos mutantes

que poseen un defecto endocrino más li-

mitado y selectivo para estas hormonas,

ha demostrado que ni la función inmune

celular, ni la humoral, ni la linfopoyesis se

ven afectadas por la deficiencia de GH o

de IGF-I o de ambos (9). Este hallazgo ha

llevado a proponer una nueva hipótesis,

según la cual, ninguna de estas hormo-

nas son inmunorreguladoras obligadas del

sistema inmune y, por el contrario, sus fun-

ciones se deben buscar por sus acciones

somatogénicas y anabólicas. Este último

postulado plantea entonces una función

nueva, como lo es el posible papel de hor-

monas anabólicas en la adaptación al

estrés en muchas células, incluidas las del

sistema inmune.

La nutrición es un determinante de

la respuesta inmune y el déficit de pro-

teína y calorías tienen efectos deletéreos

en el sistema de defensa de un organis-

mo. Se sabe que tanto el consumo de

proteína como de energía, son críticos

en la regulación del eje endocrino GH/

IGF-I. El estrés nutricional inducido por

la deficiencia de proteína o caloría en la

dieta causa un estado de resistencia glo-

bal a la acción de la GH, pero los meca-

nismos bioquímicos responsables han

sido poco estudiados (10). A la luz de la

nueva hipótesis que atribuye a la GH y

al IGF-I un papel regulador del estrés,

es importante identificar los cambios en

el eje local autocrino/paracrino de estas

hormonas, en células del sistema inmu-

ne bajo estrés nutricional. El modelo

animal de ratas ha sido ampliamente uti-

lizado en las investigaciones para res-

ponder a la pregunta de cómo la GH y el

IGF-I regulan el crecimiento, desarrollo

y metabolismo. La malnutrición reduce

los niveles séricos de IGF-I y GH. El IGF-

I circulante (endocrino) procede en su

gran mayoría (75%) del hígado. No se

conoce muy bien el efecto de la deficien-

cia de proteína sobre el eje GH/IGF-I en

el sistema linfoide, así como tampoco se

ha caracterizado el efecto de la deficien-

cia de proteína en la dieta sobre los re-

ceptores para GH e IGF-I en las

diferentes poblaciones celulares linfoci-

tarias, lo cual es importante para com-

prender las acciones reguladoras de

estas hormonas en el sistema inmune en

condiciones de estrés nutricional. El ob-

jetivo de la presente investigación fue

estudiar el efecto del nivel de proteína

en la dieta y la administración de IGF-I

sobre el eje GH/IGF-I en tejido linfoide

en el modelo experimental de ratas nor-

males. La hipótesis de la presente inves-

tigación establece que la actividad

anabólica del eje local GH/IGF-I podría

estar modulando autocrina/paracrina-

mente los cambios inducidos por la de-

ficiencia de proteína para preservar la

homeostasis del sistema inmune.

y 20%); los animales

del mismo grupo

dietario fueron

aleatoriamente

divididos en dos grupos

y durante siete días

recibieron infusión

continua de rhIGF-I o

vehículo. La malnutri-

ción proteica disminuyó

los niveles séricos de

IGF-I, la proteína de

unión IGFBP-3, insulina

y GH; mientras que los

niveles de IGFBP-1 se

incrementaron. En el

bazo el porcentaje de

células B, el mRNA para

el IGF-IR, IGFBP-3, -4 y

-6 fueron

incrementados por la

falta de proteína

dietaria; mientras que

los niveles del mRNA

para el IGF-I no

cambiaron. La adminis-

tración exógena de

rhIGF-I redujo los

niveles de insulina y GH

e incrementó la

expresión del GHR y los

niveles circulantes de

IGFBP-1 y -3. La

infusión de rhIGF-I

incrementó en 20% el

balance de nitrógeno

en animales que

consumieron dieta con

alto contenido de

proteína. En conclusión,

se demostró que el

rhIGF-I estimula el

anabolismo en el bazo

a expensas del

catabolismo inducido

por la restricción de

proteína. El incremento

en la expresión de los

genes del eje GH/IGF-I

durante la malnutrición

proteica puede estar

capturando el IGF-I

circulante o el produci-

do localmente como

manera de compensar

los bajos niveles

causados por el estrés

nutricional. Este

incremento puede

también afectar la

homeostasis de la

población linfocitaria y

prevenir que la

restricción proteica

ejerza mayores efectos

sobre la función

inmune.

Acciones anabólicas e inmunomoduladoras del factor de crecimiento similar a la insulina

56

Materiales y métodos

Diseño experimental

Ratas macho de la raza Sprague-

Dawley de 5 semanas de edad se obtu-

vieron del Instituto Nacional de Salud,

Bogotá, D.C. Luego de una semana de

preadaptación las ratas fueron manteni-

das individualmente en cajas metabóli-

cas, con libre acceso a agua y a su

respectiva dieta durante un período de 12

días. Las ratas se alimentaron con cuatro

dietas diferentes en el contenido de pro-

teína (ICN, USA): 0, 4, 12 y 20%. (Las die-

tas son isocalóricas y proporcionan 3.8

Kcal/g dieta). Para cada animal se pesó

la ración que consumiría durante todo el

experimento; al final, la parte no consu-

mida fue nuevamente pesada. Los ani-

males cuyo peso estaba alrededor de 120

g fueron aleatoriamente asignados a cada

una de las 4 dietas. El día 5 del experi-

mento, una bomba miniosmótica, Alzet

2002, fue implantada en la espalda del

animal bajo anestesia (Rompun: Ketalar:

Salina 1:2:3). La minibomba liberaba 28

µl/día, la cual se llenó con aproximada-

mente 300 µl de solución de IGF-I recom-

binante (suministra 250 µg/día de rhIGF-I)

o vehículo (ácido acético 0.1 M). De esta

forma por cada dieta se tenían dos gru-

pos, uno recibiendo infusión de rhIGF-I y

el otro vehículo durante 7 días. Al final del

período los animales fueron sacrificados

y los respectivos tejidos procesados y

analizados de acuerdo al protocolo expe-

rimental. Los protocolos y procedimien-

tos de cirugía estuvieron conformes a las

normas para utilización de animales de

experimentación del Instituto de

Biotecnología de la Universidad Nacional

de Colombia y del Instituto Nacional de

Salud, Bogotá, Colombia.

Muestras de sangre fueron tomadas

del plexo orbital usando anestesia con éter

el día 0,5 y 12. 0,5 mL de sangre fueron

tomados, se obtuvo el suero el cual se

alicuotó y guardó a –20°C hasta ser pro-

cesado para las determinaciones hormo-

nales y proteínas de unión del IGF-I.

Aproximadamente un 10% del bazo, fue

procesado para obtener suspensiones

celulares y procesadas por citometría de

flujo para la determinación de subpobla-

ciones linfocitarias y receptores de GH e

IGF-I. El resto de tejido fue congelado in-

mediatamente en nitrógeno líquido y pro-

cesado para los estudios de expresión de

mRNA.

La orina y las heces fueron recolec-

tadas diariamente para cada animal. Un

pool se hizo para los cinco primeros días

del experimento, y otro pool para los 7

días restantes. El contenido de nitróge-

no en orina y heces fue realizado siguien-

do el método estandarizado en el

laboratorio descrito en Sánchez-Gómez

et al., 1999 (11).

Modelo estadístico

La dieta fue aleatorizada dentro del tra-

tamiento. Tratamientos: T1, T2. Dietas: d1,

d2, d3, d4. Dado que el experimento no

podía ser completado al mismo tiempo los

grupos fueron escogidos al azar, 12 ratas

cada vez. Dos ratas eran escogidas cada

vez hasta completar 6 animales por gru-

po: T1d1, T1d2, T1d3, T2d1, T2d2, T2d3.

Los resultados fueron analizados usando

análisis de varianza de dos vías ANOVA.

Las comparaciones múltiples entre las

medias se realizaron usando la prueba de

Duncan, seguido de la prueba no

paramétrica Wilcoxon usando el progra-

ma SAS (SAS Institute, Inc., 1999). Las di-

ferencias se consideraron significativas

cuando los valores de P < 005.

Resultados

Efecto del consumo variable de pro-

teína en la dieta y administración conti-

nua de rhIGF-I sobre el peso corporal y

consumo de alimento.


57

Durante los cinco primeros días las

ratas alimentadas con dieta 0% proteína

perdieron 2.8 ± 0.25 g. Los animales que

consumieron las dietas 4, 12 y 20%, ga-

naron 0.9 ± 0.5 g, 5 ± 0.6 g y 6 ± 0.6 g

respectivamente (figura 1A). Para el día 12,

luego de recibir infusión continua de rhIGF-

I durante 7 días, las ratas alimentadas con

dieta 20% obtuvieron un aumento signifi-

cativo del 40% en peso corporal compa-

rado con su respectivo grupo control (5.9

± 0.18 vs. 4.1 ± 0.48; P < 0.05). En los

otros tres grupos dietarios no se observó

ningún efecto significativo de la adminis-

tración continua de rhIGF-I sobre el peso

corporal (figura 1B).

Durante los cinco primeros días, las

ratas alimentadas con dieta libre de pro-

teína consumieron significativamente me-

nos alimento, 10.6 g/día (P < 0.01)

comparado a 13.2, 14 y 12.4 g/día con-

sumidos por los animales que fueron

alimentados con dietas 4, 12 y 20% res-

Figura 1Efecto del contenido de proteína en la dieta en ratas normales durante 5 días

(A) y de la administración continua de rhIGF-I (barras negras) o vehículo(barras abiertas) durante 7 días (B). Los valores están expresados como

la media ± sem para n=6 ratas en cada grupo a

rhIGF-I vs. vehículo

alimentados con la misma dieta P < 0.05.

Tabla 1Estado nutricional de ratas con infusión continua de rhIGF-I o vehículo

% proteína en dieta 0 4 12 20

Vehículo Consumo totala 8 ± 0.8b 11 ± 0.83 13.8 ± 0.56 12.3 ± 0.43

Consumo/PCc 0.49± 0.05 0.57 ± 0.04 0.57 ± 0.02 0.58 ± 0.04

rhIGF-I Consumo totala 7.2 ± 0.73b 9.2 ± 1b 13.7 ± 0.97 17.1 ± 0.9

Consumo/PCc 0.47± 0.04b 0.5 ± 0.04b 0.59 ± 0.02 0.79± 0.07

Los valores están expresados como la media ± SEM de n = 6 ratas en cada grupo. aConsumo

de alimento (consumo día(g)/animal). cConsumo de alimento (Consumo(g)/Peso final

corporal(g)/animal) b P < 0.01 vs. Vehículo o rhIGF-I 20%.


58

pectivamente. Durante los 7 días de infu-

sión continua de rhIGF-I el consumo de

alimento fue significativamente más bajo

en los grupos que consumieron 0 y 4% de

proteína comparado con los alimentados

con 12 y 20% de proteína (tabla 1). Los

animales que recibieron infusión continua

de rhIGF-I y alimentados con 20% de pro-

teína mostraron un incremento significati-

vo (P < 0.05) en el consumo total de

alimento y en la relación de consumo y

peso corporal comparado a su respectivo

control que recibió infusión de vehículo.

Balance de nitrógeno

El comportamiento anterior se corro-

boró mediante el balance de nitrógeno.

Para el día 5, las ratas alimentadas con

dieta 0% de proteína presentaban balan-

ce negativo (-18.2 ± 5 mgN/kg/día) (figu-

ra 2A). Para el día 12, este balance, se

redujo para el grupo que recibió rhIGF-I a

-9.3 ± 1 y para el que recibió vehículo a -

6.3 ± 1.5 mgN/kg/día, sin diferencia sig-

nificativa entre estos dos grupos. La

interacción entre contenido de proteína en

Figura 2Balance de nitrógeno en ratas alimentadas con dietas 0, 4, 12 y 20% decontenido de proteína durante 5 días (A) y efecto de la administracióncontinua durante 7 días de rhIGF-I (barras negras) o vehículo (barras

abiertas) (B). Los valores están expresados como la media ± sem para n=6ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. vehículo en la misma dieta P< 0.05.


59

la dieta e infusión de rhIGF-I fue estadísti-

camente significativa (P < 0.05) en las ra-

tas alimentadas con 20% de proteína,

donde la infusión de rhIGF-I causó un in-

cremento del 20% en el balance de nitró-

geno comparado con el respectivo control

(3090 ± 185 vs. 3781 ± 284 mgN/kg/día).

No se observó diferencia significativa en

los grupos alimentados con 4 ó 12% reci-

biendo rhIGF-I o vehículo (figura 2B).


teína en la dieta y la administración de

rhIGF-I sobre el tamaño del bazo

El peso del bazo disminuyó significa-

tivamente con relación a la disminución

del contenido de proteína consumida en

la dieta. En ratas que recibieron infusión

de vehículo el peso del bazo disminuyó

significativamente de 430 ± 60 mg, en

las que fueron alimentadas con dieta 20%

de proteína, a 220 ± 20 mg en los ani-

males alimentados con dieta 0% de pro-

teína. En las ratas que recibieron infusión

continua de rhIGF-I el peso del bazo dis-

minuyó de 760 ± 100 mg a 320 ± 50 mg

en las mismas condiciones dietarias. La

normalización del peso del bazo al peso

corporal mostró que en las ratas que re-

cibieron infusión continua de rhIGF-I la

relación fue significativamente mayor en

los cuatro grupos dietarios comparado

con su respectivo control que recibió

vehículo (figura 3).


teína en la dieta y administración de

rhIGF-I sobre los niveles circulantes de

IGF-I, GH e insulina

Figura 3Efecto del contenido de proteína ingerida en la dieta durante 12 días sobre el

peso del bazo en ratas que recibieron durante 7 días infusión continua derhIGF-I (barras negras) y ratas control que recibieron vehículo (barras

abiertas). Los pesos están expresados como la relación peso tejido (mg)/peso corporal (g). Los valores están expresados como la media ± sem para

n=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. Control consumiendo la misma dietaP < 0.01; b rhIGF-I consumiendo 20% vs. rhIGF-I consumiendo 12, 4, 0% P< 0.05;

c vehículo consumiendo 20% vs. vehículo consumiendo 12, 4, 0% P< 0.05.


60

La restricción proteica durante los pri-

meros 5 días causó una reducción aproxi-

mada del 55 y 70% en los niveles

circulantes de IGF-I en ratas alimentadas

con dietas 4 y 0% de contenido de proteí-

na comparado al grupo que recibió 20%

(550 ± 60 ng/mL vs. 220 ± 30 y 150 ± 50

ng/mL) figura 4A. La infusión continua de

rhIGF-I durante 7 días subsiguientes res-

tableció los niveles circulantes en ambos

grupos (489 ± 139 y 600 ± 112, para los

animales alimentados con 4 y 0% proteí-

na respectivamente); mientras que en los

grupos control que recibieron vehículo, los

niveles fueron aún más reducidos (179 ±

18 y 118 ± 17 ng/mL en los grupos 4 y

0%) figura 4B. En los grupos 12 y 20% que

recibieron vehículo los niveles circulantes

fueron incrementados significativamente,

850 ± 60 ng/mL y 785 ± 55 ng/mL res-

pectivamente comparado a los niveles el

día 0 ó 5. Los animales en estos dos gru-

pos dietarios que recibieron infusión de

rhIGF-I, los niveles circulantes fueron

incrementados a 1986 ± 67 y 3827 ± 373

ng/mL respectivamente.

Durante los primeros 5 días de ali-

mentación, la restricción de proteína (4

ó 0%) en la dieta disminuyó significati-

vamente los niveles de insulina en un

30% comparado a las ratas consumien-

do 20% de proteína. Al día 12, luego de

recibir por 7 días infusión de vehículo o

rhIGF-I, en los animales que consumie-

ron dietas 0 y 4%, los niveles de insulina

fueron reducidos en un 75% comparado

con el grupo control alimentado con die-

ta 20% (figura 4C). La infusión de rhIGF-I

en animales con dietas 12 ó 20% causó

una reducción significativa aproximada

del 50% en los niveles circulantes de

insulina comparado con los respectivos

controles recibiendo vehículo.

Al día 0 de inicio del experimento, los

valores séricos de GH determinados en

48 animales variaron desde 0.5 ng/mL

hasta 49 ng/mL, con un valor promedio

obtenido de 10.9 ± 10 ng/mL. Cinco días

de consumo de dieta 0 ó 4% proteína

causaron una reducción en los niveles

circulantes, 3.5 ± 2.5 ng/mL y 7.1 ± 3.4

ng/mL respectivamente; mientras que los

animales que consumieron 12 ó 20% no

mostraron cambios signif icativos

respectos a los valores obtenidos al día

0. Al día 12, en los animales que recibie-

ron vehículo y alimentados con dietas 0

y 4%, los niveles circulantes fueron 3.6 ±

2.9 ng/mL y 2.4 ± 1.5 ng/mL respectiva-

mente. Aquellos que recibieron infusión

continua de rhIGF-I, los niveles fueron si-

milares a sus respectivos controles. En

los grupos alimentados con dietas 12 y

20% y que recibieron vehículo, los valo-

res se mantuvieron dentro de los rangos

normales: 8.7 ± 8.3 ng/mL y 17.3 ± 9.1

ng/mL respectivamente. La administra-

ción de rhIGF-I causó una disminución

significativa (P< 0.05) en ambos grupos

comparado a su respectivo control: 1.5

± 1.4 ng/mL y 3.9 ± 4.0 ng/mL para 12 y

20% respectivamente (figura 4D).


teína en la dieta y administración conti-

nua de rhIGF-I sobre los niveles

circulantes de IGFBPs

El efecto de la infusión continua de

rhIGF-I sobre los niveles séricos de IGFBP-

3 en los cuatro grupos dietarios se obser-

va en la figura 5; en todos los grupos, los

niveles fueron significativamente elevados

comparado a su respectivo grupo control

que recibió infusión de vehículo. La infu-

sión de rhIGF-I incrementó en dos veces

los niveles en ratas alimentadas con dieta

libre de proteína, comparado al grupo con-

trol alimentado con 20% de proteína. Por

el contrario, los grupos control, los nive-

les fueron disminuidos progresivamente

con la disminución del contenido de pro-

teína ingerida.


61

Figura 4Efecto del consumo variable de proteína en la dieta sobre los niveles

circulantes de IGF-I durante 5 días (A) y administración continua de rhIGF-Idurante 7 días (B), niveles circulantes de insulina (C) y niveles circulantes deGH (D) en ratas normales con infusión de rhIGF-I (barras negras) o vehículo(barras abiertas). Los valores están expresados como la media ± sem paran=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. Control en la misma dieta P < 0.05;

b Control alimentado 20% vs. Control alimentado 12, 4 ó 0%. c rhIGF-Ialimentado dieta 20% vs. rhIGF-I alimentado dieta 12, 4 ó 0% P < 0.05. Los

valores están expresados como la media ± sem para n=6 ratas en cadagrupo. En figura D valores individuales para n=9-12 ratas en cada grupo;animales recibiendo infusión continua de rhIGF-I (cuadrados abiertos) o

vehículo (rombos negros).


62

Los niveles de IGFBP-1 fueron signifi-

cativamente incrementados en respuesta

a la disminución del contenido de proteína

ingerida en la dieta. La infusión de rhIGF-I

incrementó significativamente los niveles de

la IGFBP-1 comparado a los controles en

los animales que consumieron dietas 12,

4 y 0% (datos no mostrados).


teína y administración continua de

rhIGF-I. sobre la distribución de pobla-

ciones linfocitarias en el bazo

El análisis de citometría para determi-

nar la distribución celular de células B, T

CD4+ y T CD8+ en el bazo de ratas trata-

das con vehículo o IGF-I y alimentadas

con varias dietas se muestran en la tabla

II. Entre las diferentes dietas, no se en-

contró diferencia entre las infusiones de

vehículo y de IGF-I en cuanto al porcen-

taje de células B, T CD4+ y T CD8+. El

porcentaje de células B se incrementó en

los animales tratados tanto con vehículo

como con IGF-I y como resultado de la

disminución del contenido de proteína en

Figura 5Efecto del consumo de proteína variable (0 - 20%) durante 12 días en ratas

normales con infusión continua de rhIGF-I (barras negras) y de vehículo(barras abiertas) sobre los niveles circulantes de IGFBP-3. Las proteínas delsuero fueron separadas por electroforesis PAGE-SDS 4-20%, transferidas a

nitrocelulosa 0.22 µm, incubadas con 125I-IGF-I y expuestas a película MS

Kodak. La cuantificación se hizo por exposición de las membranas apelículas del PhosphoImager. Los valores están expresados como la media

± sem para n=6 ratas en cada grupo. a rhIGF-I vs. control alimentados con lamisma dieta P < 0.01; b Control alimentado 20% vs. Control alimentado dieta

12, 4 ó 0% P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,4 ó 0%. P < 0.01.


63

Tabla 2Distribución de linfocitos en el bazo de ratas normales

% proteína % linfocitos B % linfocitos T CD4+ % linfocitos T CD8+

En dieta Vehículo rhIGF-I *P Vehículo rhIGF-I *P Vehículo rhIGF-I *P

valor valor valor

0 42.5 ± 2 38.4 ± 1 NS 30.2 ± 1.3 30.5 ± 2 NS 17.5 ± 1.1 19.4 ± 1.6 NS

4 39.1 ± 0.9 34.6 ± 2 NS 29.5± 1.3 30.8 ± 1.9 NS 17.3± 0.9 19.3 ± 1.3 N S

12 34.3 ± 3.6 29 ± 1.7 NS 26.7 ± 1.7 28.8 ± 1.4 NS 15.7 ± 0.8 15.8 ± 1.3 NS

20 34.7 ± 2.3 33.7 ± 3 NS 28.5 ± 1.4 27.5 ± 2.3 NS 16.5 ± 1.1 19.2 ± 2 NS

Los datos están expresados como la media ± sem para n= 6 ratas en cada grupo. NS: no significante.

la dieta. En contraste, el porcentaje de

células T CD4+ y T CD8+ no se modificó

significativamente.

Efecto de la variación del contenido

de proteína en la dieta y administración

continua de rhIGF-I. sobre la expresión

en bazo de las proteínas de unión al IGF,

GHR, IGF-IR e IGF-I

La restricción de proteína en la dieta

causó una disminución similar en la expre-

sión de la IGFBP-2 (figura 6A) en los ani-

males que recibieron rhIGF-I o vehículo.

Los niveles fueron significativamente más

bajos en ambos grupos, rhIGF-I y vehícu-

lo, alimentados con dieta 4 y 0% de pro-

teína, comparado con los grupos

alimentados con 20%. Por el contrario la

expresión de la IGFBP-3, -4 y -6 se

incrementó con la reducción del conteni-

do de proteína ingerida en la dieta tanto

en los animales con infusión de rhIGF-I

como de vehículo (figura 6B-D).

Aunque la expresión de la IGFBP-3

mostró una tendencia a ser mayor en los

grupos que recibieron rhIGF-I en las die-

tas 0 y 4%, ésta no fue significativa (P =

0.09). La expresión de la IGFBP-4 fue ma-

yor en los grupos control y rhIGF-I alimen-

tados con dieta 0 y 4% de proteína,

comparado con los grupos alimentados

con 20% de proteína. La expresión de la

IGFBP-6 fue significativamente mayor en

el grupo control comparado con el que

recibió rhIGF-I en la dieta 0% proteína.

Los niveles de mRNA para el GHR fue-

ron incrementados significativamente (P <

0.05) por la restricción de proteína en la

dieta y por la infusión continua de rhIGF-I

(figura 7B). Los animales alimentados con

dieta 0 y 4% de proteína que recibieron

infusión de rhIGF-I mostraron mayores ni-

veles de expresión que los que recibieron

vehículo. Resultados similares se obtuvie-

ron por citometría de flujo al determinar el

porcentaje de linfocitos B positivos para

el GHR (figura 7A). Los resultados

correlacionaron con los de la expresión del

mRNA del GHR, excepto para los grupos

dietarios del 0 y 4%, donde el porcentaje

de células B positivas para GHR fue ma-

yor en los animales tratados con vehículo

que con IGF-I.


64

Los niveles de mRNA para el IGF-IR

fueron significativamente (P < 0.01) más

elevados en animales alimentados con

dietas 0 y 4% de proteína comparado a

los alimentados con dietas 12 ó 20% de

proteína; no hubo diferencias significativas

entre los que recibieron infusión de rhIGF-I

o los que recibieron vehículo (figura 8B).

Los análisis de citometría de flujo demos-

traron un aumento significativo en el por-

centaje de linfocitos B, T CD4+ y T CD8+

reactivos o positivos para el receptor de

IGF-I. La figura 8A muestra este fenóme-

no en linfocitos B. Similar al fenómeno

observado en linfocitos B, la expresión del

receptor de IGF-I es incrementada por la

restricción proteica y la administración de

rhIGF-I.

La expresión del IGF-I en el bazo de

las ratas con infusión continua de rhIGF-I

no presentó ningún cambio significativo

con la variación del contenido de proteína

ingerida en la dieta (datos no mostrados).

Figura 6Efecto del contenido de proteína ingerida en la dieta sobre la expresión de lasproteínas de unión al IGF, IGFBP-2 (A) y IGFBP-3 (B), IGFBP-4 (C), IGFBP-6 (D)en ratas normales con administración continua de rhIGF-I (barras negras) o

vehículo (barras abiertas) durante 7 días. Los valores están expresados comola media ± sem para n=6 ratas en cada grupo a Vehículo vs. rhIGF-I con la

misma dieta, P < 0.01; b Vehículo alimentado 20% vs. Vehículo alimentado 12,4 ó 0% proteína, P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,

4 ó 0% proteína, P < 0.001.


65

Figura 8Efecto del contenido de proteína ingerida en la dieta sobre la expresión delreceptor para IGF-I (IGF-IR) en bazo de ratas normales con administracióncontinua de rhIGF-I (barras negras) o vehículo (barras abiertas) durante 7

días. Porcentaje de linfocitos B GHR+ determinados por citometría de flujo(A) y niveles de mRNA para el GHR determinados por ensayo de protección

de RNAsas (B). Los valores están expresados como la media ± sem paran=6 ratas en cada grupo. a Vehículo vs. rhIGF-I con la misma dieta, P < 0.01;

b Vehículo alimentado 20% vs. Vehículo alimentado 12-, 4- ó 0% proteína,P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12-, 4- o 0%

proteína, P < 0.001.

Figura 7Efecto del contenido de proteína ingerida en la dieta sobre la expresión del

receptor para hormona de crecimiento (GHR) en bazo de ratas normalescon administración continua de rhIGF-I (barras negras) o vehículo (barras

abiertas) durante 7 días. Porcentaje de linfocitos B GHR+ determinados porcitometría de flujo (A) y niveles de mRNA para el GHR determinados porensayo de protección de RNAsas(B). a Vehículo vs. rhIGF-I con la mismadieta, P < 0.01; b Vehículo alimentado 20% vs. Vehículo alimentado 12, 4

ó 0% proteína, P < 0.01; c rhIGF-I alimentado 20% vs. rhIGF-I alimentado 12,4 ó 0% proteína, P < 0.001.


66

Discusión

La hormona de crecimiento (GH) y el

IGF-I estimulan el crecimiento somático,

el desarrollo y regulan varias funciones

fisiológicas. Se conocen acciones direc-

tas e indirectas de la GH en el crecimien-

to y el metabolismo. Los efectos directos

son mediados por el receptor de la GH

(GHR) y se cree que son independientes

del IGF-I. Las acciones indirectas de la

GH son mediadas por la síntesis de IGF-I

inducida por la GH, el cual es producido

principalmente en el hígado (75%) y mu-

chos otros tejidos (7). El IGF-I y la GH tan-

to en circulación como localmente,

podrían estar regulando los efectos del

IGF-I sobre el crecimiento, desarrollo y

metabolismo. Algunos estudios de proli-

feración y diferenciación in vivo han mos-

trado que la GH y el IGF-I tienen efectos

sobre células del sistema inmune (8, 9).

Estudios in vitro igualmente han demos-

trado el efecto de estas hormonas sobre

la proliferación y diferenciación de célu-

las de origen linfoide, dando relevancia

al papel que desempeña el eje local GH/

IGF-I (12, 13). Los estudios originales con

ratones “knockout” confirmaron que el

desarrollo de la gran mayoría de los teji-

dos, sino todos, era regulado en alguna

medida por el sistema IGF- I (14).

En esta investigación el concepto de

malnutrición proteínica se refiere a la con-

dición nutricional cuando el animal con-

sume dieta con contenido de proteína del

4 ó 0%. Esta condición conlleva a una de-

tención o disminución del crecimiento cor-

poral, disminución aguda en niveles

circulantes de IGF-I, insulina, y proteína de

unión 3 al IGF-I.

Influencia de la cantidad de proteí-

na dietaria sobre los niveles circulantes

de GH e IGF-I

Se conoce que dos neuropéptidos de

origen hipotalámico, la hormona libera-

dora de la GH (GHR) y su antagonista, la

somastotatina (SRIF) regulan la secreción

de la GH de la pituitaria anterior. Esta se-

creción ocurre de manera pulsátil presen-

tándose un dimorfismo sexual; en

machos se caracteriza por picos de alta

amplitud cada 3.3 h y por niveles muy ba-

jos entre estos pulsos; mientras que en

las hembras se caracteriza por mante-

ner niveles más bajos y una pulsatilidad

reducida (15, 16). En ratas, la secreción pul-

sátil de GH es reducida por la malnutri-

ción proteínica, debido en parte a un

exceso de SRIF y una disminución en la

secreción de GHR (17). La infusión conti-

nua de rhIGF-I redujo significativamente

la secreción de GH y prolactina en con-

diciones de adecuado consumo de pro-

teína en la dieta; por el contrario en

condiciones de malnutrición proteínica

(0%, 4%) no se observaron cambios en

los grupos control o los que recibieron

infusión de rhIGF-I. Adicionalmente, se

conoce que la restricción proteica, ate-

núa la respuesta al estímulo con GHR,

reduce el tamaño de la pituitaria y el con-

tenido de GH.

La malnutrición proteica disminuyó

los niveles séricos de IGF-I en las ratas

control; mientras que en las que recibie-

ron infusión de rhIGF-I y alimentadas con

dietas 4 y 0%, los niveles permanecie-

ron normales. Esto demuestra que el

contenido de proteína dietaria puede

regular los niveles de IGF-I circulante, no

sólo el de origen hepático, sino también

el derivado de otros tejidos no hepáti-

cos (18-21). Uno de los tejidos extrahepáti-

cos que puede estar contribuyendo es

el músculo. Esto fue demostrado en ra-

tas que fueron alimentadas con dieta 8%

de proteína en las cuales los niveles del

mRNA para el IGF-I y los del péptido en

el músculo esquelético fueron signifi-

cativamente reducidos (75%) compa-

rado con los animales que consumieron

una dieta con contenido de 20% de

proteína (11).


67

Contribución de las IGFBPs circulan-

tes a la regulación nutricional sistémica

La cantidad de proteína ingerida y el

balance de energía son los principales re-

guladores del IGF-I circulante. Se conoce

que un bajo consumo de proteína está

asociado con cambios en las IGFBP’s (22).

Un déficit de proteína o de energía, o de

ambos a la vez, reduce los niveles de IGF-I

en proporciones que dependen del perío-

do y tipo de estrés nutricional. En este es-

tudio se muestra que una dieta libre de

proteína reduce los niveles séricos de IGF-I

en 65 y 80% después de 5 y 12 días res-

pectivamente. De forma similar los niveles

séricos de IGFBP-3 disminuyeron progre-

sivamente en la medida que el consumo

de proteína en la dieta disminuyó. Por el

contrario los niveles circulantes de IGFBP-1

incrementaron con la disminución del con-

sumo de proteína.

Se conoce que la IGFBP-1 es altamen-

te sensible al estado nutricional del orga-

nismo (23). En ratas alimentadas con una

dieta libre de proteína durante una sema-

na, la transcripción del gen hepático para

la IGFBP-1 fue incrementado en 3 veces;

se ha demostrado que este fenómeno es

debido en parte a la unión de al menos

dos factores que se unen al promotor. Va-

rios estudios han mostrado que la expre-

sión del gen para la IGFBP-1 es inhibida

por insulina tanto in vivo como in vitro. A

bajos niveles de proteína, factores como

la deprivación de aminoácidos se ha de-

mostrado que causan el incremento en los

niveles de IGFBP-1 en hígado de rata (24).

Por el contrario, la GH se conoce que tie-

ne efecto inhibitorio sobre la expresión del

IGFBP-1 (25).

Influencia de la cantidad de proteí-

na ingerida sobre el eje local GH/IGF-I

(GHR, IGF-IR, IGF-I y IGFBP-1 a -6). Pa-

pel de la nutrición en la disponibilidad

de IGF-I a nivel de tejido

Uno de los objetivos de esta investi-

gación fue estudiar los efectos de los ni-

veles circulantes de IGF-I y GH sobre el

bazo durante la malnutrición proteica. En

las ratas que recibieron infusión continua

de rhIGF-I, el bazo aumentó de tamaño

consistentemente en los cuatro grupos

dietarios. Este hecho sugiere que el IGF-I

circulante y la proteína dietaria son facto-

res importantes para este efecto. En la

medida que los niveles séricos de IGF-I

disminuyeron con la reducción en el con-

tenido de proteína dietaria, el peso de este

tejido también disminuyó; lo cual es una

evidencia adicional del efecto directo del

IGF-I circulante sobre el tamaño del bazo.

La distribución relativa de linfocitos en

el bazo fue afectada por la restricción de

proteína. En la rata la restricción de pro-

teína durante 12 días aumentó el por-

centaje de l infocitos B; la infusión

continua de rhIGF-I durante 7 días no

mostró un efecto significativo sobre es-

tos valores. El hecho de no haber encon-

trado cambios en la población relativa de

linfocitos en animales alimentados con

dietas de 4, 12 y 20% de proteína sugie-

re que un nivel de 4% de proteína es la

concentración crítica para mantener el

equilibrio en un organismo. Podría consi-

derarse que los cambios observados en

los animales con dieta 0% corresponden

a mecanismos regulatorios para mante-

ner el equilibrio homeostático del orga-

nismo en condiciones de restricción de

proteína dietaria; lo que estaría de acuer-

do con la hipótesis planteada reciente-

mente por Dorshkind y Horseman (26) para

explicar el mecanismo modulador de es-

tas hormonas en el sistema inmune.

Estos fenómenos pueden estar asocia-

dos con cambios en algunos elementos

del eje GH/IGF-I tanto a nivel de circula-

ción como locales. Para indagar este me-

canismo se analizó la expresión de genes

tales como el GHR, IGF-IR, IGF-I, e

IGFBP’s en el bazo. En las ratas alimenta-


68

das con los cuatro niveles de proteína no

se observó ningún cambio en los niveles

de expresión del mRNA esplénico para el

IGF-I. Por el contrario, los niveles de mRNA

del IGF-IR se incrementaron con la restric-

ción de proteína en la dieta; lo anterior

sugiere que este incremento puede ser

una respuesta secundaria a los bajos ni-

veles circulantes de IGF-I. La restricción

de proteína en la dieta incrementó la ex-

presión del mRNA para el GHR. Este in-

cremento correlacionó con la elevada

capacidad de unión observada en

linfocitos B y T. No hay claridad respecto a

la influencia que tenga los niveles circu-

lantes de GH. En ratones los niveles de

GH en condiciones de malnutrición

proteica son elevados (20), mientras que en

ratas son reducidos; por tanto, no se pue-

de generalizar que el incremento en la ex-

presión del GHR sea una respuesta

secundaria a niveles circulantes de la GH.

Interesante, es el hallazgo del incremento

en la expresión del GHR estimulada en

animales que recibieron la infusión de

rhIGF-I; pero este aumento no se observó

en la capacidad de unión de los linfocitos

esplénicos, lo cual sugiere algún efecto

postranscripcional.

El eje GH/IGF-I en el bazo muestra ser

activo y a la vez regulador del metabolis-

mo. La expresión de los receptores para

GH e IGF-I tanto en linfocitos B como T y

la expresión confirmada de cuatro de las

seis proteínas de unión al IGF son hechos

que demuestran este fenómeno. La pre-

sente investigación mostró que el mRNA

para el IGF-I en el bazo no es regulado

por la cantidad de proteína ingerida en la

dieta; mientras que los blancos de unión

del IGF-I sí lo son: el IGF-IR y las proteínas

de unión a través de los cuales el IGF-I ejer-

ce su función biológica. Lo anterior indica

que la captación de IGF-I por el bazo es

un evento importante en el metabolismo

de este órgano. La restricción de proteína

en la dieta causó un incremento en la ex-

presión del IGF-IR, la IGFBP-3, -4 y 6; mien-

tras que en circulación la IGFBP-3 dis-

minuyó y la IGFBP-4 no presentó algún

cambio.

La administración exógena de rhIGF-I

incrementó los niveles de la IGFBP-1 y -3

en circulación en ratas alimentadas con

dietas 0 y 4%, mientras que no se observó

efecto en la IGFBP-4. En condiciones de

buena nutrición, solamente los niveles de

IGFBP-3 son incrementados. La hipótesis

de trabajo de esta investigación según la

cual, en condiciones de estrés nutricional,

el eje local GH/GF-I puede estar modulan-

do los cambios inducidos por la deficien-

cia de proteína para preservar la

homeostasis del tejido encuentra soporte

en los hallazgos de este estudio. El bazo

estaría produciendo activamente IGFBP-3,

—4 y 6 para capturar el IGF-I de la circula-

ción; por tanto, el efecto anabólico obser-

vado de incremento en el tamaño del bazo

puede ser explicado por el incremento en

la captura de IGF-I de la circulación.

La respuesta fisiológica al IGF-I

exógeno bajo condiciones de estrés nu-

tricional puede ser un efecto combinado

de varios factores:

• Los altos niveles circulantes de IGFBP-

1 e IGFBP-3 incrementan la vida me-

dia del IGF-I.

• El mecanismo local paracrino/

autocrino, puede ser activado por el

aumento en la expresión ya descrita

anteriormente de los elementos res-

ponsables de la captación del IGF-I.

Esto puede resultar en un incremento

del porcentaje de células B y T expre-

sando ambos receptores, así como

también en un incremento en el núme-

ro de receptores por célula. Es cono-

cido que las IGFBPs unen el IGF-I con

afinidades mayores que las del recep-

tor de IGF-I; puede ocurrir que el in-

cremento observado en la actividad

esplénica esté captando la mayor par-


69

te del IGF-I del medio y del receptor,

modulando así la acción biológica,

aumentando su vida media y distribu-

ción en el bazo.

Dentro de los posibles mecanismos

que pueden estar involucrados en el man-

tenimiento de la homeostasis durante el

estrés nutricional inducido por una baja o

completa restricción proteica, se pueden

mencionar los siguientes:

• El incremento en la capacidad de

unión de los linfocitos a la GH para

compensar los efectos deletéreos del

déficit de nutrientes sobre la función

inmune.

• La elevada capacidad de unión a IGF-

I (IGF-IR), junto con el incremento en

la expresión de las proteínas IGFBP-3,

4 y 6, en condiciones en las que el IGF-

I circulante es reducido, pueden ser el

reflejo de una mayor captación local

de IGF-I, lo que puede estar dando

cuenta de las acciones anabólicas del

péptido en el órgano linfoide.

En conclusión, en esta investigación

se ha demostrado que la restricción

proteica tiene efectos profundos en el eje

local linfoide GH/IGF-I. Se ha podido de-

mostrar que el rhIGF-I estimula el

anabolismo en el bazo a expensas del

catabolismo inducido por la restricción de

proteína en la dieta. Los datos obtenidos

sugieren que el incremento en la expre-

sión de varios de los elementos del eje:

IGF-IR, IGFBP-3, -4 y -6 durante la malnu-

trición proteica pueden estar capturando

el IGF-I circulante o el producido localmen-

te como una manera de compensar los

bajos niveles causados por la deficiencia

de proteína en la dieta. Este incremento

puede también afectar la homeostasis de

la población linfocitaria y prevenir que la

restricción proteica ejerza mayores efec-

tos sobre la función inmune.

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