การจำลองdna (dna replication)conf.agi.nu.ac.th/webnewasp/ereading/gene/unit3.pdf ·...

พันธุศาสตรโมเลกลุเบื้องตน (258444) ปการศึกษา 2/2547

กวี สุจิปุล ิ1

บทที่ 3 การจําลองดีเอ็นเอ (DNA replication)

คํานํา การจําลองดีเอน็เอในแตละโครโมโซม (chromosome) เกดิขึ้นในระยะเอสเฟต (S phase หรือ synthesis phase) ของระยะอินเทอรเฟต (interphase) ในกระบวนการแบงเซลลแบบไมโตซีส (mitosis) และไมโอซีส (meiosis) ทําให 1 โครโมโซมมี 2 ซีสเตอรโครมาติด (sisterchromatid) ซ่ึงแตละโครมาติดประกอบดวยดีเอ็นเอ 1 โมเลกุล ในป ค.ศ. 1953 Watson และ Crick ไดตั้งสมมติฐานเกีย่วกับการจําลองดีเอ็นเอสายคู (double helix) วามีการจําลองเปนแบบกึ่งอนุรักษ (semiconservative DNA replication) คือดีเอ็นเอสายคูมีการแยกออกจากกันเปนดเีอ็นเอสายเดีย่ว (single strand DNA) 2 สาย ซ่ึงแตละสายทาํหนาที่เปนสายแมแบบ (template strand) ของดีเอ็นเอสายใหม (daughter strand) ที่มีลําดับคูสมกัน (base complementary) กับดีเอ็นเอสายแมแบบทุกประการ เมื่อส้ินสุดการจําลองดีเอ็นเอจะได ดีเอ็นเอ 2 สาย ที่แตละโมเลกุลของดีเอ็นเอประกอบดวยดีเอ็นเอสายแมแบบ 1 สาย พันเกลียวกับดีเอ็นเอสายใหมอีก 1 สาย ดงัมีรายงานการทดลองของ Mesclson และ Stahl (1958) คือทําการทดลองโดยเลี้ยง E. coli ในอาหารที่มีธาตุไนโตรเจนกัมตรังสี (15N) โดยใช 15(NH4)2SO4 ซ่ึงเปนองคประกอบหลักของไนโตจีนัสเบส (nitrogenous base) เพื่อใหดีเอน็เอของ E. coli ถูกติดฉลาก (label) ดวย 15N ทําใหได ดเีอ็นเอที่มีน้ําหนักมากคือ 15N/15N (heavy DNA) จากนั้นนําแบคทีเรียที่มีดีเอ็นเอชนิด 15N/15N ดังกลาวไปเลี้ยงในอาหารที่มี 14N แลวปลอยใหเกิดการจําลองดีเอ็นเอผานไป 1 รุน (generation) จึงทําการสกัดดีเอ็นเอจากแบคทีเรีย จากนั้นนํามาปนเหวีย่งใน CsCl gradient ไดแถบดีเอ็นเอ 1 แถบ คือแถบที่มีน้ําหนักที ่ 15N /14N (hybrid DNA) แลวเมื่อมกีารจําลองดีเอน็เอในรุนที ่2 ไดแถบดีเอ็นเอ 2 แถบ ที่มีน้ําหนักอยูระหวาง 15N /14N กับแถบที่มีน้ําหนกัเบา 14N /14N (light DNA) อยูดานบน จากนัน้เมื่อมีการจําลองดีเอ็นเอในรุนที่ 3 พบวาจะไดดีเอ็นเอที่น้ําหนกัเบา 14N /14N เพิ่มมากขึ้น ซ่ึงเห็นเปนแถบหนา จึงยืนยนัไดวาการจําลองดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตเปนแบบกึ่งอนุรักษ (รูปท่ี 3.1)

รูปแบบของการจําลองดีเอ็นเอ (DNA replication mode) แบงไดเปน 3 รูปแบบ คือ 1. การจําลองดเีอ็นเอแบบทีตา (Theta mode of DNA replication)

2. การจําลองดีเอ็นเอแบบซิกมา (Rolling circle or sigma mode of DNA replication)



3. การจําลองดเีอ็นเอแบบตวัวาย (Y-shaped mode of DNA replication)

รูปท่ี 3.1 การจําลองดีเอ็นเอเปนแบบกึ่งอนุรักษ (semiconservative DNA replication) ในการทดลองของ Mesclson และ Stahl (ที่มา : Hartl และ Jones, 1998)

I. การจําลองดเีอ็นแบบทีตา (Theta mode of DNA replication) Cairna (1963) รายงานวา การจําลองดีเอ็นรูปวงแหวนปลายปดของ E. coli เปนแบบ theta

mode กลาวคือ ที่ตําแหนง oriC ของดีเอ็นเอวงแหวนเกลียวคูจะแยกเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยไมมีการตัดสายดีเอ็นเอวงแหวนใหเปดออก เรียกจุดแยกบนดีเอ็นเอนี้วา bubble โดยบริเวณ oriC จะมีเพียง 1 จุดบนดีเอ็นเอวงแหวน (ring DNA) ของ E. coli จากนั้นมีการการจําลองดีเอ็นแบบสองทิศทาง



(bidirectional replication) (รูปท่ี 3.2) ไปตามเสนดีเอ็นเอของ E. coli ซ่ึงทําหนาที่เปนดีเอ็นเอแมแบบ เมื่อการจําลองดีเอ็นดําเนินไปครึ่งกระบวนการ จะเห็นดีเอ็นเอวงแหวนมีรูปรางคลาย theta (θ) และเมื่อส้ินสุดกระบวนการการจําลองดีเอ็น จะไดดีเอ็นเอวงแหวน 2 โมเลกุล ซ่ึงแตละโมเลกุลประกอบดวย ดีเอ็นเอ 2 สาย สายหนึ่งเปนสายแมแบบ และอีกสายหนึ่งเปนสายใหม (รูปท่ี 3.3)

หมายเหต ุจุด oriC ประกอบดวยเบสจํานวน 245 คูเบส (base pairs) โดยมีลําดับเบสจํานวน 9-13 เบส เรียงซ้ําๆ กัน ที่เรียกวา repeating sequences of 9 and 13 bases (9 mers และ 13 mers)

รูปท่ี 3.2 การจําลองดีเอน็แบบสองทิศทาง ของโปรคารีโอตและยคูารีโอต

(ที่มา : Russell, 1991)



รูปท่ี 3.3 การจําลองดีเอ็นแบบ theta mode ของ E. coli

(ที่มา : http://bioweb.wku.edu/courses/biol22000/14Topoisomerase/images/F12-18.JPG, 2547)

II. การจําลองดีเอ็นแบบซิกมา (Rolling circle or sigma mode of replication) (รูปท่ี 3.4) เปนการจําลองดีเอ็นเอแบบทิศทางเดียว (unidirectional replication) พบในเอฟแฟกเตอร

(F-factor) ของแบคทีเรีย และไวรัสบางชนิด เชน bacteriophage, λ phage และ φ X 174 phage ซ่ึงมีขั้นตอนการจําลองตัวเองดังนี้ 1. สายใดสายหนึ่งของดีเอ็นเอเกลียวคูของวงแหวนดีเอ็นเอถูกตัดที่พันธะฟอสเฟอรไดเอสเทอร (phosphodiester bond) เกิดรอยขาด (nick) ทําใหเกิดปลาย 3/OH และปลาย 5/PO4 อิสระขึ้น 2. บริเวณจุดขาดที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอจะทําหนาที่เปนไพรเมอร (primer) สําหรับเอนไซมดีเอ็นเอโพลีเมอรเรส (DNA polymerase) เพื่อสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมใหยาวออกไปโดยใชดีเอน็เออีกสายหนึ่งทีไ่มไดถูกตัดซึง่อยูในรูปวงแหวนสายเดีย่วเปนแมแบบ 3. ขณะปลาย 3/OH ที่มีการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมไปรอบๆ สายดีเอ็นเอวงแหวนสายเดี่ยวที่ทําหนาที่เปนแมแบบ ก็จะดันใหปลาย 5/PO4 ที่อยูบริเวณรอยขาดคลายตัวออกจากวงแหวนไปเร่ือยๆ หลุดมาเปนดีเอ็นเอสายเดี่ยว (linear single strand DNA) ซ่ึงจะถูกใชเปนแมแบบในการสังเคราะหดีเอน็เอสายใหมขึ้นมาอีก 1 สาย โดยดีเอ็นเอสายใหมที่สังเคราะหขึ้นจะเปนดเีอ็นเอทอน

ส้ันๆ ที่เรียกวา Okasaki fragment เนื่องจากทิศทางการสังเคราะหดีเอน็เอสายใหมเปนแบบ 5/ → 3/ ดังนั้นทุกครั้งที่ดีเอ็นเอสายแมแบบที่มีปลาย 5/PO4 ถูกดันออกมากจ็ะมีไพเมอรตวัใหมเขาเกาะแลวเร่ิมกระบวนการสงัเคราะหดีเอน็สายใหมขึ้น จงึทําใหไดดีเอน็เอสายใหมเปนทอนส้ันๆ 4. เมื่อการจําลองดีเอ็นดําเนนิไปไดประมาณครึ่งกระบวนการ จะเห็นดีเอ็นเอวงแหวนมีรูปรางคลายกับ sigma (σ)



5. เมื่อส้ินสุดกระบวนการ การจําลองดีเอ็น จะเกดิเหตุการณ 2 แบบ คือ 5.1 บริเวณปลาย 5/PO4 ของดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่ใชเปนแมแบบ อาจถูกตัดออกหรอืไมถูกตัดออกก็ได นั้น กลาวคือถาถูกตัดออกก็จะไดเปนดีเอ็นโมเลกุลใหม แตถาไมถูกตัดออกก็มีการสังเคราะหดีเอ็นสายใหมตอไปเรื่อยๆ โดยใช ดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่มีปลาย 5/PO4 กลาวเปนแมแบบ 5.2 สายดีเอ็นเอที่มีปลาย 3/OH วางอยูนัน้ยังคงสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมตอไป เพื่อเขาสูการจําลองดีเอ็นในรอบที่ 2 และเปนเชนนี้ไปเรื่อย เมื่อส้ินสุดการจําลองสาย DNA ดังกลาวก็ถูกตัดออกจากดีเอ็นเอวงแหวน

รูปท่ี 3.4 การจําลองดีเอ็นแบบซิกมา

(ที่มา : http://bricker.tcnj.edu/tech/le17/rollcir.gif , 2547 และ http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/phage/roll-circle.GIF, 2547)

http://bricker.tcnj.edu/tech/le17/rollcir.gif

http://www.sci.sdsu.edu/%7Esmaloy/MicrobialGenetics/topics/phage/roll-circle.GIF



III. การจําลองดีเอ็นแบบตัววาย (Y-shaped mode of replication) (รูปท่ี 3.5)

พบในยูคารีโอต และไวรัสบางชนิดที่มีดีเอน็เอมีรูปรางเปนเสน (linear DNA) ซ่ึงกระบวนการ จําลองดีเอ็นเอนั้นจะมีจุดเริ่มตน (ori) ของการเกิด replication bubble บนสายดีเอ็นเอ โดยในไวรสันั้น มีจุด ori เพียงจุดเดยีว แตยูคารีโอตมีจุด ori หลายจุดบนดีเอ็นเอสายเดยีวกัน ซ่ึงในแตละ bubble จะมีการจําลองดีเอน็เอแบบสองทิศทาง และยงัคงดําเนินตอไปเรื่อยๆ จนกระทั่งแตละ bubble มาบรรจบกันกลายเปน bubble ใหญ ซ่ึงการเคลื่อนที่ของ bubble ไปสูปลายดีเอ็นเอนั้นทําใหโครงสรางของดีเอ็นเอมีรูปรางเปน อักษร Y shape เมื่อส้ินสุดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอได ดเีอ็นเอ 2 โมเลกุล แตละโมเลกุลประกอบดวยสายเดิมหนึ่งสายและสายใหมที่สังเคราะหขึ้นมาอีกหนึ่งสาย

รูปท่ี 3.5 กระบวนการจําลองดีเอ็นเอแบบอักษรวาย (ที่มา Klug : และ Cummingd, 2000)

ปจจัยท่ีจําเปนตอกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ

1. สารตั้งตน (substrate หรือ precursor) สารตั้งตนที่จําเปนในการจําลองโมเลกุลของดีเอ็นเอ คือ ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไซดไทร

ฟอสเฟต (deoxyribonucleoside triphosphate; dNTP) มี 4 ชนิด คือ ดีออกซีอะดีโนซีนไทรฟอสเฟต(deoxyadenosine triphosphate ;dATP) ดีออกซีกัวโนซีนไทรฟอสเฟต (deoxyguanosine triphosphate; dGTP) ดีออกไซทิดีนซีไทรฟอสเฟต (deoxycytidine triphosphate; dCTP), ดีออกซีไทมิดีนไทร



ฟอสเฟต (deoxythymidine triphosphate; dTTP) ซ่ึงกระบวนการสังเคราะหนิวคลีโอไทดในเซลลนั้น 2 วิธี คือ

1) กระบวนการสังเคราะหขึ้นใหมจากสารโมเลกุลเล็ก (de novo synthesis) เปนกระบวนการสังเคราะห nucleotide จากสารตั้งตนที่มีโมเลกุลเล็ก เชน กรดอะมิโน (amino acid) คารบอนไดออกไซด (CO2) แอมโมเนีย (ammonia) และฟอเมต (formate) เปนตน

2) กระบวนการสังเคราะหโดยวิถีกูคืน (salvage pathway) คือ กระบวนการสังเคราะหนวิคลีโอไทดจากสารอาหาร หรือการสลายกรดนิวคลีอิก หรือนิวคลีโอไทดในรางกาย

กระบวนการสังเคราะหนิวคลีโอไทดดังกลาวเกิดขึ้นภายในเซลล โดยเริ่มสังเคราะหโมเลกุลพิวรีน (purine nucleus) และโมเลกุลไพริมิดีน (pyrimidine nucleus) กอน จากนั้นทําการเชื่อมตออะตอมของ C และ N ที่ไดจากสารตั้งตนเปนวงแหวนพิวรีน (purine ring) บนโมเลกุลของ 5/phosphoribosyl-1-pyrophosphate (PRPP) ซ่ึง C และ N ที่ใชไดมาจากคารบอนไดออกไซด (CO2) ไกลซีน (glycine) กลูตามีน (glutamine) ฟอเมต (formate) และ แอสพาเตต (aspatate) สําหรับวงแหวนไพริมิดีน (pyrimidine ring) สวนประกอบของนิวเคลียสไดมาจากคารบอนไดออกไซด กลูตามีน และ แอสพาเตต (รูปท่ี 3.6)

พิวรีน ไพริมิดีน

รูปท่ี 3.6 แหลง C และ N ของวงแหวนพวิรีน และไพรมิิดีน (ที่มา : http://medlib.med.utah.edu/NetBiochem/pupyr/pupy12.gif, 2547)

2. ดีเอ็นเอแมแบบ (DNA template) คือดีเอ็นเอสายเดี่ยว (single strand DNA) ที่เกิดจากการแยกของดีเอ็นเอสายคู (double strand

DNA) ซ่ึงทําหนาที่เปนสายแมแบบในกระบวนการจําลองดีเอ็นเอเพื่อสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมซ่ึงมีเบสคูสมเขามาจับคู (complementary base pair) กับดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยการจําลองดีเอ็นเอเปน

http://medlib.med.utah.edu/NetBiochem/pupyr/pupy12.gif



แบบกึ่งอนุรักษ คือ เมื่อส้ินสุดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ จะไดดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล แตละโมเลกุลประกอบดวยดีเอ็นเอสายเดิมหรือแมแบบ (template strand) 1 สาย กับสายใหมอีกหนึ่งสาย (daughter strand)

3. อารเอ็นเอไพเมอร (RNA primer) คือ อารเอ็นเอ (RNA) สายสั้นๆ (RNA oligonucleotide) ที่ประกอบดวยไรโบนิวคลีโอไทด

(ribonucleotide) ประมาณ 5-15 เบส ซ่ึงถูกสังเคราะหมาจากอารเอ็นเอโพลีเมอรเรส (RNA polymerase หรือ primase) โดยอารเอ็นเอไพเมอรนี้มีเบสที่เปนคูสม (complementary base) ที่สามารถเขาจับกับดีเอ็นเอแมแบบที่บริเวณจุด bubble โดยใชพันธะไฮโดรเจน นอกจากนี้ที่บริเวณปลาย 3/OH ของ อารเอ็นเอไพเมอรมีปลาย 3/OH อิสระ เพื่อใหดีเอ็นเอโพลีเมอรเรส (DNA polymerase) นําดีออกซีไรโบสนิวคลีโอไซดไทรฟอสเฟต (dNTP) ที่มีเบสคูสมกับดีเอ็นเอแมแบบเขามาเชื่อมตอดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร (phosphodiester bond) ดีเอ็นเอสายใหมที่สรางขึ้นมีทิศทางการสังเคราะหแบบ 5/

→ 3/

4. เอนไซม (enzyme) เอนไซมที่เกีย่วของกับกระบวนการจําลองดีเอ็นมีหลายชนิด ดังนี ้4.1 Helix uncoiling protein (หรือ helicase) ทําหนาที่สลายพันธะไฮโดรเจนระหวางเบสของ 2 สายโพลีนิวคลีโอไทด เพื่อแยกใหเปน

โพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ว ซ่ึงการทํางานของ helicase เกี่ยวของกับโปรตีน 3 ชนิด คือ dnaA, dnaB และ dnaC ซ่ึงโปรตีนเขาเกาะกับดีเอน็เอสายคู โดยอาศยัพลังงานจากการ hydrolysis ATP

4.2 DNA topoisomerase หรือ DNA gyrase หรือ helix relaxing protein ทําหนาที่คลายปมเหนือจดุแยก (replication fork หรือ replication bubble) โดยการตดัสายใด

สายหนึ่งหรือทั้งสองสายของดีเอ็นเอ ณ ตําแหนงเหนือบริเวณจุดแยกเพื่อคลายปมของดีเอ็นเอไมใหเกิดปมเวียนขาว (positive suppercoils) หลังจากคลายปมแลวจะเชื่อมตอรอยตดัเขาอยางเดิม ซ่ึงปฏิกิริยาดังกลาวตองอาศัยพลังงานจากการ hydrolysis ATP

4.3 DNA polymerase ในโปรคารีโอต (Prokaryote) พบวามี DNA polymerase 3 ชนิด ไดแก 1) DNA polymerase I (pol I)



เปนเอนไซมตวัแรกที่ถูกคนพบวามีหนาที่เกี่ยวของกับการจําลองดีเอ็นเอ และซอมแซมดีเอ็นเอ มีโครงสรางเปนโพลีเปบไทด (polypeptide) สายเดี่ยว มีน้ําหนาโมเลกุลประมาณ 109,000 ดาลตัน ซ่ึงการทํางานของ DNA polymerase I ตองการดีเอ็นเอแมแบบ

หนาท่ีสําคัญของ DNA polymerase I คือ 1) Proofreading หรือ editing function ในกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ ถาสายใหมของดีเอ็นเอ

ที่สังเคราะหขึ้นมา (daughter strand) มีการนําเบสที่ไมใชเบสคูสมกับดีเอ็นเอสายแมแบบ DNA

polymerase I เขาทําหนาที่ตรวจสอบและดําเนินการแกไข โดยใชคุณสมบัติ 5/ → 3/ exonuclease ตัดนิวคลีโอไทดที่ผิดนั้นออกไป แลวนํานิวคลีโอไทดที่ถูกตองเขาเชื่อมตอแทน ซ่ึงอาจเรียกกระบวนการนี้วาการซอมแซมดีเอ็นเอ (excision repair)

2) Nick translation เมื่อเกดิการแตกหักของพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรบนดีเอ็นเอสายใดสายหนึ่งของดีเอ็นเอเกลียวคู เรียกวาเกดิ nick (คือ รอยขาดบนสายโพลีนิวคลีโอไทดที่ขาดออกจากกนัเนื่องจากพันธะฟอสโฟไดเอสเทอรถูกทําลาย โดยรอยขาดนี้มีนวิคลีโอไทดหางกันอยูเพยีง 1 นิวคลีโอไทดเทานัน้ แตถาเกิดชองวางที่มีนวิคลีโอไทดหายไปหลายตัว เรียกวาเกดิ gap) พบวา DNA

polymerase I จะเขาทําหนาที่ซอมแซม nick โดยใชคุณสมบัติทั้ง 5/ → 3/ exonuclease และ polymerase โดยตัด นิวคลีโอไทดที่จากปลาย 5/PO4 ของบริเวณที่เกิด nick ออกจากสายดีเอน็เอ จากนั้นนํานวิคลีโอไทด ที่ถูกตองเขาเชื่อมตอที่ตําแหนงปลาย 3/OH ของบริเวณที่เกดิ nick โดยใชการทํางานของ polymerase แต DNA polymerase I ไมสามารถเชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทดที่บริเวณ nick ได ดังนัน้ nick เคล่ือนตัวไปตามความยาวของสายดีเอ็นเอ ในทิศทางเดียวกบัการสังเคราะหดีเอ็น

เอ (5/ → 3/) 2) DNA polymerase II (pol II) เปนเอนไซมมนี้ําหนกัโมเลกลุประมาณ 90,000 MW มีจาํนวนนอยใน E. coli อาจมีหนาที่

เกี่ยวกับการซอมแซมดีเอ็นเอ มีคุณสมบัติดังนี ้

2.1) มีคุณสมบัติ 3/→5/ exonuclease 2.2) ตองการดีเอ็นเอแมแบบ และไพรเมอร 2.3) ไมสามารถเกิดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอที่มีขนาดยาวๆ ได (นอยกวา 100 nucleotides) 2.4)ไมสามารถทํางานไดถามี sulfidyl group (-SH) 3) DNA polymerase III (pol III)



เปนเอนไซมที่ เกี่ยวของกับกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ โดยทําหนาที่กระตุนใหเกิดการสังเคราะหดีเอ็นเอสาย leading และ lagging strand ซ่ึงมีคุณสมบัติดังนี้

3.1) ทําหนาทีข่ยายยาวหรือสังเคราะหสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม โดยมีทิศทาง 5/ → 3/

3.2) ตองการดเีอ็นเอแมแบบ และไพรเมอร ตองมี Mg+2 เปนตัว catarizer ในการจําลองดีเอ็นเอ 3.3) มีโครงสรางซับซอนกวา Pol I และ Pol II โดย Pol III เปน holoenzyme ที่ประกอบดวย

โพลีเปบไทดจาํนวน 10 หนวย มนี้ําหนกัโมเลกุล 422,000 MW โดยเอมไซมหลัก (core enzyme)

ประกอบดวยโพลีเปปไทด หลายสาย เชน α, β, Ψ, γ, χ และ δ เปนตน โดยมีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 170,000 MW (รูปท่ี 3.12)

3.4) มีคุณสมบัติ 3/ → 5/ exonuclease และ 5/ → 3/ exonuclease 3.5) ไมสามารถเชื่อมตอ 3/OH และ 5/-monophosphate group 3.6) สกัดใหบริสุทธิ์ไดยาก มักจะอยูรวมกบั DNA polymerase II

3.7) มีคุณสมบัติ 3→5 exonuclease และ 5→3 exonuclease 3.8) มีประสิทธิภาพในการทงานที่เกี่ยวของกับกระบวนการจําลองดีเอ็นเอสูงกวา DNA

polymerase I ประมาณ 15 เทา และ สูงกวา DNA polymerase II ประมาณ 300 เทา

รูปท่ี 3.12 องคประกอบของ DNA polymerase III ของ E. coli

ในยูคารีโอต พบวามี DNA polymerase 3 ชนิด (รูปท่ี 3.13) 1) DNA polymerase α หรือ maxi polymerase 1.1) มีน้ําหนกัโมเลกุลประมาณ 220,000 ดาลตัน 1.2) มีปริมาณสูงในชวงระยะ S (Synthesis-DNA) ของการแบงเซลลในระยะอนิเตอรเฟต

2) DNA polymerase β หรือ mini polymerase



2.1) มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 45,000 ดาลตัน 2.2) ทําหนาที่เกี่ยวกับการซอมแซมดีเอ็นเอ 3) DNA polymerase γ หรือ mitochondrial polymerase 3.1) พบในนิวเคลียส และไมโตคอนเดรีย 3.2) มีน้ําหนักโมเลกุลประมาณ 60,000 ดาลตัน 3.3) ทําหนาที่เกี่ยวกับการจําลองดีเอ็นเอในไมโตคอนเดรีย

รูปท่ี 3.13 DNA polymersae ชนิดตางๆ ของ Simian virus 40 (SV40) 5. RNA polymerase (RNA primase)

5.1 ทําหนาทีสั่งเคราะห RNA primere ที่มีขนาดประมาณ 1-60 นิวคลีโอไทด ทั้งนี้ขึ้นอยูกับชนิดสิ่งมีชีวิต 5.2 ใช RNA polymerase เพื่อสังเคราะห RNA primer ในสาย leading strand โดย RNA polymerase ซ่ึงไวตอการตอบสนองของ rifampicin 5.3 ใช RNA primase เพื่อสังเคราะห RNA primer ในสาย lagging strand โดย RNA primase ซ่ึงไมตอบสนองตอ rifampicin

6. ทิศทาง 5/ → 3/ exonuclease ทําหนาที่ตัดนวิคลีโอไทดของโพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ว โดยตดัจากสวนปลาย 5/PO4 ไปยัง

ดาน 3/OH (ทิศทาง 5/ → 3/)

7. ทิศทาง 3/ → 5/ exonuclease



ทําหนาที่ตัดนวิคลีโอไทดของโพลีนิวคลีโอไทดสายเดีย่ว โดยตัดจากสวนปลาย 3/OH ไปยัง

ดาน 5/PO4 (ทิศทาง 3/ → 5/) 8. Endonuclease ทําหนาที่ตัดบริเวณภายในของสายโพลีนิวคลีโอไทดของดีเอ็นเอ โดยทําลายพันธะฟอสฟอได

เอสเทอร ทําใหเกิดปลาย 3/OH และ 5/PO4 ที่บริเวณจดุตดัเกิดเปนรอยขาดที่เรียกวา nick 9. DNA ligase

ทําหนาที่เชื่อมรอยขาด nick ระหวางปลาย 3/OH ของนิวคลีโอไทดหนึ่งกับ 5/ monophosphate ของอีกนิวคลีโอไทดหนึ่ง ดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร (รูปท่ี 3.14)

รูปท่ี 3.14 การเชื่อมตอรอยขาดของดีเอ็นเอ โดยการทํางานของ DNA ligase (ที่มา : http://163.238.8.180/~davis/Bio_327/lectures/DNA_Repl_Chromosomes/ligase.gif, 2547)

ขั้นตอนกระบวนการจําลองดีเอ็นเอมี 3 ขั้นตอน คือ 1. การเริ่มตนการจําลองดีเอน็เอ (initiation of DNA replication) 2. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม (polymerlization of DNA replication) 3. ส้ินสุดการจาํลองดีเอ็นเอ (termination of DNA replication)

กระบวนการจําลองดีเอ็นเอในโปรคารีโอต (DNA replication in prokaryote) การจําลองดีเอน็เอในโปรคารีโอตมีขั้นตอนที่สําคัญ ดังนี้

I. การเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ



เปนขั้นตอนที่เกี่ยวของกับการทํางานของเอมไซม และตองการตําแหนงเริ่มตนที่มีลําดับเบสจําเพาะบนสายดีเอ็นเอ ขั้นตอนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอมีดังนี้

1. เฮลิเคส (helicase) ทําหนาท่ีทําลายเกลียวคูของดีเอ็นเอ (double helix) เกิด replication fork หรือ bubble ขึ้น ณ บริเวณจุดเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ (origin of DNA

replication หรือ ori) ซ่ึงมีเพียงจุดเดยีวใน E. coli โดยมีลําดับเบสที่จําเพาะประมาณ 240-250 คูเบส ที่เปนตําแหนงจดจําของ helicase ซ่ึงทําหนาที่คลายเกลียวคูของดีเอน็เอ โดยทําลายพันธะไฮโดรเจนระหวางเบสที่อยูบนแตละสายของโพลีนิวคลีโอไทด เพื่อใหไดเปนดเีอ็นเอสายเดีย่ว

ขั้นตอนการเกิด replication fork มีดังนี ้1) dnaA protein complex ประกอบดวยโปรตีน 10-20 หนวย เขามาเกาะ (binding หรือ

interaction) กับ oriC ที่ตําแหนง 9 mers (A-T rich) โดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP ทําให DNA อยูในสภาพเกลยีวเวยีนซาย (left-hand หรือ negative supercoil) ซ่ึงงายตอการทําลายพนัธะไฮโดรเจน ทําใหดีเอน็เอเกลยีวคูเปดออก (open complex) กลายเปนดีเอ็นเอสายเดีย่ว (รูปท่ี 3.15)

2) เกิด prepriming complex โดย dnaB protein (ทําหนาที่เปน helicase) รวมตัวกับ dnaC กลายเปน prepriming complex โดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP แลวเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) บริเวณ open complex ที่อยูระหวาง dnaA และ oriC

เมื่อ helicase จะเขาทําหนาทีค่ลายเกลียวคู โดยทําลายพนัธะไฮโดรเจน ระหวางเบสที่อยูบนแตละสายโพลีนิวคลีโอไทด ทําใหเกดิ replication fork หรือ bubble ซ่ึงเปนจุดเริ่มตนการการจําลอง ดีเอ็นเอ (initiation point) โดย 1 bubble จะมี replication fork 2 จุด ที่มีทิศทางตรงขามกัน

รูปท่ี 3.15 ขั้นตอนการเกิด open complex ที่บริเวณ oriC และหนาทีข่องโปรตีน dna B ชวยให primase เขาเกาะกับดีเอ็นเอ เพื่อเร่ิมตนสังเคราะห RNA primer (ที่มา : Klug และ Cumming, 1994)



2. อารเอ็นเอไพเมสทําหนาท่ีสังเคราะหอารเอ็นเอไพเมอร (primase catalyses formation of RNA primer)

dnaB นอกจากทําหนาที่เปน helicase เพื่อเขาเกาะกับ ssDNA ที่ตําแหนงเฉพาะบนตําแหนง open complex แลวยังทําหนาที่กระตุนให primase หรือ RNA polymerase เขามาเกาะที่ตําแหนง ssDNA open complex (oriC) ทั้ง 2 strands เพื่อทําหนาที่สังเคราะห RNA primer ที่มียาวประมาณประมาณ 1-60 คูเบส ที่เรียกวา RNA primer หรือ RNA oligonucleotide ที่มีปลาย 3' OH เปนอิสระ และเปนเบสคูสมกับสายดีเอ็นเอแมแบบ (single DNA template)

การสังเคราะห RNA primer เร่ิมตนดวยการเกิด complex ที่เรียกวา primosome (6 proteins +

ss DNA + primase + helicase) ซ่ึงประกอบดวย โปรตีน 6 ชนิด คือ n, n/, n//, τ, dna B และ dna C เขาจับกับดีเอ็นเอสายเดี่ยว โดยใช ATP จากนั้น primase จะเขารวมกับ preprimosome เกิดเปนหนวยที่เรียกวา primosome ซ่ึงโปรตีน n/ จะใชพลังงานจาการยอยสลาย ATP เพื่อใชสําหรับการเคลื่อนที่ primosome ไปตามความยาวของดีเอ็นเอ จนกระทั่งไปพบ priming site ซ่ึงเลือกโดยสุม หลังจากนั้นโปรตีน dna B. จะเปลี่ยนแปลงโครงสรางของดีเอ็นเอ ตรวจหาตําแหนงที่คัดเลือก ทําให primase เร่ิมตนสังเคราะห RNA primer ขึ้น (รูปท่ี 3.16)

รูปที่ 3.16 โครงสรางของ primase (ที่มา : http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/primase_model.gif, 2547)

เมื่อมีการสังเคราะห RNA primer แลว RNA primer จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอแมแบบ เพื่อเร่ิมตน

การจําลองดีเอ็นเอ โดยอาศัยการทํางานของ polymerase III ที่นํานิวคลีโอไทดตัวใหมเขามาเติมที่ 3/OH ของ RNA primer (รูปท่ี 3.17)

http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/primase_model.gif



รูปท่ี 3.17 ไพรเมอรที่มีปลาย 3/– OH อิสระ เปนตวัเร่ิมตนในการจําลองตัวเองของ ดีเอนเอ

(ที่มา : http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/dnareppr/images/u4fg8b.jpg, 2547)

3. Single-stranded binding protein (SSBPs) SSBPs ประกอบดวยกรดอะมิโนประมาณ 100 ตัว ที่เกาะอยูกับดีเอ็นเอสายเดียว ( โดย SSBPs

มีหนาที่สําคัญคือ ชวยให helicase ทํางานไดดีขึ้น และปองกันไมใหดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) ที่แยกจากกันแลวกลับเขามาสรางพันธะไฮโดรเจนเพื่อเกิดเปนดีเอ็นเอสายคูใหมอีกครั้ง นอกจากนี้ SSBPs ยังปองกันไมให ssDNA แตละสายมาสรางพันธะไฮโดรเจนภายในสายเดียวกันที่เกิดโครงสรางที่เรียกวา hairpin loop ขึ้น รวมทั้งยังปองกันไมใหดีเอ็นเอสายเดี่ยวถูกยอยดวยเอนไซม นิวคลีเอส (nuclease) อยางไรก็ตามเมื่อ DNA polymerase ผานจุดนี้ไปแลว พบวา SSBP ก็ถูกปลอยออกจากโมเลกุลของ ssDNA (รูปท่ี 3.18)

http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/dnareppr/images/u4fg8b.jpg



รูปท่ี 3.18 ขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอที่เกี่ยวของกับเอนไซมตางๆ

(ที่มา : Klung และ Cumming, 1194)

II. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด (รูปท่ี 3.19) เหตุการณที่สําคัญในขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด มีดังนี้ 1. การสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม 2 สาย โดยการทํางานของ DNA polymerase III กระบวนการจําลองดีเอ็นเอเปนแบบกึ่งอนุรักษ ดีเอ็นเอเกลียวคูประกอบดวย 2 สายโพลีนิวคลี

โอไทด ซ่ึงมีทิศทางแบบ antiparallel คือ สายหนึ่งมีทิศทาง 5/ → 3/ สวนอีกสายหนึ่งมีทิศทางตรงกัน

ขามคือ 3/ → 5/ ดังนั้นเมื่อเกิด replication fork แลว RNA primer จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอแมแบบทั้งสองสาย จากนั้น DNA polymerase III ทําหนาที่ในการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมโดยนํา deoxynucleotide 5-triphosphate ที่มีเบสเปนเบสคูสมกับสายดีเอ็นแมแบบมาเชื่อมตอกับ RNA primer ที่มีปลาย 3/OH อิสระ โดยใชพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร ดังสมการ

poly (nucleotide) n –3/OH + dNTP → poly (nucleotide) n+1 3/OH + PP

รูปแบบการสงัเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมโดยใชดเีอ็นเอแมแบบทั้งสองสาย มีดังนี ้

1) สาย leading strand



เมื่อ RNA primer เขาเกาะกับสายโพลีนิวคลีโอไทดสายแมแบบที่มีทิศทาง 3/ → 5/ พบวา DNA polymerase สามารถสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมโดยเพิ่มจํานวนนิวคลีโอไทดไดอยางตอเนื่องตลอดสาย เรียกวา continuous หรือ leading strand ทั้งนี้เนื่องจากทิศทางการสังเคราะหสายโพลีนิวคลี

โอไทดหรือการทํางานของ DNA polymerase III ทําในทิศทาง 5/ → 3/ ซ่ึงมีทิศทางการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมเปนทิศทางเดียวกับการคลายเกลียวของดีเอ็นเอเกลียวคู

2) สาย lagging strand

ถาใชสายโพลีนิวคลีโอไทดอีกสายหนึ่งที่มีทิศทาง 5/ → 3/ เปนสายแมแบบ พบวาการสังเคราะหดีเอ็นเอสายใหมไมสามารถสังเคราะหหรือเพิ่มจํานวนนิวคลีโอไทดไดอยางตอเนื่องที่เรียกวา discontinuous หรือ lagging strand เพราะทิศทางการสังเคราะหดีเอ็นเอสวนทางกับการคลายเกลียวของดีเอ็นเอเกลียวคู ฉะนั้นจึงมีการสังเคราะห DNA เปนทอนสั้นๆ ที่เรียกวา okazaki fragment ซ่ึงมีจํานวนนิวคลีโอไทดประมาณ 1000- 2000 นิวคลีโอไทด และทุกครั้งที่เกิดจุด replication fork จุด

ใหม RNA primer ก็จะเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายแมแบบที่มีทิศทาง 5/ →3/ ใหม แลว DNA polymerse III ก็จะเขาทําหนาที่สังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมขึ้นมา

DNA polymerase III มีคุณสมบัติที่สําคัญคือ 1) ทําหนาที่ polymersize ทั้งสาย leading strand และสาย lagging strand 2) ตองการดีเอน็เอแมแบบ และ RNA primer ที่มีปลาย 3/OH อิสระ 3) เปน holoenzyme ขนาดใหญมากคือ มากกวา 600 กิโลดาลตัน ซ่ึงประกอบดวยโพลีเบป

ไทดที่แตกตางกัน 5-10 ชนิด โดยเอมไซมที่มีรูปรางแบบ asymmetric dimeric structure ประกอบดวย 2γ, β, α, δ, ε, และ τ subunit ซ่ึงเปนสวนสําคัญในปฏิกิริยา polymerize

4) β subunit มีรูปรางเปน donut-shaped dimer ซ่ึงมีลักษณะคลาย clamp ซ่ึงสามารถเคลื่อนที่ไปตามความยาวของเสนดีเอน็เอ (รูปท่ี 3.20) เพื่อทําหนาที่สังเคราะหเพียงดีเอน็เอสายสั้นๆ เทานั้น คือ ประมาณ 20 นิวคลีโอไทด

5) α subunit เปนตวัทําใหเกิดปฏกิิริยา polymeriztion สวน ε subunit ทําใหเกิดปฏิกิริยา

3/ → 5/ exnuclease 6) สวนอกี 5 subunits คือ 2γ, δ, ε, และ τ subunit รวมกนัเปน γ complex ทําหนาที่เปนตัวนํา

β subunit เขาเกาะกับ duplex DNA-primer substrate

7) τ subunit ทําหนาที่เกีย่วกับการเกดิ dimerize ของ core enzyme



รูปท่ี 3.19 ขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทด

รูปท่ี 3.20 β subunit มีรูปรางเปน donut-shaped dimer ซ่ึงมีลักษณะคลาย clamp 2. เม่ือ helicase ทําหนาทีข่ยายจดุ replication fork ตอไปอีกสาย leading strand ก็จะ

polymerize ตอไปเรื่อยๆ ในทิศทาง 5/→3/ สวนสาย lagging strand ก็จะสังเคราะห okazaki fragment



สายใหมขึ้นมาในทิศทาง 5/→3/ โดยมี RNA primer ตัวใหมเขากับดีเอ็นเอแมแบบที่บริเวณ replication fork ที่เกิดขึ้นใหม แลวเร่ิมกระบวนการสงัเคราะห okazaki fragment สายใหมขึ้นมา (รูปท่ี 3.21 และ 3.22)

รูปท่ี 3.21 การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดในกระบวนการสังเคราะหดีเอน็เอ (ที่มา : http://opbs.okstate.edu/~petracek/Chapter%2025%20figures/Fig%2025-13.JPG, 2547)



รูปท่ี 3.22 การจําลองตัวเองของดีเอนเอ

(ที่มา : http://www.groton.k12.ct.us/WWW/fsr/student/fall02/DNA/dnarep.jpg , 2547)

3. DNA topoisomerase หรือ DNA gyrase ขณะที่ helicase ทําลายพันธะไฮโดรเจนระหวางเบสที่อยูตางสายโพลีนิวคลีโอไทดนั้น พบวา

บริเวณเหนือจุดแยกจะเกิดปมของสายดีเอ็นเอที่พันกันแนน (คลายกับการดึงปลายเชือกเสนคูใหแยกออกจากกันเปนเสนเดี่ยว โดยกดใหปลายเชือกดานหนึ่งใหอยูกับที่ ก็จะทําใหเกิดปมเหนือจุดแยกขึ้น) ดังนั้น DNA topoisomerase จะมีทําหนาที่คลายปมเหนือจุดแยก (replication fork) ในขณะเกิดกระบวนการจําลองดีเอ็นเอ โดยการทําลายพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรระหวางนิวคลีโอไทดภายในสายโพลีนิวคลีโอไทดเดียวกัน เพื่อเปนการลดจํานวน supercoil ที่เกิดขึ้นเหนือบริเวณจุด replication fork



โดยใชพลังงานจาก ATP จากนั้นก็ทําหนาที่เช่ือมรอยขาดระหวางนิวคลีโอไทดดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร DNA topoisomerase แบงออกเปน 2 ชนิด คือ

1) DNA topoisomerase I ทําหนาที่ตัดดีเอ็นเอสายเดีย่วที่อยูเหนือจุด replication fork (บางครั้งอาจตัดทั้งสองสายของโพลีนิวคลีโอไทด) (รูปท่ี 3.23)

2) DNA topoisomerase II (DNA gyrase) ทําหนาที่ตัดและเชื่อมตอดีเอ็นเอสายเดี่ยวที่อยูเหนือจดุ replication fork (บางครั้งอาจตัดทั้งสองสายของโพลีนิวคลีโอไทด)

รูปท่ี 3.23 คุณสมบัติของ gyrase หรือ topoisomerase ที่ทําหนาทีค่ลายเกลียวเหนือจุดแยก

III. การสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ เมื่อส้ินสุดขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอจะไดดีเอ็นเอ 2 โมเลกุล โดยแตละโมเลกุลประกอบดวย

โพลีนิวคลีโอไทดแมแบบหรือโพลีนิวคลีโอไทดสายเดิม 1 สาย และอีกสายหนึ่งเปนโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม ซ่ึงโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมที่พบใน leading strand และ lagging strand นั้นมี RNA primer ติดอยูที่ปลาย 5/PO4 ซ่ึง RNA primer นี้จําเปนตองถูกขจัดออกไปโดยใช (1) ribonuclease (RNase) ที่

มีความจําเพาะกับ RNA primer หรือ (2) DNA polymerase I (5/→3/ exonuclease) ตัดที่ปลาย 5/PO4 ของ RNA primer โดยตัดที่ละโมเลกุล ขณะเดียวกันก็มีการเติมนิวคลีโอไทดตัวใหมเขาไปที่ปลาย 3/OH ของสายดีเอ็นเอสายใหมที่ถูกสังเคราะหขึ้น คลายกับการเกิด nick translation จนเหลือชองวางที่เรียกวา nick จากนั้น DNA lygase จึงเขาทําหนาที่เปนเชื่อมรอยตอระหวางนิวคลีโอไทด (nick) โดยสรางพันธะฟอสฟอไดเอสเทอรที่ปลาย 3/OH ของนิวคลีโอไทดหนึ่ง กับ 5/PO4 ของอีกนิวคลีโอไทดหนึ่งที่อยูติดกันโดยใชพลังงานจากการ hydrolysis ATP (รูปท่ี 3.24) เหตุการณที่เกิดขึ้นในขั้นตอนการส้ินสุดการจําลองดีเอ็นเอ พอสรุปไดดังนี้



1. การขจัด RNA primer บนสาย leading strand สายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมที่พบใน leading strand ที่มี DNA polymerase III ทําหนาที่

สังเคราะหสายโพลีนิวคลีโอไทดในทิศทาง 5/→3/ ไปเรื่อยจนสิ้นสุดสายดีเอ็นเอแมแบบ (3/→5/)

จากนั้น DNA polymerase III จะหยุดทํางาน แตจะมี DNA polymerase I ชนิด 5/→3/ exonuclease เขามาทําหนาที่ตัด ณ ตําแหนงปลาย 5/PO4 ของ RNA primer โดยตัดทีละ 1 นิวคลีโอไทด ขณะเดยีวกนั DNA polymerase I ก็นํานิวคลีโอไทดที่ถูกตองหรือมีเบสคูสมกับดีเอ็นเอแมแบบมาเชื่อมตอที่ปลาย 3/OH ของสาย leading strand (theta mode of DNA replication) คลายกับการเกิด nick translation จากนั้น DNA ligase เขาทําหนาที่เช่ือมชองหวางระหวางนิวคลีโอไทดโดยตอระหวางนิวคลีโอไทดดวยพันธะฟอสฟอไดเอสเทอร

กรณีของโปรคารีโอตดีเอ็นเอมีรูปรางเปน circular DNA พบวาไมมีปญหาเรื่องการเติม nucleotide ในสวนของชองวาง (gap) หลังจากที่มีการตัด RNA primer ออกไปแลว เนื่องจากมีการจําลองดีเอ็นเอแบบ theta mode of DNA replication (รูปท่ี 3.24)

2. การขจัด RNA primer บนสาย lagging strand สวนสายโพลนีิวคลีโอไทดสายใหมของ lagging strand นั้นจะประกอบไดดวย okazaki

fragment จํานวนมาก ซ่ึงแตละสาย okazaki fragment จะถูกนํามาเชือ่มตอเปนสายโพลีนิวคลีโอไทดยาวตอเนื่อง (continuous strand) ได โดยการทํางานของ DNA polymerase III ซ่ึงทําหนาที่นํานิวคลีโอไทดมาตอที่ปลาย 3/OH ของ okazaki fragment หนึ่งไปเรื่อยๆ จนถงึปลาย 5/PO4 ของ RNA primer ของอีก okazaki fragment หนึ่งที่อยูติดกันซึ่งถูกสังเคราะหขึ้นมากอนแลว จากนัน้ DNA polymerase III จะแยกออกจาก okazaki fragment (ทั้งนี้เพราะวา DNA polymerase III ไมสามารถ polymerization ตอไปได หรือ DNA polymerase III ไมสามารถทํางานไดบริเวณ nick ทีมีปลาย 5/ triphosphate อยูดวย (RNA primer) ยกเวนแตมเีอมไซมบางชนิดมาตัด triphosphate ใหเปน monophosphate) ดังนัน้การเชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทดที่อยูบริเวณ nick ตองอาศัยการทํางานของ DNA ligase จึงเขาทาํงานเชื่อมตอระหวางนิวคลีโอไทด (โดยทัว่ไป DNA ligase จะอยูในสภาพ inactive เมื่อนิวคลีโอไทดอยูในรูปของ ribo-form แต DNA polymerase I สามารถทํางานไดอยางมีประสิทธิภาพบริเวณรอยขาดนี้ คือทําใหเกดิ nick translation ขึ้น)



รูปท่ี 3.24 การขจัด RNA primer ที่ปลาย 5/ ของดีเอ็นเอสายใหม

กระบวนการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอต (DNA replication in eukaryote) ขั้นตอนการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอตมีลักษณะคลายกบัโปรคารีโอตแตมีความซ้ําซอนมากกวา และมีชนิดของเอมไซม รวมทั้งวิธีการในแตละขั้นตอนแตกตางกันไปบาง ซ่ึงสามารถสรุปขั้นตอนการจําลองดีเอ็นในยคูารีโอตได ดังนี้

I. การเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอ ในสัตวเล้ียงลูกดวยน้ํานม พบวามี DNA polymerase และเอมไซมหลายชนิดที่เกี่ยวของกับกระบวนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นโดยขั้นตอนการคลายกับโปรคารีโอตแตตางกันเล็กนอย เชน ขั้นตอนการเริ่มตนการจําลองดีเอ็นเอของไวรัสชนิดsimian virus 40 หรือ SV40 (in vitro) สามารถสรุปไดดังนี้ (รูปท่ี 3.25)

1. T antigen เปนโปรตีนทีม่ีหนาที่หลายอยาง (multifunctional proteins) โดย T antigen จะเขาจับกับตําแหนงเริ่มตนบนสายดีเอ็นเอของไวรัส (SV40 origin) เพื่อคลายเกลียวคูของ duplex DNA ของไวรัสใหเปนดีเอ็นเอสายเดยีว โดย T antigen ทําหนาที่คลายกับ helicase ในโปรคารีโอต

2. จากนั้น Replication protein A (RPA) เขามามาจับกบัดีเอ็นเอสายเดี่ยว (ssDNA) โดย RPAทําหนาที่คลาย single-strand binding protein (SSB) ในโปรคารีโอต

3. เกิด Complex โดย Primase เขาเกาะกับ DNA polymerase α จากนั้นจึงเขารวมกับ RFA (Replication protein A) เปน complex แลวจึงเขาเกาะกบั ssDNA template เพื่อเร่ิมกระบวกการจําลอง



ดีเอ็นเอ โดย primase ทําหนาที่สราง RNA primer และ DNA polymerase α ทําหนาที่สังเคราะหสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหม โดยไดรับการกระตุนจาก RFA

II. การขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดของยูคารีโอต กระบวนการจาํลองดีเอ็นเอโดยทั่วไปเปนแบบ bidirectional DNA replication (แบบ Y mode)

เมื่อส้ินสุดกระบวนการจะไดดีเอ็นเอสาย 2 สาย คือ leading strand และ lagging strand คลายกับการจําลองดีเอ็นเอในโปรคารีโอต โดยเหตกุารณที่สําคัญในขั้นตอนการขยายยาวของสายโพลีนิวคลีโอไทดของยูคารโีอต (รูปท่ี 3.25) มีดังนี ้

1. เหตุการณบนสาย leading strand สายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของสาย leading strand พบวา มีโปรตีนที่เรียกวา proliferating

cell nuclear antigen (PCNA) ซ่ึงทําหนาที่คลาย β subunit ของ DNA polymerase III คือ เขาเกาะที่ปลาย 3/OH RNA primer–template terminus เพื่อปลดปลอย DNA polymerase α และ primase ออกจากสายดีเอ็นเอแมแบบ จากนั้น DNA polymerase δ เขารวมกับ RFC-PCNA complex ที่ปลาย 3/OH ของ leading strand เพื่อทําหนาที่สังเคราะหหรือขยายยาวสายโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของสาย leading strand

2. เหตุการณบนสาย lagging strand สวนสายโพลนีิวคลีโอไทดสายใหมของสาย lagging strand พบวา RFC-primase-polymerase

α complex เขาเกาะที่ปลาย 3/OH ของ lagging strand เพื่อทําหนาที่ polymerization ในทิศทาง 5/→3/ โดยจะมีการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของ lagging strand แบบไมตอเนื่อง ทําใหเกดิ okazaki fragment ขึ้น

ในขณะที่มีการสังเคราะหโพลีนิวคลีโอไทดสายใหมของทั้งสาย leading strand และ lagging strand ก็จะมเีอมไซม topoisomerase ทําหนาที่คลายปมเหนือจดุ replication fork (หรือ replicon) คลายกับในโปรคารีโอต



รูปท่ี 3.25 ขั้นตอนการเริ่มการจําลองดีเอ็นเอของไวรัสชนิด SV40 (in vitro) (ที่มา : http://www.rci.rutgers.edu/~molbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf, 2547)

http://www.rci.rutgers.edu/%7Emolbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf



III. การสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ (รูปท่ี 3.26) กระบวนการสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอในยูคารีโอตจะมีความซับซอนมากกวาในโปรคารีโอต

เนื่องจากดีเอ็นเอในยูคารีโอตมีลักษณะเปนเสน (linear DNA) โดยพบวามีลําดับเบสที่จําเพาะบริเวณสวนปลายของโครโมโซมยูคารีโอต (eukaryotic chromosome หรือ telomere) ซ่ึงเปนลําดับเบสที่ไมมีสวนของยีนอยู แตมีบทบาทสําคัญในการกําหนดกระบวนการสิ้นสุดการจําลองดีเอ็นเอ กลาวคือบริเวณสวนปลายของโครโมโซมยูคารีโอตประกอบดวยจํานวนซ้ําหลายๆ ซํ้าของลําดับเบสทอนสั้นของ G-C rich sequence ที่ตําแหนงปลาย 3/OH เชน ในสัตวมีกระดูกสันหลัง (vertibrate) พบวามีลําดับเบส 5/ TTGGGG 3/ / 3/ AACCCC 5/ สวนในมนุษย พบวามีลําดับเบส 5/ TTAGGG 3’ / 3/ AATCCC 5/ sequence ที่เปนสวนสําคัญในกระบวนการสิ้นสุดการจําลองตัวเองของดีเอ็นเอ โดยสามารถสรุปขั้นตอนได (รูปท่ี 3.24) ดังนี้ 1. การเพิ่มของ G-C rich sequences ท่ีบริเวณปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ ซ่ึงจะทําการเพิ่มลําดับเบส G-C rich sequence หลายๆ ชุด (copy) ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ โดยการทาํงานของ telomerase ซ่ึงภายใน telomerase ประกอบดวยสายอารเอ็นเอแมแบบ (RNA template) ที่มีลําดับเบส 5/ AACCCC 3/ ซ่ึงจะเขาเกาะกับสายดเีอ็นเอแมแบบที่ปลาย 3/OH โดย RNA template มีลําดับเบส 5/ AAC 3/ ลอยอยูอิสระหรอืที่ไมไดเขาเกาะกับดีเอน็เอดีเนเอแมแบบ ซ่ึงจะใช 5/ AAC 3/ นี้เปน อารเอ็นเอแมแบบ เพื่อสังเคราะหลําดับเบส 5/ TTG 3/ ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยการทํางานของ telomerase

2. การเคล่ือนท่ี (translocation) ของ telomerase โดย telomerase มีการเคลื่อนที่ตอไปอีก 3 เบส ทําใหตําแหนง 5/ AAC 3/ ของอารเอ็นเอไพเมอรที่อยูใน telomerase ลอยเปนอิสระอีกครั้ง ดังนั้นจึงมีการสังเคราะห TTG ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบขึ้นมาอีก

3. การขยายยาวของลําดับเบส TTG ท่ีปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบ โดยมีการสังเคราะหนิวคลีโอไทดที่มีลําดับ 5/ TTG 3/ ที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอสายแมแบบเพิ่มขึ้นโดยใช อารเอ็นเอไพเมอรรวมกับทํางานของ telomerase ซ่ึงอาจทําซํ้าหลายๆ ซํ้า จนไดลําดับเบสดังกลาวเพิ่มขึ้นมากมาย (ทําใหมี G rich จํานวนมาก)

4. การสังเคราะห primer โดย primase เขามาเกาะที่ปลาย 3/OH ของดีเอ็นเอแมแบบ แลวเร่ิมกระบวนการสงัเคราะห RNA primer (ใน tetrahymena มี RNA จํานวน 159 นิวคลีโอไทด ซ่ึงประกอบดวย 5/ CAACCCCAA 3/) ซ่ึงเขาเกาะกับดีเอ็นเอสายแมแบบ 5. DNA replication โดย DNA polymerase จึงเขาทําหนาที่นํานิวคลีโอไทดเขามาเชื่อมตอที่ปลาย 3/OH ของไพรเมอรโดยมีลําดับเบสเปนเบสคูสมกับดีเอ็นเอสายแมแบบ



6. Primer remove เมื่อส้ินสุดกระบวนการจําลองดีเอน็เอพบวา RNA primer ที่ปลาย 5/PO4 ของสายโพลีนิวคลีโอไทดทีสั่งเคราะหขึ้นมาใหมจะถูกตดัทิ้งไปประมาณ 12-16 เบส โดยไมมกีารทดแทนขึ้นมาอีก เพราะสวนที่ขาดหายไปคือ telomere sequence ซ่ึงจะมีการสรางขึ้นมาทดแทนอยูเสมอโดย telomerase

รูปท่ี 3.26 ขั้นตอนการขยายยาวของดีเอน็เอสายใหม โดยการทํางานของ telomerase

ในกระบวนการสิ้นสุดจําลองดีเอ็นเอ (ที่มา : http://www.rci.rutgers.edu/~molbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf, 2547)

http://www.rci.rutgers.edu/%7Emolbio/Courses/MBB_408_512/DNAreplec3.pdf

การจำลองdna (dna replication)conf.agi.nu.ac.th/webnewasp/ereading/gene/unit3.pdf ·...

Documents