สัตวแพทย์มหานครสารjo ouurrn naall off mma ahhaanaakkoorrnn...
TRANSCRIPT
สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee
ปทปท 11 ฉฉบบบทบท 1 มกรามกราคมคม – มมถนายนถนายน 22555599
VVoolluummee 1111 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001166
IISSSSNN:: 11990055--77557711
wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm
คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร ไดจดท าวารสารทางวชาการขนดวย วตถประสงคเพอเผยแพรผลงานคนควาวจยทางวชาการ รวมถงกจกรรมตางๆ ทเกยวของกบสาขาสตวแพทย ศาสตร สตวบาล และสาขาทเกยวของ สงเสรมความสมพนธอนดระหวางนกวชาการทเกยวของกบว ชาชพ สตวแพทย สตวบาล และเพอเผยแพรเกยรตคณของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร สานกงาน: คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถนนเชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร: 0-2988-3655 โทรสาร: 0-2988-4040
กาหนดตพมพ: ปละ 2 ฉบบ ฉบบท 1 เดอน มกราคม – มถนายน ฉบบท 2 เดอน กรกฎาคม – ธนวาคม คาสมาชก: 1 ป 140 บาท 2 ป 280 บาท 3 ป 420 บาท ตลอดชพ 1,000 บาท ราคาฉบบละ 70 บาท
สตวแพทยมหานครสารสตวแพทยมหานครสาร
JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee
คณะทปคณะทปรรกษากษา // AAddvviissoorryy CCoommmmiitttteeee อธการบดมหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร President of Mahanakorn University of Technology คณบดคณะสตวแพทยศาสตร Dean of Faculty of Veterinary Medicine รองคณบดคณะสตวแพทยศาสตร Associate Dean of Faculty of Veterinary Medicine
บรรณาบรรณาธธการการ // EEddiittoorr
ผศ.น.สพ.ดร.จ าลอง มตรชาวไทย Assist.Prof.Dr.Jamlong Mitchaothai คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
ผชวยบรรณาธการ / ผชวยบรรณาธการ / AAssssiissttaanntt EEddiittoorr
ผศ.รชกฤช เลศภทรโกมล Assist.Prof.Rachakris Lertpatarakomol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
กองบรรณากองบรรณาธธการการ // EEddiittoorriiaall BBooaarrdd
ผศ.สพ.ญ.ดร.จตรบรรจง เวยงเจรญ Assist.Prof.Dr.Jitbanjong Wiengcharoen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
น.สพ.ธนากร พจนประสาท Thanakorn Pojprasath คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
สพ.ญ.ภควด ค าพลงาม Pakawadee Kumpolngam คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
น.สพ.อนสรณ จาแสนชน Anusorn Jasancheun คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
น.สพ.เกยรตชย โรจนมงคล Kiatchai Rojanamongkol คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
รศ.สพ.ญ.ดร.นนทรกา ชนซอ Assoc.Prof.Dr.Nantarika Chansue
คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine จฬาลงกรณมหาวทยาลย Chulalongkorn University
ผศ.น.สพ.อดศร ยะวงศา Assist.Prof.Adisorn Yawongsa คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน Kasetsart University, Kamphaengsaen campus
ผศ.น.สพ.ดร.สรรเพชญ องกตตระกล Assist.Prof.Dr.Sunpetch Angkittitrakul คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยขอนแกน Khon Kaen University
น.สพ.ดร.วรพงศ ตงจตเจรญ Dr.Weerapongse Tangjitjaroen คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเชยงใหม Chiangmai University
ผศ.ดร.เฉลมพล เยองกลาง Assist.Prof.Dr.Chalermpon Yuangklang คณะทรพยากรธรรมชาต Faculty of Natural Resources มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน Rajamangala University of Technology Isan, วทยาเขตสกลนคร Sakon Nakhon Campus
Prof.Dr.Kazuyoshi Taya Prof.Dr.Kazuaki Takehara Faculty of Agriculture, Faculty of Agriculture, Tokyo University of Agriculture and Technology Tokyo University of Agriculture and Technology
Prof.Dr.Kazuyuki Taniguchi Assoc.Prof.Dr.Kazumi Taniguchi Faculty of Agriculture, School of Veterinary Medicine, Iwate University Kitasato University
Prof.Dr.Anton C. Beynen Faculty of Natural Resources, Rajamangala University of Technology-Isan, Sakon Nakhon campus
ฝายทะเบยนวารสารฝายทะเบยนวารสาร // JJMMVVMM MMeemmbbeerr RReeggiissttrraattiioonn
จฬาภา สอนกลน Chulabha Sonklein คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
สพ.ญ.สวรน ภาวสทธไพศฐ Suvarin Pavasutthipaisit คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
ฝายฝายจจดการเวบไซตดการเวบไซต // JJMMVVMM WWeebbssiittee AAddmmiinniissttrraattoorr ฟารส ชนภกด Faris Cheunpakdee
คณะสตวแพทยศาสตร Faculty of Veterinary Medicine มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร Mahanakorn University of Technology
ผทรงคณวฒประจาฉบบผทรงคณวฒประจาฉบบ // IIssssuuee RReevviieewweerrss ผศ.น.สพ.ดร.เฉลมพล เลกเจรญสข ผศ.สพ.ญ.ดร.วลยพร ตนพทกษ ผศ.น.สพ.ดร.ทนงศกด มะมม ผศ.น.สพ.ดร.ส าราญ บรรณจรกล ผศ.รชกฤช เลศภทรโกมล สพ.ญ.ดร.ดานย แสงทอง น.สพ.ดร.เจษฎา รงภประดษฐ น.สพ.ดร.กฤษฎา ข าพล น.สพ.ดร.อรชน หยกจโกศล น.สพ.ดร.สทธชน รตนจนทร ดร.สนษา ศรมงคลวรกลข
บทบรรณาธการบทบรรณาธการ
สวสดผอานทกทานสวสดผอานทกทาน
วารสารสตวแพทยมหานครสารยางเขาสปท 11 แลว โดยฉบบนเปนปท 11 ฉบบท 1 ซงทางกองบรรณาธการวารสารไดพยายามมงมนพฒนาวารสารใหคณภาพสงยงขนตามล าดบ ในโอกาสนทางกองบรรณาธการวารสารขอแจงนกวชาการ นกวจย ผอาน และสมาชกของวารสารทกทาน ใหทราบวาในฉบบถดไปทางวารสารจะจดพมพในรปแบบอเลกทรอนกสเทานน เพอรวมอนรกษพลงงานและสอดคลองกบสถานการณการจดท าวารสารในปจจบน โดยจะมองคประกอบของวารสารครบเหมอนเชนเคย ทงนสามารถเขาถงไดจาก http://www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
วารสารฉบบนมบทความทนาสนใจหลากหลายเรอง ซงทางกระผมและกองบรรณาธการของวารสารหวงเปนอยางยงวา ทานผอานทกทานจะไดรบความรทน าไปใชประโยชนตอไปได
สดทายนกระผมและกองบรรณาธการ ขออาราธนาคณพระศรรตนตรยอ านวยพรใหทานผอานทกทาน จงประสบแตความสข ความเจรญ ความกาวหนาในหนาทการงาน มสขภาพกายและใจแขงแรง และมครอบครวทอบอน
จาลอง จาลอง มตรชาวไทยมตรชาวไทย
บรรณาธการบรรณาธการ
สตวแพทสตวแพทยยมหานครสารมหานครสาร
ปท ปท 1111 ฉบบท ฉบบท 11 มกรามกราคม คม –– มถนายนมถนายน 25525599
IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm
สารบญสารบญ บทความวจยบทความวจย
ความชกของเชอกอโรคทน าโดยเหบในสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม อมรรตน เจอสข ธดารตน บญมาศ ปราณ ศรราช รชฎาวรรณ อรรคนมาตย ธราดล จตจกร ภคญาณ สดสาร อโณทย แพทยกจ ศรนทพย บญจรสภญโญ และวนชย มาลวงศ ........................................................ 1
การตรวจหาความเรวสงสดในการวงเรยบ ทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท ในมาลกผสมพนเมองของไทย
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ อารย ไหลกล ขนษฐา เพชรอดมสนสข วชรพล ปฐมสกลวงศ ณฐพล ภาณเสวกล และวรกจ เชดชธรรม .................................................................................................................................................... 11
การศกษาลกษณะและการแสดงออกของรปแบบโปรตนในปทะเล (Scylla serrata) ทมอาการอกทองแดงระยะแรก
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ ............................................................................................................... 23
การตรวจหาเชอ Brucella melitensis โดยวธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอจากตวอยางอวยวะของแพะเนอในประเทศไทย
ลขณา รามรน เรขา คณตพนธ มนยา เอกทตร และองอาจ เลาหวนจ ......................................................................... 35
การยอยไดของโภชนะไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบในสนข เฉลมพล เยองกลาง ไกรสทธ วสเพญ ศศพนธ วงศสทธาวาส และ Anton C. Beynen .............................................. 47
บทความวชาการบทความวชาการ การสญเสยแคปซลของเชอ Streptococcus suis
ณฐกานต มขนอน ......................................................................................................................................................... 57
JJoouurrnnaall ooff MMaahhaannaakkoorrnn VVeetteerriinnaarryy MMeeddiicciinnee
VVoolluummee 1111 NNoo.. 11 JJaannuuaarryy –– JJuunnee 22001166
IISSSSNN:: 11990055 –– 77557711 wwwwww..vveett..mmuutt..aacc..tthh//jjoouurrnnaall__jjmmvvmm
CCoonntteennttss RReesseeaarrcchh aarrttiiccllee
Prevalence of Tick-borne Pathogens in Quarantined Dogs at Nakornpranom Animal Quarantine Station, Thailand
Amornrat Juasook, Thidarut Boonmars, Pranee Sriraj, Ratchadawan Aukkanimart, Tharadol Jitjuk,
Pukkayanee Sudsarn, Anothai Phaetkit, Sirintip Boonjaraspinyo and Wanchai Maleewong ..................... 1
Determination of the Maximal Lactate Steady State Speed of Trotting in Crossbred Native Thai Ponies
Pattanaporn Thawornpattanapong, Aree Laikul, Kanittha Phetudomsinsuk, Watcharapol Pathomsakulwong,
Nuttapon Phanusaweekul and Worakij Cherdchutham .................................................................................. 11
Characters and Protein Profile in the First Stage of Mud Crab (Scylla serrata) Infected by Red Sternum Syndrome
Pattarawadee Srimeetian and Suriyan Tunkijjanukij ......................................................................................... 23
Detection of Brucella melitensis Using Real-time PCR and Isolation from Organs of Meat Goat in Thailand
Luckana Ramrin, Reka Kanitpun, Monaya Ekgatat and Ongard Lawhavinit................................................. 35
Digestibility of a Structural Fat Consisting of Stearic and Palmitic Acid in Dogs Chalermpon Yuangklang, Kraisit Vasupen, Sasiphan Wongsuthavas and Anton C. Beynen .................... 47
RReevviieeww aarrttiiccllee Loss of Capsule in Streptococcus suis
Nattakan Meekhanon .............................................................................................................................................. 57
ขอแนะนาสาหรบผเขยนขอแนะนาสาหรบผเขยน
วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา วตถประสงคและขอบเขตของเนอหา ((AAiimm aanndd SSccooppee))
สตวแพทยมหานครสารเปนวารสารทางวชาการของคณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร จดท าขนเพอเผยแพรผลงานการคนควาวจยทางวชาการทเกยวของกบสตวแพทยศาสตร สตวศาสตร และวทยาศาสตรทเกยวของกบการผลตสตว โดยเนอหาจะครอบคลมตงแตระดบโมเลกลและเซลล วทยาศาสตรพนฐาน ชววทยาของสตว พฤตกรรมสตว พชอาหารสตว วทยาศาสตรการผลตสตว วทยาศาสตรการสตวแพทย (พนฐาน พรคลนก และคลนก) ระบาดวทยาในสตว สตวแพทยสาธารณสข และวทยาศาสตรเนอสตว ตลอดจนวทยาศาสตรและเทคโนโลยแขนงอนๆ ทมโอกาสในการพฒนาและ/หรอประยกตใชในวทยาศาสตรทเกยวของกบสตวได
คาแนะนาสาคาแนะนาสาหรบการเตรยมบทความหรบการเตรยมบทความ กองบรรณาธการวารสาร สตวแพทยมหานคร
สาร ยนดรบเรองจากทกทานทใหความสนใจ และกรณาสงมาเพอเผยแพร ดงนนเพอความสะดวกในการพจารณา กองบรรณาธการมขอเสนอแนะดงน
11.. เรองทจะนาสงลงตพมพเรองทจะนาสงลงตพมพ 1.1 บทความวจย (Research article หรอ
Original article) เปนงานคนควาทดลอง หรองานวจยทางวชาการทเกยวกบสตวหรอพชอาหารสตว ทงทท าในประเทศและ/หรอตางประเทศ
1.2 บทความวจยขนาดสน (Short communication) เปนรายงานผลการวจย หรอผลงานทดลองทางดาน
วทยาศาสตรทเกยวของกบสตว เพอการเผยแพรโดยสงเขป หรอเพอการน าเสนอประเดนทคนพบใหมโดยเผยแพรเฉพาะสวนส าคญอยางกระชบ
1.3 รายงานสตวปวย (Case report) เปนรายงานทไมเคยตพมพมากอนและเกยวของกบโรคหรอปญหาทพบในสตว ซงทางกองบรรณาธการพจารณาเหนประโยชนตอทางวชาการสตวแพทย
1.4 บทความวชาการ (Review article) เปนบทความหรอยอเอกสารท เปนประโยชน และเกยวของกบวชาการทางสตวแพทย สตวบาล และสาขาทเกยวของทกสาขา โดยการรวบรวมและเรยบเรยงจากเอกสารทางวชาการ
1.5 บทความปกณกะ (Miscellany article) เปนบทความทเกยวกบการใหขอมลทางวชาการส าหรบผปฏบตงานทเกยวของกบสตว เชน ปรศนาสตวปวย ปรศนาเซลลวทยาวนจฉย
22.. ตนฉบบตนฉบบ 2.1 ตนฉบบทจะสงมาลงพมพตองไมเปนเรองท
เคยตพมพ หรอก าลงอยระหวางพจารณาเพอลงในหนงสอหรอวารสารอน
2.2 ต น ฉ บ บ พ ม พ เ ป น ภ า ษ า ไ ท ย ห ร อภาษาองกฤษ ดวยอกษร Browallia new 16 บนกระดาษขาวเอ 4 เวนขอบกระดาษดานซาย และดานบน 1.5 นว ดานขวาลาง และดานลาง 1 นว โดยความยาวของเรองพรอมตารางและภาพประกอบรวมแลว ไม เกน 12 หนา และให ใสหมายเลขหนาตามล าดบ โดยพมพดวยโปรแกรม Microsoft Word (Window 98 หรอเวอรชนทสงกวา)
2.3 หากตนฉบบทจะสงมรปภาพประกอบดวย ใหแทรกรปภาพดงกลาวในต าแหนงทเหมาะสมในตนฉบบ และ Save ไฟลตนฉบบของรปภาพทมความละเอยดสงลงในแผนซดขอมลแยกจากไฟลตนฉบบ โดยตงชอไฟลของรปภาพใหสามารถสอบทวนไดวาเปนรปภาพใดในตนฉบบ
2.4 ไมมการสงคนตนฉบบ ในกรณทไมผานการพจารณาแตจะแจงใหทราบ
33.. การลาดบเรองควรเรยงดงนการลาดบเรองควรเรยงดงน 3.1 ชอเรอง (Title) ควรตงชอใหสอดคลอง สอ
ความหมายไดดกบเนอหาในเรอง 3.2 ชอผเขยนและผรวมเขยน (Author and Co-
authors) เขยนช อนามสกลเตมท งภาษาไทยและภาษาองกฤษใตชอเรอง พรอมทงสถานทท างานทตดตอไดสะดวก และกรณาบอกหมายเลขโทรศพทหรอโทรสาร และ E-mail ของผรบผดชอบ (Corresponding author) เพอความรวดเรวในการตดตอ โดยใหระบอยใตค าส าคญ
3.3 บทคดยอ (Abstract) เข ยนส นๆ ให ไดเนอความครอบคลมท งหมด ในกรณทตนฉบบภาษาไทยจะตองมช อ เร องและบทคดยอ เปนภาษาองกฤษ และตนฉบบภาษาองกฤษตองมชอเรองและบทคดยอเปนภาษาไทย บทคดยอใหเขยนไวหนาสดทายของเรองเปนหนาหนงตางหาก
3.4 ค าส าคญ (Keywords) เปนค าหรอขอความสนๆ ทมความหมายแสดงถงความเปนไปของการทดลองนนๆ รวมกนแลวไมเกน 5 ค า ระบอยใตบทคดยอ (ขนบรรทดใหม ) ท งภาษาไทยและภาษาองกฤษ
3.5 บทน า ( Introduction) บ ร ร ย ายคว ามเปนมา และควรมการตรวจเอกสาร (Literature
review) ประกอบดวย รวมทงอธบายถงจดประสงคของการทดลอง
3.6 อปกรณและวธการ (Materials and Methods) ในกรณท เปนการคดคนขนใหมควรอธบายอยางละเอยด ถาเปนวธการททราบกนอยแลวและเคยมผตพมพแลว ไมตองบรรยายซ าควรเขยนในลกษณะอางอง และอธบายเฉพาะสวนทดดแปลงหรอเพมเตม พรอมทงวธวเคราะหผลการทดลองทางสถตดวย
3.7 ผลการทดลอง (Results) การรายงานผลการทดลองเปนค าบรรยายควรใหละเอยดและเขาใจงาย หากเปนไปไดควรเสนอผลในรปตาราง รปภาพ หรอกราฟ ไมควรแสดงถงผลทเหมอนกน ถาเปนตารางควรใหชดเจนและขนาดพอเหมาะกบขนาดของหนาหนงสอ ตารางควรมความหมายในตวเอง และตองมค าอธบายเหนอตารางดวย ในกรณท เปนรปภาพ (Figures) ควรเปนภาพขาวด าหรอสไลด หากตองการใหตพมพภาพส ทางคณะผจดท าจะพจารณาถงความเหมาะสมและคาใชจาย หากมหลายรปตองเรยงล าดบกอนหลงพรอมทงมเครองหมายก าหนดบอกดานบนของรปดวยดนสอ และอธบายรายละเอยดไวใตรป ค าอธบายประกอบรปภาพและตาราง รวมท งองคประกอบในตารางและร ปภาพให ใช เป นภาษาองกฤษทงหมด โดยรวบรวมและเรยงตามล าดบใหสอดคลองกบหมายเลขของรปภาพและตารางทน าเสนอ ควรระบความหมายของสญลกษณทใช ในกรณทก าหนดเครองหมายแสดงความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถต ใหก ากบ P-value ทใชในการวเคราะหผลการทดลอง ทงนการกลาวถงคา P-value ในเนอหาของบทความใหใชอกษรภาษาองกฤษตวพ
ตวใหญเอยง เชน P-value, P0.05 และ P>0.05 3.8 วจารณ (Discussion) เปนการวจารณผล
การทดลอง การประเมนผล และการตคาของผลงาน
การวจารณผลควรเปรยบเทยบกบผลงานของผอนทไดกระท ามาแลว และควรเนนถงสงทไดคนพบ
3.9 สรป (Conclusion) อาจมหรอไมกได หากเปนบทความ การตรวจเอกสาร หรอเปนการทดลองทมหลายขอ ควรมบทสรปทเขยนใจความส าคญและคณคาของงานเพอผอานจะไดเขาใจมากขน
3.10 กตตกรรมประกาศ (Acknowledgement) ควรมในกรณทไดรบความชวยเหลอหรอความรวมมอในการสนบสนนงานคนควาวจย
3.11 เอกสารอางอง (References)
44.. การเขยนอางองในเนอเรองควรอางองการเขยนอางองในเนอเรองควรอางอง
ดงน ดงน - การอางองให เขยนเปนภาษาองกฤษ
ทงหมด ทงการอางองในเนอหาบทความ และในสวนของเอกสารอางองดานทายบทความ โดยหากเนอหาของเอกสารทน ามาใชอางองเขยนเปนภาษาอน ทไมใชภาษาองกฤษ ใหเขยนอางองเปนภาษาองกฤษ พรอมระบภาษาทใชเขยนในบทความนนๆ ไวในวงเลบดานทายสดของรายการเอกสารอางองนนๆ ตวอยางเชน Mitchaothai, J., Wiengchareon, J.,
Chaiworaporn, J., Srenanuan, P. and Yuangklang, C. 2005. Balantidiasis in growing pigs: A case report. KKU. Vet. Journal. Vol.15 No.1: 166-174. (in Thai)
{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากบทความภาษาไทย : จ าลอง มตรชาวไทย จตรบรรจง เวยงเจรญ จฑามาศ ชยวร
ภร ไพวลย ศรนานวล และ เฉลมพล เยองกลาง. 2548. ภาวะการตดเชอ Balantidium ในสกรรน: รายงานสตวปวย. วารสารสตวแพทยศาสตร มข. 15 (1): 166-174. }
- กรณอางองจากการตรวจเอกสารโดยผอนใหใช ค าวา อางถงโดย (Cited by) - ผรายงานเอกสารทงทเปนคนไทยและชาว
ตางประเทศ เมอเปนประธานของประโยคใหใช Mitchaothai et al. (2005), Tomato and Danny (2006), Taylor et al. (2006) หรอเมอผรายงานอยกลางและทายประโยคใหใช (Mitchaothai et al., 2005), (Tomato and Danny, 2006), (Taylor et al., 2006) ตามล าดบ โดยหากในประโยคหรอสวนของประโยคทมเอกสารอางองมากกวาหนงเอกสารใหคนระหวาเอกสารดวยเครองหมาย “ ; ”) - อางถงบคคล หรอเรองทไมเคยตพมพมา
กอน (Personal comm.) ใหอางเฉพาะในเนอเรองเทานน ไมตองน าไปลงในรายชอเอกสารอางอง - การเขยนเอกสารอางองทายบทความ ให
เขยนเรยงล าดบพยญชนะภาษาองกฤษของชอสกล ตามดวยชอยอของผแตง (หากมผแตงมากกวาหนงคน ใหคนระหวางผแตงดวยเครองหมาย “ , ”) ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Everts, H., Yuangklang, C.,
Wittayakun, S., Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., Hovenier, R. and Beynen, A.C. 2008. Digestion and deposition of individual fatty acids in growing-finishing pigs fed diets containing either beef tallow or sunflower oil. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. 92 (4): 502-510. - หากเอกสารอางองเปนต ารา ใหระบชอผเขยน
ปท พมพ ช อเร อง ช อต ารา คร งท พมพและช อบรรณาธการ (หากม) ส านกพมพ เมองทพมพ และจ านวนหนาทงหมด ดงตวอยาง คอ
Mamom, T. 2008. Basic Veterinary Histopathology and Practice. 1sted. Mahanakorn University of Technology publishing. Bangkok. 227 p.
{ ซงเปนตวอยางทอางองมาจากหนงสอภาษาไทย : ทนงศกด มะมม. 2551. ต าราจลพยาธวทยาขนพนฐานทาง
สตวแพทยและบทปฏบตการ (Basic Veterinary Histopathology and Practice). พมพครงท1. ส าน กพ มพ มหาว ทยาล ย เทคโนโลย มหานคร . กรงเทพมหานคร. 227 หนา. } - หากเอกสารอางองเปนบทความจากการ
ประชมวชาการ (Conference proceedings) ใหระบชอผเขยน ปทพมพ ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-เดอน-ปทประชม ส านกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Lertpatarakomol, R., Mitchaothai, J.,
Trairatapiwan, T. and Lukkananukool, A. 2010. Preliminary survey on intestinal parasite infestation in natural Thai indigenous beef cattle from Kanchanaburi province at a slaughterhouse. Proceedings of the 14th Asian-Australasian Association of Animal Production Societies (AAAP), Pingtung, Taiwan, ROC, 23-27 August 2010: 468.
- หากเอกสาร อ าง อ ง เป นบทความจาก
อนเตอรเนท (Internet) ใหระบชอผเขยน ปทเผยแพรทางอนเตอรเนท (สบคนขอมลเมอ วน-เดอน-ป) ชอเรอง ชอการประชมวชาการ สถานทจดประชม วน-
เดอน-ปทประชม ส านกพมพ และเลขทหนาของบทความ ดงตวอยาง คอ Mitchaothai, J., Yuangklang, C., Wittayakun, S.,
Vasupen, K., Wongsuthavas, S., Srenanul, P., and Beynen, A.C. 2005 (cited 21 December 2010). Mathematical modelling between Pork Colour and Pork and Carcass Qualities in commercial finishing pigs. Available from: http:// www.scisoc.or.th/stt/31/ sec_f/paper/stt31_F0043.pdf.
55.. การพจารณาบทความการพจารณาบทความ บทความทกบทความทลงตพมพในวารสารสตว
แพทยมหานครสาร เปนบทความทผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญ (Referees) ส าหรบแตละสาขาอยางนอย 2 ทานตอบทความ ยกเวนบทความปกณกะผานการพจารณาจากผทรงคณวฒทเชยวชาญอยางนอย 1 ทาน
66.. การสงตนฉบบบทความการสงตนฉบบบทความ เอกสารทตองสง คอ บทความตนฉบบจรง ทจดเตรยมตามค าแนะน าส าหรบผเขยน วธการสงบทความ คอ สงผานระบบออนไลน ไดท http://www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
77.. ชอชอ--ทอย สาหรบตดตอวารสารทอย สาหรบตดตอวารสาร บรรณาธการ สตวแพทยมหานครสาร คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยมหานคร 140 ถ. เชอมสมพนธ เขตหนองจอก กรงเทพมหานคร 10530 โทร. 0-2988-3655 ตอ 5102-3, โทรสาร 0-2988-4040
หมายเหต 1. ชอทางวทยาศาสตรทงภาษาองกฤษและทบศพทภาษาไทยใหพมพโดยใชตวอกษรเอยง 2. ไมมคาเรองลงพมพและผเขยนตองรบผดชอบคาพมพภาพส หากเปนความตองการของผเขยน และ
ผเขยนผรบผดชอบทกเรองจะไดรบส าเนาพมพ 3. ความคดเหนใดๆ ทลงตพมพในวารสารสตวแพทยมหานครสารในแตละฉบบเปนของผเขยน ไมจ าเปน
ทกองบรรณาธการของวารสารฯ และผทรงคณวฒตองเหนดวยเสมอไป
บทความวจย
สตวแพทยมหานครสาร
JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
ความชกของเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม
อมรรตน เจอสข1 ธดารตน บญมาศ2,# ปราณ ศรราช3 รชฎาวรรณ อรรคนมาตย2,3 ธราดล จตจกร5
ภคญาณ สดสาร2 อโณทย แพทยกจ5 ศรนทพย บญจรสภญโญ4 และวนชย มาลวงศ2
1คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยมหาสารคาม มหาสารคาม 44000
2ภาควชาปรสตวทยา คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ขอนแกน 40002 3มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน วทยาเขตสกลนคร สกลนคร 47160
4ภาควชาเวชศาสตรชมชน คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยขอนแกน ขอนแกน 40002
5คณะเกษตรศาสตร มหาวทยาลยราชภฎสกลนคร สกลนคร 47000
บทคดยอ: เพอเปนการศกษาความชกของเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนข ณ ดานกกกนสตว จงหวดนครพนม
ชวงเดอนกนยายน พ.ศ.2556 สนขเรรอนและสนขบานจานวน 5% (43 ตว) ทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม ไดถกเกบตวอยางเลอดในสาร EDTA และนามาสกดดเอนเอเพอตรวจหาเชอ Babesia sp., Erlichia sp. และ
Hepatozoon sp. ดวยเทคนคปฏกรยาลกโซโพลเมอรเรส ผลการศกษาพบวา 29 ตวอยางจาก 43 ตวอยาง
ตดเชอกอโรคท เ กดจากเหบเพยงชนดเดยวคอ B. canis (10.35%), E. canis (13.80%) และ H. canis
(65.50%) อกทงพบการตดเชอรวมกนระหวาง E. canis และ B. canis เปน 3.45% และการตดเชอรวมกน
ระหวาง E. canis และ H. canis เปน 3.45% การศกษานแสดงใหเหนวาเชอกอโรคทนาโดยเหบในสนขยงคง
เปนปญหาดานสขภาพของสนขทดานกกกนสตว จงหวดนครพนม ซงเปนสาเหตใหเกดการปวยและเสยชวตได
ดงนนจงมความจาเปนตองทาการรกษาเมอพบสตวปวยอกทงตองมแนวทางการปองกนโรคทเกดจากเหบเปน
พาหะดวย
คาสาคญ: สนข บาบเซย เออรลเคย เฮปาโตซน นครพนม #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9. E-mail address: [email protected], [email protected]
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
2
Prevalence of Tick-borne Pathogens in Quarantined Dogs at
Nakornpranom Animal Quarantine Station, Thailand
Amornrat Juasook1, Thidarut Boonmars2,#, Pranee Sriraj3, Ratchadawan Aukkanimart2,3, Tharadol Jitjuk1, Pukkayanee Sudsarn 2, Anothai Phaetkit5, Sirintip Boonjaraspinyo4 and
Wanchai Maleewong2
1Faculty of Veterinary Sciences, Mahasarakham University, Mahasarakham 44000, Thailand
2 Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand 3Rajamangala University of Technology Isan Sakonnakhon Campus, Sakonnakhon, 47160, Thailand
4Department of Community Medicine, Faculty of Medicine, Khon Kaen University, Khon Kaen 40002, Thailand 5Faculty of Agriculture, Sakon Nakhon Rajabhat University, Sakon Nakhon 47000, Thailand
Abstract: To know the prevalence of tick-borne pathogens in quarantined dogs at
Nakhonpranom animal quarantine station, Nakornpranom province, Thailand during
September, 2013. About 5% (43 dogs) of EDTA-blood from stray and domestic dogs in
Nakhonpranom animal quarantine station were collected and extracted DNA for detection of
Babesia sp., Erlichia sp. and Hepatozoon sp. using conventional polymerase chain reaction
(PCR). The result found that 29 out of 43 were infected with tick borne pathogens. There were
single infection with B.canis (10.35%), E.canis (13.80%) and H.canis (65.50%). Co-infection with
B.canis, E.canis and H.canis was 3.45%, co-infection with E.canis and B.canis was 3.45% and co-infection with E.canis and H.canis was 3.45%. This study suggests that tick-borne pathogens
remain the health problem in dog which may cause of sick and death at Nakhonpranom
animal quarantine station, Thailand. Therefore, treatment and prevention of tick-borne disease
are extremely needed.
Keywords: Dogs, Babesia, Hepatozoon, Ehrlichia, Nakhonpranom #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 1-9. E-mail address: [email protected], [email protected]
Introduction
Ticks are the most important
ectoparasites in temperate climates (Bryson et
al., 2000; Gray et al., 2013). These
ectoparasites cause significant damages to the
hosts during the feeding process, such as
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
3
blood loss and dilacerations of tissues due to
mechanical action of mouthparts of ticks, in
addition to being vectors of several pathogens,
which cause serious harms to animals and
public health. The recognized tick-borne
diseases for dogs that transmitted by the main
vector, Rhipicephalus sangiuneus are
babesiosis, hepatozoonosis and ehrlichiosis (Coutinho et al., 2005; Demma et al., 2005;
Dantas-Torres, 2008). The majority of patients
with these diseases cause a mild sickness or
asymptomatic case but some develop severe
sickness that may result in death. Therefore,
rapid diagnostic technique with more
sensitivity, specificity and reproducibility are
needed for early treatment (Krause et al.,
1996). In general, laboratory method for tick-
borne diseases diagnosis is microscopic
examination of stained blood smears but it has
very limited sensitivity and cannot be
distinguished by visual identification. Thus,
molecular techniques have become the preferred method for detection of tick-borne
blood parasites in vertebrates (Matjila et al.,
2008; Irwin, 2009; Abd Rani et al., 2011;
Laummaunwai et al., 2014). This technique
can use for diagnose and differentiate various
tick-borne parasites and has a sensitivity tool
in asymptomatic case for early treatment
(Moraes et al., 2014).
The aim of this study was to investigate the prevalence of canine tick-borne
pathogens (Babesia canis, Hepatozoon canis
and Ehrlichia canis) in domestic dogs from
Nakhonpranom animal quarantine station,
Nakornpranom province, Thailand by using
microscopic examination and conventional
polymerase chain reaction (PCR).
Materials and Methods
Specimen collection
EDTA-blood of 43 domestic dogs from
Nakornpranom province at latitude 17o
23’7.34”, 104o 45’56.15” were collected and
then processed for Giemsa’s staining and DNA extraction.
Fig. 1 The Nakornpranom quarantine unit (A) domestic and stray dogs in quarantine unit (B)
blood collection (C).
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
4
Microscopic examination
To perform Giemsa’s straining slides,
fresh bloods were thin smear and fixed with
absolute methanol for 1 minute and
subsequently stained with 2.5% Giemsa in
phosphate buffer, pH 7.2, for 30-60 minutes,
and then rinse with tap water. Tick-borne
pathogens were examined on the thin blood film under a light microscope. The
morphology of the blood parasite was
identified as shown in Fig. 2.
Conventional polymerase chain reaction (PCR)
0.5 ML of EDTA blood of each sample
was used for DNA extraction. In brief,
hemolytic buffer was added to the EDTA
blood and then centrifuged at 12,000 rpm for
10 min. One hundred μl. of 0.5% PK and 0.1%
SDS in TE buffer was added and incubated at
60 0C for 1 hr. After that, 100 μl. of 1:1 of
chloroform and phenol was added and then
precipitated with 10% of 2.5M sodium acetate
and 2.5X ethyl alcohol. The reaction was
incubated at -200C overnight and then
centrifuged at 12,000 rpm for 10 min. and
then washed with 75% ethyl alcohol. Twenty
μl. of distilled water was added and the DNA
concentration was measured with Nano-drop
technology (Nanodrop2000®, USA).
All samples were confirmed the result using conventional PCR for genus and species
diagnosis. The analysis was carried out by the
Department of Parasitology, Faculty of
Medicine, Khon Kaen University using a
modified method previously (Moraes et al.,
2014). The PCR mixture contained 10 μl of
PCR master mix 1 μl of 5mM dNTP, 1 μl
of MgCl2, 0.2 μl of Taq polymerase
(Fermentus® Germany) 1 μl of primer pair
mix consisting of 5 pmol/μl each primer, and
6 μl of distilled water. PCR condition was
95°C for 10 min, 1 cycle at 95 °C for 1 min,
Fig. 2 The morphology of tick-borne pathogens from microscopic observation. The
representative picture of E. canis reside in the membrane-lined cytoplasmic vacuoles of
infected leukocytes in dog. Within the cytoplasmic vacuoles Ehrlichia form morulae (A)
merozoite form of Babesia spp. in red blood cell (B) and ellipsoidal-shaped gamont of H. canis
in the cytoplasm of a leukocyte (C).
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
5
60°C for 30 sec, and at 72 °C for 1 min, 35
cycles. Primers for B. canis , H. canis and E.
canis were designed as follows: B. canis
(GenBank accession no. JQ613105) 5’-CAGGG
CTAATGTCTTGTAATTGG-3’ and 5’-ATTTCTCT
CAAGCTCCTGAAGG-3’; 557 bp, H. canis
(GenBank accession no. AF176835.1) 5’-TTAA
CGGGGGATTAGGGTTC-3’ and 5’-CGGCCTGCTA GAAACACTCT-3’; 437 bp, E. canis (GenBank
accession no. AY205342.1) 5’-CCATAAGCATAG
CTGATAACCCTGTTACAA-3’ and 5’-TGGATAATA
AAACCGTACTATGTATGCTAG-3’; 380 bp
(Laummaunwai et al., 2014). Specific band of
each primer was observed and photographed
as shown in Fig. 3.
Fig. 3 The representative specific bands of B. canis (lane 1), E. canis (lane 2) and H. canis
(lane 3). (M; marker)
Results
Detection of tick-borne pathogens by
microscopic examination
Out of 43 samples, 19 were detected
positive for blood parasites by microscopic
examination. The highest positive rate was H.
canis (32.56%), E. canis (4.56%), B. canis
(2.33%), B. canis co-infection with E. canis
(2.33%) and E. canis co-infection with H. canis
(2.33%) respectively. There were no found B.
canis co-infection with H. canis and co-
infection with all of three blood protozoon.
Fig. 4 The percentage of tick borne pathogen
DNAs in EDTA blood using PCR technique.
Detection of tick-borne pathogens by PCR
technique
Tick blood parasites were found in 29
samples by PCR technique, the positive
samples were 19 samples of H. canis (67%), 4
samples of E. canis (14%), 3 samples of B.
canis (10%), 1 sample of B. canis co-infection
with E. canis (4%), 1 sample of E. canis co-
infection with H. canis (3%) and 1 sample was
co-infection with all of these parasites (3%) respectively (Fig. 4). The diagnostic of tick-
borne pathogen using PCR technique showed
higher positive rate (67.44%) when compared
with microscopic examination (44.19%) (Table
1 and 2) resulting to PCR method showed
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
6
negative rate less than blood smear
technique (32.55% and 55.8% respectively).
Table 1. Comparison of tick-borne pathogens
positive samples examined by microscopic
examination and PCR technique (N=43)
Positive
samples
Microscopic
examination
PCR
technique
n 19 29
% 44.19 67.44
Discussion
In present study, microscopic
examination and PCR technique are useful to
diagnostic the epidemiology of canine tick-
borne pathogens. The identification of thin
blood film is often used for detection of
blood parasite morphology in practical
laboratory because of it is a rapid diagnostic
method. However, the accuracy of this
method relies on the training and skill of
technician and parasites are not revealed in
early infection (Krause et al., 1996). PCR
method is a sensitivity tool for blood
diagnosis in current study which showed higher positive rate than traditional
identification. Therefore, molecular assay
could be advantage as an alternative way and
a sensitivity method in asymptomatic case for
early treatment, prevention and control in
prevalence region.
From this result, the highest prevalence
rate of tick-borne pathogens at Nakhon-
pranom animal quarantine station, Thailand
was canine hapatozoonosis, ehrlichiosis and
Table 2. Examination of tick-borne pathogens by microscopic examination and PCR technique
(N=43)
Pathogens Microscopic examination PCR technique
% (n) % (n)
Positive B. canis 2.33 (1) 6.97 (3)
Positive E. canis 4.65 (2) 9.30 (4)
Positive H. canis 32.56 (14) 44.19 (19)
Positive B. canis and E. canis 2.33 (1) 2.33 (1)
Positive B. canis and H. canis 0.00 (0) 0.00 (0)
Positive E. canis and H. canis 2.33 (1) 2.33 (1)
Positive B. canis, E. canis and H. canis 0.00 (0) 2.33 (1)
Negative B. canis, E. canis and H. canis 55.8 (24) 32.55 (14)
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
7
babesiosis respectively. The highest
prevalence of hepatozoonosis in this area
confirmed that H. canis is innate tick-borne
parasite to Thailand (Jittapalapong et al.,
2006). Hepatozoonosis transmit to dogs by
the ingestion of tick containing Hepatozoon
canis mature oocyst (Baneth, 2011; O'Dwyer,
2011). H. canis infects leukocytes and parenchymal tissues of its host and affects
the haematological system organs such as
spleen, lymph nodes and bone marrow, and
it causes the abnormality such as increased
white blood cell number, stiffness, pain,
weight loss, lethargy, anemia and fever;
although generally chronic or mild disease,
the infection can be life-threatening in severe
clinical manifestations associated with high
parasitemia level (Baneth and Weigler, 1997).
The diagnosis of H. canis infection is usually
performed by cytology of blood but this
method may not be sensitive (Otranto et al.,
2011). Babesiosis, the disease caused by the Babesia parasite, is most common among
vertebrates (dogs, cattle, horses, rodents)
including (though rarely) humans (Homer et
al., 2000). Canine babesiosis is characterized
by fever, anemia, hemoglobinuria, thrombo-
cytopenia, jaundice, and functional disorders
of organs (Solano-Gallego and Baneth, 2011).
Moreover, an obligate intracellular bacterium
of the family Anaplasmataceae and gram-
negative coccobacilli are best known for their
etiological agency in the transmission of a
group of tick-borne illnesses known as
ehrlichiosis. All members of the
genus Ehrlichia are pathogenic, causing mild
to severe symptoms, specifically in humans
and canines. The most commonly clinical
signs in dog are weight loss, anorexia, pale
mucous membranes, high fever, lethargy, lymphadenopathy and splenomegaly
(Skotarczak, 2003; Harrus and Waner, 2011; De
Tommasi et al., 2013; Aktas et al., 2015).
From stained blood smear and PCR
technique results indicated that canine tick-
borne disease is remaining the health
problem in dog which may cause of sick and
death at Nakhonpranom animal quarantine
station, Thailand. Therefore, a sensitivity
diagnostic method for early treatment and
prevention of tick-borne disease are needed.
Moreover, tick population control should be
conducted in dog and environment in this
region also.
Acknowledgments
This work was supported by a grant
from Thailand Research Fund (RTA5580004)
and we also wish to thank the Department of
Research Affairs Faculty of Medicine, Khon
Kaen University for research assistant
(AS56203), Nakhonpranom animal quarantine
station and Department of livestock
development, Thailand for their assistance.
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
8
References
Abd Rani, P.A., Irwin, P.J., Coleman, G.T.,
Gatne, M. and Traub, R.J. 2011. A survey
of canine tick-borne diseases in India.
Parasit. Vectors. 4: 141.
Aktas, M., Ozubek, S., Altay, K., Ipek, N.D.,
Balkaya, I., Utuk, A.E., Kirbas, A., Simsek,
S. and Dumanli, N. 2015. Molecular detection of tick-borne rickettsial and
protozoan pathogens in domestic dogs
from Turkey. Parasit. Vectors. 8: 157.
Baneth, G. 2011. Perspectives on canine and
feline hepatozoonosis. Vet. Parasitol.
181 (1): 3-11.
Baneth, G. and Weigler, B. 1997. Retrospective
case-control study of hepatozoonosis
in dogs in Israel. J. Vet. Intern. Med. 11
(6): 365-370.
Bryson, N.R., Horak, I.G., Hohn, E.W. and Louw,
J.P. 2000. Ectoparasites of dogs
belonging to people in resource-poor
communities in North West Province, South Africa. J. S. Afr. Vet. Assoc. 71 (3):
175-179.
Coutinho, M.T., Bueno, L.L., Sterzik, A., Fujiwara,
R.T., Botelho, J.R., De Maria, M., Genaro,
O. and Linardi, P.M. 2005. Participation of
Rhipicephalus sanguineus (Acari:
Ixodidae) in the epidemiology of canine
visceral leishmaniasis. Vet. Parasitol. 128:
149-155.
Dantas-Torres, F. 2008. Canine vector-borne
diseases in Brazil. Parasit. Vectors. 1: 25.
De Tommasi, A.S., Otranto, D., Dantas-Torres,
F., Capelli, G., Breitschwerdt, E.B. and de
Caprariis, D. 2013. Are vector-borne
pathogen co-infections complicating
the clinical presentation in dogs?
Parasit. Vectors. 6: 97. Demma, L.J., Traeger, M.S., Nicholson, W.L.,
Paddock, C.D., Blau, D.M., Eremeeva,
M.E., Dasch, G.A., Levin, M.L., Singleton,
J., Jr., Zaki, S.R., Cheek, J.E., Swerdlow,
D.L. and McQuiston, J.H. 2005. Rocky
Mountain spotted fever from an
unexpected tick vector in Arizona. N.
Engl. J. Med. 353: 587-594.
Gray, J., Dantas-Torres, F., Estrada-Pena, A.
and Levin, M. 2013. Systematics and
ecology of the brown dog tick,
Rhipicephalus sanguineus. Ticks Tick
Borne Dis. 4 (3): 171-180.
Harrus, S. and Waner, T. 2011. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis
(Ehrlichia canis): an overview. Vet. J. 187
(3): 292-296.
Homer, M.J., Aguilar-Delfin, I., Telford, S.R., Krause,
P.J. and Persing, D.H. 2000. Babesiosis. Clin.
Microbiol. Rev. 13: 451-469.
Irwin, P.J. 2009. Canine babesiosis: from
molecular taxonomy to control.
Parasit. Vectors. 2 Suppl 1: 54.
อมรรตน เจอสข และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 1-9.
9
Jittapalapong, S., Rungphisutthipongse, O.,
Maruyama, S., Schaefer, J.J. and Stich,
R.W. 2006. Detection of Hepatozoon
canis in stray dogs and cats in Bangkok,
Thailand. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1081:
479-488.
Krause, P.J., Telford, S., 3rd, Spielman, A.,
Ryan, R., Magera, J., Rajan, T.V., Christianson, D., Alberghini, T.V., Bow, L.
and Persing, D. 1996. Comparison of
PCR with blood smear and inoculation
of small animals for diagnosis of
Babesia microti parasitemia. J. Clin.
Microbiol. 34: 2791-2794.
Laummaunwai, P., Sriraj, P., Aukkanimart, R.,
Boonmars, T., Boonjaraspinyo, S.,
Sangmaneedet, S., Potchimplee, P.,
Khianman, P. and Maleewong, W. 2014.
Molecular detection and treatment of
tick-borne pathogens in domestic dogs
in Khon Kaen, northeastern Thailand.
Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 45: 1157-1166.
Matjila, P.T., Leisewitz, A.L., Jongejan, F. and
Penzhorn, B.L. 2008. Molecular detection
of tick-borne protozoal and ehrlichial
infections in domestic dogs in South
Africa. Vet. Parasitol. 155: 152-157.
Moraes, P.H., Rufino, C.P., Reis, T., Aguiar, D.C.,
Meneses, A.M. and Goncalves, E.C.
2014. Optimization of a molecular
method for the diagnosis of canine
babesiosis. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 23:
105-108.
O'Dwyer, L.H. 2011. Brazilian canine
hepatozoonosis. Rev. Bras. Parasitol. V.
20: 181-193.
Otranto, D., Dantas-Torres, F., Weigl, S.,
Latrofa, M.S., Stanneck, D., Decaprariis,
D., Capelli, G. and Baneth, G. 2011. Diagnosis of Hepatozoon canis in young
dogs by cytology and PCR. Parasit.
Vectors. 4: 55.
Skotarczak, B. 2003. Canine ehrlichiosis. Ann
Agric Environ Med. 10 (2): 137-141.
Solano-Gallego, L. and Baneth, G. 2011.
Babesiosis in dogs and cats—Expanding
parasitological and clinical spectra. Vet.
Parasitol. 181: 48-60.
บทความวจย
สตวแพทยมหานครสาร
JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
การตรวจหาความเรวสงสดในการวงเรยบ ทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตท
ในกระแสเลอดใหคงท ในมาลกผสมพนเมองของไทย
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ1 อารย ไหลกล2 ขนษฐา เพชรอดมสนสข2 วชรพล ปฐมสกลวงศ2
ณฐพล ภาณเสวกล2 และวรกจ เชดชธรรม2,#
1สาขาวชาคลนกศกษาทางสตวแพทย, 2ภาควชาเวชศาสตรคลนกสตวใหญและสตวปา คณะสตวแพทยศาสตร
มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน อ.กาแพงแสน จ.นครปฐม 73140
บทคดยอ: การศกษาวจยนมวตถประสงคเพอหาความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกายสามารถรกษาระดบ
แลคเตทในกระแสเลอดใหคงท (Maximal Lactate Steady State Speed; MLSS) ในมาลกผสมพนเมองของ
ไทย (crossbred native Thai ponies; CNTP) 6 ตว โดยทาการประเมนจากระดบแลคเตทในกระแสเลอดท
มการเปลยนแปลงขณะทมาทาการวงตามวธการทดสอบทความเรวระดบตางๆพบวาคา MLSS ของมากลมนคอ 15±1.1 km/h ซงเปนความเรวทมาใชแลวไมเกดการสะสมของแลคเตทในกระแสเลอด เปรยบเทยบ
ความเรวเฉลยทแลคเตทตาทสด (lactate minimum speed; LMS) และความเรวทสงขนอก 10% ของ LMS
(10%LMS) พบวาทระยะ 4, 6, 8 และ 10 กโลเมตร มความแตกตางกนของระดบแลคเตทของมาทงสองกลม
อยางมนยสาคญทางสถต (P<0.05) บงชวาความเรวในการวงทระดบ LMS คอคา MLSS จรง ระดบแลคเตท
เฉลยทความเรว MLSS เทากบ 1.8±0.2 mmol/L การสะสมของแลคเตททสงสด (เฉลยท 8.0±1.1 mmol/L)
ใชเวลาสะสมเฉลยเทากบ 1±0 นาท และใชเวลาเฉลยในการกาจดแลคเตทใหกลบเขาสระดบระดบพนฐาน
เทากบ 71.6±9.8 นาท สรปไดวาจากผลงานวจยนคา MLSS ในมา CNTP อยท 15.0±1.1 km/h ซงจะเปน
ขอมลทสามารถนาไปใชประโยชนในการกาหนดโปรแกรมออกกาลงกายของมาในประเทศไทยตอไป
คาสาคญ: มาลกผสมพนเมองของไทย แลคเตทในกระแสเลอด ความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกายสามารถ
รกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21. E-mail address: [email protected]
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
12
Determination of the Maximal Lactate Steady State Speed of Trotting in
Crossbred Native Thai Ponies
Pattanaporn Thawornpattanapong1, Aree Laikul2, Kanittha Phetudomsinsuk2, Watcharapol Pathomsakulwong2, Nuttapon Phanusaweekul2 and
Worakij Cherdchutham2,#
1Department of Veterinary Clinical Studies, 2Department of Large Animal and Wildlife Clinical science,
Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Kamphaengsaen, Nakhon Pathom 73140, Thailand
Abstract: The purpose of this study aimed to determined maximal lactate steady state speed
(MLSS) of the 6 crossbred native Thai ponies (CNTP). Blood lactate concentrations during
different velocity of protocols were evaluated. The MLSS in CNTP was 15±1.1 km/h which did
not accumulate of blood lactate. Compared mean lactate minimum speed (LMS) and
comparison with 10% above LMS, found significant different lactate concentration (P<0.05) at
4, 6, 8 and 10 km. distance indicating that LMS was absolute MLSS (mean MLSS lactate was
1.8±0.2 mmol/L). The average peak blood lactate (LP) was 8.0±1.1 mmol/L. The mean of
lactate peak time was 1±0 min. after the exercise test, and mean of the time to base lactate
was 71.7±9.8 min. In conclusion, the MLSS of CNTP (15±1.1 km/h) was proposed from this
study that would be beneficial for tailoring the exercise program of this type of equids in
Thailand.
Keywords: Crossbred native Thai ponies, Blood lactate, Maximal lactate steady state speed (MLSS) #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 11-21. E-mail address: [email protected]
บทนา
การแขงขนกฬาขมามาราธอน (endurance)
เปนการแขงขนเ พอทดสอบทงในดานความเรว
(speed) แล ะค ว า ม แข ง แ ก ร ง (stamina หร อ
endurance ability) ของม า โดย ใ ชการ ว ง เ ร ยบ
(trotting) เ ป น ท า ว ง ห ล ก เ ป น ก า ร ท ด ส อ บ
ความสามารถของผข ในการวางแผนการขดวย
ความเรวทเหมาะสมกบสภาพรางกายของมาและวาง
แผนการเดนทางผานภมประเทศ มาทเหมาะกบการ
แขงขนกฬาประเภทนมากทสดไดแกมาพนธอารา
เบยน (Arabian) ซงมลกษณะทางสรระวทยาทเหมาะ
กบการแขงขนกฬาประเภทน (Prince et al., 2001)
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
13
ประ เทศ ไทย มก า ร เ ล ย ง ม า ล ก ผสม พน เ ม อ ง
(crossbred native Thai ponies; CNTP) โ ด ย
เกษตรกรเพอใชในงานตางๆ รวมถงมาขเลนเพอออก
กาลงกาย มาลกผสมพนเมองของไทยเหลานมการ
เลยงดไมยงยากและไมตองใชตนทนสงนก โดยม
ขนาดรางกายไมสงใหญมาก สามารถฝกหดไดจง
นาจะเหมาะสมสาหรบผขทเปนเยาวชนหรอผหดขมา
ใหม และใชในการแขงขนขมามาราธอนในระดบเบองตนหรอระดบฝกหดกอนทจะพฒนาไปสการ
แขงขนขมามาราธอนในระดบสงตอไป
การกาวยางหรอการวงของมาในลกษณะตางๆ
เชนการเดน (walk) การวงเรยบ (trotting) จะม
รปแบบการสรางพลงงาน 2 รปแบบหลกคอแบบใช
ออกซ เจน (aerobic) และแบบไ ม ใ ชออกซ เจน
(anaerobic) ซงอตราสวนของการใชพลงงานของ
สองรปแบบดงกลาวจะขนอยกบความหนกเบา
(intensity) และระยะเวลา (duration) ของการออก
กาลงกาย (exercise) เปนสวนใหญ (Desmecht et
al., 1996) โดยมาทมการออกกาลงกายอยางหนกใน
ชวงเวลาสน มกจาเปนตองการพลงงานในรปแบบ
ของ Adenosine triphosphate (ATP) อยางมาก
และรวดเรวเพอนาไปใชในการหดและคลายตวของกลามเนอเพอใหเกดการกาวยางอยางมประสทธภาพ
(efficient gait) (Evans, 2000) ดงนนมาจงตองการ
ใชการสรางพลงงานในรปแบบไมใชออกซเจนเปน
หลกเพราะสามารถใหพลงงานในรปแบบของ ATP
ไดปรมาณมากและรวดเรวการสรางพลงงานแบบไม
ใชออกซเจนจะเกดในไซโตพลาสซมของเซลล โดย
การนากลโคสเขามาใชในเซลลกลามเนอนจะม
glucose transporter-4 (GLU4) (Richter et al.,
2013) ซ ง จ ะ เ ป น ต ว ส ง ก ล โ ค ส ผ า น plasma
membrane ไปยง T-tubules ในขณะทกลามเนอม
การหดตว ซงกลโคสนมาจากการขบวนการสลายไกล
โคเจน (glycolytic pathway) ของกลามเนอหรอ
เปนกลโคสทอยในกระแสเลอดทมาจากขบวนการเม
แทบอลซมจากอวยวะอนของรางกาย และผลผลต
อยางหนงของการสรางพลงงานแบบไมใชออกซเจนก
คอเกดการสรางและการสะสมของกรดแลคตก
(lactic acid) หรอ อกรปแบบหนง กคอแลคเตท
(lactate) โดยแลคเตทจะไดจากขบวนการสรางพลงงาน (ATP) จากกลโคส โดยเกดจากการเปลยน
ไพรเวท (pyruvate) ไปเปนแลคเตทโดยเอนไซมแลค
แตทดไฮโดรจเนส (lactate dehydrogenase; LDH)
ซงการขจดแลคเตทออกจากเซลลจะมโปรตนท
เรยกวา monocarboxylate transporters (MCT)
เปนตวขนสงแลคเตทผานเยอหมเซลลเขาสกระแส
เลอด (Revold et al., 2010) ซงมปจจยหลายอยาง
ทมผลกระทบความสามารถในการกาจดกรดแลคตก
เชน มวลกลามเนอ การไหลเวยนของกระแสเลอด
และปรมาณเสนเลอดฝอยในกลามเนอ เปนตน
(Gollnick et al.,1986; Brooks, 1991)
ความเรวททาใหระดบแลคเตทในกระแสเลอด
เทากบ 4 mmol/L (V4) ซ งหมายความถงการท
รางกายตองการพลงงานมากขนจงเรมมการเปลยนไปใชการสรางพลงงานแบบไมใชออกซเจน (anaerobic
threshold; AT) จงทาใหมการสรางและสะสมของ
แลคเตทในกระแสเลอดคา V4 นจ งถกใชอยาง
แพรหลายในการนามาตดสนสมรรถภาพของมากฬา
(Lindner et al., 2009)
การทดสอบการออกกาลงกายมาตรฐาน
(Standardized exercise testing; SET) ถกนามาใช
ในการศกษาเพอตดสนระดบความสมบรณของมา
โดยการประเมนสมรรถนะทางดานการออกกาลงกาย
ในมา โดยมการใชพารามเตอรหลายชนดในการ
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
14
ประเมน คาความเขมขนของแลคเตทในกระแสเลอด
(blood lactate concentration; LA) ก เ ปนอกค า
หนงทนยมใชในการประเมนสภาพรางกายทงของคน
และมาในการออกกาลงกายหรอในการแขงขน
(Kobayachi, 2007; Lindner et al., 2009) LA ถก
นามาใชในการประเมนความหนกของการออกกาลง
กายในมากฬาอยางแพรหลาย (Foreman et al.,
1990, McGowan et al., 2002, Serrano et al., 2002)
ในป ค.ศ. 1994 มการศกษาถงความแตกตาง
ระหวางสายพนธมาเกยวกบระดบ LA เมอใหมาวงท
ความเรว 15, 20 และ 25 km/h พบวา มาพนธอารา
เบยนและพนธแองโกลอาหรบมระดบ LA ตากวา มา
พน ธ อนดาล เ ชยนส (Castejon et al., 1994) ใน
งานวจยเดยวกนน ยงพบวา เมอใหมาวงทความเรว
20 km/h มาพนธอนดาลเชยนส มอตราการเตนของ
ห ว ใจส งก วาม า อก 2 สายพน ธท เหลอ บ ง ชถ ง
ความสามารถในการปรบตวตอการขระยะทางไกล
ของมาพนธอาราเบยนและพนธแองโกลอาหรบ แต
เมอวงทความเรว 30 km/h พบวาไมมความแตกตาง
ระหวางมา 3 สายพนธ ทงระดบ LA และอตราการ
เตนของหวใจ (Castejon et al., 1994) ระดบแลคเตทคงทสงสด (maximum lactate steady state,
MLSS) แสดงใหเหนการทางานทสงสด ทสามารถ
รกษาระดบแลคเตทใหคงท กอนทจะมการสะสม
เกดขน ซงหมายถงการเรมทจะเกดการสรางแลคแต
ทจากการไมใชออกซเจนเกดขน (Mader et al.,
1976, cited in Lindner, 2010)
จดประสงคของการศกษาคร ง นค อการ
ประเมนหาความเรวสงสดในการวงเรยบทรางกาย
สามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอดใหคงท
(MLSS) ของมาลกผสมพนเมองของไทย
อปกรณและวธการ
สตวทดลอง
การศกษาครงนจะใชมาลกผสมพนเมองของ
ไทย เพศผตอน อาย 4-12 ป นาหนกระหวาง 180-
230 กโลกรม คะแนนสภาพรางกายเฉลย 3.5 จาก
คะแนนเ ตม 5 (Carroll and Huntington, 1988)
จานวน 6 ตว ทมสขภาพแขงแรง และถกเลยงด
ภายใตสภาพแวดลอมเดยวกน มาทกตวทเขารวมการทดลองตองผานการตรวจรางกายภาวะขากระเผลก
การตรวจความสมบรณของเลอด (complete blood
count) และคาเคมโลหต (blood chemistry) คอ
เ อ น ไ ซ ม Aspartate aminotransferase (AST),
Alkaline phosphatase (ALP), Creatine kinase
(CK), Blood urea nitrogen (BUN), Creatinine
และ Total protein วาอยในเกณฑปกตกอนนามา
ทาการศกษา มาทใชเปนมาของหนวยงานสตวทดลอง
คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร
ซงผานขนตอนเตรยมการวจยในระยะเวลา 1 ปโดย
เปนมาทเคยเขารวมการแขงขนกฬาขมามาราธอนใน
ระดบฝกหด ระยะทาง 20-40 กโลเมตร ทงนในชวง
กอนการทดลอง 6 เดอน มาจะไมไดเขารวมการ
แขงขน จะมเพยงถกใชในการสอนขมาตามโปรแกรมการขปกตเทานน และพนททใชในการวงทดสอบเปน
พนดนอดแนน (turf surface) เหมอนกบทใชตาม
โปรแกรมการขปกต
การเตรยมมากอนการศกษา
มาทง 6 ตว ในหนงสปดาหจะมโปรแกรมการออก
กาลงกาย (ตามโปรแกรมการใชขปกต) ดงน
วนท 1: พกมา
วนท 2-5: อบอนรางกายโดยการเดน (walk)
ระยะทาง 300 เมตรใชเวลา 5 นาท (ความเรวเฉลย
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
15
1 เมตรตอวนาท) และวงเรยบ (trotting) ระยะทาง
9400 เมตรนาน 45 นาท (ความเรวเฉลย 3.48 เมตร
ตอวนาท) และเดนคลายอนอกประมาณ 300 เมตร
โดยใชเวลา 5 นาท (ความเรวเฉลย 1 เมตรตอวนาท)
รวมเปนระยะทางทงสน 10 กม. วนละ 1 ครง (ตอน
เยน)
วนท 6-7: ใชการออกกาลงกายตามขนตอน
เหมอนวนท 2-5 แตปฏบตวนละ 2 ครง (เชาและเยน) รวมเปนระยะทาง 20 กม.ตอวน
ดงนนในหนงสปดาหมาแตละตวจะไดออก
กาลงกายประกอบดวยการเดน (คดเปน 6% ของการ
ออกกาลงกาย) และวงเรยบ (คดเปน 94% ของการ
ออกกาลงกาย) รวมเปนระยะทางตวละ 80 กโลเมตร
ตอสปดาห โดยมการเตรยมรางกายมาทงหมดเปน
เวลา 6 เดอนจงนามามาศกษาตามขนตอน ซงผาน
ก า ร อ น ม ต ก า ร ใ ช ส ต ว เ พ อ ง า นทด ล อ ง จ า ก
คณะกรรมการจรรยาบรรณการใชสตวเพองานวจย
มหาวทยาลยเกษตรศาสตร
ขนตอนการศกษา (ขนตอนท 1 และ 2 ประยกตจาก
Gondim และคณะ) (Gondim et al., 2007)
1. การประเมนสมรรถภาพทางกายภาพ (fitness) ของมา
1.1 การหาคาความเขมขนสงสดของการ
สะสมแลคเตทในกระแสเล อด ( lactate peak
concentration; LP) เวลาทเกดการสะสมถงระดบ
สงสด ( time to lactate peak; TLP) และเวลาท
ระ ดบแลคเตทลดลงส ระ ดบ พนฐาน (time to
baseline lactate; TLB) โดยวดคา LA ในขณะพก
( resting state) และก าหนด เ ปนระ ดบ พนฐาน
(baseline value) อบอนรางกายมา (warm up)
ประกอบดวยการเดน (walk) 10 นาท ว ง เรยบ
(trotting) 5 นาท และวงโขยก (canter) 1 นาท
จากนนจงขในจงหวะวงหอ (gallop) เปนระยะทาง
500 เมตร เพอกระตนใหเกดการสรางและสะสมของ
แลคเตท (Gondim et al., 2007) เมอหยดวงทาการ
เจาะเลอดวดคา LA ทกๆ 2 นาทจนกวาคา LA จะ
ลดลงจนถงระดบพนฐาน (baseline value) โดย
เจาะเลอดจากเสนโลหตดาทคอ (jugular vein) เปน
ปรมาณ 0.5 มลลลตร และนามาวดตามขนตอนดวยเ ค ร อ ง Accutrend®Plus (จ า ก บ ร ษ ท Roche
ประเทศสหรฐอเมรกา) (Kullmann et al., 2014)
1.2 ก า ร ท ด ส อ บ เ พ ม ก า ร อ อ ก ก า ล ง
( incremental exercise protocol) โดยจากการ
ทดลองท 1.1 จะไดทราบ คา TLP ทาการพกมาหลง
จบการทดลองท 1.1 เปนระยะเวลา 36 ชวโมง เรม
การทดลองท 1.2 โดยวดคา LA และวดอตราการเตน
ของหวใจในขณะพก (resting state) และกาหนด
เปนระดบพนฐาน (baseline value) จากนนอบอน
รางกายมาตามขนตอนเดม แลวจงขในจงหวะวงหอ
เปนระยะทาง 500 เมตร หยดพกมาครบตาม TLP ท
ไดจากการทดลองท 1.1 (เพอรอจนกระทงระดบแลค
เตทในกระแสเลอดส งสด ; LP) แลวขม า ว ง เ ปน
ระยะทางรอบละ 1,000 เมตร รอบแรกใชความเรว 10 km/h เมอครบ 1 รอบจงวดคา LA และวดอตรา
การเตนของหวใจและพกมา 1 นาท จงวงรอบตอไป
โดยเพมความเรวขนรอบละ 2 km/h เมอมา วง
ครบรอบจงปฏบตเชนเดม ทาเชนนจนคา LA เรมเพม
สงขนจงหยดการทดลอง ซงจะทราบความเรวในการ
วงทระดบแลคเตทในกระแสเลอดมคาตาสดหรอ
lactate minimum speed (LMS)
1.3 การหาคาความเรวสงสดในการวงเรยบท
รางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทในกระแสเลอด
ใ หคงท ห ร อท เ ร ยก ว า Maximal blood lactate
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
16
steady state speed (MLSS phase confirmation
protocol) ทาการพกมาหลงจบการทดลองท 1.2
เปนระยะเวลา 36 ชวโมง เรมการทดลองท 1.3 โดย
วดคา LA ในขณะพก (resting state) และกาหนด
เปนระดบพนฐาน (baseline value) อบอนรางกาย
มา (warm up) ตามขนตอนเดม จากนนขมาวงดวย
ความเรว LMS ของมาแตละตว เปนระยะทางทงหมด
10 กโลเมตร โดยหยดเพอเจาะเกบเลอดและวดคา LA ทก 2 กโลเมตร หลงจากนนพกมา เปนระยะเวลา
36 ชวโมง เจาะเลอดวดคา LA เพอใชเปนคาพนฐาน
(baseline value) ทาการอบอนรางกายมา จากนน
วงดวยความเรวทเพมขน 10% จาก LMS ของมาแต
ละตว เปนระยะทางทงหมด 10 กโลเมตร โดยหยด
เพอเจาะเลอดวดคา LAทก 2 กโลเมตร
2. ก า ร ว เ ค ร า ะ ห ค า blood lactate
concentration (LA) ทไดในแตละการทดลองยอย
จากการทดลองท 1.1 จะไดคาเฉลยของคา
แลคเตทพนฐานขณะพก (lactate baseline resting
value, baseline lactate) (mmol/L) คาเฉลยของ
คา TLP (นาท) คาเฉลยของ TLB (นาท) และคาเฉลย
ของคา LP (mmol/L) ของมาท ง 6 ตว จากการ
ทดลองท 1.2 จะไดคาเฉลยของ baseline lactate, blood lactate at LMS และ LMS จากการทดลอง
ท 1.3 นาคา LA เฉลยในมาทง 6 ตว จากการวง 2
รอบมาเปรยบเทยบกนและเปรยบเทยบกบคา
baseline lactateหากคาเฉลยทวด ณ จด 2, 4, 6, 8
และ 10 กโลเมตร ของการวงดวยความเรวทระดบ
LMS กบ คา baseline lactate เฉลยไมแตกตางกน
แตแตกตางจากการวงดวยความเรวทเพมขน 10%
จาก LMS อยางมนยสาคญทางสถตและการวงดวย
ความเรวทเพมขน 10% จาก LMS กบ คา baseline
lactate เฉลยแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต
จะบงชวาความเรวในการวงทระดบ LMS คอคา
MLSS
3. การวเคราะหขอมลทางสถต
ก า ร ว เ ค ร า ะ ห ข อ ม ล ท า ง ส ถ ต โ ด ย ว ธ
descriptive statistic analysis ถกนามาใชเพอหา
คาเฉ ลย (mean) และสวนเ บยงแบนมาตรฐาน
(standard deviation; SD) ของคาแลคเตทพนฐาน
ขณะพก (baseline lactate) เวลาทเกดการสะสมแลคเตทถงระดบสงสด (LTP) ระดบแลคเตทสงสดใน
กระแสเลอด (LP) ความเรวในการวงทระดบแลคเตท
ในกระแสเลอดมคาตาสด (LMS) และความเขมขน
ของแลคเตทในกระแสเลอดท LMS (blood lactate
concentration at LMS, LMS lactate) การใ ช ว ธ
paired sample t-test เพอเปรยบเทยบคาเฉลยของ
แลคเตทในกระแสเลอดของมาทง 6 ตวหลงจากการ
วงทความเรวระดบ LMS กบการวงทระดบความเรวท
เพมขน 10% ของ LMS ณ ระยะทาง 2, 4, 6, 8 และ
10 กโลเมตร โดยกาหนดให P-value <0.05 จง
ยอมรบวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต
ใชโปรแกรม SPSS19 ในการวเคราะหทางสถต
ผลการวจย ค า เ ฉ ล ย ข อ ง LP ค อ 8.0±1.1 mmol/L
คาเฉลยของ TLP คอ 1±0 นาท คาเฉลยของ TLB
คอ 71.7±9.8 นาท (ตารางท 1) คาเฉลยของคา
baseline lactate คอ 1.6±0.2 mmol/L คาเฉลย
LMS คอ 15±1.1 km/h คาเฉลยของ LMS lactate
คอ 1.8±0.2 mmol/L (ตารางท 2)
ตวอยาง ระดบ LA ทวดหลงจากทดสอบของ
มา D ทมแนวโนมลดลง เมอวงทความเรวตางๆ และ
เมอถงความเรวท LMS ของมา D จะพบวาคา LA ใน
กระแสเลอดจะเรมมการเพมขน (รปท 1)
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
17
ตารางท 1 แสดงคา อาย นาหนก คา LP คา TLP และคา TLB ของมาแตละตวและคาเฉลย
มา อาย(ป) นาหนก(kg) LP(mmol/L) TLP(นาท) TLB(นาท)
A 4 195 8.9 1 65 B 8 230 8.9 1 65
C 6 210 8.3 1 80
D 5 205 5.9 1 60
E 4 180 8.8 1 85
F 6 190 7.3 1 75
คาเฉลย±SD 5.5±1.5 201.7±17.5 8.0±1.1 1±0 71.7±9.8
ตารางท 2 แสดงคา LMS คา LMS lactate และคา baseline lactate ของมาแตละตวและคาเฉลย
มา
LMS
(km/h)
LMS lactate
(mmol/L)
Baseline lactate
(mmol/L)
A 14 1.8 1.4
B 14 1.5 1.9
C 16 1.8 1.7
D 16 1.7 1.4
E 14 2.0 1.7
F 16 2.2 1.4
คาเฉลย±SD 15.0±1.1 1.8±0.2 1.6±0.2
รปท 1 ลกษณะกราฟของระดบแลคเตทของมา D กบความเรวทใชในการวง
LMS
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
18
รปท 2 เปรยบเทยบระดบแลคเตทเฉลยของกลมมาทงหมด ในระหวางมาทวงดวยความเรวทระดบแลคเตท
นอยทสด (LMS) กบมาทวงดวยความเรวเพมขนอก 10% ของความเรวทระดบแลคเตทนอยทสด (10%LMS)
ทระยะทางตางๆ
วจารณผลการวจย
มาทกตวทใชทดสอบหา MLSS ในการศกษา
ครงนไมปรากฏพบการบาดเจบของกลามเนอ หรอ
ภาวะขากระเผลกในระหวางการศกษา ซงอาจเปนเพราะการศกษาครงนใชโปรแกรมการฝกฝนมา
(training exercise) ทมการออกกาล งกายอ ย ใน
ระดบทตา (low intensity) กอนนามามาทดสอบหา
MLSS
ความเรวในระดบ LMS ทไดจากทดสอบเปน
คา LMS ทแทจรง เนองจากเมอมการเพมระดบ
ความเรวขนจากระดบ LMS ของมาแตละตว จะ
พบวามการเพมขนหรอมการสะสมของแลคเตทใน
กระแสเลอด โดยทระดบพนฐานและระยะทางท 2
กโลเมตร ของทงสองกลมพบวาไมมความแตกตางกน
อยางมนยสาคญทางสถต (P>0.05) แตทระยะ 4, 6,
8 และ 10 กโลเมตร พบวามความแตกตางกนของ
ระดบแลคเตทในกระแสเลอดของมาทงสองกลมอยาง
มนยสาคญทางสถต (P<0.05) (รปท 2) จากกการศกษาครงนพบวามาลกผสมพนเมอง
ของไทยจะม LMS เฉลยท 15±1.1 km/h ซงตากวา
เมอเปรยบเทยบกบการศกษาของ Gondim และ
คณะในมาพนธอนๆ (อาราเบยน ควอเตอร และแอง
โกลอาหรบ) คอมความเรวเฉลยท 20.75 km/h และ
ยงพบวาคา TLP เฉลยคอ 1±0 นาท ซงตากวามา
พนธอนๆ (อาราเบยน ควอเตอร และแองโกลอาหรบ) ทได 5.8±6.09 นาท ทงนอาจเนองมาจากสดสวนของ
ชนดเสนใยกลามเนอของมาลกผสมพนเมองของไทย
มความแตกตางกบมาพนธอาราเบยน ซงมสดสวน
เสนใยกลามเนอชนดทใชพลงงานจากการสนดาป
ออกซเจน (type I) มากกวาเสนใยกลามเนอชนดอน
ซงเปนเปนปจจยในการสรางและกาจดแลคเตท
ภายในรางกาย (Gladden, 1996, Votion et al.,
2010) แตพบวาระดบ LP เฉลยทไดของมาลกผสม
พนเมองของไทย (8.0±1.1 mmol/L) ใกลเคยงกบ
มาพนธอน (อาราเบยน ควอเตอร และแองโกล
อ า ห ร บ ) (8.2±0.7 mmol/L) (Gondim et al.,
2007) ความเรวทใชและขนาดกลามเนอทตางกนของ
มาลกผสมพนเมองของไทย และมาพนธอนๆ (อารา
เบยน ควอเตอร และแองโกลอาหรบ) ตามหลกกายวภาค สงผลตอปรมาณไกลโคเจนทอยในกลามเนอจง
มผลตอปรมาณการสรางแลคเตททเกดขนจากกการ
สรางพลงงาน และชนดของเสนใยกลามเนอซงม
LMS
10%LMS
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
19
สดสวนท ตางกนกมผลตอการทางานและสราง
แลคเตทไดเชนเดยวกน (Snow and Valberg, 1994)
สรปผลการวจย
จากการศกษาการตรวจหาความเรวสงสดใน
การวงเรยบทรางกายสามารถรกษาระดบแลคเตทใน
กระแสเลอดใหคงท (MLSS) ในมาลกผสมพนเมอง
ของไทย พบวาความเรวสงสดทสามารถใชไดในมากลมนคอ 15±1.1 km/h ซงจะเปนความเรวทมาใช
แลวจะไมเกดการสรางแลคเตทในรางกายมากเกน
กวาทจะกาจดออกไดทนจนเกดการสะสมอย ใน
กระแสเลอด และพบวามากลมทดลองใชเวลาเฉลย
เทากบ 1±0 นาท ในการทเกดการสะสมของแลคเตท
ทสงสดหลงจากออกกาลงตามโปรแกรมการประเมน
สมรรถภาพทางกายภาพ (fitness) ของมา (ประยกต
จาก Gondim et al., 2007) และใช เวลาในการ
กาจดแลคเตททสรางขนใหกลบเขาสระดบปกต
(ระดบพนฐานของมาแตละตว) เฉลย 71.7±9.8 นาท
ซงจะเปนขอมลทสามารถนาไปใชประโยชนในการ
กาหนดโปรแกรมออกกาลงกายของมาลกผสม
พนเมองของไทย ในประเทศไทยตอไป
กตตกรรมประกาศ
ทางคณะผศกษาขอขอบคณ หนวยงานสตว
ทดลอง คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลย
เกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน ทใหความ
อนเคราะหมาเพอใชในการศกษาครงน
เอกสารอางอง
Baldari, C., Bonavolonta, V., Emerenziani, G.P.,
Gallotta, M.C., Silva, A.J. and Guidetti, L.
2009. Accuracy, reliability, linearity of
Accutrend and Lactate Pro versus EBIO
plus analyzer. Eur. J. Appl. Physiol. 107:
105-111.
Brooks, G.A. 1991. Current concepts in lactate
exchange. Med. Sci. Sports. Exerc. 23 (8):
895–906.
Carroll, C.L. and Huntington P.J. 1988. Body
condition scoring and weight estimation of horses. Equine Vet. J. 20(1): 41-45.
Castejón, F., Rubio, D., Tovar, P., Vinuesa, M.
and Riber, C. 1994. A comparative study
of aerobic capacity and fitness in three
different horse breeds (Andalusian,
Arabian and Anglo-Arabian).
ZentralblVeterinarmed A. 41 (9): 645–
652.
Desmecht, D., Linden, A., Amory, H., Art, T. and
Lekeux, P. 1996. Relationship of plasma
lactate production to cortisol release
following completion of different types
of sporting events in horses. Vet. Res.
Commun. 20(4): 371-379. Evans, D.L. 2000. Training and fitness in
athletic horses. Barton, Camberra: Rural
Industries Research and Development
Corporation, 64p.
Foreman, J.H., Bayly, W.M., Grant, B.D. and
Gollnick, P.D. 1990. Standardized
exercise test and daily heart rate
response of Thoroughbreds undergoing
conventional race training and
detraining. Am. J. Vet. Res. 51: 914-920.
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
20
Gladden, L.B. 1996. Lactate transport and
exchange during exercise. In: Handbook
of Physiology. Section 12: Exercise:
Regulation and Integration of Multiple
Systems, L. B. Rowell and J. T. Shepherd
(Eds.). New York: Oxford University
Press, pp. 614–648.
Gollnick, P.D., Bayly, W.M. and Hodgson, D.R., 1986. Exercise intensity, training, diet,
and lactate concentration in muscle
and blood. Med. Sci. Sports. Exerc. 18
(3): 334–340.
Gondim, F.J., Zoppi, C.C., Pereira-da-Silva, L.
and Macedo, D.V. 2007. Determination
of the anaerobic threshold and
maximal lactate steady state speed in
equines using the lactate minimum
speed protocol. Comp. Biochem. Phys.
A. 146: 375-380.
Kobayashi, M. 2007. Simple lactate
measurement in horses using a
portable lactate analyzer with lancet skin punctures under field conditions. J.
Equine. Sci. 18(1): 5-11.
Kullmann, A., Sanz, M., Fosgate G.T., Sualez,
M.N., Page P.C., Rioja, E., 2014. Effects of
xylazine, romifidine, or detomidine on
hematology, biochemistry and splenic
thickness in healthy horses. Can. Vet. J.
55: 334–340.
Lindner, A. 2000. Use of blood biochemistry
for positive performance diagnosis of
sport horses in practice. Revue. Med.
Vet. 151: 611-618.
Lindner, A., Mosen, H., Kissenbeck, S.,
Fuhrmann, H., and Sallmann, H.P., 2009.
Effect of blood lactate-guided
conditioning of horses with exercises of
differing durations and intensities on
heart rate and biochemical blood variables. J. Anim. Sci. 87: 3211-3217.
McGowan, C.M., Golland, L.C., Evans, D.L.,
Hodson, D.R. and Rose, R.J. 2002.Effects
of prolonged training, overtraining and
detraining on skeletal muscle
metabolites and enzymes. Equine. Vet.
J. 34: 257-263.
Mykkanen, A.K., Poso, A.R., McGowan, C.M.
and McKane, S.A. 2010. Expression of
lactate transporters MCT1, MCT2, and
CD147 in the red blood cells of three
horse breeds: Finnhorse, Standardbred
and Thoroughbred. Equine. Vet. J.
42(34): 161-166. Perez, E.H., Dawood, H., Chetty, U.,
Esterhuizen, T.M. and Bizaare, M. 2008.
Validation of the Accutrend® lactate
meter for hyperlactatemia screening
during antiretroviral therapy in a
resource-poor setting. Int. J. Infect. Dis.
12: 553-556.
Prince, A., Geor, R., Harris, P., Hoekstra, K.,
Gardner, S., Hudson, C. and Pagan, J.
2001. Comparison of the metabolic
พฒนพร ถาวรพฒนพงศ และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 11-21.
21
responses of trained Arabian and
Thoroughbred horses during high and
low intensity exercise. Proceedings 17th
Symposium of the Equine Nutrition and
Physiology Society, Lexington,
Kentucky, USA. pp. 267– 272.
Revold, T., Mykkanen, A.K., Karlstrom, K., Ihler,
C.F., Poso, A.R. and Essen-Gustavsson, B. 2010. Effects of training on equine
muscle fibres and monocarboxylate
transporters in young Coldblooded
Trotters. Equine Vet. J. 42(38): 289-295.
Richter, E.A. and Hargreaves, M. 2013.
Exercise, GLUT4, and skeletal muscle
glucose uptake. Physiol. Rev. 93: 993-
1017.
Serrano, M.G., Evans, D.L. and Hodgson, J.L.
2002. Heart rate and blood lactate
responses during exercise in
preparation for eventing competition.
Equine Vet. J. 34: 135-139.
Votion, D.M., Fraipont, A., Goachet, A.G., Rorert, C., VanErck, E., Amory, H.,
Ceusters, J., DeLaRebière DePouyade,
G., Franck, T., Mouithys-mickalad, A.,
Niesten, A. and Serteyn, D. 2010.
Alterations in mitochondrial respiratory
function in response to endurance
training and endurance racing. Equine
Vet. J. 42(38): 268-274.
Werkmann, J., Lindner, A. and Sasse, H.HL.
1996. Conditioning effects in horses of
exercise of a 5, 15 or 20 minutes
duration at two blood lactate
concentrations. Pferdeheikunde. 12:
474-479.
บทความวจย
สตวแพทยมหานครสาร
JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
การศกษาลกษณะและการแสดงออกของรปแบบโปรตนในปทะเล (Scylla serrata)
ทมอาการอกทองแดงระยะแรก
ภทราวด ศรมเทยน1,2,# และสรยน ธญกจจานกจ3
1ศนยเทคโนโลยชวภาพเกษตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตกาแพงแสน จ.นครปฐม 73140 2ศนยความเปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร สานกพฒนาบณฑตศกษาและวจยดานวทยาศาสตรและเทคโนโลย
สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา กรงเทพฯ 10900 3ภาควชาเพาะเลยงสตวนา คณะประมง มหาวทยาลยเกษตรศาสตร เขตจตจกร กรงเทพฯ 10900
บทคดยอ: การศกษาลกษณะของปทะเล (Scylla serrata) ทมความผดปกตในระยะแรกทมอาการอกทอง
แดง จากฟารมปทะเล ตาบลคลองโคลน อาเภอเมอง จงหวดสมทรสงคราม นามาสงเกตลกษณะอาการเปน
เวลา 7 วน พบวาวนท 1, 2 และ 3 ปมลกษณะอาการคลายกบปปกต เชน มความตองการอาหารสงและมการ
เคลอนทอยางรวดเรว แตเมอเขาสวนท 4, 5, 6 และ 7 พบวาปกนอาหารนอยลงและการเคลอนทลดลง ซง
แตกตางจากปปกต สวนลกษณะภายนอกพบวา บรเวณอกทองมสสม และรยางคขามสสมและมจดสดาคลาย
กบสนมเกาะขณะทอวยวะภายในพบวา ตบเละไมคงรป เหงอกมสสม พองบวม ปลายเหงอกมสดานอกจากน
ยงพบวากระดองแตกหกงาย เปราะบางและกรอบ เมอนาปดงกลาวมาปรงเปนอาหารพบวามรสขม สวนเลอด
ปทะเลทมอาการอกทองแดงในระยะแรก สามารถแบงออกไดเปน 2 กลมลกษณะ ไดแก กลมลกษณะแรก
เลอดมสสมอมฟา พบในปทะเลทมอาการอกทองแดง หลงจากสงเกตในวนท 1, 2 และ 3 วน และกลมลกษณะ
ทสองมเลอดสสมชดเจนพบในปทะเลทมอาการอกทองแดงหลงจากสงเกตในวนท 4, 5, 6 และ 7 วน หลงจาก
นนนาเลอดไปทาการศกษารปแบบการแสดงออกของโปรตนดวยเทคนค Sodium Dodecyl Sulphate-
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) พบวากลมลกษณะเลอดสสมชดเจนมโปรตนนาหนกโมเลกลประมาณ 137 kDa เพมขน แตกตางจากกลมลกษณะเลอดปปกตและเลอดสสมอมฟา
คาสาคญ: ปทะเล อาการอกทองแดง รปแบบโปรตน #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33. E-mail address: [email protected]
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
24
Characters and Protein Profile in the First Stage of Mud Crab (Scylla serrata)
Infected by Red Sternum Syndrome
Pattarawadee Srimeetian1,2,# and Suriyan Tunkijjanukij3
1Center for Agricultural Biotechnology, Kasetsart University, Kamphaeng Saen Campus, Nakhon Pathom,
Thailand, 73140; 2Center of Excellence on Agricultural Biotechnology: (AG-BIO/PERDO-CHE), Bangkok 10900,
Thailand; 3Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kasetsart University, Bangkok 10900, Thailand
Abstract: The first stage of mud crabs infected by red sternum symptom and normal mud
crabs were collected from a farm in Samut Songkhram province, Thailand and their used to
study in external-internal morphological characterization and their behavior. The symptoms
of red sternum syndrome showed orange color of abdominal thorax, black spots on joints and
very thin carapace. In internal organs were dark and soft as well as bitter meats. The behavior of mud crab were normal feeding and moving at 1st to 3rd day after infected by the syndrome.
While 4th to 7th day after infected found that mud crabs were lose appetite and limited moving.
The color blood of those crabs were classified into two groups; orange-blue (group I: 1st to 3rd
day) and orange (group II: 4th to 7th day). To determine the protein expression of red sternum
and normal mud crabs using Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(SDS PAGE) found that during 1st to 3rd day after red sternum syndrome infection demonstrated
that the pattern of proteins were same as normal crab, while 4th to 7th day after infection
showed that the additional protein was found compared to normal mud crab, approximately
137 kDa.
Keywords: Mud crab, Red sternum symptom, Protein profile #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 23-33. E-mail address: [email protected]
บทนา ปทะเลเปนสตว นาเศรษฐกจทสาคญของ
ประเทศไทยเนองจากมรสชาตดและมคณคาทาง
โภชนาการสง จงเปนทนยมบรโภคของทงชาวไทย
และตางประเทศ เ ชน ญ ปน แคนนาดา และออสเตรเลย เ ปนตน Department of Fisheries
(2015) รายงานการสงออกปของประเทศไทย
ประจาเดอนมกราคม-พฤษภาคม พ.ศ. 2557 มมลคา
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
25
402.76 ลานบาท ความตองการปของตลาดสงผลด
แกเกษตรผเลยงป การเลยงปทะเลนนเกษตรกรจะนา
ปเลกจากธรรมชาตมาเลยงจนไดขนาดตามทตลาด
ตองการ ไดแก ปเนอ ปไขและปนม โดยฟารมสวน
ใหญจะใชกลองในการเลยงปทะเล หนงกลองตอป
หนงตวเพอปองกนการตอสกนเองของปทะเลและ
สะดวกตอการเกบเกยว ปญหาทสาคญในการเลยงป
ทะเล เชน การขาดแคลนพนธป การลอกคราบไมสมบรณ และอาการผดปกตทบรเวณอกทองของปมส
แดงนอกจากนปทมอาการผดปกตดงกลาวยงพบวาม
การเปลยนแปลงของเลอดอกดวย โดย Areekijseree
et al. (2010) ไดแบงความผดปกตของปทะเลทม
อาการอกทองแดงซงจาแนกตามตามความรนแรงโดย
ใชลกษณะของสเลอดเปนเกณฑ โดยแบงออกไดเปน
3 ระยะดวยกนคอ ระยะแรกเลอดสสม ระยะท 2
เลอดสสมขาว และระยะท 3 เลอดมสขาวคลายนม
แตกตางจากเลอดของปปกตทใสไมมสซงเมอสมผส
กบออกซเจนจะมสฟา โดยระยะท 2 และระยะท 3
ของปทมอาการอกทองแดงนนเปนระยะทมความ
รนแรง โดยปจะมลกษณะอาการคลายเปนอมพาต
และตายภายในเวลา 24 ชวโมง (Intanakom, 2010)
Plainpun (2014) ร า ย ง า น ว า เ ช อ Vibrio parahaemolyticus ทาใหเลอดของปทะเลชนด
Scylla serrata เปลยนจากใสไมมเปนสสมโดย เมอ
อาการอกทองแดงเกดขนในปทะเล ปทมอาการ
ดงกลาวอาจจะมการเปลยนแปลงของสารชวโมเลกล
ภายในเซลล เชน สารส ไขมน คารโบไฮเดรต และ
โปรตน โดยโปรตนเปนสารชวโมเลกลทมความสาคญ
เปนอยางยงตอสงมชวต ซงโปรตนภายในเซลลจะทา
ห น าท ห ล ากหลายแตก ต า ง กน เ ชน เ อน ไซม
(enzyme) ก า ร ข จ ด ส า ร พ ษ (detoxification)
ฮอร โมน (hormone) และภม ค ม กน (immune
system) เปนตน โปรตนแตละชนดจะถกผลตและ
แ ส ด ง อ อ ก ใ น ส ภ า ว ะ ท แ ต ก ต า ง ก น อ อ ก ไ ป
( Thammasirirak, 2002) Salaenoi et al. (2006)
รายงานวาเลอดของปทะเลชนด S. serrata ทม
อาการอกทองแดง ระยะเลอดสขาวคลายนมไมพบ
ก า ร แ ส ด ง อ อ ก ข อ ง โ ป ร ต น ฮ โ ม ไ ซ ย า น น
(haemocyanin) เ ม อท าการศ กษา ด วย เทค นค
Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) ความผดปก ต
ของปทะเลทแสดงอาการอกทองแดงนไดสรางความ
เสยหายใหแกเกษตรกรผเลยงปทะเล Salaenoi et
al. (2006) รายงานการระบาดของอาการอกทองแดง
พบ 10% ในฟารมปทะเล โดยอาการผดปกตอกทอง
แดงทาใหเกษตรกรสญเสยคาจายใชและสญเสย
รายไดเนองจากปทมอาการอกทองแดงนนจะไมลอก
คราบเพอเพมการเจรญเตบโต โดยสวนมากเกษตรกร
จะทราบวาปทะเลมอาการดงกลาวเมอเขาสระยะท
รนแรงใกลตายแลวซงปจจบนขอมลและการศกษา
เกยวกบอาการผดปกตอกทองแดงในปทะเลยงม
คอนขางนอย ดงนนผ วจยจงมความสนใจศกษา
ลกษณะและอาการของปทะเลทมอาการอกทองแดง
ในระยะแรกเพอจกเปนประโยชนแกเกษตรกรนาไปสงเกตลกษณะอาการอกทองแดงของปทะเลในระยะ
เรมแรก กอนทปทะเลจะเขาสระยะทรนแรงมากขน
สามารถชวยลดความเสยหายจากอาการอกทองแดง
เชน ลดการสญเสยคาจายใชและเวลาในการเลยงป
ทะเลทมอาการดงกลาว นอกจากนยงทาการศกษา
รปแบบการแสดงออกของโปรตนในเลอดของปทะเล
ทมอาการอกทองแดง ซงจะเปนขอมลเบองตนเพอใช
ในการศกษาระดบชวโมเลกลของอาการดงกลาวในป
ทะเลตอไป โดยงานวจยนจะเปนขอมลพนฐาน
สาหรบใชเปนแนวทางในการศกษาวนจฉยอาการ
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
26
ผดปกตอกทองแดงในปทะเลเพอหาทางปองกนและ
รกษาในอนาคต
อปกรณและวธการ
การเตรยมสตวทดลอง
ทาการสารวจเกบตวอยางปทะเลจานวน 100
ตว จากฟารมปทะเล ตาบลคลองโคลน อาเภอเมอง
จงหวดสมทรสงคราม เดอนเมษายน พ.ศ. 2555 พบปทะเลเพศผและเพศเมยจานวน 5 ตว ทมอาการอก
ทองแดงในระยะแรกโดยสงเกตจากเลอดทมสสมและ
อาการผดปกตบรเวณอกทองของปทะเล ซงมขนาด
ความกวางของกระดอง 8.22±0.26 เซนตเมตร ความ
ยาว 5.70±0.19 เซนตเมตร ความหนา 3.15±0.10
เซนตเมตร และนาหนก 367±12.16 กรม และทา
การเกบปทะเลปกตเพศผและเพศเมยจานวน 5 ตว ม
ขนาดความกวางของกระดอง 8.27±0.24 เซนตเมตร
ความยาว 5.73±0.15 เ ซน ต เมตร ความหนา
3.17±0.08 เซนตเมตร และนาหนก 369.40±9.14
กรม นามาศกษาลกษณะภายนอกเชน สของบรเวณ
อกทอง จบปง และรยางคขา เปนตน หลงจากนนนา
ปลงเลยงในถงไฟเบอรทความเคม 25 สวนในพนสวน
ใหอากาศตลอดเวลา และให เ นอปลาสดขนาดประมาณ 2×1.5 เซนตเมตร เปนอาหารวนละ 1 ครง
สงเกตลกษณะอาการเปนเวลา 7 วน โดยนาปมาเจาะ
เลอดทกๆ วน ดวยเขมฉดยาเบอร 21 บรเวณโคนขา
เ ดน น า เล อด เ กบ ในหลอดพลาส ตกท ม 10%
trisodium citrate (อตราสวนเทากบ 5:1) แลวนาไป
ปนเหวยงทความเรวรอบ 12000 รอบตอนาท ท 4
องศาเซลเซยส เปนเวลา 30 นาท นาไปศกษารปแบบ
โปร ตน ดวย เทคนค SDS PAGE เม อครบ 7 วน
ทาการศกษาลกษณะภายนอกอกครง หลงจากนนทา
ใหปสลบโดยการแชในนาเยนจดเปนเวลา 3 นาท
แลวผาตดเพอศกษาอวยวะภายในการวางแผนการ
ท ด ล อ ง เ ป น แ บ บ ส ม ส ม บ ร ณ (completely
randomized design; CRD)
การวดปรมาณโปรตน
การวดปรมาณโปรตนในตวอยางเนอเยอตางๆ
ของปทะเล โดยใชวธ Bradford (Bradford, 1976)
เปรยบเทยบกบสารละลายโปรตนมาตรฐาน BSA (bovine serum albumin) วดคาดดกลนแสงทความ
ยาวคลนแสง 595 นาโนเมตร คานวณหาปรมาณ
โปรตนโดยเปรยบเทยบกบสารสาระลายโปรตน
มาตรฐาน
การแยกโปรตนดวยเทคนค SDS PAGE
นาตวอยางเลอดความเขมขนของโปรตน 5
ไ ม โ ค รก ร ม ผสมก บ 2X sample buffer (50%
glycerol, 250 mM tris-HCl buffer pH 6.8, 10%
SDS, 0.5% bromphenol blue, 0.5%
mercaptoethanol) โดยใชอตราสวน 1:1 ผสมให
เขากนนาไปตมทอณหภม 95 องศาเซลเซยสเปนเวลา
10 นาทหล งจาก นนแชใน นาแข งทนท เตรยม
separating gel (12% acrylamide) และ stacking gel (6% acrylamide) โหลดตวอยาง 10 ไมโครลตร
ลง ในหล ม เจลและ โหลดโปร ตนมาตรฐาน 5
ไมโครลตร โดยใชกระแสไฟฟาความตางศกย 70
โวลต เปนเวลา 20 นาท และกระแสไฟฟาความตาง
ศกย 120 โวลต เปนเวลา 100 นาท หลงจากนนนา
แผนเจลไปยอมดวย coomassie brilliant blue เปน
เ ว ล า 15 นาท ล า ง ด ว ย destaining solution
(methanol, acetic acid) 3 คร ง ๆ ละ 30 นาท
(Laemmli, 1970)
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
27
ผลการทดลอง
จากการเกบตวอยางปทะเลปกตและปทะเลใน
ระยะแรกทมอาการอกทองแดง จากฟารมปทะเล
นามาสงเกตลกษณะและอาการเปนเวลา 7 วน จาก
การศกษาสงเกตลกษณะอาการของปปกตเปนเวลา 7
วน พบวาปมลกษณะดรายมาก โดยแสดงอาการ
ตางๆ ดงน ชกามและกระโดดหนบสงทเขาไปกระตน
ไดอยางรวดเรวและทนททนใด มการตอสเพอปองกนตว เคลอนทไดอยางคลองแคลวและวองไว ปราด
เปรยว ปนปาย กนอาหารปลาสดหมดทก วน
นอกจากนยงพบวาเลอดของปปกตมเลอดใสไมมส
เมอสมผสกบออกซเจนจะมสฟา (Figure 1A, B, C,
D, E, F, G: a) เมอทาการศกษาอาการของปทะเล
หลงจากทมอาการอกทองแดงในระยะแรกสงเกต
ลกษณะอาการเปนเวลา 7 วน พบวาวนท 1, 2 และ
3 ปมการกนอาหารและการเคลอนทคลายคลงกบป
ปกต เชน ความดราย การตอบสนองตอสงทเขาไป
กระ ตนอยางรวดเร ว มการ ปนปาย เคล อนท
คลองแคลว กนอาหารหมด เมอสงเกตลกษณะของ
เลอดพบวาเลอดมสสมอมฟา (Figure 1A, B, C: b)
เมอทาการสงเกตในวนท 4, 5, 6 และ 7 พบวาปม
การกนอาหารนอยลง การเคลอนทลดลง ไมปนปาย มการยกชกามขนมาปองกนตวเอง เมอมสงกระตน
พยายามหลบซอนตวและหลบเลยงจากการตอส ไมม
การกระโดดหนบสงทเขาไปกระตน ลกษณะของ
เลอดพบวามสสมชดเจน (Figure 1D, E, F, G: b)
การศกษาลกษณะภายนอกกอนและหลง 7
วน ของปปกตพบวามลกษณะเหมอนกน คอทวทง
บรเวณอก ทอง และจบปง มสขาว (Figure 2A) สวน
อวยวะภายในทาการศกษาหลงเลยงได 7 วน พบวา
ตบจะคงรป เหงอกสดสขาวสะอาด และฉา นา
(Figure 2B) สวนรยางคขามสเงน (Figure 2C) และ
เนอบรเวณโคนขามสขาวขนปปกตกระดองมลกษณะ
หนาและแขงมาก ดานในของกระดองมสเทาอมเงน
(Figure 2D) สวนปทะเลในระยะแรกทมอาการอก
ทองแดง เมอนามาศกษาลกษณะและอาการ พบวา
ลกษณะภายนอกกอนและหลง 7 วน มลกษณะ
เหมอนกนคอบรเวณอกทองพบวามสสม โดยมสสม
เดนชดทบรเวณจบปง (Figure 3A) รยางค ขามสสม
อมชมพ (Figure 3C) นอกจากนบรเวณบรเวณโคนรยางคขายงพบวามจดสดาคลายกบสนมเกาะและ
เนอบรเวณโคนขามสสม สวนอวยวะภายในของป
ทะเลหลงจากทมอาการอกทองแดงเปนเวลา 7 วน
พบวาตบเละไมคงรป หวใจมสสมคลา เหงอกมสสม
พอง หลวม และคอนขางแหง สวนตรงบรเวณปลาย
เหงอกมสดา (Figure 3B) เมอใชกรรไกรตดกระดอง
พบวามลกษณะแตกงาย บางและกรอบ นอกจากนยง
พบวาลกษณะของเนอเยอใตกระดองจะรอนออกจาก
กระดองโดยงาย ไมตดกระดอง สวนดานในของ
กระดองมสสม (Figure 3D) นอกจากนยงพบวาเมอ
นามาทาใหสกและปรงเปนอาหารพบวามรสขม
Figure 1 Blood color changing of mud crab during 7
days; day 1 (A), day 2 (B), day 3 (C), day 4 (D), day 5
(E), day 6 (F) and day 7 (G), (a) Normal mud crab and
(b) the first stage of mud crab infected by red
sternum syndrome
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
28
Figure 2 Appearance of the normal mud crab. The
sternum was white and hard shell (A).The heart (h),
hepatopancreas (hep), and gills (g) were normal
(B).The legs were gray color (C). The carapace was
gray color (D).
Figure 3 Appearance of the red sternum mud crab.
The sternum was orange, especially orange
abdomen (a) and easily broken shell (A). The heart
(h) and gills (g) changed to orange. The
hepatopancreas (hep) were soft and unshaped (B).
The legs were orange color (C). The carapace was
orange color (D).
จากการศกษาลกษณะของเลอดปทะเลในระยะแรกทมอาการอกทองแดง สามารถแบงเลอด
ของปทะเลออกไดเปน 2 กลมลกษณะไดแก กลม
ลกษณะแรกเลอดทมสสมอมฟาซงพบในวนท1, 2
และ 3 หลงจากทปทะเลมอาการอกทองแดง และ
กลมลกษณะทสองเลอดมสสมอยางชดเจน ซงพบใน
วนท 4, 5, 6 และ7 วนหลงจากทปทะเลมอาการอก
ทองแดง หลงจากนนนาเลอดทง 2 กลมลกษณะมา
ทาการศกษารปแบบโปรตนดวยเทคนค SDS PAGE
บน 12% acrylamide gel ความเขมขนของโปรตน 5 ไมโครกรม โดยเทยบกบเลอดของปปกตทปรากฏส
ฟาเมอสมผสกบออกซเจน ผลการศกษาพบวากลม
ลกษณะเลอดทมสสมอมฟา มรปแบบโปรตนท
เหมอนกนกบเลอดของปปกต สวนกลมลกษณะทม
เลอดสสมอยางชดเจนมรปแบบโปรตนทแตกตาง
ออกไป พบวามการแสดงออกของโปรตนทนาหนก
โมเลกล (molecular weight)ประมาณ 137 กโล
ดาลตน (kDa) เพมขน โดยไมพบการแสดงออกของ
โปรตนทนาหนกโมเลกลดงกลาวในเลอดปปกตและ
เลอดสสมอมฟาของปทมอาการอกทองแดงระยะแรก
(Figure 4)
สรปและวจารณผล
ผลการศกษาพบวาปทมอาการอกทองแดงในระยะแรกนน กระดองจะเปราะและบาง ซงคลายกบ
โรค shell disease หรอ black spot ททาใหปชนด
Cancer pagurus เปนจดสดาทวโครงราง มสาเหต
มาจากการตดเชอกลม chitinolytic bacteria เชน
Aeromonas sp. แ ล ะ Vibrio sp. เ ป น ต น โ ด ย
แบคทเรยกลมนจะผลตเอนไซมไคตเนส (chitinase)
ซงทาหนาทในการยอยสลายไคตน (chitin) (Vogen
et al., 2002) โดยกระดองของป นนม ไคตนเปน
องคประกอบทสาคญ ซงทาใหโครงรางมความแขง
(Merzendorfer and Zimoch, 2003) ดง นนเมอม
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
29
การยอยสลายไคตนจงทาใหไคตนในกระดองของป
ลดลงกวาปปกตสงผลใหกระดองของปมลกษณะผ
กรอนและแตกหกงาย (Ayres and Edwards, 1982)
นอกจากนลกษณะจดสดาคลายสนมเกาะทรยางคขา
ของปทมอาการอกทองแดงนนอาจเกดจากการทเมด
เลอดเขาไปลอมรอบเพอทาลายเชอโรคซงทาใหเกดม
ลกษณะทเปนจดสดา (Noga et al., 1994)
สวนลกษณะภายนอกของปทมอาการอกทองแดงในระยะแรกนน พบวาบรเวณอกทอง รยางคขา
ของปทะเลทมอาการอกทองแดงพบวามสสม คลาย
ก บ โ ร ค pink crab disease ซ ง เ ป น โ ร ค ท ม
เปลยนแปลงปรมาณสารสทาใหอกและทองของป
ชนด C. pagurus เปลยนเปนสชมพ เมอนาปทม
อาการอกทองแดงมาทาใหสกและปรงเปนอาหาร
พบวามรสขม คลายกบโรค bitter crab disease
(Meyers et al., 1987) โดยโรคนทาใหเนอปชนด
Chionoecetes bairdi มรสขมซงมสาเหตมาจาก
ป ร ส ต (dinoflagellate) ส ก ล Hematodinium
ขณะ ท Taylor et al. (1996) ร า ย ง าน ว า เ ม อ
Hematodinium เ ข า ส ก ง ช น ด Nephrops
horvegicus แล ว นน Hematodinium จะอาศ ย
โปรตนและคารโบไฮเดรตในรางกายของกงเปนแหลงอาหาร ซงจะทาใหโปรตนและคารโบไฮเดรตในกงม
การเปลยนแปลง ดงนนอาจเปนเปนไปไดวาปทม
อาการอกทองแดง เมอนามาประกอบอาหารแลวมรส
ขม อาจมสาเหตเกดจากการเปลยนแปลงของโปรตน
และคารโบไฮเดรตในเนอเยอนนเอง นอกจากนเลอด
ของปทมอาการอกทองแดงคลายกบโรค milky
blood disease โดยโรคนจะทาใหเลอดมลกษณะ
ค ล า ย น ม (milky hemolymph) ใ น ก ง ช น ด
Exopalaemon carinicauda (Xu et al., 2010) ซง
มสาเหตมาจาก Hematodinium และยงทาใหปชนด
Paralithodes camtschaticus แ ล ะ ป ช น ด P.
platypus เปลยนจากเลอดใสไมมสเปนเลอดทม
ลกษณะคลายครม (cream colored) (Ryazanova,
2008) อกดวย
Figure 4 Lane M) molecular markers, Lane N) the
blood of normal mud crab. The blood in the first
stage of mud crab infected by red sternum
syndrome Lane O1) day 1, Lane O2) day2, Lane O3)
day3, Lane O4) day 4, Lane O5) day 5, Lane O6) day
6 and Lane O7) day 7
จากผลการศกษาพบวาเลอดของปทมอาการ
อกทองแดงในระยะแรกนน สามารถแบงตามลกษณะ
ของสเลอดออกไดเปน 2 กลมลกษณะ ไดแก กลม
ลกษณะเลอดทมสสมอมฟาและกลมลกษณะทมเลอด
สสมอยางชดเจน สวนพฤตกรรมพบวาปทมอาการอก
ทองแดงระยะแรกกลมเลอดสสมอมฟามพฤตกรรม
คลายคลงใกลเคยงกบปปกต สวนกลมลกษณะทม
เลอดสสมอยางชดเจนพบวามพฤตกรรมทแตกตาง
จากปปกต Srimarksuk (2012) รายงานวาลกษณะ
การแสดงออกของพฤตกรรมจะสมพนธกบความ
รนแรงของอาการปวยในกงชนด Litopenaeus
vannamei ส ว น Costa-Ramos and Rowley
(2004) พบวา ปชนด C. pagurus เม อ ไ ดรบ เ ชอ
Pseudoalteromonas atlantica ป จ ะ เ ร ม ก น
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
30
อาหารลดลง การเคลอนทลดลง ในเวลาตอมาจะไม
กนอาหาร ไมสามารถเคลอนทหรอเคลอนไหวไดและ
ตายลงในทสด จากผลการทดลองพบวาปทมอาการ
อกทองแดงระยะแรกกลมลกษณะเลอดทมสสมอมฟา
เกดขนในชวงวนท 1-3 (ปวนท 1-3 มพฤตกรรม
เหมอนกน) ซงอาจเปนไปไดวาปยงไมแสดงอาการ
ปวย โดยสงเกตจากลกษณะพฤตกรรมทคลายกบป
ปกต แตเมอเขาสวนท 4-7 (ปวนท 4-7 มพฤตกรรมเหมอนกน) พบวาปมพฤตกรรมการกนอาหารและ
การเคลอนทลดลง ซงอาจเปนไปไดวาปเรมทจะแสดง
อาการปวยเกดขน Nonwachai (2010) รายงานวา
กงชนด L. vannamei หลงจากไดรบเชอแบคทเรย
V. harveyi จะมพฤตกรรมอาการเชนเดยวกบกงปกต
แตหลงจากชวโมงท 24 หลงจากไดรบเชอแบคทเรย
ดงกลาว กงจะเรมแสดงลกษณะอาการปวย โดย
พฤตกรรมอาการของกงปวยคอจะไมมปฏกรยา
ตอบสนองตอสงเราตางๆ ไมวายนาและตายในทสด
นอกจากนในกงปวยดงกลาวยงพบวามการสรางเมลา
นน (melanin) แทรกทกลามเนอแตไมพบเมลานนใน
กงปกต ซงเมลานนดงกลาวเกดขนหลงจากทาการ
เหนยวนาเชอแลวเปนเวลา 24 ชวโมง โดยเมลานน
เปนสารสดาทมชวยในการยบยงและปองกนการเจรญเตบโตของแบคทเรยและเชอรา (Söderhäll
and Cerenius 1998) Somboonwiwat et al.
(2010) ยงพบวากงชนด Penaeus monodon หลง
ทาการเหนยวนาดวยเชอ V. harveyi กงจะเรมแสดง
อาการปวยในชวโมงท 24 เปนตนไป นอกจากนกงท
มอาการปวยในชวโมงท 24 และ 48 ยงพบวามการ
ผลตรปแบบโปรตนทเหมอนกนอกดวย ดงนนอาจ
เปนไปไดวาหลงจากทปมอาการอกทองแดง ปจะเรม
ทจะแสดงลกษณะอาการปวยในวนท 4-7 ซงวนท
4-7 ปดงกลาวมพฤตกรรมเหมอนกนและมเลอดทม
ลกษณะสสมอยางชดเจนเหมอนกน ซงอาจเปนไปได
วาตงแตวนท 4-7 มความรนแรงของอาการอกทอง
แดงในปทะเลเทาเดม โดยเลอดของปทมอาการอก
ทองแดงวนท 4-7 มการแสดงออกของโปรตนขนาด
ป ร ะ ม าณ 137 kDa เ พ ม ข น เ ห ม อ น ก น เ ม อ
ทาการศกษาดวยเทคนค SDS PAGE ซงไมพบขนาด
โปรตนดงกลาวในกลมเลอดทมสสมอมฟา (วนท 1-3)
และปปกต Plainpun (2014) รายงานวาเลอดของปชนด S. serrata ทมอาการอกทองแดงระยะเลอดส
ชานม (ระยะทสอง) พบการแสดงออกของโปรตน
ขนาดประมาณ 70 และ 53 kDa แตไมพบการ
แสดงออกของขนาดโปรตนดงกลาวในปปกต สวน
Qiao et al. (2011) พบโปรตนขนาดประมาณ 188
kDa ซงเปนโปรตน hemlymph clottable protein
ใ น เ ล อ ด ขอ งก ง ช น ด L. vannamei ท ท า ก า ร
เหนยวนาดวยเชอ V. parahemolyticus แตไมพบ
โปรตนดงกลาวในปปกต hemlymph clottable
protein เปนโปรตนทเกยวของกบระบบภมคมกน
โดยโปรตนดงกลาวทาหนาทในกระบวนการการ
แขงตวของเลอด ซงจะชวยในการปองกนการสญเสย
เลอดของรางกาย (Martin et al., 1991) ดงนนอาจ
เปนไปไดวาโปรตนทพบในเลอดของปทมอาการอกทองแดงระยะแรกแตไมพบในปปกต อาจเปนโปรตน
ทถกผลตออกมาเพอทาหนาทในการตอบสนองตอ
อาการอกทองแดงในปทะเล Liu et al. (2011)
ศกษาการแสดงออกของโปรตนทการตอบสนองตอ
เชอไวรสตวแดงดวงขาว (white spot syndrome
virus) ของปชนด S. serrata พบโปรตน catalase,
cryptocyanin และ heat shock protein 90-2 ท
ถกแสดงออกมาเพอทาหนาทในการตอบสนองตอเชอ
ไวรสดงกลาว สวน Somboonwiwat et al. (2010)
ร า ย ง าน ว า ก ง ช น ด P. monodon เ ม อ ท า ก า ร
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
31
เหนยวนาดวยเชอ V. harveyi จะมการแสดงออก
ของโปรตนทแตกตางจากกงทไมไดเหนยวนาเชอ
ดงกลาว
จากการศกษารปแบบโปรตนในปทมอาการอก
ทองแดงระยะแรกดวย SDS PAGE ซงเปนเทคนคท
ใ ช ในการแยก นาหนกโมเล กลของโปรตน ผล
การศกษาในครงนทาใหทราบถงปทมอาการอกทอง
แดงระยะแรก กลมทมเลอดลกษณะสสมชดเจนเทานนทมการแสดงออกของโปรตนทแตกตางจากป
ปกต ซงเปนขอมลพนฐานทสาคญทอาจจะนากลม
ลกษณะเลอดสสมชดเจนไปศกษาโปรตนดวยเทคนค
อนทสามารถทาการแยกไดทงนาหนกโมเลกลและคา
Isoelectric point (pI) ของโปรตน ซง pI เปนคาท
เฉพาะของโปรตนหนงๆ หรออาจกลาวไดวาโปรตน
แตละชนดจะมคา pI ทแตกตางกน (Klose, 1975)
เพอนาไปใชในการศกษาเพมเตมใหทราบถงชนดของ
โปรตนทแสดงออกในปทะเลกลมลกษณะเลอดทมส
สม แตไมแสดงออกในกลมลกษณะเลอดสมอมฟา
และเลอดปทะเลปกตตอไป
จากผลการศกษานจะเปนขอมลเบองตนทจะ
ชวยใหเกษตรกรสามารถนาไปใชสงเกตอาการ
ระยะแรกของปทมอาการอกทองแดง โดยสงเกตไดจากลกษณะภายนอก และอาการตางๆ ของปทะเล
นอกจากนอาจมการตรวจสอบลกษณะของสเลอด
เพมเตม (อาจโดยการตดทปลายขาเพยงเลกนอยของ
ปทะเล) เพอทเกษตรจะไดทาการแยกคดทงปทม
อาการดงกลาวกอนทจะนาลงเลยงในบอหรอในกลอง
และยงสามารถนาไปสงเกตในชวงระหวางการเลยงป
ทะเลไดดวยเชนกน ซงจะทาใหเกษตรกรลดการ
สญเสยคาใชจายในการเลยงปทะเลทมอาการอกทอง
แดง เนองจากปทมอาการนจะไมลอกคราบและเมอ
เขาสระยะทรนแรงปทมอาการดงกลาวจะตายในทสด
นอกจากนการศกษาการแสดงออกของรปแบบ
โปรตนยงเปนขอมลพนฐานเพอใชเปนแนวทางใน
การศกษาวนจฉยปทะเลทมอาการอกทองแดง
ทางดานชวโมเลกลตอไปในอนาคต
กตตกรรมประกาศ
งานวจยนไดรบการสนบสนนจากศนยความ
เปนเลศดานเทคโนโลยชวภาพเกษตร สานกพฒนาบณฑตศ กษาและ วจ ย ด าน วทยาศาสตร และ
เทคโนโลย สานกงานคณะกรรมการการอดมศกษา
กระทรวงศกษาธการ สานกงานคณะกรรมการวจย
แหงชาต ประเภททนบณฑตศกษา สญญาเลขท
กบง./2557-อ6.03 ทนพฒนาอาจารยและบคลากร
สาหรบสถาบนอดมศกษาในเขตพฒนาเฉพาะกจ
จงหวดชายแดนภาคใตสานกงานคณะกรรมการการ
อดมศกษากระทรวงศกษาธการ สญญาเลขท
21/2554
เอกสารอางอง
Areekijseree, M., Chuen-I, T. and Panyarachun,
B. 2010. Characterization of red sternum
syndrome in mud crab farms from Thailand. Biologia (Section Zoology).
65(1): 150-156.
Ayres, P. and Edwards, E. 1982. Notes on the
distribution of ‘‘black spot” shell
disease in crustacean fisheries. J. Chem.
Ecol. 1: 125-130.
Bradford, M.M. 1976. A Rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
32
the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem.72: 248-254.
Costa-Ramos, C. and Rowley, A. F. 2004. Effect
of Extracellular Products of Pseudo-
alteromonas atlantica on the Edible
Crab Cancer pagurus. Appl. Environ.
Microbiol. 70(2): 729-735.
Department of Fisheries. 2015. http://www. fisheries.go.th/. 12 December 2015.
Intanakom, J. 2010. Study on morphological,
bacterial identification and histology in
mud crab (Scylla sp.) with red thoracic-
abdominal syndrome. The thesis of
Kasetsart University.Bangkok. 93 p. (in
Thai)
Klose, J. 1975. Protein mapping by combined
isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to
testing for induced point mutations in
mammals. Humangenetik. 26(3): 231-243.
Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural
proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227:
680-685.
Liu, W., Qian, D. and Yan, X. 2011. Protemic
analysis of differentially expressed
proteins in hemolymoh of Scylla
serrata response to white spot
syndrome virus infection. Aquaculture.
314: 53-57.
Martin, G.G., Hose, J.E., Omori, S., Chong, C.,
Hoodbhoy, T. and McKrell, N. 1991.
Localization and roles of coagulogen and
transglutaminase in hemolymph
coagulation in decapods crustaceans.
Comp Biochem Physiol. 100(B): 517-522.
Merzendorfer, H. and Zimoch, L. 2003. Chitin
metabolism in insects: structure,
function and regulation of chitin
synthases and chitinases. J. Exp. Biol. 206: 4393-4412.
Meyers, T.R., Koeneman, T.M., Botelho, C. and
Short, S. 1987. Bitter crab disease: a
fetal dinoflagellate infection and
marketing problem for Alaska tanner
crabs Chionoecetes bairdi. Dis. Aquat.
Organ. 3: 195-216.
Noga, E.J., Engel, D.P., Arroll, T.W., McKenna S.
and Davidian, M. 1994. Low serum
antibacterial activity coincides with
increased prevalence of shell disease in
blue crabs Callinectes sapidus. Dis.
Aquat. Organ. 19: 121-128.
Nonwachai, T. 2010. Growth, survival and non-specific immune characteristics of
pacific white shrimp (Litopenaeus
vannamei) fed with supplement
Sehizochytrium sp. and ARA containing
diets, and challenged with Vibrio
harveyi. The thesis of Kasetsart
University.Bangkok. 113 p. (in Thai)
Plainpun, N. 2014. Induction of red thoracic –
abominal syndrome with bacteria
isolated from mud crab (Scylla sp.). The
ภทราวด ศรมเทยน และสรยน ธญกจจานกจ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 23-33.
33
thesis of Kasetsart University. Bangkok.
121 p. (in Thai)
Qiao, J., Du, Z., Zhang Y., Du H., Guo L., Zhong
M., Cao J. and Wang X. 2011. Proteomic
identification of the related immune-
enhancing proteins in shrimp
Litopenaeus vannamei stimulated with
vitamin C and Chinese herbs. Fish & Shellfish Immunol. 31: 736-745.
Ryazanova, T.V. 2008. Bitter crab syndrome in
two species of king crabs from the Sea of
Okhotsk. Russ. J. Mar. Biol. 34: 411-414.
Salaenoi, J., Sangcharoen, A., Thongpan, A. and
Mingmuang, M. 2006. Morphology and
haemolymph composition changes in
red sternum mud crab (Scylla serrata).
KasetsartJ. (Nat. Sci.) 40: 158-166.
Söderhäll, K. and Cerenius, L. 1998. Role of
the prophenoloxidase-activating
system in invertebrate immunity. Curr
Opin Immunol. 10: 23-28.
Somboonwiwat, K., Chikeeratisak, V., Wang, H.C., Lo F.C. and Tassanaka, A. 2010.
Proteomic analysis of differentially
expressed proteins in Penaeus
monodon hemocytes after Vibrio
harveyi infection. Proteome Sci. 8: 1-11.
Srimarksuk A. 2012. Growth, survival, non-
specific immune characteristics and
resistance to Vibrio harveyi of pacific
white shrimp (Litopenaeus vannamei)
fed with yeast cell debris. The thesis of
Kasetsart University.Bangkok. 114 p.
Stentiford, G.D., Green, M., Bateman, K., Small,
H.J., Neil, D.M. and Feist, S.W. 2002.
Infection by a hematodinium-like
parasitic dinoflagellate causes pink crab
disease (PCD) in the edible crab Cancer
pagurus. J. Invertebr. Pathol. 79: 179-191. Taylor, A.C., Field, R.H. and Parslow-Williams,
P.J. 1996. The effects of Hemato-
diniumsp infection on aspects of the
respiratory physiology of the Norway
lobster, Nephrops norvegicus (L.). J. Exp.
Mar. Biol. Ecol. 207: 217-228.
Thammasirirak, S. 2002. Proteomics. KKU Sci.
J. 30(3): 160-168. (in Thai)
Vogan, L. C., Costa-Ramos, C. and Rowley, A.
F. 2002. Shell disease syndrome in the
edible crab, Cancer pagurus – isolation,
characterization and pathogenicity of
chitinolytic bacteria. Microbiology.
148:743-754. Xu,W., Xie, J.,Shi H. and Li, C. 2010.
Hematodinium infections in cultured
ridgetail white prawns, Exopalaemon
carinicauda, in eastern China.
Aquaculture. 300: 25-31.
บทความวชาการ
สตวแพทยมหานครสาร
JOURNAL OF MAHANAKORN VETERINARY MEDICINE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
การสญเสยแคปซลของเชอ Streptococcus suis
ณฐกานต มขนอน1,#
1ภาควชาเทคนคการสตวแพทย คณะเทคนคการสตวแพทย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร 10900
บทคดยอ: เชอ Streptococcus (S.) suis เปนเชอตดตอจากสตวสคนทสาคญ ซงสามารถกอใหเกดโรคได
หลากหลาย โดยเฉพาะอยางยงภาวะเยอบสมองอกเสบทพบไดทงในสกรและมนษย โดยผปวยทหายจากภาวะ
น มกเกดอาการหหนวกอยางถาวรตามมา จากการศกษาเกยวกบปจจยทเกยวของกบความรนแรงของการเกด
โรค พบวาแคปซลเปนปจจยหนงทสาคญททาใหเกดโรคทรนแรงได และจากความแตกตางกนของแอนตเจน
บนผวแคปซลของเชอ ทาใหสามารถแบงเชอ S. suis ไดหลายซโรไทป อยางไรกตาม การพบเชอทไมสามารถ
จาแนกซโรไทปได ไดเพมจานวนมากขน ซงการสญเสยแคปซลจดเปนสาเหตหนงททาใหเชอไมสามารถจาแนก
ซโรไทปได ทงน สาเหตของการสญเสยแคปซลสามารถเกดไดจากการเปลยนแปลงของยนทเกยวของกบการ
สรางแคปซล นอกจากนยงพบวา เชอ S. suis ทสญเสยแคปซลมความสามารถในการยดเกาะและการสรางไบ
โอฟลมเพมขน เนองจากการยดเกาะเซลลโฮสตถอเปนขนตอนเรมแรกในกระบวนการกอโรคจากการตดเชอ S.
suis การสญเสยแคปซลของเชอจงอาจเปนขนตอนสาคญทเกยวของกบการเกดความรนแรงของการตดเชอทง
ในสกรและมนษย
คาสาคญ: Streptococcus suis แคปซล ความรนแรง #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68. E-mail address: [email protected]
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
58
Loss of Capsule in Streptococcus suis
Nattakan Meekhanon1,#
1Department of Veterinary Technology, Faculty of Veterinary Technology, Kasetsart University,
Bangkok, 10900, Thailand
Abstract: Streptococcus (S.) suis is an important zoonotic pathogen. It can cause various
diseases, particularly meningitis in swine and human. Most patients recovering from meningitis
further develop permanent deaf. Among the proposed virulence factors described so far,
capsule is thought to be a significant factor contributing to severe diseases. According to the
antigenicity of the capsular polysaccharides, S. suis can be classified into different serotypes.
However, the nontypeable S. suis has increasingly been reported. The loss of capsule in S.
suis, which results in being the nontypeable strain, can be caused by the alteration of gene(s)
in a group of capsular polysaccharide synthesis genes. In addition, the non-encapsulated cells
were reported to have greater adherence and biofilm formation abilities than those of the
encapsulated cells. Since the adherence to host cell has been considered as the initial step for the pathogenesis of S. suis infection, the loss of capsule in S. suis may play an important
role in the severe infection in both swine and human.
Keywords: Streptococcus suis, Capsule, Virulence #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 57-68. E-mail address: [email protected]
บทนา
เ ชอ Streptococcus (S.) suis เ ปนเ ชอ
แบคทเรยทสามารถตดตอจากสตวสคนทสาคญ และ
กอใหเกดโรคทกระทบตอการทางานหลายระบบใน
รางกาย โดยเชอนสามารถพบไดบรเวณทางเดน
หายใจสวนตน โดยเฉพาะทตอมทอนซลและชองจมก
ของสกรสขภาพด บรเวณระบบสบพนธและทางเดน
อาหาร รวมทงบรเวณตอมนาลาย (Arends et al.,
1984; Gottschalk and Segura, 2000;
Padungtod et al., 2010) โดยอาจพบสกรในฟารม
ทเปนพาหะของเชอไดตงแต 0 - 100% (Clifton-
Hadley et al., 1986) แม วา อตราดงกลาวยงไม
พบวามความสมพนธกบระดบของโรคทเกดขนใน
ฟารม (Wisselink et al., 1999) แตสกรทเปนพาหะ
กจดวามบทบาทสาคญในการแพรกระจายของเชอ
ภายในฟารม
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
59
เชอ S. suis สามารถแบงไดหลายซโรไทป โดย
อาศยความแตกตางกนของแอนตเจนบนผวของ
แคปซลของเชอ จากรายงานทผานมาพบวาซโรไทป
2 เปนซโรไทปทพบไดมากทสดในการตดเชอทงใน
สกรและมนษย (Higgins and Gottschalk, 2006)
แมวาแคปซลจะจดเปนปจจยสาคญทกอใหเกดความ
รนแรง (virulence factor) ของการตดเชอ S. suis
(Baums and Valentin-Weigand, 2009; Fittipaldi et al., 2012) แตปจจบนมรายงานเกยวกบการพบ
เชอ S. suis ท ไมสามารถจดอยในซโรไทปใดได
รวมทงเชอ S. suis ทปราศจากแคปซลเพมขน ซง
การศกษาเกยวกบการสญเสยแคปซลของเชอ S. suis
น อาจนาไปสความรใหม ตลอดจนสามารถทาใหเกด
ความเขาใจในกระบวนการเกดโรคจากการตดเชอน
ไดดยงขน
การตดเชอ S. suis ในสกรและมนษย
สาหรบในสกร พบรายงานการตดเชอ S. suis
ในหลายประเทศทวโลก เชนสหรฐอเมรกา แคนาดา
บราซล สหราชอาณาจกร เบลเยยม เดนมารค
นอรเวย ออสเตรเลย และนวซแลนด รวมทงหลาย
ประเทศในทวปเอเชย ไดแก จน ฮองกง ญ ปน เวยดนาม และไทย (Staats et al., 1997; Wertheim
et al., 2009) การแพรกระจายของเชอภายในฟารม
นนสวนหนงเกดจากการถายทอดเชอจากแมสกรสลก
สกรผานทางมดลกหรอชองคลอด และสวนใหญมก
พบการแพรกระจายของเชอเมอลกสกรหลายตวถก
ยายเขามาเลยงรวมกนในชวงของการหยานม (Staats
et al., 1997) โดยอาการหลกทพบ คอ ภาวะเยอหม
สมองอกเสบ นอกจากนอาการทางคลนกอนทมกพบ
ไดบอย คอ ขออกเสบ เยอบหวใจอกเสบ และปอด
อกเสบ (Gottschalk et al., 2007) ทงนหากไมทา
การรกษาอาจพบอตราการตายไดถงรอยละ 20
(Cloutier et al., 2003)
สวนใหญเชอทแยกไดจากสกรปวยมกจากดอย
เพยงบางซโรไทป นอกจากซโรไทป 2 ซงเปนซโรไทป
ทพบบอยในเชอทกอใหเกดโรคในสกรแลว ยงพบเชอ
S. suis ซโรไทป 1, 9, 14 และ 1/2 ในประเทศใน
แถบทวปยโรป (Princivalli et al., 2009; Wisselink
et al., 2000) ซโรไทป 1, 7, 8, 9, 11 และ 14 ในประเทศบราซล (Costa et al., 2005) และซโรไทป
1, 3, 4, 5, 7, 8 และ 1/2 ในประเทศจน (Wei et al.,
2009) อยางไรกตาม จากการศกษาการตดเชอ S.
suis ในสกรของประเทศแคนาดา (Gottschalk et
al., 2013) พบเชอ S. suis ซโรไทป 2 จานวนไมมาก
เมอเทยบกบเชอทแยกไดจากในประเทศอน แสดงให
เหนวา ความแตกตางของซโรไทปทพบในประเทศท
ตางกนนอาจสงผลมาจากสภาพภมศาสตรในแตละ
พนท นอกจากน ยงพบวา ซโรไทปของเชอทแยกได
จากผปวยนนมกเปนซโรไทปเดยวกนกบเชอทมกแยก
ไดจากสกรในพนทนนๆ ซงชใหเหนถงความสาคญ
ของปญหาทางสาธารณสขของการตดเชอ S. suis
จากสกรสมนษยได
การรายงานผปวยตดเชอ S. suis เกดขนครงแรกทประเทศเดนมารคในป ค.ศ. 1968 หลงจากนน
กพบผปวยตดเชอนจานวนเพมขนในหลายประเทศ
โดยเฉพาะอยางยงประเทศทมการเลยงสกรกนอยาง
หนาแนน (Wertheim et al., 2009) และในชวงฤด
รอนของป ค.ศ. 2005 ไดมการระบาดครงใหญของ
การตดเชอ S. suis ซโรไทป 2 ในมนษย เกดขนใน
มณฑลเสฉวน ประเทศจน ทาใหพบผปวยตดเชอ
จานวน 215 คน และมผเสยชวต 39 ราย โดยอาการ
ของผปวยทพบจากการระบาดครงนไดแก การตดเชอ
ในกระแสเลอด ภาวะเยอหมสมองอกเสบ และ
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
60
ภาวะชอค (streptococcal toxic shock syndrome)
ซงคาดวาผปวยไดรบเชอโดยตรงผานทางเลอดหรอ
เนอเยอของสกรท ตดเชอ (Yu et al., 2006) และ
นอกจากการระบาดในครงนแลว ยงมรายงานการตด
เชอนในคนอยอยางตอเนองในหลายประเทศทวโลก
รวมทงประเทศไทยเองกพบผปวยทตดเชอ S. suis
เปนจานวนมาก โดยพบการรายงานจานวนผตดเชอ
ในประเทศไทยมากทสดเปนอนดบ 3 ของโลก รองจากจนและเวยดนาม (Wertheim et al., 2009)
สาหรบการตดเชอจากสกรสมนษยนนอาจเกดจาก
การไดรบเชอโดยตรงจากสกรปวย สกรทเปนพาหะ
หรอเนอสกรทปนเปอนเชอ ผานทางบาดแผลท
ผวหนงหรอบร เวณเ ยอเมอก ดง นนผทท างาน
เกยวของกบสกรหรอเนอสกร เชน เกษตรกรผเลยง
สกร ผททางานในโรงฆาสตว ผ ชาแหละเนอสกร
ผตรวจเนอ สตวบาล สตวแพทยและผจบตองเนอสกร
ดบ จงเปนผทมความเสยงในการตดเชอน (Lun et
al., 2007) นอกจากน ยงพบรายงานการแยกเชอ S.
suis ไดจากกระดก ตอมทอนซล ลนและหางสกรใน
ตลาดของประเทศฮองกง (Ip et al., 2007) และการ
แยกเชอ S. suis ไดจากเนอและเครองในสกรท
จาหนายในประเทศญปน (Arai et al., 2015) อกทงผปวยตดเชอสวนใหญทพบทงในประเทศไทยและ
เวยดนามมกมสาเหตจากการบรโภคเนอสกรหรอ
ผลตภณฑจากสกรทปรงไมสก (Fongcom et al.,
2009; Nghia et al., 2011; Takeuchi et al., 2012)
ดงนน การบรโภคเนอหรอผลตภณฑจากสกรทปรงไม
สกนนจงเปนอกสาเหตหนงทมความสาคญกบการ
ระบาดของเชอน
สาหรบการตดเชอในผปวยนนสวนมากมกพบ
ภาวะเยอหมสมองอกเสบ นอกจากนยงอาจพบภาวะ
ตดเชอในกระแสเลอด เยอบหวใจอกเสบ ขออกเสบ
และปอดอกเสบ (Segura, 2009) โดยอาการทพบได
บอยในผปวยทหายจากภาวะเยอหมสมองอกเสบ คอ
อาการหหนวกซงมความรนแรงแตกตางกน และสวน
ใหญไมสามารถรกษาใหหายได แมวาในการศกษา
ของ Tan et al. (2010) จะพบวาอาการหหนวกท
เกดขนในผปวยตดเชอ S. suis นาจะเปนผลจากการ
เกดห ชนในอกเสบแบบมเลอดออก แตสาเหตท
แทจรงของการเกดหหนวกหลงจากตดเชอ S. suis น น ย ง ไ ม ท ร า บ แ น ช ด ( Choi et al., 2 0 1 2 ;
Gottschalk et al., 2007) นอกจากซโรไทป 2 แลว
ยงพบรายงานผปวยตดเชอ S. suis ซโรไทป 1, 4, 5,
14, 16, 21 และ 24 ใ นหล ายประ เทศ อก ด ว ย
( Goyette-Desjardins et al., 2 0 1 4 ; Kerdsin et
al., 2011; Nghia et al., 2008; Takeuchi et al.,
2012; Wertheim et al., 2009) จากขอมลดงกลาว
จะเหนไดวาเชอ S. suis เปนเชอตดตอจากสตวสคนท
สาคญในหลายประเทศ โดยเฉพาะอยางยงประเทศใน
ทวปเอเชย
การบงชชนดของเชอและการแยกซโรไทปของเชอ
S. suis
เชอ S. suis เปนเชอแบคทเรยแกรมบวกขนาดเลก รปรางกลม มกพบการเรยงตวแบบเดยว เปนค
หรอตอกนเปนสายสนๆ (Wertheim et al., 2009)
ในการบงชชนดของเชอนน เบองตนจะอาศยการ
ทดสอบคณสมบตทางชวเคม อยางไรกตาม คณสมบต
ทางชวเคมของเชอมความผนแปรสง ทาใหตองอาศย
เทคนคอนรวมดวย เชน การตรวจหาซโรไทปของเชอ
และการใชเทคนคทางอณชววทยาซงเปนวธทมความ
นาเชอถอสงกวา โดยวธการตรวจยนยนเชอดวยวธ
ทางอณ ชววทยานน อาจทาไดโดยการทา PCR
ตรวจหายนทจาเพาะตอเชอ (species-specific PCR)
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
61
เ ช น ย น glutamate dehydrogenase (gdh)
(Okwumabua et al., 2003) ย น
recombination/repair protein (recN) (Ishida et
al., 2014) นอกจากนยงสามารถใชการหาลาดบเบส
ทบรเวณยน 16s rRNA ตลอดจนการใช probe เพอ
จบบรเวณทจาเพาะบนยน 16s rRNA
จากความแตกตางกนของแอนตเจนบนผวของ
แคปซลของเชอทาใหสามารถแบง S. suis ไดเปนซโรไทปทแตกตางกน 35 ซโรไทป (ซโรไทป 1 – 34 และ
1/2 ซงเปนซโรไทปทสามารถทาปฏกรยาไดทงตอ
แอนตบอดของซโรไทป 1 และ 2) อยางไรกตาม จาก
การศกษาของ Hill et al., (2005) ไดจาแนกเชอซโร
ไทป 32 และ 34 เปนเชอ Streptococcus orisratti
และจากการศกษาของ Tien le et al. (2013) ได
จาแนกเชอซโรไทป 20, 22, 26 และ 33 ออกมาเปน
เชออนเชนกน ซงลาสดเชอ S. suis ซโรไทป 20, 22
และ 26 ไดถกจดเปนเชอ Streptococcus parasuis
(Nomoto et al., 2015) สาหรบการตรวจหาซโร
ไทปสามารถใชวธทางซรมวทยา โดยอาศยปฏกรยา
ระหวางแอนตเจนบนผวแคปซลกบแอนตซรมท
จาเพาะกบแตละซโรไทป โดยอาจใชปฏกรยาการ
ตกตะกอน (capillary precipitation) หรอ การเกาะกลม (co-agglutination test) (Gottschalk et al.,
1989; Perch et al., 1983) อยางไรกตาม การใชวธ
ทางซรมวทยาคอนขางมความยงยากและมคาใชจาย
สง จงไดมการพฒนาวธ multiplex PCR โดยใช
primers 2-3 เซท เพอตรวจหาซโรไทปจากยนท
จาเพาะของเชอ S. suis แตละซโรไทป และปจจบน
สามารถใชวธนเพอตรวจหาซโรไทปของเชอ S. suis
ได (Kerdsin et al., 2014, Liu et al., 2013, Okura
et al., 2014) แตวธนไมสามารถแยกเชอซโรไทป 1
ออกจากซโรไทป 14 และไมสามารถแยกเชอ ซโรไทป
2 ออกจากซโรไทป 1/2 ได ดงนน การตรวจหาซโร
ไทปดวยวธทางซรมวทยายงคงมความจาเปนสาหรบ
การยนยนเชอในกลมน
การสญเสยแคปซลของเชอ S. suis และผลกระทบ
ตอกระบวนการเกดโรค
จ ากก า ร ศ กษ าท ผ า น ม า (Corbett and
Roberts, 2009) พบวาแคปซลจดเปนปจจยหนงทบ ง ช ค ว ามร นแร ง (virulence factor) ของกา ร
กอใหเกดโรคของแบคทเรยหลายชนด รวมทงเชอ S.
suis และเชออนๆในกลม streptococci โดยพบวา
แคปซลของเชอ S. suis สามารถปองกนเชอจากการ
ถ ก จ บ ก น โ ด ย phagocytic cell (Houde et al.,
2012) และยงเกยวของกบการตดเชอในกระแสเลอด
(Segura and Gottschalk, 2002) แ ล ะ ก า ร
แพรกระจายของเชอไปยงอวยวะตางๆ ทวรางกาย
(Meijerink et al., 2012) อยางไรกตาม ในระยะสบ
ป ท ผ า น ม า ไ ด ม ร า ย ง า น ก า ร พ บ เ ช อ ก ล ม
streptococci รวมถงเชอ S. suis ทไมสามารถจดอย
ในซโรไทปใดได รวมทงเ ชอทปราศจากแคปซล
จานวนมากขน (Bonifait et al., 2010; Crum et
al., 2004; Melchiorre et al., 2012) แ ม ว าการศกษาทผานมาพบวา เชอ S. suis ทมแคปซล
สามารถกอโรคจากการทดลองในหนและสกรได
มากก ว า เ ช อส าย พน ธ เ ด ยว กนท ไ ม ม แคปซ ล
(Charland et al., 1998; Smith et al., 1999) แ ต
จ ากการ ศกษาของ Salasia et al. (1995) และ
Benga et al. (2004 & 2005) พบวาเชอ S. suis ท
ถกทาใหยนทสรางแคปซลเกดการเปลยนแปลงจนไม
สามารถสรางแคปซลไดนน มความสามารถในการยด
เกาะกบเซลลหลายชนด เชน epithelial cell ของ
มนษยและสกรไดดกวาเชอทมแคปซล นอกจากน
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
62
จากผลการศกษาของ Tanabe et al. (2010) ยง
พบวาเชอทไมมแคปซลนน ยงสามารถสรางไบโอฟลม
ไดดกวาเชอทมแคปซลอกดวย ซงขนตอนทสาคญใน
กระบวนการกอใหเกดโรคของเชอนน นอกจากจะ
อาศยการหลบเลยงภมคมกนรางกายแลว ยงตอง
อาศยการยดเกาะเซลลโฮสต ตลอดจนการสรางไบโอ
ฟลมเพอทาใหเชอสามารถอยในรางกายไดนานขน
ด ง น น จ งม ค ว าม เ ปน ไป ไ ด ว า เ ช อท ส ญ เ ส ยความสามารถในการสรางแคปซลนน ยงสามารถ
กอใหเกดโรคทมความรนแรงได
จากการศกษาทผานมานน พบวาสามารถแยก
เชอ S. suis ทไมสามารถจดอยในซโรไทปใดได (ซง
อาจเกดจากเชอไดสญเสยความสามารถในการสราง
แคปซล) ไดจากทงตวอยางสกรสขภาพดหรอสกร
ป ว ย (Gottschalk et al., 2013; Katsumi et al.,
1997) สาหรบสาเหตของการสญเสยแคปซลของเชอ
S. suis นน ไดมการศกษาในเชอ S. suis ซงมยนบงช
วาเปนซโรไทป 2 (หรอ 1/2) ทพบจากตวอยางสกร
ปวยดวยภาวะเยอบหวใจอกเสบ (Lakkitjaroen et
al., 2011 & 2014) ซงพบวาเกดการเปลยนแปลง
ของยนบางสวนทเกยวของกบการสรางแคปซลของ
เชอ จงทาใหเกดการสญเสยแคปซลขน โดยลกษณะการเปลยนแปลงของยนทพบจนทาใหเชอไมสามารถ
สรางแคปซลได ไดแก การเกด deletion หรอการ
เกด insertion ซงโดยสวนมากเปนพวก Insertion
Sequence (IS) element ตลอดจนการแทนทของ
นวคลโอไทดบางตว รวมถงการเกด frameshift
mutation อกดวย นอกจากน ในการศกษาดงกลาว
นยงพบอกวา เชอทปราศจากแคปซลนนสามารถยด
เกาะกบเกลดเลอดไดดกวาเชอทมแคปซล เนองจาก
การยดเกาะของเชอกบเกลดเลอดจดเปนขนตอนหนง
ทสาคญในกระบวนการเกดภาวะเยอบหวใจอกเสบ
(Sullam et al., 1996) การสญเสยแคปซลของเชอท
แ ย ก ไ ด น จ ง อ า จ เ ป นป ร ะ โ ยช น อ ย า ง ย ง ต อ
กระบวนการเกดโรค ซงจากรายงานการพบเชอ S.
suis ทปราศจากแคปซลเ พมมากขน ตลอดจน
ความสามารถในการยดเกาะโฮสตทเพมขนหลงการ
สญเสยแคปซล จงอาจเปนไปไดวา การสญเสย
แคปซลของเชอ S. suis อาจเปนประโยชนตอขนตอน
ใดขนตอนหนงของกระบวนการกอโรคของเชอหรออาจเกยวของกบความรนแรงของโรคอกดวย
สรป
เชอ Streptococcus suis เปนเชอแบคทเรย
ทสามารถตดตอจากสตวสคนทส าคญในหลาย
ประเทศ ซงการตดเชอนอาจทาใหเกดภาวะตดเชอใน
กระแสเลอด เยอหมสมองอกเสบ เยอบหวใจอกเสบ
รวมถงขออกเสบ ทงในมนษยและสกร โดยในผปวย
สวนใหญทหายจากภาวะเยอหมสมองอกเสบมกพบ
อาการหหนวกอยางถาวรตามมา โดยทวไปเชอ S.
suis จดเปนเ ชอทมแคปซล ซ ง เมออาศยความ
แตกตางกนของแอนตเจนบนผวของแคปซลของเชอ
ทาใหสามารถแบงเชอ S. suis ออกไดเปนหลายซโร
ไทป โดยการตรวจหาซโรไทปของเชอสามารถทาไดดวยการตรวจโดยวธทางซรมวทยา และ/หรอ วธ
multiplex PCR นอกจากนแคปซลของเชอยงจดเปน
ปจจยสาคญททาใหเกดความรนแรงของการเกดโรค
อกดวย อยางไรกตาม ไดมการศกษาในหลายประเทศ
พบวาเชอ S. suis ทแยกไดจากสกรปกตและสกรปวย
บางสวนเปนเชอทไมมแคปซลหม และยงพบอกวา
เชอเหลานมความสามารถในการยดเกาะเซลลตางๆ
ตลอดจนการสรางไบโอฟลมเพมขน จงเปนไปไดวา
แมวาจะมการยนยนวาแคปซลเปนปจจยสาคญทชวย
ใหเชอ S. suis สามารถกอโรคได แตการสญเสย
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
63
แคปซลของเชอ S. suis อาจเปนกลไกหนงทเปน
ประโยชนตอกระบวนการเกดโรคหรออาจเกยวของ
การทาใหเกดโรคทรนแรงขน
เอกสารอางอง
Arai, S., Tohya, M., Yamada, R., Osawa, R.,
Nomoto, R., Kawamura, Y. and Sekizaki,
T. 2015. Development of loop-mediated isothermal amplification to
detect Streptococcus suis and its
application to retail pork meat in Japan.
Int. J. Food Microbiol. 208: 35-42.
Arends, J.P., Hartwig, N., Rudolphy, M. and
Zanen, H.C. 1984. Carrier rate of
Streptococcus suis capsular type 2 in
palatine tonsils of slaughtered pigs. J.
Clin. Microbiol. 20(5): 945-947.
Baums, C.G. and Valentin-Weigand, P. 2009.
Surface-associated and secreted factors
of Streptococcus suis in epidemiology,
pathogenesis and vaccine
development. Anim. Health Res. Rev. 10(1): 65-83.
Benga, L., Friedl, P. and Valentin-Weigand, P.
2005. Adherence of Streptococcus suis
to porcine endothelial cells. J. Vet.
Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health.
52(9): 392-395.
Benga, L., Goethe, R., Rohde, M. and Valentin-
Weigand, P. 2004. Non-encapsulated
strains reveal novel insights in invasion
and survival of Streptococcus suis in
epithelial cells. Cell. Microbiol. 6(9):
867-881.
Bonifait, L., Gottschalk, M. and Grenier, D. 2010.
Cell surface characteristics of nontypeable
isolates of Streptococcus suis. FEMS
Microbiol. Lett. 311(2): 160-166.
Charland, N., Harel, J., Kobisch, M., Lacasse, S.
and Gottschalk, M. 1998. Streptococcus suis serotype 2 mutants deficient in
capsular expression. Microbiology. 144:
325-332.
Choi, S.M., Cho, B.H., Choi, K.H., Nam, T.S.,
Kim, J.T., Park, M.S., Kim, B.C., Kim, M.K.
and Cho, K.H. 2012. Meningitis caused
by Streptococcus suis: case report and
review of the literature. J. Clin. Neurol.
8(1): 79-82.
Clifton-Hadley, F.A., Alexander, T.J. and
Enright, M.R. 1986. Monitoring herds for
Streptococcus suis type 2: chance
contamination of slaughter pigs. Vet.
Rec. 118(10): 274. Cloutier, G., D'Allaire, S., Martinez, G.,
Surprenant, C., Lacouture, S. and
Gottschalk, M. 2003. Epidemiology of
Streptococcus suis serotype 5 infection
in a pig herd with and without clinical
disease. Vet. Microbiol. 97(1-2), 135-151.
Corbett, D. and Roberts, I.S. 2009. The role of
microbial polysaccharides in host-
pathogen interaction. F1000 Biol. Rep.
1: 30.
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
64
Costa, A.T., Lobato, F.C., Abreu, V.L., Assis, R.A.,
Reis, R. and Uzal, F.A. 2005. Serotyping
and evaluation of the virulence in mice
of Streptococcus suis strains isolated
from diseased pigs. Rev. Inst. Med. Trop.
Sao Paulo 47(2): 113-115.
Crum, N. F., Barrozo, C. P., Chapman, F. A.,
Ryan, M. A. and Russell, K. L. 2004. An outbreak of conjunctivitis due to a
novel unencapsulated Streptococcus
pneumoniae among military trainees.
Clin. Infect. Dis. 39(8): 1148-1154.
Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D. and
Gottschalk, M. 2012. Virulence factors
involved in the pathogenesis of the
infection caused by the swine pathogen
and zoonotic agent Streptococcus suis.
Future Microbiol. 7(2): 259-279.
Fongcom, A., Pruksakorn, S., Netsirisawan, P.,
Pongprasert, R. and Onsibud, P. 2009.
Streptococcus suis infection: a
prospective study in northern Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public
Health. 40(3): 511-517.
Gottschalk, M., Higgins, R., Jacques, M., Mittal,
K.R. and Henrichsen, J. 1989.
Description of 14 new capsular types of
Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol.
27(12): 2633-2636.
Gottschalk, M., Lacouture, S., Bonifait, L., Roy, D.,
Fittipaldi, N. and Grenier, D. 2013.
Characterization of Streptococcus suis
isolates recovered between 2008 and
2011 from diseased pigs in Quebec,
Canada. Vet. Microbiol. 162(2-4): 819-825.
Gottschalk, M. and Segura, M. 2000. The
pathogenesis of the meningitis caused
by Streptococcus suis: the unresolved
questions. Vet. Microbiol. 76(3): 259-272.
Gottschalk, M., Segura, M. and Xu, J. 2007. Streptococcus suis infections in
humans: the Chinese experience and
the situation in North America. Anim.
Health. Res. Rev. 8(1): 29-45.
Goyette-Desjardins, G., Auger, J.P., Xu, J.,
Segura, M. and Gottschalk, M. 2014.
Streptococcus suis, an important pig
pathogen and emerging zoonotic agent-
an update on the worldwide
distribution based on serotyping and
sequence typing. Emerg. Microbes
Infect. 3(6): e45.
Higgins, R. and Gottschalk, M. 2006. Diseases
of Swine. Blackwell publishing, Ames, Iowa.
Hill, J.E., Gottschalk, M., Brousseau, R., Harel,
J., Hemmingsen, S.M. and Goh, S.H.
2005. Biochemical analysis, cpn60 and
16S rDNA sequence data indicate that
Streptococcus suis serotypes 32 and 34,
isolated from pigs, are Streptococcus
orisratti. Vet. Microbiol. 107(1-2): 63-69.
Houde, M., Gottschalk, M., Gagnon, F., Van
Calsteren, M.R. and Segura, M. 2012.
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
65
Streptococcus suis capsular
polysaccharide inhibits phagocytosis
through destabilization of lipid
microdomains and prevents
lactosylceramide-dependent recognition.
Infect. Immun. 80(2): 506-517.
Ip, M., Fung, K.S., Chi, F., Cheuk, E.S., Chau,
S.S., Wong, B.W., Lui, S., Hui, M., Lai, R.W. and Chan, P.K. 2007. Streptococcus suis
in Hong Kong. Diagn. Microbiol. Infect.
Dis. 57(1): 15-20.
Ishida, S., Tien le, H.T., Osawa, R., Tohya, M.,
Nomoto, R., Kawamura, Y., Takahashi,
T., Kikuchi, N., Kikuchi, K. and Sekizaki, T.
2014. Development of an appropriate
PCR system for the reclassification of
Streptococcus suis. J. Microbiol.
Methods. 107: 66-70.
Katsumi, M., Kataoka, Y., Takahashi, T., Kikuchi,
N. and Hiramune, T. 1997. Bacterial
isolation from slaughtered pigs
associated with endocarditis, especially the isolation of Streptococcus suis. J.
Vet. Med. Sci. 59(1): 75-78.
Kerdsin, A., Dejsirilert, S., Sawanpanyalert, P.,
Boonnark, A., Noithachang, W.,
Sriyakum, D., Simkum, S., Chokngam, S.,
Gottschalk, M., Akeda, Y. and Oishi, K.
2011. Sepsis and spontaneous bacterial
peritonitis in Thailand. Lancet.
378(9794): 960.
Kerdsin, A., Akeda, Y., Hatrongjit, R.,
Detchawna, U., Sekizaki, T., Hamada, S.,
Gottschalk, M. and Oishi, K. 2014.
Streptococcus suis serotyping by a new
multiplex PCR. J. Med. Microbiol. 63:
824-830.
Lakkitjaroen, N., Takamatsu, D., Okura, M.,
Sato, M., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2011. Loss of capsule among Streptococcus
suis isolates from porcine endocarditis
and its biological significance. J. Med.
Microbiol. 60: 1669-1676.
Lakkitjaroen, N., Takamatsu, D., Okura, M.,
Sato, M., Osaki, M. and Sekizaki, T. 2014.
Capsule loss or death: the position of
mutations among capsule genes sways
the destiny of Streptococcus suis. FEMS
Microbiol. Lett. 354(1): 46-54.
Liu, Z., Zheng, H., Gottschalk, M., Bai, X., Lan,
R., Ji, S., Liu, H. and Xu, J. 2013.
Development of multiplex PCR assays
for the identification of the 33
serotypes of Streptococcus suis. PLoS
One. 8(8): e72070. Lun, Z.R., Wang, Q.P., Chen, X.G., Li, A.X. and
Zhu, X.Q. 2007. Streptococcus suis: an
emerging zoonotic pathogen. Lancet
Infect. Dis. 7(3): 201-209.
Meijerink, M., Ferrando, M.L., Lammers, G.,
Taverne, N., Smith, H.E. and Wells, J.M.
2012. Immunomodulatory effects of
Streptococcus suis capsule type on
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
66
human dendritic cell responses,
phagocytosis and intracellular survival.
PLoS One. 7(4): e35849.
Melchiorre, S., Camilli, R., Pietrantoni, A.,
Moschioni, M., Berti, F., Del Grosso, M.,
Superti, F., Barocchi, M. A. and Pantosti,
A. 2012. Point mutations in wchA are
responsible for the non-typability of two invasive Streptococcus
pneumoniae isolates. Microbiology.
158: 338-344.
Nghia, H.D., Hoa, N.T., Linh le, D., Campbell,
J., Diep, T.S., Chau, N.V., Mai, N.T., Hien,
T.T., Spratt, B., Farrar, J. and Schultsz, C.
2008. Human case of Streptococcus
suis serotype 16 infection. Emerg.
Infect. Dis. 14(1): 155-157.
Nghia, H.D., Tu le, T.P., Wolbers, M., Thai, C.Q.,
Hoang, N.V., Nga, T.V., Thao le, T.P., Phu,
N.H., Chau, T.T., Sinh, D.X., Diep, T.S.,
Hang, H.T., Truong, H., Campbell, J.,
Chau, N.V., Chinh, N.T., Dung, N.V., Hoa, N.T., Spratt, B.G., Hien, T.T., Farrar, J. and
Schultsz, C. 2011. Risk factors of
Streptococcus suis infection in Vietnam.
A case-control study. PLoS One. 6(3):
e17604.
Nomoto, R., Maruyama, F., Ishida, S., Tohya,
M., Sekizaki, T. and Osawa R. 2015.
Reappraisal of the taxonomy of
Streptococcus suis serotypes 20, 22 and
26: Streptococcus parasuis sp. nov. Int.
J. Syst. Evol. Microbiol. 65: 438-443.
Okura, M., Lachance, C., Osaki, M., Sekizaki, T.,
Maruyama, F., Nozawa, T., Nakagawa, I.,
Hamada, S., Rossignol, C., Gottschalk, M.
and Takamatsu, D. 2014. Development
of a two-step multiplex PCR assay for
typing of capsular polysaccharide synthesis gene clusters of
Streptococcus suis. J. Clin. Microbiol.
52(5): 1714-1719.
Okwumabua, O., O'Connor, M. and Shull, E.
2003. A polymerase chain reaction
(PCR) assay specific for Streptococcus
suis based on the gene encoding the
glutamate dehydrogenase. FEMS
Microbiol. Lett. 218(1): 79-84.
Padungtod, P., Tharavichitkul, P., Junya, S.,
Chaisowong, W., Kadohira, M., Makino,
S. and Sthitmatee, N. 2010. Incidence
and presence of virulence factors of
Streptococcus suis infection in slaughtered pigs from Chiang Mai,
Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med.
Public Health. 41(6): 1454-1461.
Perch, B., Pedersen, K.B. and Henrichsen, J.
1983. Serology of capsulated
streptococci pathogenic for pigs: six
new serotypes of Streptococcus suis. J.
Clin. Microbiol. 17(6): 993-996.
Princivalli, M.S., Palmieri, C., Magi, G., Vignaroli,
C., Manzin, A., Camporese, A., Barocci,
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
67
S., Magistrali, C. and Facinelli, B. 2009.
Genetic diversity of Streptococcus suis
clinical isolates from pigs and humans
in Italy (2003-2007). Euro Surveill.
14(33): pii: 19310.
Salasia, S. I., Lammler, C. and Herrmann, G.
1995. Properties of a Streptococcus suis
isolate of serotype 2 and two capsular mutants. Vet. Microbiol. 45(2-3): 151-156.
Segura, M. 2009. Streptococcus suis: an
emerging human threat. J. Infect. Dis.
199(1): 4-6.
Segura, M. and Gottschalk, M. 2002.
Streptococcus suis interactions with the
murine macrophage cell line J774:
adhesion and cytotoxicity. Infect.
Immun. 70(8): 4312-4322.
Smith, H. E., Damman, M., van der Velde, J.,
Wagenaar, F., Wisselink, H. J., Stockhofe-
Zurwieden, N. and Smits, M. A. 1999.
Identification and characterization of
the cps locus of Streptococcus suis serotype 2: the capsule protects against
phagocytosis and is an important
virulence factor. Infect. Immun. 67(4):
1750-1756.
Staats, J.J., Feder, I., Okwumabua, O. and
Chengappa, M.M. 1997. Streptococcus
suis: past and present. Vet. Res.
Commun. 21(6): 381-407.
Sullam, P. M., Bayer, A. S., Foss, W. M. and
Cheung, A. L. 1996. Diminished platelet
binding in vitro by Staphylococcus
aureus is associated with reduced
virulence in a rabbit model of infective
endocarditis. Infect. Immun. 64(12):
4915-4921.
Takeuchi, D., Kerdsin, A., Pienpringam, A.,
Loetthong, P., Samerchea, S., Luangsuk,
P., Khamisara, K., Wongwan, N., Areeratana, P., Chiranairadul, P.,
Lertchayanti, S., Petcharat, S., Yowang,
A., Chaiwongsaen, P., Nakayama, T.,
Akeda, Y., Hamada, S., Sawanpanyalert,
P., Dejsirilert, S. and Oishi, K. 2012.
Population-based study of
Streptococcus suis infection in humans
in Phayao Province in northern
Thailand. PLoS One. 7(2): e31265.
Tan, J.H., Yeh, B.I. and Seet, C.S. 2010.
Deafness due to haemorrhagic
labyrinthitis and a review of relapses in
Streptococcus suis meningitis.
Singapore Med. J. 51(2): e30-33. Tanabe, S., Bonifait, L., Fittipaldi, N., Grignon,
L., Gottschalk, M. and Grenier, D. 2010.
Pleiotropic effects of polysaccharide
capsule loss on selected biological
properties of Streptococcus suis. Can. J.
Vet. Res. 74(1): 65-70.
Tien le, H.T., Nishibori, T., Nishitani, Y.,
Nomoto, R. and Osawa, R. 2013.
Reappraisal of the taxonomy of
Streptococcus suis serotypes 20, 22, 26,
ณฐกานต มขนอน / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 57-68.
68
and 33 based on DNA-DNA homology
and sodA and recN phylogenies. Vet.
Microbiol. 162(2-4): 842-849.
Wei, Z., Li, R., Zhang, A., He, H., Hua, Y., Xia, J.,
Cai, X., Chen, H. and Jin, M. 2009.
Characterization of Streptococcus suis
isolates from the diseased pigs in China
between 2003 and 2007. Vet. Microbiol. 137(1-2): 196-201.
Wertheim, H.F., Nghia, H.D., Taylor, W. and
Schultsz, C. 2009. Streptococcus suis:
an emerging human pathogen. Clin.
Infect. Dis. 48(5): 617-625.
Wisselink, H.J., Reek, F.H., Vecht, U.,
Stockhofe-Zurwieden, N., Smits, M.A.
and Smith, H.E. 1999. Detection of
virulent strains of Streptococcus suis
type 2 and highly virulent strains of
Streptococcus suis type 1 in tonsillar
specimens of pigs by PCR. Vet.
Microbiol. 67(2): 143-157.
Wisselink, H.J., Smith, H.E., Stockhofe-Zurwieden, N., Peperkamp, K. and
Vecht, U. 2000. Distribution of capsular
types and production of muramidase-
released protein (MRP) and
extracellular factor (EF) of
Streptococcus suis strains isolated from
diseased pigs in seven European
countries. Vet. Microbiol. 74(3): 237-248.
Yu, H., Jing, H., Chen, Z., Zheng, H., Zhu, X.,
Wang, H., Wang, S., Liu, L., Zu, R., Luo,
L., Xiang, N., Liu, H., Liu, X., Shu, Y., Lee,
S.S., Chuang, S.K., Wang, Y., Xu, J. and
Yang, W. 2006. Human Streptococcus
suis outbreak, Sichuan, China. Emerg.
Infect. Dis. 12(6): 914-920.
บทความวจย
สตวแพทยสตวแพทยมหานครสารมหานครสาร JJOOUURRNNAALL OOFF MMAAHHAANNAAKKOORRNN VVEETTEERRIINNAARRYY MMEEDDIICCIINNEE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
การตรวจหาเชอ Brucella melitensis โดยวธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอ
จากตวอยางอวยวะของแพะเนอในประเทศไทย
ลขณา รามรน1 เรขา คณตพนธ2 มนยา เอกทตร2 และองอาจ เลาหวนจ1,#
1ภาควชาจลชววทยาและวทยาภมคมกน คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพมหานคร 10900 2สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว กรงเทพมหานคร 10900
บทคดยอ: Brucella melitensis เปนสาเหตหลกของโรคบรเซลโลสสในแพะ ทาใหแพะเกดการแทงลก
นอกจากนโรคบรเซลโลสสยงเปนโรคตดตอระหวางสตวและคนทสาคญ วธมาตรฐานสาหรบการชนสตรโรค บรเซลโลสสคอวธการเพาะแยกเชอ แตเชอบรเซลลาเปนเชอทกออนตรายตอผปฏบตงาน และตองใชเวลานาน
ในการวเคราะห ดงนนงานวจยครงนมวตถประสงค เพอประเมนความสามารถวธการตรวจหาเชอ B.
melitensis โดยวธ Real-time PCR เปรยบเทยบกบวธการเพาะแยกเชอ โดยเกบตวอยางอวยวะจากแพะเนอ
ทใหผลบวกและผลสงสยทางซรมวทยา liver, spleen, mammary/inguinal lymph node, mandibular
lymph node, popliteal lymph node, parotid lymph node, pre-femoral lymph node และ pre-
scapular lymph node ทงหมด 320 ตวอยาง โดย primers และ probe ทใชมความจาเพาะตอยน IS711
ของโรคบรเซลโลสส ผลการศกษาพบวา ความเขมขนของดเอนเอตาสดท วธ Real-time PCR สามารถ
วเคราะหได คอ 2 เฟมโตกรม ไมมปฏกรยาขามกบแบคทเรยชนดอน และวธ Real-time PCR มคาความไว
92.45% ความจาเพาะ 92.88% และคาความถกตอง 92.81% ดงนนวธ Real-time PCR สามารถนามาใชใน
การตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสสทมความจาเพาะ ความไว รวดเรว และปลอดภย
คาสาคญ: เชอ Brucella melitensis วธ Real-time PCR วธการเพาะแยกเชอ แพะเนอ #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46. E-mail address: [email protected]
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
36
Detection of Brucella melitensis Using Real-time PCR and Isolation from
Organs of Meat Goat in Thailand
Luckana Ramrin1, Reka Kanitpun2, Monaya Ekgatat2 and Ongard Lawhavinit1,#
1Department of Veterinary Microbiology and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine,
Kasetsart University, Bangkok 10900 2National Institute of Animal Health, Department of Livestock Development, Bangkok 10900
Abstract: Brucella melitensis is the most prevalent causative agent of goat brucellosis: one
of the most important zoonotic diseases related to the reproductive losses and abortion.
Conventional culture method is considered the gold standard for brucellosis diagnosis.
However, this method is hazardous, labor-intensive and time-consuming. Therefore, the
present study aims to evaluate an efficiency of Real-time PCR diagnosis method: the more
convenient and less time consuming method by comparing to culture method. Total 320
samples of liver, spleen, mammary/inguinal lymph node, mandibular lymph node, popliteal
lymph node, parotid lymph node, pre-femoral lymph node and pre-scapular lymph node were collected from seropositive and suspicious meat goats. Primer and probe specific for
the insertion sequence (IS711) gene of B. melitensis were used. The limit of detection (LoD)
of Real-time PCR assay is 2 femtogram (fg) with no cross reactions with other 20 related
pathogens. Compared to the gold standard method, Real-time PCR assay contains 92.45%
sensitivity, 92.88% specificity and 92.81% accuracy. In conclusion, Real-time PCR assay is
sensitivity and specificity method for the rapid and safe detection of brucellosis diagnosis.
Keywords: Brucella melitensis, Real-time PCR, Isolation, Meat goat #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 35-46. E-mail address: [email protected]
บทนา
โรคบรเซลโลสส (Brucellosis) มสาเหตมา
จากเชอบรเซลลา พบไดในสตวเลยงลกดวยนมหลาย
ชนด รวมทงในปศสตว เชน โค กระบอ สกร แพะ
แ ก ะ แ ล ะ ส ต ว ป า ( Lapaque et al., 2005)
โดยเฉพาะโรคบรเซลโลสสในแพะ เกดจากเชอ
แบคทเรย Brucella melitensis ทมการระบาดทว
โลก แพะทเปนโรคจะเกดความลมเหลวของระบบ
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
37
สบพนธ เชน ทาใหเกดการแทงลก มดลกอกเสบ
อณฑะอกเสบ ทาใหแพะเปนหมน ผสมไมตด หรอ
ผสมตดยาก เกดขออกเสบ และใหผลผลตลดลง
(Blood and Henderson, 1968) โดยแพะมกจะ
แทงในระยะสดทายของการตงทอง แตในรายทไมเกด
การแทง แพะจะปลอยเชอมาพรอมกบนานม รก
หรอนาคราเวลาคลอด แพะทเปนโรคสามารถแพร
เชอตอไปยงสตวอนได (Nielsen, 2002) นอกจากนโรคบรเซลโลสสยงเปนโรคตดตอระหวางสตวและคน
พบวาโรคบรเซลโลสส ทเกดจากเชอ B. melitensis
เปนสายพนธทกอโรครนแรงมากทสดในคน โดยจะ
แสดงอาการคลายไขหวด ทาใหคนทตดเชอมอาการ
ปวดศรษะ ไขสงๆ ตาๆ (undulant fever) ปวดตาม
ขอ สนและออนแรง หรอมการตดเชอเฉพาะท เชน
กระดก เนอเยอ และอวยวะในระบบตางๆ แตในราย
ทรนแรงจะมผลกบระบบประสาทและหวใจ การ
รกษาตองตอเนองและใชเวลานาน (Pellicer et al.,
1988) โรคบรเซลโลสสจงจดเปนโรคสาคญทสราง
ความสญเสยทงระบบสาธารณสขและเศรษฐกจ
(Godfroid et al., 2005; Pappas et al., 2006)
ปจจบนการตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสสทาง
หองปฏบตการของกรมปศสตว ใชการตรวจทางซรมวทยาโดยว ธ Rose bengal test (RBT), Enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA) แ ล ะ
Complement fixation test (CFT) เพ อ ต รวจห า
แอนตบอดตอเชอบรเซลลา แตการตรวจทางซรม
วทยาจะมปฏกรยาขามกบเชอแบคทเรยอนๆ ได เชน
Yersinia enterocolitica O:9 (Bounaadja et al.,
2009) วธการชนสตร โรคบรเซลโลสสทไดรบการ
ยอมรบวาสมบรณทสดในปจจบน คอ วธการเพาะ
แยกเชอ ถอวาเปนวธมาตรฐานสาหรบชนสตรโรคบร
เซลโลสส (Alton et al., 1975) แตการปฏบตการ
เกยวกบเชอบรเซลลามความเสยงตอการตดเชอของ
ผปฏ บ ตงาน ดงนนจ งจาเปนตองใช เครองมอท
เหมาะสมและมประสทธภาพ รวมทงผปฏบตงานตอง
มท กษะในการใช เครองมอและตองปฏ บ ตตาม
มาตรฐานความปลอดภยทางชวภาพในหองปฏบตการ
ระดบ 3 เพอลดความเสยงของผปฏบตงาน (OIE,
2012) นอกจากนการเพาะแยกเชอตงแตขนตอนการ
เตรยมตวอยาง จนทราบผลการจาแนกเชอตองใชเวลานาน (Bounaadja et al., 2009) ตอมาจงไดม
การนาเทคนคทางชวโมเลกลโดยวธ conventional
PCR มาใชในการพสจนเชอบรเซลลา ออกจากเชอ
แบคทเรยชนดอน (Kanitpun et al., 2006) อยางไร
กดมขอจากดของวธคอไมสามารถตรวจวเคราะหเชง
ปรมาณได นอกจากนนยงกอใหเกดการฟงกระจาย
แ ล ะ ก า ร ป น เ ป อ น ข อ ง PCR products จ า ก
ก ร ะ บ ว น ก า ร ท า PCR โ ด ย ว ธ agarose gel
electrophoresis ซงเปนสาเหตสาคญของการเกด
การปนเปอนแบบ carry over contamination ทา
ให เกดผลบวกเทจได (false positive) (Kwok and
Higuchi, 1989) วธ Real-time PCR เปนเทคนคการ
เพมขยายปรมาณดเอนเอจากตวอยาง โดยสามารถ
ตรวจวดปรมาณ PCR products ท เกดขนจรง ณ เวลานนๆ มวธทาสะดวก ไมยงยาก มอนตรายนอย
และมความไวสง (Bricker, 2002) สามารถตรวจโรค
โดยตรงจากตวอยางสงตรวจ
ด งนนงาน วจยค รงนม วตถประสงค เพ อ
ประเมนความสามารถวธการตรวจวนจฉยโรคบร
เซลโลสสสาหรบใชตรวจหาเชอ B. melitensis โดยวธ
Real-time PCR เปรยบเทยบกบวธการเพาะแยกเชอ
ในแพะทเลยงในประเทศไทย เพอนามาใชในการตรวจ
วนจฉยโรคทมความปลอดภย รวดเรว ถกตอง แมนยา
และสามารถนาไปใชตรวจในหองปฏบตการได
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
38
ตารางท 1 รายละเอยดลาดบเบส (sequence) ของ primers และ probe
Name Primer sequence 5’-3’ Location
Forward-primer CGCTCGCGCGGTGGAT 421
Reverse-primer CTTGAAGCTTGCGGACAGTCACC 511
Probe FAM-ACGACCAAGCTGCATGCTGTTGTCGATG-TAMRA 438
ทมา: Bounaadja et al. (2009)
อปกรณและวธการ
ต ว อ ย า งส าห ร บ ก า รท วน ส อบ ค ว าม ใช ไ ด
(Validation) ของวธ Real-time PCR
- เ ช อ อ า ง อ ง ( reference strain) ใ ช เ ช อ B.
melitensis biovar 1 ref 16M ATCC 23456
สาหรบทดสอบความไว (Analytical Sensitivity,
ASe หรอคา Limit of Detection, LoD)
- เ ช อ แ บ คท เร ย ช น ด อ น (non-Brucella spp.)
จานวน 20 ตวอยาง สาหรบทดสอบความจาเพาะ
(Analytical Specificity, ASp)
ตวอยางอวยวะสาหรบทดสอบเปรยบเทยบวธการ
เพาะแยกเชอกบวธ Real-time PCR
เปนตวอยางอวยวะจากแพะเนอทใหผลบวก
และผลสงสยทางซรมวทยา โดยวธ Rose bengal
test (RBT), Complement fixation test (CFT)
และวธ Enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA) จากตวอยางแพะเนอ จานวน 40 ตว โดย
เกบในระหวางป พ.ศ. 2557 ทาการเกบตวอยางจาก
ตอมนาเหลองและตวอยางอวยวะ ไดแก liver,
spleen, mammary/inguinal lymph node,
mandibular lymph node, popliteal lymph
node, parotid lymph node, prefemoral
lymph node แ ล ะ pre-scapular lymph node
ทงหมด 8 ตวอยางตอตว รวมตวอยางทงหมด 320
ตวอยาง
Primers และ probe
Primers และ probe ทใชมความจาเพาะตอ
ยน IS711 ของโรคบรเซลโลสส ซง probe ทใชเปน
ชนด hydrolysis probe ท ตดฉลากดวย FAM (6-
carboxyfluorescein) ทดานปลาย 5’ ทาหนาทเปน
reporter dye แ ล ะ TAMRA (6-carboxy-tetra-
methyl-rhodomine) ทปลาย 3’ เปน quencher
โดยมรายละเอยดลาดบเบสแสดงในตารางท 1
การเตรยมดเอนเอของเชออางอง
เลยงเชอ B. melitensis biovar 1 ref 16M
ATCC 23456 บนอาหาร selective media จากนน
นาไป บมใน 5% CO2 incubator ท อณ หภม 37
องศาเซลเซยส นาน 4 วน นาโคโลนปรมาณ 1 ลป
มาสกดดเอนเอ โดยใชชดสกดดเอนเอสาเรจรป QIA®
DNA Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 51306) ว ธการ
และขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนวด
ปรมาณดเอนเอดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร
(SmartSpecTM Plus, Biorad) ทความยาวคลนแสง
260 นาโนเมตร เกบทอณหภม -20 องศาเซลเซยส
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
39
การทดสอบหาสภาวะท เหมาะสมของปฏกรยา
Real-time PCR
น าด เอน เอของเชอ อางอ ง B. melitensis
biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ทาเปนตวควบคม
บวก และใชนากลนทปราศจาก RNase และ DNase
แทนดเอนเอ เปนตวควบคมลบ มาทาปฏกรยา Real-
time PCR โดยใชเครอง LightCycler®480 (Roche,
Germany) แตละปฏกรยามปรมาตร 20 ไมโครลตร ป ระก อบ ด วย น าย า LightCycler®480 Probes
Master (Roche, Germany) (2x) 10 ไม โค รล ต ร
Forward-primer Reverse-primer แ ล ะ Probe
(Sigma-Proligo, Singapore) เขมขน 10 ไมโครโมล
อยางละ 0.5 ไมโครลตร นากลน 3.5 ไมโครลตร และ
DNA template 5 ไมโครลตร โดยตงโปรแกรมดงน
Pre-incubation 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10
นาท Amplification 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15
วนาท และ 60 องศาเซลเซยส เปนเวลา 40 วนาท
จานวน 45 รอบ และ Cooling ท 40 องศาเซลเซยส
เปนเวลา 30 วนาท เมอปฏกรยาสมบรณจะไดคา
Crossing point (Cp) ซงเปนจานวนรอบทแสดงผล
เปนบวก ทตรวจวดสญญาณไดดวย Software ของ
เครอง LightCycler®480 ตวอยางทใหผลเปนบวก จะใหคา Cp นอยกวา 45 รอบ
การทา Standard curve
เจอจางดเอนเอของเชออางอง B. melitensis
biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ดวยนากลนแบบ
10-fold dilution ทระดบความเขมขน 10-1 ถง 10-
10 จากนนนาแตละความเขมขนมาทาปฏกรยา Real-
time PCR โดยใช primers และ probe ชดนายา
และวธการทดสอบโดยวธ Real-time PCR ตามทได
กลาวไวขางตน คา Cp ทไดถกคานวณโดย Software
ของเครอง LightCycler®480 ซงพจารณาจากคา
Efficiency; E คอการทไดจานวนเพมเปน 2 copy
ตอรอบ (อโณทย, 2549) เพอแสดงถงปฏกรยาทม
ประสทธภาพมากทสด
การทดสอบความไว (Analytical Sensitivity;
ASe หรอคา Limit of Detection; LoD)
ความไวจะตองพจารณาจากคาความเขมขนของดเอนเอตาสดท ว ธ Real-time PCR สามารถ
ตรวจวดได (Limit of Detection; LoD) โดยนาด
เอนเอของเชออางอง B. melitensis biovar 1 ref
16M ATCC 23456 ททราบคาความเขมขนของดเอน
เอมาเจอจางดวยนากลนแบบ 10-fold dilution
จากนนนามาทดสอบโดยวธ Real-time PCR ตามท
ไดกลาวไวขางตน และนาขอมลทไดมาคานวณหาคา
ส ม ป ร ะ ส ท ธ ก า ร ต ด ส น ใ จ (Coefficient of
determination; R2) ซ งค า R2 ควรมค ามากกวา
0.99
ก า ร ท ด ส อ บ ค ว า ม จ า เพ า ะ ( Analytical
Specificity, ASp)
ทาการทดสอบกบเชอแบคท เรยชนด อน (non-Brucella spp.) จานวน 20 ตวอยาง สกดด
เอนเอโดยใชชดสกดดเอนเอสาเรจรป QIA® DNA
Mini Kit (Qiagen, Cat. No. 51306) ว ธ ก ารและ
ขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนวด
ปรมาณดเอนเอดวยเครองสเปกโตรโฟโตมเตอร
(SmartSpecTM Plus, Biorad) ทความยาวคลนแสง
260 นาโนเมตร นามาเจอจางดวยนากลนใหมความ
เขมขน เท ากนท ก ตวอยางเพ อ เปรยบ เท ยบผล
หลงจากนนนามาทาปฏกรยา Real-time PCR โดย
ใช primers และ probe ชดนายาและวธการทดสอบ
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
40
โดยวธ Real-time PCR ตามทไดกลาวไวขางตน เพอ
ทดสอบหาความจาเพาะตอเชอ Brucella spp. ผล
การทดสอบพจารณาจากคา Cp ตวอยางทใหผลเปน
ลบและตวควบคมลบ จะใหคา Cp มากกวา 45 รอบ
ขนตอนการทดสอบเปรยบเทยบระหวางวธการ
เพาะแยกเชอกบวธ Real-time PCR
การทดสอบตวอยางอวยวะ โดยวธการเพาะแยกเชอ ตดตวอยางอวยวะเปนชนเลกๆ ประมาณ 5
ก ร ม ใ ส ใ น Tissue grinder เ ต ม ส า ร ล ะ ล า ย
phosphate-buffer saline (PBS) pH 7.2 ปรมาตร
5 มลลลตร บดเนอเยอ ประมาณ 5-10 นาท นาสวน
ของ suspension จานวน 1 มลลลตร ใสหลอดไว
สาหรบใชในการสกดดเอนเอ (DNA extraction)
และดดสวนของ suspension จานวน 0.1 มลลลตร
หยดบนอาหารเลยงเชอ selective media จานวน 2
เพลท โดยวธ Spread plate หลงจากนนนาไปบมใน
5% CO2 incubator ทอณหภม 37 องศาเซลเซยส
นาน 5-10 วน ทาการพสจนเชอดวยวธทางชวเคม
และวธ conventional PCR
การทดสอบตวอยางอวยวะ โดยวธ Real-time PCR นาตวอยางจากการเตรยมตวอยางขางตน
ปรมาตร 200 ไมโครลตร มาสกดดเอนเอ โดยใชชด
สกดดเอนเอสาเรจรป DNeasy® Blood&Tissue Kit
(Qiagen, Germany, Cat. No. 69506) ว ธการและ
ขนตอนตามขอบงใชของบรษทผผลต จากนนนาดเอน
เอทสกดไดจากตวอยาง มาทาการทดสอบโดยวธ
Real-time PCR ตามทไดกลาวไวในหวขอการทดสอบ
โดยวธ Real-time PCR ตวอยางทใหผลเปนบวกและ
ตวควบคมบวก จะใหคา Cp นอยกวา 45 รอบ
การวเคราะหผลการทดสอบหาคาความไว คา
ความจาเพาะ และคาความถกตองของวธทดสอบ
หลงจากทาการตรวจหาเชอ B. melitensis
โดยวธการเพาะแยกเชอ และวธ Real-time PCR
เสรจแลว นาขอมลจากผลการทดลองมาวเคราะหหา
ความสมพนธกน โดยใชผลการทดลองโดยวธ Real-
time PCR เทยบกบวธการเพาะแยกเชอ แลวหาคา
ความไวของวธทดสอบ (Sensitivity) ความจาเพาะของวธทดสอบ (Specificity) และคาความถกตอง
ของวธทดสอบ (Accuracy) ของวธ Real-time PCR
เทยบกบวธการเพาะแยกเชอทสมพนธกน โดยวธ
chi-square และใชระดบความเชอมนท 95%
ผลการทดลอง
การทา Standard curve
จากการทา Standard curve ทระดบความ
เขมขน 10-1 ถง 10-10 นามาวเคราะหตามสภาวะท
กาหนดของวธ Real-time PCR เมอปฏกรยาดาเนน
ไปครบ 45 รอบ ไดคา Crossing point (Cp) ดงน ท
ระดบความเขมขน 10-1 Cp = 14.04, 10-2 = 17.80,
10-3 = 21.47, 10-4 = 25.09, 10-5 = 28.89, 10-6 =
32.73 และ 10-7 = 36.41 ตามลาดบ ผลการคานวณค า Efficiency; E จาก เค ร อ ง LightCycler®480
สามารถหาคา E ไดเทากบ 1.857 (รปท 1) ซงแสดง
ให เห น วา primers และ probe ท ออกแบบ ให
ปฏกรยาทมประสทธภาพ
การทดสอบความไว (Analytical Sensitivity;
ASe หรอคา Limit of Detection; LoD)
จากการวดปรมาณดเอนเอของเชออางอง B.
melitensis biovar 1 ref 16M ATCC 23456 ดวย
เครองสเปกโตรโฟโตมเตอร (SmartSpecTM Plus,
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
41
Biorad) ทความยาวคลนแสง 260 นาโนเมตร นาด
เอนเอทวดไดมาเจอจางดวยนากลนใหมคา 20 นาโน
กรม/ปฏกรยา จากนนเจอจางดวยนากลนแบบ 10-
fold dilution พบวาปรมาณดเอนเอตาสด (Limit of
Detection; LoD) ท ว ธ Real-time PCR สามารถ
วเคราะหไดคอ 2 เฟมโตกรม (รปท 2) เมอสราง
กราฟมาตรฐานของความสมพนธระหวางความ
เขมขนของดเอนเอและคา Cp กราฟทไดเปนเสนตรง สามารถวเคราะหไดคอ 2 เฟมโตกรม (รปท 2) เมอ
สรางกราฟมาตรฐานของความสมพนธระหวางความ
เขมขนของดเอนเอและคา Cp กราฟทไดเปนเสนตรง
และความสมพนธในเชงถดถอย หรอสมประสทธการ
ต ด ส น ใ จ (Coefficient of determination; R2)
เทากบ 0.999 แสดงดงรปท 3
การทดสอบความจาเพาะ (Analytical Specificity,
ASp) จากการทดสอบปฏกรยา Real-time PCR กบ
เชอแบคทเรยชนดอน (non-Brucella spp.) จานวน
20 ตวอยาง ทความเขมขนของดเอนเอ 2 นาโนกรม/
ปฏกรยา พบวาใหผลลบทกตวอยาง ซงใหคา Cp
มากกวา 45 รอบ แสดงดงตารางท 2
การทดสอบเปรยบเทยบระหวางวธการเพาะแยก
เชอกบวธ Real-time PCR
จากการตรวจหาเชอ B. melitensis จาก
ตวอยางอวยวะของแพะเนอ วทยา liver, spleen,
mammary/inguinal lymph node, mandibular
lymph node, popliteal lymph node, parotid
lymph node, pre-femoral lymph node แ ล ะ
pre-scapular lymph node จานวน 320 ตวอยาง
โดยวธ Real-time PCR เมอเปรยบเทยบกบวธการ
เพาะแยกเชอ พบวาใหผลบวกทงวธ Real-time PCR
และวธการเพาะแยกเชอ จานวน 49 ตวอยาง ให
ผลบวกโดยวธการเพาะแยกเชอ แตใหผลลบโดยวธ
Real-time PCR จานวน 4 ตวอยาง ใหผลลบตอ
วธการเพาะแยกเชอ แตใหผลบวกตอวธ Real-time
PCR จานวน 19 ตวอยาง และใหผลลบตอการตรวจ
ท งว ธ Real-time PCR และวธการเพาะแยกเชอ
จานวน 248 ตวอยาง และพบวาวธการเพาะแยกเชอสามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ได 53 ตวอยาง
สวนวธ Real-time PCR สามารถตรวจพบเชอ B.
melitensis ได 68 ตวอยาง (ตารางท 3)
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
42
ตารางท 2 เชอแบคทเรยชนดอน (non-Brucella spp.) ทใชทดสอบความจาเพาะ
Species Source Real-time PCR result
Burkhoderia cepacia DMST 15507 negative
Burkhoderia pseudomallei DMST 19919 negative
Burkhoderia pseudomallei DMST 25426 negative
Burkhoderia pseudomallei IMM/NIAH negative
Burkhoderia thailandensis DMST 6431 negative
Corynebacterium pseudotuberculosis IMM/NIAH negative Eschericia coli ATCC 25922 negative
Escherichia coli O157:H7 BACT/NIAH negative
Listeria monocytogenes BACT/NIAH negative
Mycobacterium paratuberculosis IMM/NIAH negative
Mycobacterium ovis IMM/NIAH negative
Pseudomonas aeruginosa BACT/NIAH negative
Salmonella enteritidis ATCC 13076 negative
Salmonella typhimurium ATCC 14028 negative
Staphylococcus aureus BACT/NIAH negative
Staphylococcus epidermidis BACT/NIAH negative
Streptococcus agalactiae BACT/NIAH negative
Vibrio cholerae BACT/NIAH negative
Vibrio parahaemolyticus BACT/NIAH negative
Yersinia enterolitica ATCC 9610 negative
วจารณการทดลอง
จากผลการศกษา พบวาความเขมขนของดเอน
เอตาสดทวธ Real-time PCR สามารถวเคราะหได คอ 2 เฟมโตกรม ผลการทดสอบความจาเพาะ ไมม
ปฏกรยาขามกบแบคทเรยชนดอน และวธ Real-
time PCR มค าความไว 92.45% ความจ าเพาะ
92.88% และคาความถกตอง 92.81% พบวาวธการ
เพาะแยกเชอสามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ได
53 ตวอยาง สวนวธ Real-time PCR สามารถตรวจ
พบเชอ B. melitensis ได 68 ตวอยาง จ า ก ก า ร ศ ก ษ า ข อ ง Bounaadja et al.
(2009) โดยศกษาการตรวจหาเชอบรเซลลาดวยวธ
Real-time PCR ใชยน IS711 ยน bcsp31 และยน
per เปนยนเปาหมาย กบเชอ B. melitensis 16 M
พบวายน IS711 เปนยนทใหคาความไวดกวา ยน
bcsp31 และยน per และพบวาไดคาปรมาณดเอน
เอตาสด (LoD) เทากบ 2 เฟมโตกรม ซงในการวจย
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
43
ครงนใชยน IS711 เชนเดยวกนพบวาใหผลเหมอนกน
ซ งแตก ตางจากการศ กษาของ Probert et al.
(2004) ทใหคา LoD สงกวามาก สวนการศกษาทใช
ยนเปาหมายท แตกตางกน โดย Sohrabi et al.
(2014) ไดศกษาโรคบรเซลโลสสในคนทตดเชอ B.
melitensis จากตวอยางซรมโดยวธ Real-time PCR
ใชยน bcsp31 และ Bogdanovich et al. (2004) ท
ใชยน per ในการตรวจหาเชอบรเซลลาพบวา ไดคาดเอนเอตาสด (LoD) ของเชอ B. melitensis ทมคาสง
กวาการศกษาครงน และจากการศกษาการทดสอบ
ความจาเพาะกบเชอ non-Brucella spp. พบวา
ใหผลลบตอเชอ Brucella spp. คดเปน 100%
เหม อน กบการศ กษาของ Bogdanovich et al.
(2004) Probert et al. (2004) Bounaadja et al.
(2009) และ Sohrabi et al. (2014) ดงนนวธ Real-
time PCR สามารถนามาใชในการตรวจหาเชอ B.
melitensis ได จ ากผลการเป ร ยบ เท ยบ ว ธก าร
ตรวจหาเชอ B. melitensis โดยวธ Real-time PCR
กบวธการเพาะแยกเชอ จากตวอยางอวยวะของแพะ
เนอคร ง น พบวาไดค าความไว (Sensitivity) คา
ความจาเพาะ (Specificity) และคาความถกตอง
(Accuracy) คอนขางสง สวนวธการเพาะแยกเชอ
สามารถตรวจพบเชอ B. melitensis ไดนอยกวาวธ
Real-time PCR อาจเนองมาจากเชอบรเซลลาเปน
เชอทโตชาและเพาะเลยงเชอยาก (Seleem et al.,
2010) และอาจเกดจากผลลบเทจ (false negative)
จากการเพาะแยกเชอ เนองจากตวอยางททดสอบม
การปนเปอนเชอชนดอน ทาใหไมสามารถดโคโลน
ของเชอบรเซลลาไดอยางชดเจนหรออาจเปนผลมาจาก เกดการยบยงเชอของยาบางตวทอยในอาหาร
selective agar ทใชสาหรบเลยงเชอ B. melitensis
(Blasco, 1 9 9 2 ) ว ธ Real-time PCR เ ป น ว ธ ท
สามารถเพมจานวนผลบวกของสตวทตดเชอไดใน
กรณทตรวจดวยวธทางซรมวทยาหรอวธการเพาะ
แยกเชอแลวใหผลการตรวจเปนลบ (Hinic et al.,
2009) จากการศกษาการตรวจวนจฉยโรคบรเซลโล
สสโดยวธ Real-time PCR ในครงน สามารถใชตรวจ
โรคจากสงสงตรวจไดโดยตรง โดยไมตองใชวธการ
เพาะแยกเชอ ทาใหลดการสมผสเชอและลดความ
เสยงในการตดเชอจากการปฏบตงานได การตรวจ
ว น จ ฉ ย โรค บ ร เซ ล โล ส ส ท ม ค ว าม ถ ก ต อ ง ม
ความสาคญมากในการควบคม และกาจดเชอ วธ
ตารางท 3 เปรยบเทยบผลการตรวจหาเชอ B. melitensis จากตวอยางอวยวะ ระหวางวธ Real-time PCR
กบวธการเพาะแยกเชอ โดยวธ chi-square
Isolation
Real-time PCR
+ - Total
+ 49 19 68
- 4 248 252
Total 53 267 320
ความ ไว (Sensitivity) = 49/(49+4) X 100 = 92.45%
ความจาเพาะ (Specificity) = 248/(248+19) X 100 = 92.88%
ความถกตอง (Accuracy) = (49+248)/(49+19+4+248) X 100 = 92.81%
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
44
Real-time PCR เป น ว ธ ห น งท ม ป ระส ท ธภ าพ
สามารถวเคราะหไดรวดเรว มความไวเปนทยอมรบ
สาหรบตรวจวนจฉยโรคบรเซลโลสส ความถกตอง
แมนยา และความจาเพาะ คอนขางสง รวมทงลด
ระยะเวลาในการตรวจวเคราะหได ปจจบนราคา
คอนขางถก สามารถนามาใชตรวจในบรเวณทเปน
endemic area ได และแนะนาใชเปนทางเลอกใน
การตรวจเชอบรเซลลา (Probert et al., 2004; Redkar et al., 2001)
สรปผลการทดลอง
การศกษาครงน พบวาวธ Real-time PCR
สามารถตรวจหาความเขมขนของดเอนเอท ตามาก
ซงใช primers และ probe ทมความจาเพาะตอยน
IS711 ขอ งโรคบ ร เซ ล โลส ส พบม ค าค วาม ไว
(Sensitivity) คาความจาเพาะ (Specificity) และคา
ความถกตอง (Accuracy) คอนขางส ง สามารถ
นามาใชในการตรวจวนจฉยโรคทมความปลอดภย
รวดเรว ถกตอง แมนยา ไดอกวธหนง เพอทาใหเพม
ประสทธภาพในการชนสตรโรคบรเซลโลสสไดถกตอง
และรวดเรวมากขน
กตตกรรมประกาศ
คณะผวจยขอขอบคณเจาหนาทกลมอมมน
และซรมวทยา และเจาหนาทกลมแบคทเรยและเชอ
รา สถาบนสขภาพสตวแหงชาต กรมปศสตว ทกๆ
ทานทใหความชวยเหลอ และใหคาแนะนาตางๆ ท
เปนประโยชน และขอขอบคณ Animal and Plant
Quarantine Agency, Anyang, Gyeonggi do,
สาธารณรฐเกาหลทสนบสนนคาใชจายในการวจยครง
นจนสาเรจลลวงดวยด
เอกสารอางอง
อโณทย โภคาธกรณ. 2549. เอกสารประกอบประชม
เชงปฏบตการ เรอง Introduction to Real
time-PCR and its applications. ภาควชา
พ ย า ธ ว ท ย า ค ณ ะ แ พ ท ย ศ า ส ต ร
มหาวทยาลยสงขลานครนทร.
Alton, G.G., Jones, L.M. and Pietz, D.E. 1975.
Laboratory techniques in brucellosis, second ed. Monograph Series No. 55
World Health Organisation, Geneva.
Blasco, J.M. 1992. Diagnosis of Brucella
melitensis infection in small ruminants.
In: Plommet, M. (Ed.), Prevention of
Brucellosis in the Mediterranean
Countries. Puduc Scientific Publishers,
Wageningen, The Netherlands. 272-278.
Blood, D.C. and Henderson, J.A. 1968.
Veterinary medicine. Bailliere Tindal
Cassel Ltd. London, England.
Bogdanovich, T., Skurnik, M., Lubeck, P.S.,
Ahrens, P. and Hoorfar, J. 2004.
Validated 5’ Nuclease PCR Assay for Rapid Identifidation of the Genus
Brucella. J. Clin. Microbiol. 42: 2261-
2263.
Bounaadja, L., Albert, D., Chenais, B.,
Henault, S., Zygmunt, M.S., Poliak, S.
and Garin-Bastuji, B. 2009. Real-time
PCR for identification of Brucella spp.:
A comparative study of IS711, bcsp31
and per target genes. Vet. Microbiol.
137:156-164.
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
45
Bricker, B.J. 2002. PCR as a diagnostic tool for
brucellosis. Vet. Microbiol. 90: 435-446.
Godfroid, J., Cloeckaert, A., Liautard, J.P.,
Kohler, S., Fretin, D., Walravens, K.,
Garin-Bastuji, B. and Letesson, J.J.
2005. From the discovery of the Malta
fever’s agent to the discovery of a
marine mammal reservoir, brucellosis has continuously been a re-emerging
zoonosis. Vet. Res. 36: 313-326.
Hinic, V., Brodard, I., Thomann, A., Holub, M.,
Miserez, R. and Abril, C. 2009. IS711-
based real-time PCR assay as a tool for
detection of Brucella spp. in wild
boars and comparison with bacterial
isolation and serology. BMC Vet. Res.
5:22.
Kanitpun, R., Ekgatat, M., Thammasart, S. and
Nokdhes, C. 2006. Identification of
Brucella spp. by polymerase chain
reaction. J. Regional Bureau Anim.
Health Sanitary. 6. 3: 1-9. Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false
positive with PCR. Nature. 339: 273-8.
Lapaque, N., Moriyon, I., Moreno, E. and
Gorvel, J.P. 2005. Brucella
lipopolysaccharide acts as a virulence
factor. Microbiology. 8: 60-66.
Nielsen, K. 2002. Diagnosis of brucellosis by
serology. Vet. Microbiol. 90: 447-459.
Office International Des Epizooties. 2012.
(cited 18 July 2013). Terrestrial Manual.
Biosafety and biosecurity in the
veterinary microbiology laboratory and
animal facilities. Available from:
http://www.oie.int/fileadmin/Home/en
g/Health_standards/tahm/1.01.03_BIOS
AFETY.pdf.
Pappas, G., Panagopoulou, P., Akritidis, N.,
Christou, L. and Tsianos, E.V. 2006. The new global map of human brucellosis.
Lancet Infect. Dis. 6: 91-99.
Pellicer, T., Ariza, J., Foz, A., Pallares, R. and
Gudiol, F. 1988. Specific antibodies
detected during relapse of human
brucellosis. J. Infect. Dis. 157: 918-924.
Probert, W.S., Schrader, K.N., Khuong, N.Y.,
Bystrom, S.L. and Graves, M.H. 2004.
Real-Time Multiplex PCR Assay for
Detection of Brucella spp., B. abortus,
and B. melitensis. J. Clin. Microbiol. 42:
1290-1293.
Redkar, R., Rose, S., Bricker, B. and
DelVecchio, V. 2001. Real-time detection of Brucella abortus, Brucella
melitensis and Brucella suis. Mol. Cell.
Probe. 15: 43-52.
Seleem, M.N., Boyle, S.M. and
Sriranganathan, N. 2010. Brucellosis: A
re-emerging zoonosis. Vet. Microbiol.
140: 392-398.
Sohrabi, M., Mobarez, A.M., Khoramabadi, N.,
Doust, R.H. and Behmanesh, M. 2014.
Efficient diagnosis and treatment
ลขณา รามรน และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 35-46.
46
follow-up of human brucellosis by a
novel quantitative TaqMan real-time
PCR assay: A human clinical survey. J.
Clin. Microbiol. 52: 4239-4243.
บทความวจย
สตวแพทยสตวแพทยมหานครสารมหานครสาร JJOOUURRNNAALL OOFF MMAAHHAANNAAKKOORRNN VVEETTEERRIINNAARRYY MMEEDDIICCIINNEE
Available online: www.vet.mut.ac.th/journal_jmvm
การยอยไดของโภชนะไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบในสนข
เฉลมพล เยองกลาง1,2 ไกรสทธ วสเพญ1,2,# ศศพนธ วงศสทธาวาส1.2 และ Anton C. Beynen2,3
1สาขาวชาเทคโนโลยการเกษตรและสงแวดลอม คณะวทยาศาสตรและศลปศาสตร มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน
วทยาเขตนครราชสมา อ.เมอง จ.นครราชสมา 30000 2สาขาวชาสตวศาสตร คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลอสาน อ.พงโคน จ.สกลนคร 47160
3Vobra Special Petfoods, Veghel, ประเทศเนเธอรแลนด
บทคดยอ: ไขมนโครงสรางทมกรดสเตยรกและกรดปาลมมตกเปนองคประกอบนาจะมประสทธภาพการยอย
ไดตา ซงมบทบาทเสมอนวตถดบอาหารเพอสขภาพ ทใหพลงงานตามากและสามารถใชประกอบในอาหารสตร
เพอลดนาหนกสาหรบสนขได จากรายงานพบวาครงหนงของไขมนโครงสรางน ประกอบดวย กรดสเตยรกรอย
ละ 55 และกรดปาลมมตกรอยละ 44 ในการศกษาครงนเปนการทดสอบอาหารสาหรบสนข ดาเนนการโดย
วดคาสมประสทธการยอยไดของไขมนโครงสรางดวยวธผลตาง (difference method) โดยเปรยบเทยบกบ
นามนปาลม วางแผนงานทดลองแบบ 3 × 3 ละตนสแควร โดยใชสนขพนธโกลเดนทรทรฟเวอร จานวน 11
ตว ซงไดรบอาหารแหงสาเรจรปจากบรษททไมเสรมนามนปาลม หรอ เสรมนามนปาลมรอยละ 10 หรอ เสรม
ไขมนโครงสรางรอยละ 10 ผลการศกษาพบวาคาสมประสทธการยอยไดของนามนปาลมและไขมนโครงสราง
เทากบรอยละ 96.6 และ รอยละ 68.8 ตามลาดบ ดงนนจากการศกษาครงนสามารถสรปไดวาคาสมประสทธ
การยอยไดของไขมนโครงสรางมคาการยอยไดทสงมากเกนไปสาหรบประกอบสตรอาหารทใหพลงงานตามาก
เพอชวยลดนาหนกสนข นอกจากนการเสรมอาหารดวยไขมนโครงสรางทดแทนนามนปาลมสงผลใหเพม
ปรมาณมลทขบออก ซงมสาเหตมาจากการลดลงของคาสมประสทธการยอยไดของวตถแหง อนมผลมาจาก
การยอยไดทตาของไขมนโครงสรางและการลดลงของการยอยไดของคารโบไฮเดรตทไมใชโครงสราง
คาสาคญ: ไขมนโครงสราง กรดสเตยรก กรดปาลมมตก คาสมประสทธการยอยไดของโภชนะ สนข #ผรบผดชอบบทความ สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56. E-mail address: [email protected]
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
48
Digestibility of a Structural Fat Consisting of Stearic and Palmitic Acid in Dogs
Chalermpon Yuangklang1,2, Kraisit Vasupen1,2,#, Sasiphan Wongsuthavas1.2
and Anton C. Beynen2,3
1Department of Agricultural Technology and Environment, Faculty of Sciences and Liberal Arts, Rajamangala
University of Technology-Isan, Nakhon Ratchasima Campus, Muang, Nakhon Ratchasima 30000 Thailand 2Department of Animal Science, Faculty of Natural Resources, Rajamangala University of Technology-Isan,
Sakon Nakhon Campus, Phang Khon, Sakon Nakhon 47160 Thailand 3Vobra Special Petfoods, Veghel, The Netherlands
Abstract: It was speculated that a structured fat consisting of stearic and palmitic acid
would have sufficiently low digestibility that it could serve as functional ingredient in a very-
low energy, weight-reduction diet for dogs. The fatty-acid moiety of the structured fat under study contained 55 % stearic acid and 44 % palmitic acid. In a feeding trial with dogs, the
apparent digestibility of the structured fat was determined by the difference method and
compared with that of palm oil. In a 3x3 Latin square-design, 11 dogs were fed a commercial
dry food without or with 10% added palm oil or structured fat. The digestibility of palm oil
was found to be 96.6 % and that of the structured fat was 68.8 %. It is concluded that the
digestibility of the structured fat is too high for the formulation of a very-low energy, canine
weight-reduction diet. The addition to the diet of the structured fat, instead of palm oil,
increased the amount of feces. This was caused by a lower apparent digestibility of dietary
dry matter, due to the low digestibility of the structured fat and a decrease in the
digestibility of non-structural carbohydrates.
Keywords: Structured fat, Stearic acid, Palmitic acid, Nutrients digestibility, Dog #Corresponding author J. Mahanakorn Vet. Med. 2016. 11(1): 47-56. E-mail address: [email protected]
Introduction Obesity is common in dogs, the
prevalence being as high as 30% in many
countries. The condition is associated with
an increased incidence of diseases such as osteoarthritis, cardiovascular disorders,
diabetes mellitus, hyperlipidemia, cancer
and skin problems (German, 2006). The
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
49
development of overweight has been shown
to reduce longevity in dogs (Kealy et al.,
2002). It is anticipated that weight loss in
obese dogs reduces the severity of disease
or prevents its development. Indeed, it has
been shown that weight loss improves the
clinical signs of osteoarthritis in obese dogs
(Mlacnik et al., 2006). Weight loss can only be achieved by creating a negative energy
balance: energy intake must be less than
energy expenditure. This implies food
restriction, ideally in combination with
increased exercise. A specific weight-
reduction diet with low energy content may
have surplus value in the treatment of
canine obesity. A low energy value can be
achieved by the combination of a low
content of fat and a high level of crude
fiber. On a weight basis, fats provide twice as
much energy as proteins or carbohydrates.
The energy value of crude fiber is
considered negligible in canine nutrition. Time-limited feeding of a low-energy, high-
fiber diet lowers energy intake (Weber et al.,
2007). In addition, such a diet may reduce
pet owner’s pitying because a reasonable
amount of food can be supplied while
imposing energy restriction. Technically, the
energy value of a low-fat, high-fiber, weight-
reduction diet can be lowered further by the
replacement of carbohydrates by a fat
source that is indigestible or poorly
digestible. Indigestible fats do not provide
energy. For poorly digestible fats to be
applicable, they must provide substantially
less energy than carbohydrates. Ideally, the
indigestible or poorly digestible fat
contributes to diet palatability. In rats,
digestibilities of different fat sources are
negatively correlated with melting points above 30 oC (Clifford et al., 1986). It is likely
that high-melting point, and thus solid state,
impairs the emulsifying capacity of the
digestive tract. Higher degree of saturation
and longer chain length of the constituent
fatty acids of fats are associated with higher
melting point. Fats that are rich in stearic
and palmitic acid can be structured by
enzymatic hydrolysis, fractionation and
selective re-esterification of palm oil. It
would be anticipated that such fats have
low digestibility and might be useful as
ingredient of a weight-reduction diet for
dogs. Clearly, it should be excluded that the structured fat has any negative impact on
health. It is reassuring that the long-term
feeding to dogs of a dry diet containing 10 %
of an indigestible sorbitol fatty acid
polyester did not cause steatorrhea or any
other negative effects (Miller et al., 1991).
The questions to be addressed in the
present experiment with dogs were as
follows. 1) What is the apparent digestibility
of a structured fat consisting of stearic and
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
50
palmitic acid? To answer this question the
apparent digestibility of the fat preparation
was determined by the difference method
and compared within the same experiment
with that of palm oil. 2) Does inclusion of
the structured fat into the diet of dogs affect
feed intake, body weight and feces quality?
3) Does the structured fat versus palm oil have an effect on the digestibility of crude
protein, non-structural carbohydrates
(nitrogen-free extract), crude fiber and
minerals?
Materials and Methods
Dogs and housing
Eleven Golden Retrievers, aged 8
months, were used. There were 8 intact
males and 3 spayed females. The dogs were
housed as a group in a confinement (10 ×
10 m) located under a roof, but otherwise
with open air. Within the confinement there
were 12 cages (1.0 × 0.5 × 0.6 m) with
plastic grated floor. The animals could move freely within the confinement, including the
open cages. However, during feeding and
feces collection intervals, the dogs were
locked up in their own cage.
Experimental design
The dogs were subjected to a 3 × 3
Latin square design with three experimental
diets and three periods of three weeks each.
Per diet order there were 3 or 4 dogs. Table
1 shows the ingredient and analyzed
composition of the three experimental diets.
The control diet was a commercial diet of
one production batch. The extruded diet
was homogenized, water was added and the
mixture was put through a pelleting
machine. The pellets were sundried. The test diets were made in the same manner,
but after homogenizing either 10 % palm oil
or the structured fat, (Cargill, Schiedam, The
Netherlands), was added. According to the
manufacturer, the structured fat contained
44% palmitic acid (P) and 55% stearic acid
(S). The composition of triacylglycerols (with
P or S at the 1, 2 and 3 position of the
glycerol molecule) was as follows: PPP,
6.3%; SSS, 6.7%; SPS, 4.8%; PSP, 33.9%; SSP,
35.7% and PPS, 8.1%. The manufacturer
declared a slip melting point of 55-60 oC for
the structured fat.
A restricted amount of each diet was fed in two equal portions per day. During
feeding, the dogs were confined in their own
cage for a period of 15 min. The daily
amount of food provided was equivalent to
5,752 kJ (1,375 kcal) and 4,314 kJ (1,031 kcal)
of metabolizable energy for the males and
females, respectively. The amounts of
energy were equivalent to those fed prior to
the experiment. To calculate the energy
value of the experimental diets, the energy
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
51
values for protein, fat and non-structural
carbohydrates were taken to be 17 (4.06), 37
(8.84) and 16 (3.82) kJ (kcal) metabolizable
energy per gram. It was assumed that crude
fiber and the structured fat would not
provide energy. The calculated energy value
of the control diet was 1,612 kJ (385
kcal)/100 g. For the test diets with palm oil or structured fat the calculated energy
densities were 1,821 (435) and 1,451 (347
kcal) kJ/100 g. The energy density of the
control diet was based on the guaranteed
analysis panel on the packaging: crude
protein, 27 %; crude fat, 13 %; crude fiber, 3
%; ash, 6 %; moisture, 9 %. During the last 5
days of each period, the dogs were locked
up in their own cage. From each dog the
feces were collected quantitatively.
Measurements
At the beginning of each period, body
weights of the dogs were determined. Throughout the experiment, the feces
quality was scored on a 1-5 scale (Waltham
Faecal Grading System). Feed and feces
samples were processed for the proximate
analysis of macronutrients (dry matter, crude
fat, crude protein, crude fiber, ash) and
minerals (calcium, phosphorus) as described
(Vasupen et al., 2008). Nitrogen-free extract
was calculated as residual fraction.
Statistical analysis
The data were evaluated for diet
effects with the use of ANOVA. If there were
statistically significant diet effects, the three
diet groups were compared with the Tukey
test. The paired Student’s t test was used to
evaluate the digestibilities of the two fat
sources. P<0.05 was taken as criterion of statistical significance.
Results
Table 1 shows the analyzed
composition of the experimental diets. The
protein content of the control diet was
lower than that declared by the
manufacturer. As would be expected the
addition of palm oil and structured fat raised
the amount of crude fat in the diet, the
increase being somewhat smaller than that
calculated. The addition of extra fat lowered
the concentrations of crude prSotein and
minerals. It was detected that the feces collected
during the first period of the Latin-square
design was not pooled properly. The feces
samples were discarded and the experiment
was extended by repetition of the first
period. Throughout the experiment there
were no food refusals: each dog ate its
ration within 15 min after administration.
Within each feeding period, there was no
significant change in body weight. Initial
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
52
Table 1 Ingredient and analysed composition
of the experimental diets Control Palm
oil
Structured
fat
Ingredient, g
Commercial
diet
1,000 900 900
Palm oil - 100 -
Structured fat - - 100
Chemical analysis, % of dry matter
Dry matter* 92.8 94.4 92.6
Crude fat 13.3 20.0 20.7
Crude protein 22.8 21.3 21.7
Crude fiber 3.6 3.3 3.9
Nitrogen-free
extract
53.5 49.3 47.6
Ash 6.8 6.1 6.1
Calcium 1.12 0.98 1.04
Phosphorus 0.74 0.68 0.66
*Expressed on product basis.
body weights were 26.8 ± 0.4 kg (mean ±
SEM) for the males and 20.9 ± 0.5 kg for the
females. The final body weights were 31.5 ±
0.5 and 25.3 ± 0.7 kg.
The inclusion of structured fat versus
palm oil in the diet significantly elevated the
amount of fresh and dry feces (Table 2). The
diet containing structured fat significantly
increased the percentage of dry matter in
feces. The mean values were 30.9 % for
both the control and palm-oil diet. After
feeding the structured-fat diet, the feces
contained 34.1 % dry matter. The SEM was
0.34 %. The feces score was slightly, but
significantly, lowered by the addition of
either palm oil or structured fat to the diet
(Table 2). A feces score of 2.5 is equivalent
to well formed stools with a slightly moist
surface.
Apparent digestibility of dry matter
was reduced by 2.7 % units after feeding the diet with structured fat (Table 3). The intake
of palm oil did not influence dry-matter
digestibility. Structured fat versus palm oil in
the diet significantly reduced apparent,
total-fat digestibility. The digestibility of
crude protein was not differently influenced
by the experimental diets. The addition of
fat to the diet markedly raised the apparent
digestibility of crude fiber, irrespective of the
type of fat. Group mean apparent
digestibility of the nitrogen-free extract was
lowered by the addition of palm oil to the
diet, but more so, and significantly, by the
addition of structured fat. The three diets did not differently influence the apparent
digestibility of ash. Calcium absorption was
not clearly affected by diet, but phosphorus
absorption was significantly lowered by high
fat intake (Table 3).
The apparent digestibilities of palm oil
and structured fat were calculated by the
difference method. The mean digestibility of
palm oil was found to be 96.6 ± 2.61 % and
that of structured fat was 68.8 ± 18.71%
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
53
Table 2. Feces production and score for dogs (n=11) fed the experimental diets
Control Palm oil Structured fat SEM P value
Feces g/day 225a,b 204b 255a 7.3 0.027
g dry matter/day 69b 63b 87a 2.3 <0.001
Score 2.6a 2.5b 2.5b 0.02 0.028 a,b Means not sharing the same superscript letter are significantly different (P<0.05)
Table 3. Apparent digestibility of nutrients in dogs (n =11) fed the experimental diets
Control Palm oil Structured fat SEM P value
Apparent digestibility, % of intake
Dry matter 79.0 79.0 76.3 0.62 0.079
Crude fat 93.9b 95.1b 83.8a 1.40 <0.001
Crude protein 79.2 79.1 79.9 2.05 0.959
Crude fiber 33.7a 43.1b 44.1b 1.65 0.004
Nitrogen-free extract 83.0b 81.4b 77.8a 1.27 0.028
Ash 33.0 30.9 37.1 2.12 0.578
Calcium 49.0 47.0 50.3 2.57 0.670 Phosphorus 64.0b 57.5a 58.6a 1.77 0.033 a,b Means not sharing the same superscript letter are significantly different (P<0.05)
(means ± SD). The difference was statistically significant (P<0.001).
Discussion
This study shows that the apparent
digestibility of palm oil in dogs is 96.6 %. For
comparison, an earlier experiment with dogs
documents that the apparent digestibility of
soybean oil, lard and beef tallow is 98 % for
all three fat sources (Gröner and Pfeffer,
1997). The observed digestibility for palm oil can be considered accurate.
The slip melting point of the
structured fat was 55 - 60 OC and the
apparent digestibility in the dogs was 68.8 %.
In rats, there is a strong, negative correlation
between fat digestibility and melting point
above 30 oC (Clifford et al., 1986). The rats in
the study of Clifford et al. (1986) were fed
diets containing 0.82 % safflower oil and 8%
of either trimyristin, tripalmitin or tristearin.
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
54
For safflower oil a digestibility of 95 % was
assumed and the digestibilities of the
variable fats were calculated. Trimyristin,
tripalmitin and tristearin were found to have
an apparent digestibility of 86, 31 and 13%,
respectively. The melting points were
reported to be 57, 64 and 73 oC (Clifford et
al., 1986). Thus, the observed digestibility of the structured fat in dogs corroborates the
negative relationship between melting point
and digestibility in rats.
The nutritional energy value of fat in
dog food is commonly set at 37 kJ (8.84
kcal) metabolizable energy per gram.
According to this study, the energy value of
the structured fat would be equivalent to
(68.8/96.6) x 37 = 26 kJ (6.21 kcal). For
dietary non-structural carbohydrates
(nitrogen-free extract), the assumed energy
value is 16 kJ (3.82 kcal)/g. The energy value
of the structured fat is much higher than
that of non-structural carbohydrates. Clearly, the structured fat cannot serve as substitute
for carbohydrates to lower the energy value
of dog food. Consequently, the structured
fat cannot be used for the formulation of a
very-low energy, weight-reduction diet.
The addition of the structured fat to
the diet instead of palm oil increased the
amount of feces. This is explained by the
lower average digestibility of dry matter seen
after feeding the diet with structured fat.
The lower digestibility of dry matter in turn
is explained by the significantly lower
digestibility of fat and nitrogen-free extract.
Possibly, the presence of the structured fat
in the digesta interferes with the enzymatic
digestion and/or absorption of
carbohydrates. The structured fat versus
palm oil did not significantly influence the apparent digestibility of crude protein, crude
fiber and ash.
The two high-fat diets versus the
control diet significantly increased the
apparent digestibility of crude fiber and
decreased that of phosphorus. These
observations are difficult to explain. High fat
intake would be expected to lead to higher
contents of fatty acids in the hindgut. This
would inhibit microbial fermentation of fiber
and thus induce lower apparent digestibility
of crude fiber. High fat intake would be
expected to cause the formation of calcium
soaps in the small intestinal lumen. The resulting decrease in calcium availability for
the formation of calcium phosphate
precipitate would raise apparent phosphorus
absorption. We are not aware of other
studies in dogs fed a high-fat diet and
describing the effect on fiber and
phosphorus digestibility. In cats, the addition
of beef tallow to the diet, at the expense of
an isoenergetic amount of carbohydrates,
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
55
did not influence phosphorus absorption
(Beynen and Opitz, 1994).
In conclusion, in this study with dogs
the structured fat consisting of stearic and
palmitic acid was found to have a low
digestibility, when compared with regular fat
sources. However, the digestibility was not
low enough to make the structured fat under study a candidate ingredient for the
formulation of very-low energy, weight-
reduction diets. The structured fat
significantly reduced the digestibility of non-
structural carbohydrates, thereby lowering
the energy value of this diet constituent, but
with little impact on the energy content of
the whole diet.
References
Beynen, A.C. and Opitz, R. 1994. Isoenergetic
substitution of dietary fat (beef tallow)
for carbohydrates (cooked corn starch
plus dextrin) does not affect magnesium absorption in cats. J. Anim.
Physiol. Anim. Nutr. 72: 176-183.
Clifford, A.J., Smith, L.M., Creveling, R.K.,
Hamblin, C.L. and Clifford, C.K. 1986.
Effects of dietary triglycerides on
serum and liver lipids and sterol
excretion of rats. J. Nutr. 116: 944-956.
German, A.J. 2006. The growing problem of
obesity in dogs and cats. J. Nutr. 136:
1940S-1946S.
Gröner, T. and Pfeffer, E. 1997. Digestibility of
organic matter and digestible energy in
single ingredients of extruded dog feeds
and their effects on faecal dry matter
concentration and consistency. J. Anim.
Physiol. Anim. Nutr. 77: 214-220.
Kealy, R.D., Lawler, D.F., Ballam, J.M., Mantz,
S.L., Biery, D.N., Greeley, E.H., Segre, M., Smith, G.K. and Stowe, H.D. 2002.
Effects of diet restriction on life span
and age-related changes in dogs. J.
Am. Vet. Med. Assoc. 220: 1315-1320.
Miller, K.W., Wood, F.E., Stuard, S.B. and
Alden, C.L. 1991. A 20-month olestra
feeding study in dogs. Fd Chem.
Toxicol. 29: 427-435.
Mlacnik, E., Bockstahler, B.A., Műller, M.,
Tetrick, M.A., Nap, R.C. and Zentek J.
2006. Effects of caloric restriction and
a moderate or intense physiotherapy
program for treatment of lameness in
overweight dogs with osteoarthritis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 229: 1756-1760.
Vasupen, K., Yuangklang, C., Wongsuthavas,
S., Srenanul, P., Mitchaothai, J. and
Beynen, A.C. 2008. Macronutrient
digestibility in Kadon pigs fed diets
with isonitrogenous amounts of various
carbohydrate sources. Trop. Anim.
Health Prod. 40: 249-253.
เฉลมพล เยองกลาง และคณะ / สตวแพทยมหานครสาร. 2559. 11(1): 47-56.
56
Weber, M., Bissot, T., Servet, E., Sergheraert,
R., Biourge, V. and German, A.J. 2007. A
high-protein, high-fiber diet designed
for weight loss improves satiety in
dogs. J. Vet. Intern. Med. 21: 1203-
1208.