a nÁlises b romatolÓgicas profa. ionara f. r. vieira proteÍnas em alimentos

ANÁLISES BROMATOLÓGICAS

Profa. Ionara F. R. Vieira

PROTEÍNAS PROTEÍNAS EM ALIMENTOSEM ALIMENTOS

PROTEÍNASDEFINIÇÃO Substâncias orgânicas complexas (C,

H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn). Polímero de alto peso molecular Unidade básica: aminoácidos

IMPORTÂNCIA• nutricional• propriedades

sensoriais2

Unidades estruturais básicas das proteínas

PROTEÍNASAMINOÁCIDOS (aa)

3

Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) característica, que influencia suas propriedades físico-químicas.

Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica.

Arranjo tetraédrico atividade ótica isômero L e D

Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas naturais.

AMINOÁCIDOS (AA)AMINOÁCIDOS (AA)

4

alanina

valina

leucina

triptofano

fenilalanina

metionina


Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:Apolares ou hidrofóbicas, exemplos:

5

ácido aspártico

histidinaasparagina glicina

serina ácido glutâmico

tirosina


Polares ou hidrofílicos, Polares ou hidrofílicos, exemplos:exemplos:

6

PROTEÍNASPROTEÍNAS

7

PROTEÍNASPROTEÍNASSão polímeros de aminoácidos. Vinte tipos de aminoácidos ocorrem

naturalmente nas proteínas.Diferem com o tipo, número e seqüência de

aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional.

Apresentam 50-55% de C, 20-23 % de O, 14-18 % de N14-18 % de N, 6-8% de H, 0-4 % de S.

8

ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS

ESTRUTURA PRIMÁRIASeqüência linear de aminoácidos

Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula

Varia em 3 aspectos: número, seqüência e natureza dos AA


9

ESTRUTURA SECUNDÁRIA

Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica

Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares

Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares


11

ESTRUTURA TERCIÁRIA

Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas

Estabilização: Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da

molécula


12

ESTRUTURA QUATERNÁRIA

Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes

Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc.


13

Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.

Aminoácidos essências (lisina, triptofano,

metionina, leucina, isoleucina e valina) não

podem ser sintetizados pelo organismo humano.

Proteínas alimentares são digeríveis, não

tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas

moleculares, atributos nutricionais e

propriedades físico-químicas.

PROTEÍNAS NO ALIMENTOPROTEÍNAS NO ALIMENTO

14

Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos.

Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, freqüentemente determinam sua textura, por exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe.


15

Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes.

Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos, castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.


16

IMPORTÂNCIA

Conhecer o valor nutritivoDeterminação da composição centesimal

de um alimento e análise para rotulagemEstimar rendimento industrialAvaliar a qualidade (ex.: glúten

qualidade da farinha)Avaliar a influência nas propriedades

sensoriais

MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS

17

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃOMÉTODOS DE DETERMINAÇÃO

A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por

nêutrons; ativação por prótons

B. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol

reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia

18

É a determinação mais utilizada.

Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio.

Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%.

%Proteinas = F x %N%Proteinas = F x %N

Fatores de conversão específicos: trigo-5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.

Análise de nitrogênio

19

Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.

Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento.

Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas.

F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão.

Proteínas - KjeldahlProteínas - Kjeldahl

20

KJELDAHLKJELDAHL

É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado.

Tem alta precisão e boa reprodutibilidade.

O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.digestão, destilação e titulação.

21

MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL1a etapa: DigestãoO alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4

+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim

permanece na solução:

CHON CHON (alimento)(alimento) (NH (NH44))22SOSO44 + C0 + C02(g)2(g) + H + H220 0 (g)(g) (1)(1)

22

MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃODepois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia:

(NH(NH44))22SOSO44 + 2 NaOH + 2 NaOH 2NH 2NH33 + 2H + 2H22O + NaO + Na22SOSO44 (2)

A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso.

NHNH33 + H + H33BOBO33 NH NH44++ + H + H22BOBO33

-- (íon borato)(íon borato) (3) 23

DIGESTOR

DESTILADOR

Água de arraste

Amostra

NaOH

Erlenmeyer com solução de H3BO3

24

MÉTODO KJELDAHLMÉTODO KJELDAHL3a etapa: Titulação O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico.

HH22BOBO33-- + H + H++ H H33BOBO33 (4)

A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio.O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado:

%Protein = F x %N%Protein = F x %N 25

Falhas do processo (Kjeldahl): 1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas,

dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos.

3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos

5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes

26

DESTILAÇÃO DIRETADESTILAÇÃO DIRETA Modificação do método de kjeldahl.Sem digestão.Amostra + NaOH/Na2SO4 NH3

Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido.

Necessita de curva de calibração.É usado como rotina em alguns

alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).

27

MÉTODO DUMAS MÉTODO DUMAS (1831)(1831)Também determina N total.

Princípio: Combustão a 700-900°C – produz CO2, H2O e N2.

O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental.

N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final.

Combustão da amostra (700º-800ºC)

Medição do N

gasoso

28

MÉTODO DUMASMÉTODO DUMASNecessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F.

Problemas: sujeita à erros pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa.

Equipamento - melhora precisão;

- mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl;

-- não necessita de reagentes ou catalisador.

TURBIMÉTRICOTURBIMÉTRICO Fundamento: medida da turbidez

causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico.

Precipitante + proteína turbidez Mede-se o grau de turbidez. Rápido, simples (proteínas líquidas). Desvantagens: não é usado p/sólidos;

depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.

30

MÉTODOS MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOSESPECTROFOTOMÉTRICOS

As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas.

A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração.

As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida.

31

MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS UV E VISÍVELVISÍVEL

Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas.

Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho.

Absorbância depende do tipo de proteína. 32

Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxavioleta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas.

Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro.

Faz-se a reação e após uns 15-20 minutos lê-se a absorbância a 540 nm.

Determina proteínas.

Teste do Biureto (Teste do Biureto (Riegler, 1914)

33

Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.

34

B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)

Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas).

Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul.

Cor azul colorímetro (500 a 750 nm) curva padrão. 35

B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Follin-Ciocalteau-Lowry)

Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de

incubação Necessita de uma curva padrão com proteína

conhecida Intensidade da cor depende de cada proteína.

36

http://www.igpozzo.it/claroline/claroline/img/biureto.jpg

C. Métodos Espectofotométricos UVC. Métodos Espectofotométricos UVPrincípio - proteínas possuem absorção UV em

280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina.

Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo.

Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos.

Ácidos nucléicos podem interferir. 37

Método Dye-bindingMétodo Dye-binding Corantes que reagem quantitativamente

com proteínas. Lisina, histidina e arginina reagem com -

SO3H. Corante + proteína complexo insolúvel. Mede-se o excesso de corante

colorimetricamente. A quantidade de proteína :Corante ligado = corante inicial – corante livre.

Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.

38

DYE-BINDINGDYE-BINDING

Fundamento:

Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico.

Desvantagens: Aquisição do equipamento

Amostra +

corante (exc.)

Formação de um complexo

insolúvel

Separação (centrifugaçã

o ou filtração)

Mede o excesso de corante que não reagiu

Por diferença obtém-se a

quantidade de proteína

39

SEPARAÇÃO DE PROTEÍNASSEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS

Solubilidade

Cromatografia: - tamanho,

- carga, - adsorção.

40

ANÁLISE DE AMINOÁCIDOSANÁLISE DE AMINOÁCIDOSDeterminar a composição de aminoácidos

nas proteínas.A proteína é hidrolisada usando um

ácido forte ou enzimas libera aminoácidos.

Cromatografias separam os aminoácidos troca iônica, afinidade ou por absorção.

41

a nÁlises b romatolÓgicas profa. ionara f. r. vieira proteÍnas em alimentos

Documents