a génexpresszió minőségbiztosítási rendszerei · szent istván egyetem a génexpresszió...
TRANSCRIPT
Szent István Egyetem
A génexpresszió minőségbiztosítási rendszerei:
a Nonsense-Mediated Decay mRNS bontó rendszer
szabályozó elemei
Kerényi Farkas
Gödöllő
2017
Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet
A doktori iskola
megnevezése: Biológiatudományi Doktori Iskola
tudományága: molekuláris biológia
vezetője: Dr. Nagy Zoltán
intézetvezető egyetemi tanár, az MTA doktora
SZIE, Mezőgazdaság- és Környezettudományi Kar,
Növénytani és Ökofiziológiai Intézet
Témavezető: Dr. Silhavy Dániel
tudományos tanácsadó, az MTA doktora
NAIK Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóintézet
Genetikai főosztály, Növényi RNS Biológia csoport
........................................................... ...........................................................
Az iskolavezető jóváhagyása A témavezető jóváhagyása
1. TARTALOMJEGYZÉK
1. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................................. 1
2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ..................................................................................................... 3
3. BEVEZETÉS .............................................................................................................................. 4
4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ....................................................................................................... 6
4.1. A génexpresszió szabályozása ............................................................................................. 6
4.2. Az mRNS-ek szerkezete és lebomlása ................................................................................ 7
4.3. Citoplazmás mRNS minőségbiztosítási rendszerek ............................................................ 9
4.4. A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD)................................................................... 10
4.4.1. Az NMD jelentősége ................................................................................................. 10
4.4.2. Az NMD működése, cisz-elemei és transz-faktorai .................................................. 12
4.4.3. Az NMD korai szakasza ............................................................................................ 14
4.4.3.1. A hosszú 3'UTR alapú NMD ............................................................................. 15
4.4.3.2. Az intron alapú NMD ........................................................................................ 17
4.4.3.3. Az uORF alapú NMD ........................................................................................ 19
4.4.4. Az UPF1 foszforilációs ciklusa ................................................................................. 20
4.4.5. Az NMD kései lépései ............................................................................................... 27
4.5. A növényi NMD vizsgálatára használt tesztrendszerek .................................................... 31
4.5.1. Agroinfiltráción alapuló tranziens génexpresszió ...................................................... 32
4.5.2. Agroinfiltráción alapuló VIGS-komplementációs tranziens NMD tesztrendszer ..... 33
5. ANYAG ÉS MÓDSZER ........................................................................................................... 35
5.1. Növények ........................................................................................................................... 35
5.2. Agrobaktérium törzs .......................................................................................................... 35
5.3. Expressziós vektorok és NMD tesztkonstrukciók ............................................................. 35
5.4. PCR-mutagenezis .............................................................................................................. 35
5.5. Agroinfiltrálás .................................................................................................................... 36
5.6. Vírus indukálta géncsendesítés és VIGS-komplementáció ............................................... 36
5.7. RNS kivonás növényi szövetből ........................................................................................ 37
5.8. Northern blot ..................................................................................................................... 37
5.9. Fehérje kivonás növényi szövetből.................................................................................... 38
5.10. Western blot ..................................................................................................................... 38
5.11. Immunprecipitáció (IP) ................................................................................................... 38
5.12. Foszfofestés ..................................................................................................................... 39
6. EREDMÉNYEK ....................................................................................................................... 40
6.1. Növényi mRNS-ek 3’ nem transzlálódó régiójában helyeződő intronok
finomtérképezése ...................................................................................................................... 40
6.2. A növényi UPF1 foszforegulációja ................................................................................... 42
6.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának S/TQ potenciális foszfohelyei részt vesznek az
NMD-ben ............................................................................................................................. 43
6.2.2. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része erősen foszforilált, de nincs szerepe
az NMD-ben ........................................................................................................................ 47
6.2.3. Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő S/TQ helyek valóban
foszforiláltak, és szükségesek az NMD-hez ........................................................................ 48
6.2.4. A funkcióját vesztett N-terminális UPF1 mutánsoknak domináns-negatív hatásuk
van ........................................................................................................................................ 51
6.2.5. Az UPF1 fehérje C-terminális régiója funkciójukat tekintve redundáns részekre
bontható ............................................................................................................................... 52
6.2.6. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén különböző funkciójú S/TQ helyek
vannak .................................................................................................................................. 54
6.2.7. AZ UPF1 C-terminális régiójának C1 részén az S/TQ potenciális foszfohelyek
valóban foszforiláltak .......................................................................................................... 57
6.3. Új tudományos eredmények .............................................................................................. 58
7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ............................................................................ 59
7.1. A stop kodon és a 3'UTR-ben helyeződő intron közötti távolság szerepe a növényi NMD-
ben ............................................................................................................................................ 59
7.2. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben ............................................... 61
7.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben .............................. 61
7.2.2. Az UPF1 C-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben .............................. 63
7.2.3. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben ....................................... 65
8. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................................. 67
9. SUMMARY .............................................................................................................................. 69
MELLÉKLETEK
3
2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
A fontosabb, többször előforduló rövidítések abc sorrendben.
CBP - cap binding protein
CBC - cap binding complex
CCR4 - C-C motif chemokine receptor 4
CFP - cyan fluorescent protein
CH domain - cystein-histidin rich domain
DCP - decapping protein
DECID complex - decay inducing complex
DSE - downstream sequence element
dsRNS - double stranded RNS
EBM - EJC binding motif
eIF - eucaryote initiation factor
EJC - exon junction complex
eRF - eucaryote release factor
FRET-FLIM - fluorescence resonance energy transfer - fluorescence lifetime imaging
GFP - green fluorescent protein
MS - mass spectrometry
NGD - no-go decay
NMD - nonsense-mediated mRNA decay
NOT - negative regulator of transcription
NR - nuclear receptor
NSD - non-stop decay
PABP - poly(A)-binding protein
PDS - phytoene desaturase
PIKK kináz - phosphatidylinositol 3-kinase related kinase
PNRC2 - proline-rich nuclear receptor coregulatory protein 2
PP2A - protein phosphatase 2A
PTC - premature termination codon
RISC - RNA induced silencing complex
RNP - ribonucleoprotein
SMG - suppressor with morphogenetic effect on genitalia
SMG1C - SMG1 complex
sRNS - small RNS
SURF complex - SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3 complex
TRV - Tobacco Rattle Virus
U1DN - UPF1 dominant-negative
UPF - up frameshift
uORF - upstream open reading frame
UTR - untranslated region
VIGS - virus induced gene silencing
XRN - 5'-3' exoribonuclease
YFP - yellow fluorescent protein
4
3. BEVEZETÉS
Az eukarióta sejtekben a génexpresszió szigorúan szabályozott. A mennyiségi szabályozás mellett
nagyon fontos a minőségi ellenőrzés is, erre a feladatra alakultak ki a különféle minőségbiztosítási
rendszerek. Ezek a rendszerek azért felelnek, hogy a sejtekben csak hibátlan fehérjék legyenek
jelen. A minőségbiztosítási rendszerek a génexpresszió minden lépését ellenőrzik, közülük a
legváltozatosabbak az mRNS-eket, mert az mRNS-ek érése rendkívül bonyolult folyamat, ezért
annak során sok a hibalehetőség. A különböző hibákat különféle rendszerek ismerik föl,
melyekben az a közös, hogy a felismert hibás RNS-eket nem kijavítják, hanem azok lebontását
indukálják, mégpedig a vad típusú RNS-eket is lebontó útvonalakon keresztül. Az evolúció során
kialakult különféle minőségbiztosítási rendszerek közül az egyik, a Nonsense-Mediated mRNA
Decay (NMD), a korai stop kodont (premature termination codon - PTC) tartalmazó hibás mRNS-
eket ismeri föl. Az ilyen mRNS-ekről csonka, gyakran domináns-negatív hatású fehérjék
keletkezhetnek, melyek különböző betegségeket okozhatnak. Az NMD a hibás mRNS-ek
lebontása mellett részt vesz egyes vad típusú gének expressziójának szabályozásában is. Az NMD-
t irányító legfontosabb fehérjék (transz faktorok), az UPF1, az UPF2 és az UPF3 (up frameshift 1,
-2, -3) az élesztőtől a gerincesekig konzerváltak. A cisz elemek azonban, amik alapján az NMD
fölismeri a hibás, PTC-t tartalmazó mRNS-eket, eltérőek. Az élesztő és a gerinctelen NMD
elsősorban azokat a stop kodonokat ismeri fel koraiként, amik után a 3’UTR szokatlanul hosszú
(hosszú 3’ UTR alapú NMD). Gerincesekben viszont főként azok a stop kodonok minősülnek
korainak, amelyek után a 3'UTR-ben legalább 50 nukleotidnyi távolságra intron található, és az
intron kivágódása során az mRNS-re az exon junction complex (EJC) rakódik (intron alapú NMD).
A hibás mRNS felismerése során szerelődik össze az UPF1-UPF2-UPF3 komplex (NMD-
komplex), ami az mRNS lebontását indukálja. Állatokban a hibás mRNS felismerését és lebontását
összekötő kulcslépés az UPF1 SMG1 (suppressor with morphogenetic effect on genitalia 1) általi
foszforilációja, ugyanis a foszforilált UPF1-hez tudnak kötődni a degradációért felelős faktorok,
az SMG6, az SMG5/SMG7 heterodimer és a PNRC2 (proline-rich nuclear receptor coregulatory
protein 2). Az SMG6 az mRNS endonukleolitikus hasításával, az SMG5/SMG7 komplex
deadeniláció és decapping, a PNRC2 decapping kiváltásával hoz létre szabad, fehérjék által nem
védett végű mRNS-eket, amiket az RNS bontó exonukleázok hatékonyan és gyorsan lebontanak.
Az NMD tehát egy rendkívül fontos mRNS minőségbiztosítási rendszer. Ennek megfelelően
élesztőben, Drosophilában és emlősökben alaposan tanulmányozott és nagyon sok részletében már
ismert folyamat. Csoportunk korábban kidolgozott egy hatékony tranziens NMD tesztrendszert,
ami a növényi NMD cisz elemeinek és transz faktorainak azonosítására és vizsgálatára alkalmas.
5
Ennek a kísérleti rendszernek a segítségével a csoport feltárta a növényi NMD mechanizmusának
alapjait. Bizonyították, hogy növényekben a hosszú 3’UTR alapú és az intron alapú NMD is
működik. Azonosították a növényi NMD fő transz faktorait, az UPF1, az UPF2, az UPF3, és az
SMG7 géneket. Igazolták, hogy ezek a gének kellenek mindkét típusú növényi NMD-hez, míg az
emlős EJC két összetevőjének (Y14 és Mago) ortológjai növényekben csak az intron alapú NMD-
hez szükségesek. Kiderítették, hogy nem minden 3’UTR intron okoz NMD-t növényekben, a stop
kodonhoz nagyon közeli intronok - az emlősökhöz hasonlóan – növényekben sem indukálnak
NMD-t. Valószínűsítették azt is, hogy az UPF1 növényekben is foszforegulált lehet. Kimutatták
ugyanis, hogy a növényi UPF1 N- és C-terminális régiója funkcióját tekintve redundáns, mindkettő
tud NMD-t indukálni, és mindkét régió foszforilált.
Miután kiderült, hogy növényekben is pozíció függő az, hogy a 3’UTR intronok okoznak-
e NMD-t vagy sem, illetve az is, hogy az emlős NMD-ben kulcsszerepet játszó EJC egyes fehérjéi
a növényi intron alapú NMD-hez is szükségesek, valószínűsítettük, hogy a szerkezeti
hasonlóságok miatt növényekben is körülbelül 50 nukleotid lehet az a távolság a stop kodon és az
intron kivágódásának helye között, ami már NMD-t indukál. Ezen feltételezésünket, valamint azt,
hogy az emlősökéhez hasonlóan igen-nem válasz van, vagy pedig a távolság növekedésével van
valamiféle fokozatosság, olyan NMD riporter GFP konstrukciókkal kívántuk megvizsgálni,
melyek 3'UTR-jébe a stop kodontól különböző távolságra intront klónoztunk.
Az UPF1 meglehetősen konzervatív fehérje, a növényi UPF1 N- és C-terminális régiói
ugyanúgy S/TQ potenciális foszfohelyekben gazdag, mint az emlős UPF1. Ezért kérdéses volt,
hogy vajon ezek az S/TQ helyek kellenek-e a növényi NMD-hez is, hogy ezek a helyek
foszforiláltak-e, és ha igen, a foszforilációra szükség van-e az NMD-hez. Ezek vizsgálatára pont-
és deléciós mutáns UPF1 konstrukciókat terveztünk készíteni, melyek alkalmasak az S/TQ
potenciális foszfohelyek, így az N- és C-terminális régiók funkcionális térképezésére.
Célkitűzéseink tehát pontokba szedve:
1. Meg kívántuk határozni, hogy a 3'UTR-ben helyeződő intronoknak növényekben is
a stop kodontól legalább 50 nukleotidra kell-e lenniük ahhoz, hogy NMD-t
okozhassanak, és hogy a STOP-EJC távolság növekedésével az NMD hatékonysága
is változik-e.
2. Ki akartuk deríteni, hogy az UPF1 N-, illetve C-terminális S/TQ-gazdag régióiban
az S/TQ helyekre szükség van-e az NMD-hez, és ha igen, melyek ezek; valamint azt,
hogy ezek az S/TQ helyek foszforiláltak-e, és ha igen, a foszforiláció szükséges-e az
NMD-hez.
6
4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
Ebben a fejezetben legfőképp a munkám kezdetekor rendelkezésre álló ismereteket összegzem.
Az eredményeink publikálásával egy időben, illetve azóta megjelent új információkat a
"Következtetések és javaslatok" fejezetben tárgyalom.
4.1. A génexpresszió szabályozása
Az eukariótákban a génexpresszió szigorúan és több szinten szabályozott, így biztosítva, hogy egy
adott sejt típusban, az adott fejlődési stádiumban csak az ott szükséges fehérjék legyenek jelen. A
génexpresszió mennyiségi és minőségi szabályozására külön rendszerek alakultak ki.
Hagyományosan a génexpresszió szabályozása alatt a mennyiségi szabályozást értjük, mely azt
határozza meg, hogy adott helyen és időben egy génről mennyi RNS és fehérje termelődjön. Az
optimális sejtműködéshez azonban nagyon fontos a minőségi szabályozás is, ezt a feladatot
különféle minőségbiztosítási rendszerek végzik. Ezek a minőségbiztosítási rendszerek azért jöttek
létre, hogy hibás fehérjék ne termelődhessenek. Mivel az eukariótákban az mRNS érése rendkívül
komplex folyamat, a minőségbiztosítási mechanizmusok nagy része az mRNS-eket ellenőrzi. Az
evolúció során pedig úgy alakult, hogy ezen rendszerek egy része új funkciót is nyert: némely
hibátlan, vad típusú mRNS szintjét is szabályozzák.
Az mRNS-ek mennyisége a transzkripció és a degradáció intenzitásától függ. A
transzkripció szabályozásához képest a poszttranszkripciós szabályozó mechanizmusok pontos
működéséről egyelőre sokkal kevesebbet tudunk. Az eukarióta mRNS-ek fehérjékkel alkotnak
komplexet, szabad formában - normális körülmények között - nincsenek jelen a sejtben. Ezek a
fehérjék védik az RNS-t a lebomlástól, részt vesznek az mRNS érési és export folyamataiban,
valamint biztosítják a normális citoplazmás lokalizációt és transzlációt (Houseley and Tollervey,
2009). Az mRNS érésekor annak 5' végére egy sapka (cap) kerül, mely az RNS-bontó enzimektől
védi a transzkriptumot; az intronok kivágódnak (splicing); az RNS a poliadenilációs jel közelében
elvágódik és a 3' végére poliadenin(poliA)-farok szintetizálódik (Perales and Bentley, 2009). Azon
fehérjék némelyike, amik az mRNS exportjához kellenek, a transzkripció során kapcsolódik az
mRNS-hez. Ezek és a később felrakódó fehérjék az exporton kívül szerepet játszanak a sejten
belüli lokalizációban, valamint a transzláció lépéseiben. Az mRNS érésének lépései is szigorú
ellenőrzés mellett zajlanak, hogy a kellő helyen és időben megfelelő mennyiségű és minőségű
7
fehérje álljon rendelkezésre (Sonenberg and Hinnebusch, 2009, Martin and Ephrussi, 2009, Moore
and Proudfoot, 2009).
Az mRNS-ek stabilitása több tényezőtől függ, fejlődési stádiumtól és környezeti
hatásoktól függően nagyban változhat. Az mRNS-ek is szigorú kontroll alatt degradálódnak, ennek
helyét és idejét az mRNS stabilitását meghatározó cisz-elemek és a citoplazmában jelen lévő
transz-faktorok koncentrációja határozza meg. Hogy egyes mRNS-ek szabályozása mennyire
különbözhet egymástól, azt az is mutatja, hogy pl. emlősökben stressz hatására az mRNS-ek
negyedének változott az expressziós szintje, egyik felének az mRNS transzkripcióján, másik
felének a degradációján keresztül (Fan et al., 2002). Az mRNS-ek egy másik, jelentős része stressz
esetén nem lebomlik, hanem transzlációs gátlás alá esik, és vannak olyan mRNS-ek is, amelyeket
különféle mechanizmusok menekítenek ki ez alól a transzlációs gátlás alól (Spriggs et al., 2010).
4.2. Az mRNS-ek szerkezete és lebomlása
Az eukarióta mRNS-ek féléletideje változatos, de általában igen hosszú, növényekben átlagosan
csaknem 6 óra (Narsai et al., 2007). Ezt a stabilitását az mRNS molekulák zárt gyűrű szerkezete
biztosítja, mely úgy alakul ki, hogy az érés során felrakódott sapkához sapka-kötő fehérjék (cap
binding protein, CBP), míg a 3' végre szintetizálódott polyA-farokhoz polyA-kötő fehérje (polyA
binding protein, PABP) kapcsolódik, a CBP-k és a PABP pedig egymáshoz kötődnek (Moore and
Proudfoot, 2009). Ez a stabil mRNS-fehérje komplex (ribonucleoprotein, mRNP) már védve van
az RNS-bontó exonukleáz enzimektől. A gyűrű alakú szerkezet, illetve a kialakításában részt vevő
fehérjék a hatékony transzlációhoz is hozzájárulnak (Houseley and Tollervey, 2009).
A különböző lebomlási útvonalak teszik lehetővé, hogy egy sejtben az akkor éppen
meglévő mRNS készletet szükség esetén - pl. stressz hatására - gyorsan le lehessen cserélni. Az
mRNS lebontásához a zárt gyűrűstruktúra megszüntetése az első lépés. Ezt az esetek többségében
a deadenilázok váltják ki, ezért a citoplazmás mRNS lebomlásnak ez a sebesség-meghatározó
lépése. A stop kodonhoz érkezett, termináló riboszómához - megfelelő tRNS hiányában - a tRNS-
hez hasonló szerkezetű eRF1 (eucaryotic release factor 1), illetve együttműködő partnere, az eRF3
kötődik. Az eRF3 ezután a PABP-vel is kapcsolódik, ez teszi lehetővé a hatékony transzláció
terminációt. A deadeniláció szabályozásának egyik népszerű modellje szerint a deadenilázok – a
PABP közreműködésével – minden terminációs eseménynél levágnak egy darabot a polyA-
farokból (Funakoshi et al., 2007, Wolf and Passmore, 2014, Celik et al., 2015). Ha a polyA-farok
8
1. ábra. mRNS lebomlási útvonalak eukariótákban.
Az mRNS-t egy sapka védi az 5' végen és egy poliA-farok, illetve az ahhoz kötődő PABP a 3' végen. Az
mRNS lebontási folyamatokban az első lépés szinte mindig a deadeniláció. Ezt decapping és 5'-3' irányú
lebontás követi (XRN1, XRN4), vagy pedig 3'-5' irányú lebontás (exoszóma). Emlősökben létezik egy ún.
scavanger decapping is, ami a 3'-5' irányú lebomlás végén történik. Ha az mRNS-t valamilyen endonukleáz
hasítja el (ezen az ábrán ez nincs feltüntetve), a szabad mRNS végeket ugyanezek az exonukleázok
támadják: a szabad 3' vég felől az exoszóma, a szabad 5' vég felől pedig az XRN1 illetve az XRN4. A
színes nyilak a különféle organizmusok útvonalait jelölik (zöld: növények, fekete: élesztő, piros: emlősök).
Az ábrát Chiba és munkatársai munkája alapján, módosítva közlöm (Chiba and Green, 2009).
a kritikus hossz alá kerül (kb. 20 adenin), a PABP leválik az mRNS-ről, ezzel a 3' vég szabaddá
válik a 3'-5' irányú exonukleázok, az exoszóma komplexek számára (1. ábra) (Belostotsky and
Sieburth, 2009).
A transzlálódó mRNS-en a PABP a sapka-kötő komplex egyik elemével, az eIF4G-vel
kapcsolódik (Silva et al., 2008, Wells et al., 1998). A PABP leválásával PABP-kötés hiányában
megszűnik a sapka stabilitása is, vagyis a deadenilációt gyors decapping követi (Tharun, 2009).
Ezzel az mRNS 5' vége is szabaddá válik s így egyúttal támadhatóvá is az 5'-3' exonukleázok
számára (1. ábra). Élesztőben és állatokban ez az enzim az XRN1 (5'-3' exoribonuclease).
Növényekben három ilyen enzimet ismerünk: az XRN2 és az XRN3 a sejtmagban, míg az XRN4
9
a citoplazmában lokalizálódik, ennek megfelelően az XRN4 felelős a decappinget követő 5'-3'
irányú mRNS lebontásért (Souret et al., 2004).
PolyA polimerizáció a cappinggel ellentétben a citoplazmában is zajlik, ezért a
citoplazmában a deadeniláció reverzibilis, míg a decapping irreverzibilis folyamat (Garneau et al.,
2007). Ez utóbbi lehet a magyarázata annak, hogy Arabidopsis thaliana-ban az xrn4 mutánsok
fenotípusa viszonylag enyhe: a decappingen átesett mRNS-ek már nem transzlálódnak, így előbb
vagy utóbb egy másik lebontási útvonal áldozatai lesznek.
Szükség esetén a deadenilációt meg is lehet kerülni, vagy akár föl is lehet gyorsítani.
Például az RNS interferencia alapú szabályozás (lásd később) esetén az mRNS elvágódik, ezáltal
keletkezik egy szabad 3' végű és egy szabad 5' végű RNS darab, amiket az exonukleázok azonnal
támadni tudnak (Voinnet, 2009). Felgyorsult deadenilációt, vagy deadenilációtól független
decappinget okozhatnak azok a fehérjék, amelyek az mRNS-ek cisz-elemeihez tudnak kötődni,
így gyorsítva az mRNS lebomlását (Garneau et al., 2007).
4.3. Citoplazmás mRNS minőségbiztosítási rendszerek
Ha az eukarióta sejtekben képződő jelentős mennyiségű hibás mRNS transzlálódna, akkor a vad
típusútól akár jelentősen eltérő aktivitású fehérjék is termelődnének. Ezért alakulhatott ki többféle,
a hibás mRNS-eket hatékonyan felismerő, és azokat lebontó RNS minőségbiztosítási rendszer
(Doma and Parker, 2006). A keletkező mRNS-ek ellenőrzése már a sejtmagban, rögtön a
transzkripció után elkezdődik és a citoplazmában folyó transzláció végéig tart. Eukariótákban
jelenleg négyféle, a citoplazmában működő RNS-szintű minőségbiztosítási rendszert ismerünk, az
RNS interferencia, No-Go decay (NGD), a Non-Stop decay (NSD) és a Nonsense-Mediated
mRNA decay (NMD) rendszereket. Ezek más-más módon azonosítják és bontják le a különböző
hibákat tartalmazó mRNS-eket.
Az RNS interferencia rendszere (más néven géncsendesítés vagy RNS silencing) a
kétszálú RNS-eket (double stranded, dsRNS), valamint cap vagy polyA nélküli mRNS-eket
azonosít (Baulcombe, 2005). A dsRNS-eket először a DICER endonukleáz hasítja rövid, kétszálú
kis RNS-ekre (small RNS, sRNS; 21-26 nt). Ezek a végrehajtó komplexekbe egyszálú (single-
stranded, ss) formában épülnek be és biztosítják azok szekvencia-specifitását. Ez alapján találja
meg az effektor komplex a komplementer szekvenciát hordozó mRNS-eket. A legfontosabb RNS
interferencia végrehajtó komplex, a RISC (RNA induced silencing complex) az mRNS-eket az
sRNS-mRNS kétszálú régió kb. közepén elhasítja, ezáltal csökkenti a target mRNS-ek
10
expresszióját, vagyis az azokat kódoló géneket csendesíti. Előfordul, hogy az sRNS és az mRNS
nem teljesen komplementer. Ha csak egy-két mismatch van az sRNS-en, még tud hasítani a RISC,
de ha több, akkor már nem képes elvágni a target mRNS-t, csak a transzlációját gátolja. (Hutvagner
and Simard, 2008, Liu et al., 2009, Voinnet, 2008, Wassenegger and Krczal, 2006). Az RNS
interferencia nem csak a minőségbiztosításban és több saját gén expressziójának transzkripcionális
és poszttranszkripcionális szabályozásában vesz részt, hanem egyúttal a növények leghatékonyabb
antivirális rendszere is (Llave, 2010).
Az NGD azokat az mRNS-eket bontja, amelyeken a transzláció elongáció elakadt,
például hibás nukleotidok vagy erős másodlagos szerkezet miatt. Az elakadt riboszóma a
Dom34/Pelota és Hbs1 fehérjékkel együtt az mRNS riboszómához közeli helyen történő
endonukleolitikus vágását indukálja (Doma and Parker, 2006, Swisher and Parker, 2009).
Az NSD olyan mRNS-ek felismerését végzi, melyekből - mutáció, hibás átírás vagy a
transzkripció korai terminációja miatt - hiányzik a stop kodon. A riboszóma így végigmegy az
mRNS-en, transzlálja a polyA-farkat is, ezzel lelöki a PABP-t, ami pedig az mRNS zárt gyűrű
szerkezetének felbomlásához, és az mRNS lebomlásához vezet (Frischmeyer et al., 2002). A
növényi NSD és NGD rendszerek kevésbé ismertek. Az NGD fő faktorainak (Dom34/Pelota és
Hbs1) növényi ortológjait már azonosították (Siwaszek et al., 2014), és mivel ősi rendszerről van
szó, valószínűleg a növényekben is működik. A gyors és hatékony élesztő NSD-hez szükséges
Ski7 növényi ortológja hiányzik (Atkinson et al., 2008), ennek ellenére ez a rendszer hatékonyan
működik növényekben is (Szádeczky-Kardoss et al., közlésre beküldve).
Az NMD a korai in-frame stop kodont (premature termination codon, PTC) ismeri fel és
bontja az ezt tartalmazó mRNS-t, ezzel megakadályozza a csonka, sokszor domináns-negatív
hatású fehérjék termelődését (Behm-Ansmant et al., 2007b, Alonso, 2005).
4.4. A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD)
4.4.1. Az NMD jelentősége
Az NMD útvonal és annak fő faktorai konzerváltak: az összes vizsgált eukariótában
(egysejtűekben, pékélesztőben, hasadó élesztőben, fonálféregben, muslicában, halakban,
emlősökben és növényekben) van NMD (Stalder and Muhlemann, 2008).
11
Az NMD azokat a hibás mRNS-eket ismeri fel és bontja le, amelyek korai stop kodont
tartalmaznak, megakadályozva ezzel a csonka, gyakran domináns-negatív hatású fehérjék
képződését. Domináns-negatív hatású fehérjék többféleképpen is létrejöhetnek. Például úgy, hogy
a katalitikus domén átíródik, de a szabályozó régió nem, és így egy folyamatosan aktív fehérje
keletkezik. Vagy úgy, hogy az aktív rész hiányzik, így a csonka fehérje beépül ugyan a megfelelő
komplexbe, de ott már nem tudja elvégezni a feladatát, ezért befagyasztja az egész komplexet
(Miller and Pearce, 2014).
Egy korai stop kodon kialakulásának számos módja létezik. PTC-t tartalmazó mRNS
átíródhat mutáns génekről, ahol a kódoló régióban pontmutáció, frameshift vagy inzerció miatt
jött létre stop kodon. A transzkripció hibája is vezethet PTC kilakulásához, ahogy az mRNS
érésének hibája is. A monogénesen öröklődő humán betegségek nagyjából harmadát okozza PTC-
t hordozó mRNS (pl. β-thalassemia, retinitis pigmentosa, cisztás fibrózis, stb.). E betegségek
többsége recesszív, mert az NMD ezeket a hibás mRNS-eket felismeri és lebontja (Thein et al.,
1990). Azon hibás mRNS-ek azonban, amiket az NMD valami miatt nem ismer fel, domináns
mutánsként betegséget okozhatnak (Kuzmiak and Maquat, 2006).
A humán alternatív splicing termékek körülbelül harmada tartalmaz korai stop kodont, a
PTC-t hordozó mRNS-ek jelentős része innen származik. Ezen alternatív splicing termékek
többsége feltehetően hibás termék, melyeket az NMD felismer és lebont (Hillman et al., 2004,
Zhang et al., 2009, Lewis et al., 2003).
Az NMD-nek hibaelhárító szerepe mellett fontos feladata van endogén géntermékek
szabályozásában is (Behm-Ansmant et al., 2007b). A pékélesztő, a muslica és a humán gének 4-
10%-ának expressziója emelkedik szignifikánsan a különböző NMD-faktorok hiányában (He et
al., 2003, Mendell et al., 2004, Rehwinkel et al., 2005b, Rehwinkel et al., 2006). Ezen gének
termékeinek egy része direkt NMD célpont, más részük olyan indirekt target, amiket NMD-
regulált faktorok szabályoznak. Pékélesztőben a megváltozott expressziójú mRNS-eknek
nagyjából a fele állhat közvetlen NMD szabályozás alatt (Guan et al., 2006). Az NMD különböző
fajokban gyakran különböző, egymással nem feltétlenül ortológ géntermékeket szabályoz
(Rehwinkel et al., 2005b).
NMD mutáns növényekben a fehérjét kódoló mRNS-ek 2-3%-ának nő szignifikánsan az
expressziós szintje (Kurihara et al., 2009). A. thaliana-ban az mRNS-ek kb. 20%-ának van 300
nukleotidnál hosszabb 3’UTR-je. Ezek az RNS-ek valamilyen fokú NMD-szabályozás alatt
állhatnak (Kerenyi Z. et al., 2008). A növényi NMD egyes splicing faktorokat is közvetlenül
szabályoz, így közvetetten a splicingon áteső mRNS-ek expressziós szintjére is hatással lehet
(Palusa et al., 2007).
12
Intronban gazdag genomja van a gerinceseknek és a növényeknek is. Az előbbieknél, ahol
majdnem az összes génről, és az utóbbiaknál is, ahol a gének nagyjából 40%-áról képződnek
alternatív splicing termékek (Lewis et al., 2003, Filichkin et al., 2010), az NMD hiánya a legtöbb
esetben letális (Medghalchi et al., 2001, McIlwain et al., 2010, Wittkopp et al., 2009, Yoine et al.,
2006b). Ez azért lehetséges, mert az alternatív splicinggal könnyen képződhet korai stop kodon
és/vagy kerülhet a 3'UTR-be intron, így ha az NMD nem működik, sok csonka, köztük sok
domináns-negatív fehérje is képződik. Élesztőben viszont, ahol nincs (illetve alig van) alternatív
splicing, az NMD hiánynak sincs komolyabb, látható tünete (Amrani et al., 2006)
Néhány növényi NMD faktor (UPF1, UPF3, SMG7) hipomorf mutánsai A. thaliana-ban
(upf1-5, upf3-1, smg7-1) pleiotróp fenotípusúak: a fűrészes levelek, az abnormális és késői
virágzás az NMD fontos szerepét mutatja a fejlődés szabályozásában. Az upf1-3 null mutáns
viszont hamar elpusztul. Ezekben az NMD mutáns növényekben azoknak a géneknek az
expressziója is emelkedik, amelyek a szalicilsav indukálta patogén válaszban vesznek részt. Az
említett fenotípusokat valószínűleg az állandóan expresszálódó, patogén válasz útvonalaiban
szerepet játszó fehérjék okozzák: ha elrontották a patogén válasz PAD4/EDS1 útvonalát, az
menekítette a hipomorf és letális fenotípusokat is. A növényi NMD tehát gátolja a növény számára
is veszélyes, a patogén válaszban részt vevő gének kifejeződését, amik így csak a fertőzéskor, a
szükséges helyen és a szükséges időben nyilvánulnak meg (Jeong et al., 2011, Rayson et al., 2012,
Riehs-Kearnan et al., 2012, Yoine et al., 2006a, Yoine et al., 2006b).
4.4.2. Az NMD működése, cisz-elemei és transz-faktorai
Az NMD a transzláció terminációjához kapcsolt, jól ismert folyamat élesztőben, gerinctelenekben
(Drosophila, C. elegans), gerincesekben és – többek között csoportunk munkájának köszönhetően
– már növényekben is. Az eukarióta NMD központi fehérjéi (UPF1, UPF2 és UPF3) konzerváltak
(Hwang and Maquat, 2011). A legkonzerváltabb az UPF1 helikáz, amely az összes eukariótában
nélkülözhetetlen az NMD-hez. Az UPF2 és az UPF3 fehérjék szintén fontos szerepet töltenek be
az NMD-ben. Az UPF2 többek között összekötő szerepet játszik az UPF1 és az UPF3 között, de
bizonyos esetekben élesztőben és állatokban ez a kapcsolat létrejöhet UPF2 nélkül is (Amrani et
al., 2006, Shyu et al., 2008, Takahashi et al., 2008). Az UPF3-ból egy génduplikáció miatt
állatokban kettő van, UPF3a és UPF3b (4. ábra c). Az UPF3a az UPF3b szabályozása alatt áll. Ha
az UPF3b hiányzik, az UPF3a szintje megemelkedik, és – legalábbis részben – átveszi az UPF3b
feladatait. Ugyanakkor az UPF3a is befolyással van az NMD-re: mivel az UPF3b erőteljesebben
tudja aktiválni az NMD-t, az UPF3a kötődése az UPF2-höz gyengíti az NMD hatékonyságát (Chan
13
et al., 2009). A legújabb eredmények szerint az UPF3a hatékony NMD inhibitorként számos
transzkriptumot stabilizál. Az UPF3a hiányos egerekben az NMD "túlműködése" következtében
fejlődési rendellenességek figyelhetők meg, azaz ennek az NMD gátló hatásnak fontos fiziológiai
szerepe van (Shum et al., 2016).
Míg élesztőben csak az UPF1, -2 és -3 faktorok kellenek az NMD-hez, az állati NMD-
ben számos további fehérje is fontos szerepet játszik. Állatoknál az UPF1 egy foszforegulált
fehérje, az SMG1 PIKK kináz (phosphatidylinositol 3-kinase related kinase) foszforilálja
(Yamashita et al., 2001), míg az SMG5, az SMG6 és az SMG7 fehérjék az UPF1
defoszforilációjában vesznek részt (Fukuhara et al., 2005, Unterholzner and Izaurralde, 2004). Az
UPF1, UPF2, UPF3 és az SMG7 fő faktorok a növényi NMD-ben is létfontosságúak (Kerenyi Z.
et al., 2008).
Az NMD transz faktorai a cisz elemek alapján tudják megkülönböztetni a PTC-t a normál,
vad típusú stop kodontól. NMD cisz elemet nem tartalmazó mRNS transzlációjának
terminációjakor az eRF1-eRF3 fehérje komplex kapcsolódik a riboszómához. Az eRF3 az mRNS
3’ végi poly(A)-farkát kötő PABP-vel interaktál, így a termináció gyors lesz és hatékony. Az
újonnan szintetizált fehérje, a terminációs komplex, és a riboszóma pedig le tud válni a stabil
mRNS-ről. Egy korai stop kodon ezt a gyors és hatékony terminációt akadályozza meg.
Élesztőben, gerinctelenekben (Drosophila, C. elegans) és növényekben a szokatlanul hosszú
3’UTR jelöli meg koraiként a stop kodont az NMD számára (Amrani et al., 2004, Kertesz et al.,
2006, Longman et al., 2007). Gerinceseknél az NMD azokat az mRNS-eket támadja, ahol a
3’UTR-ben a stop kodontól legalább 50 nukleotidra intron van, mégpedig az exon junction
complex (EJC) segítségével (Chang et al., 2007, Nagy and Maquat, 1998). Növényekben meglepő
módon hatékonyan működik a hosszú 3’UTR alapú és az intron alapú NMD is (Kerenyi Z. et al.,
2008, Kertesz et al., 2006).
Az NMD-nek két szakasza van. A korai szakaszban történik a transzláció terminációja,
ekkor ismeri fel az UPF1 a korai stop kodonokat. Az UPF1 köti az UPF2-t és az UPF3-at,
kialakítva így egy funkcionális NMD komplexet a hibás mRNS-en. Az NMD késői szakaszában
történik a hibás mRNS lebontása. Az NMD komplex összeszerelődése után az mRNS degradációs
rendszerek felgyorsítják vagy megkerülik a deadenilációt, és gyorsan lebontják a PTC tartalmú
mRNS-t (Isken and Maquat, 2008, Muhlemann et al., 2008).
14
4.4.3. Az NMD korai szakasza
Az NMD korai szakasza két elemre bontható: (i) az UPF1 kapcsolódása a terminálódó
riboszómához (marking), (ii) az UPF1, -2 és -3 fehérjék alkotta NMD komplex kialakulása. Azok
az elemek, amelyek az UPF1 kapcsolódását vagy az NMD komplex kialakulását elősegítik,
felgyorsítják az NMD-t.
AZ UPF1 akkor tud kapcsolódni a terminálódó riboszómához, ha a transzláció befejező
lépése lassú. Ennek oka lehet a terminációt serkentő 3’UTR faktorok hiánya, vagy a terminációt
gátló 3’UTR faktorok jelenléte.
A PABP egy pozitív jelmolekula a transzláció terminációja során: ha kapcsolódni tud
hozzá az eRF3, akkor a termináció gyors, az mRNS pedig stabil marad (2. ábra a). (Amrani et al.,
2004).
A Hrp1p, ami egy, az élesztő DSE-jéhez (downstream sequence element) kapcsolódó
fehérje, valamint az emlősökben és növényekben megtalálható EJC negatív szignálként
funkcionálnak. A DSE az élesztő több génjében is megtalálható motívum. Ha egy DSE elé korai
stop kodon kerül, a DSE növeli a marking valószínűségét azáltal, hogy a hozzá kötődő Hrp1p az
UPF1-gyel is interaktál (Gonzalez et al., 2000, Ruiz-Echevarria et al., 1998). Az élesztő és
gerinctelen UPF1 önmagában kötődik az eRF3-hoz, emlősökben a SURF-komplex (SMG1-
komplex, UPF1, eRF1, eRF3) részeként. Az UPF1 kötődés önmagában nem vált ki NMD-t, ahhoz
szükség van a funkcionális UPF1-UPF2-UPF3 NMD-komplex kialakulására is, ami az emlős
NMD sebességmegszabó lépése. Az EJC-hez az UPF2 és az UPF3 kötődik, így egy EJC jelenléte
a 3’UTR-ben jelentősen felgyorsítja az NMD-komplex felépülésének sebességét, ezáltal pedig
hatékonyabbá teszi az NMD-t (Muhlemann et al., 2008, Kashima et al., 2006, Yamashita et al.,
2009).
Korábban azt feltételezték, hogy az UPF1-et a termináló riboszóma köti az eRF1-en és
eRF3-on keresztül (Kashima et al., 2006). Azonban kiderült, hogy az UPF1 közvetlenül is tud
kötődni - főleg splicingon átesett - transzkriptumokhoz, függetlenül attól, hogy azok NMD-
targetek vagy sem. E modell szerint az UPF1 leginkább a 3’UTR-ben van jelen, mivel az 5’UTR-
ről és a kódoló régióról a szkenelő majd transzláló riboszóma lelöki (Hurt et al., 2013, Kurosaki
and Maquat, 2013, Zund et al., 2013).
Emlősökben az NMD az első (pioneer) transzlációhoz kötött folyamat. Az mRNS 5'-végi
sapkájához kötődő egyik fehérje (a CBP80 - cap binding protein 80) segít a SURF-komplexnek
bekötődni a termináló riboszómához, valamint felgyorsítja az NMD-komplex kialakulását is. Az
15
első transzláció után a CBC20/80 komplexet leváltó eIF4F-komplex ezt a feladatot már nem látja
el, így a korai stop kodonnal rendelkező mRNS-eket ezután az NMD már nem tudja támadni
(Hwang et al., 2010). A. thaliana-ban CBP20- és CBP80-hiányos mutánsokban is van NMD, ami
arra utal, hogy növényekben az NMD minden egyes transzlációnál elvégzi minőségbiztosítási
feladatát (Dzikiewicz-Krawczyk et al., 2008).
4.4.3.1. A hosszú 3'UTR alapú NMD
A PTC azonosításának ez a módja főként azokban a fajokban játszik szerepet,
amelyeknek genomjában kevés az intron, így az mRNS-eken a legtöbb korai stop kodon után
intron kivágódási hely sem található (Gatfield et al., 2003). Ezek elsősorban a gerinctelenek.
Gerincesekben is előfordul ugyan, de ott sokkal kisebb a jelentősége. Ez az NMD rendszer a
szokatlanul hosszú 3’UTR-t tartalmazó mRNS-eket ismeri föl, és azonosítja koraiként a stop
kodonjukat. Ez úgy történik, hogy ha a termináló riboszómához kötődő eRF3 túl messze van a
PABP-től, az lelassítja a terminációt, és mivel a két fehérje nem, vagy csak nehezen tud
kapcsolódni, az UPF1-nek van ideje az eRF3-hoz kötődni. A stop kodon így PTC-ként lesz
megjelölve (marking) (Amrani et al., 2004, Behm-Ansmant et al., 2007a, Singh et al., 2008). A
PABP-n kívül minden bizonnyal léteznek más pozitív 3'UTR szignálok is, mivel élesztőben a nem
poliadenilált, és így PABP által nem kötött mRNS-eken is megkülönbözteti az NMD a korai stop
kodonokat a normál stop kodontól (Meaux et al., 2008). E modell szerint a transzláció
terminációjának hatékonysága szabja meg, hogy az adott mRNS-t támadja-e az NMD (Amrani et
al., 2004, Muhlemann, 2008). A lassú (és immár hibás) termináció után az eRF3-hoz kötődött
UPF1-hez az UPF2 és az UPF3 kapcsolódik. Az NMD-komplex összeszerelődése az mRNS
lebontását indukálja és egyúttal a riboszóma is kiszabadul az mRNP-ből. Az UPF1 és a PABP
végső soron versenyeznek az eRF3-ért, vagyis minél messzebb van a PABP a termináló
riboszómától, annál gyorsabban tud kialakulni az NMD komplex (2. ábra b). Egy-egy
organizmusban a 3’UTR régiók hossza viszonylag szűk határok között mozog, így a normális
hossztól való eltérés korai stop kodont jelölhet (Behm-Ansmant et al., 2007a, Longman et al.,
2007, Singh et al., 2008).
A starthoz túl közeli korai stop kodonok nem indukálnak hatékony NMD-t (Inacio et al.,
2004, Silva et al., 2006, Singh et al., 2008, Iwakawa et al., 2012). Ennek az mRNS cirkuláris
szerkezete lehet az oka. Rövid open reading frame-ek (ORF) transzlációjakor megesik, hogy az
iniciációs-komplex (eIF4F-komplex), amihez egy ideig még kötve marad a PABP, még nem
16
2. ábra. A hosszú 3'UTR alapú NMD modellje.
(a) A vad típusú, PTC-t nem tartalmazó mRNS transzlációjának terminációja - az eRF fehérjék és a PABP
interakciója miatt - gyors. (b) A túl hosszú 3’ UTR miatt a transzláció lelassul, így a termináció hibás. A
riboszómán kialakul a SURF komplex (SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3), majd az UPF2 és UPF3 kötődésével
az NMD komplex, ami az mRNS gyors lebomlását idézi elő. (Mérai Zsuzsanna rajza, módosításokkal.)
disszociált, amikor a riboszóma már a stop kodonhoz ért. Ekkor a PABP elég közel van a korai
stop kodonhoz ahhoz, hogy hatékony legyen a transzláció terminációja. A korai, ám hatékony
transzláció termináció pedig megakadályozza az NMD-komplex összeszerelődését (Silva et al.,
2008). A hosszú 3’UTR alapú NMD során tehát a PABP-eRF3 kapcsolódás kialakulásának
gyorsasága dönti el, hogy az NMD milyen hatékonyan támadja az mRNS-t.
Csoportunk korábban igazolta, hogy Nicotiana benthamiana-ban az NMD annál
hatékonyabban támadta a riporter mRNS-t, minél hosszabb volt a 3’UTR-je (Kertesz et al., 2006).
Az UPF1, UPF2, UPF3 és SMG7 fő NMD faktorok részt vesznek a hosszú 3’UTR-rel rendelkező
növényi mRNS-ek lebontásában (Kerenyi Z. et al., 2008). Növényekben még nem sikerült
kimutatni a PABP-eRF3 közvetlen kapcsolatot, viszont – csakúgy, mint a többi eukariótában – a
PABP-t mesterségesen a 3’UTR-hez kötve növényekben is ki lehetett menteni az mRNS-eket az
NMD alól (Amrani et al., 2004, Behm-Ansmant et al., 2007a, Singh et al., 2008). Ezek alapján –
más eukariótákhoz hasonlóan – növényekben is a stop-PABP távolság dönti el, hogy az adott
mRNS-t támadja-e az NMD.
17
4.4.3.2. Az intron alapú NMD
Mivel az EJC elemei gerincesekben és növényekben konzerváltak, az intron alapú NMD
valószínűleg az eukarióták közös ősében alakult ki, hiszen az ő génjeikben is sok intron volt
(Kerenyi Z. et al., 2008). Ha pedig sok intron van egy génben, akkor egy korai stop kodon után 3’
irányban jó eséllyel lesz legalább egy, s ez alapján a PTC felismerhető. A gerincesek génjeinek
túlnyomó többsége tartalmaz intront, ez pedig jelentős mértékben járulhatott hozzá ahhoz, hogy
náluk az intron alapú NMD lett a fő NMD útvonal (Lynch and Kewalramani, 2003).
Emlősökben azok az mRNS-ek NMD-targetek, amelyek 3’UTR-jukban egy (vagy több)
intront hordoznak, mégpedig a stop kodontól legalább 50 nukleotidra (Nagy and Maquat, 1998).
Az intronkivágódás (splicing) után az exon junction complex (EJC) rakódik az mRNS-re az intron
kivágódásának helyétől upstream 20-25 nukleotidra. Az EJC-t négy fő fehérje alkotja (Y14,
MAGO, eIF4AIII, Barentz), amelyek több, ideiglenesen kapcsolódó fehérjének szolgálnak
kötőhelyül, így az UPF3-nak is (Chang et al., 2007, Le Hir et al., 2000).
Az EJC-UPF3 komplex az mRNS-hez kapcsolódva kerül a citoplazmába. Az UPF2 a perinukleáris
térben kötődik ehhez a komplexhez. A transzláció során a riboszóma le tudja lökni az EJC-UPF3-
UPF2 komplexeket az 5’UTR-ről és a kódoló régióról. A 3’UTR-ben lévőket (ha azok legalább
25 nukleotidra vannak a stoptól) viszont már nem távolítja el, miután megállt a stop kodonnál (3.
ábra a) (Chang et al., 2007, Dostie and Dreyfuss, 2002). Az mRNS-en maradó EJC-k úgy
aktiválják az NMD-t, hogy az EJC-UPF3-UPF2 komplex köti az eRF1-eRF3 komplexhez
kötődött, transzlációs terminációs komplex (SURF) részeként megjelenő UPF1-et, létrehozva a
DECID (decay inducing) komplexet (Gehring et al., 2005) (3. ábra b). Ennek következményeként
az SMG1 kináz foszforilálja az UPF1-et (Kashima et al., 2006). Az SMG5, SMG6 és SMG7 rokon
fehérjék, mindhárom tartalmaz egy-egy 14-3-3 domént. Ennek a segítségével ismerik föl és
kötődnek a foszforilált UPF1-hez. Ez a kötődés végeredményben a transzkriptum lebomlásához
vezet (3. ábra c) (Muhlemann and Lykke-Andersen, 2010,). Emlősökben tehát az intronok a stoptól
legalább 50 nukleotidra downstream okoznak NMD-t, vagyis ezek az intronok pozíciófüggő cisz
elemek. Az intron alapú NMD-ben kulcsszerep jut az EJC-nek.
Élesztőben és gerinctelenekben gyakorlatilag nincs intron alapú NMD, ezért az a
feltételezés alakult ki, hogy az intron alapú NMD a gerincesekben jött létre az evolúció során. E
szerint a modell szerint az alternatív splicing megjelenése és elterjedése tette lehetővé az intron
18
3. ábra. Az emlős intron alapú NMD modellje.
(a) A korai stop kodonnál (PTC) elakadó riboszómához bekötődő eRF1/eRF3 komplexhez kapcsolódó
UPF1 valamint az SMG1C (SMG1/SMG8/SMG9 komplex) kialakítják a SURF komplexet. A 3'UTR-ben
lévő EJC-re még a sejtmagban felrakódik az UPF3, amihez az export során, már a citoplazmában kötődik
az UPF2. (b) Az EJC kötött UPF2 kapcsolódása a SURF komplexhez az UPF1 foszforilációját indukálja.
(c) A foszforilált UPF1-hez az SMG6 és az SMG5/SMG7 heterodimer kötődik, amik az SMG1C
disszociációját és végső soron a PTC-t tartalmazó mRNS gyors degradációját okozzák. Az ábrát Kervestin
és Jacobson összefoglaló munkája alapján, módosításokkal közlöm (Kervestin & Jacobson 2012).
alapú NMD kialakulását majd uralkodóvá válását. Az alternatív splicing egyre összetettebbé
válásával egyre több hibás mRNS keletkezett, melyek korai stop kodont és a 3’UTR-ben intront
hordoztak. Ez egyben a PTC hatékony azonosításával is járt, ami szintén segíthetett abban, hogy
19
az intron alapú NMD dominánssá vált. Kiderült azonban, hogy az intron alapú NMD növényekben
is működik (Kerenyi Z. et al., 2008).
Figyelembe véve, hogy a növényi gének többsége szintén tartalmaz intront (Narsai et al.,
2007), nem is olyan meglepő, hogy a növényekben is elterjedt az intron alapú NMD. Csoportunk
korábbi munkáiból kiderült, hogy növényekben is csak a 3’UTR-ben helyezkedő intronok
indukálhatnak NMD-t, és ezek is csak akkor, ha nincsenek túl közel a stop kodonhoz: 28
nukleotiddal a stop után nem, a stop kodontól 99 nukleotidra igen; hogy a növényi intron alapú
NMD-hez is szükség van az UPF1-re és az UPF2-re, valamint az SMG7-re is; hogy a növényi
UPF1 N- és C-terminális, S/TQ-gazdag régiói részt vesznek az NMD-ben és ezek a régiók
foszforiláltak; valamint az, hogy a gerinces EJC tagjainak, az Y14-nek, a Magoh-nak a homológjai
szükségesek a növényi intron alapú NMD-hez is (Kerenyi Z. et al., 2008, Kertesz et al., 2006,
Merai et al., 2013).
Több, az intron alapú NMD-ről alkotott korábbi elképzelés is változott az utóbbi időben.
D. melanogaster sejtekben a cisz elemektől függően az intron kivágódás után nem mindig rakódik
EJC az mRNS-re, (Sauliere et al., 2010). Hasadó élesztőben (Schizosaccharomyces pombe)
upstream és downstream a stop kodon közeli intronok NMD-t okoznak. Ezt a splicing során
kötődő, nem EJC-komponens fehérjék okozzák (Wen and Brogna, 2010). A transzláció-függő
UPF1-kötődést megkérdőjelezi az a tanulmány, amiben bizonyították, hogy az UPF1
transzlációtól függetlenül is kötődik a 3'UTR-hoz (Hogg and Goff, 2010).
4.4.3.3. Az uORF alapú NMD
Az eukarióta transzláció iniciációjakor a riboszóma kis alegysége megkeresi az mRNS (általában
első) AUG (start) kodonját. A GTP-t és metionin-tRNS-t már korábban megkötött nagy alegység
ezután kötődik a kis alegységhez, kialakul a transzláció iniciációs komplex, majd elkezdődik a
transzláció elongációja.
Az 5’UTR-jükben nyitott leolvasási keretet (upstream open reading frame, uORF)
hordozó mRNS-ek az NMD-targetek harmadik, speciális csoportja (Nyiko et al., 2009, Saul et al.,
2009). Az eukarióta gének 20-30%-ának 5’UTR régiójában található egy vagy több rövid uORF
(Hayden and Jorgensen, 2007, Nyiko et al., 2009). Ezeknek a cisz elemeknek is fontos szerepük
lehet a poszttranszkripciós génexpresszió szabályozásában: a főgén csak akkor transzlálódik, ha a
riboszóma átsiklik az uORF start kodonján (leaky scanning), vagy ha az uORF transzlációja után
a riboszóma kis alegysége ahelyett, hogy leválna, tovább pásztázza az mRNS-t, majd a főgén
20
startjánál ismét transzlálni kezd (reiniciáció). Az uORF start kodonja körüli szekvencia határozza
meg a leaky scanning hatékonyságát (Suzuki et al., 2000), az uORF kódoló szakaszának és az
intercisztronikus régiónak a hossza pedig a reiniciációét. Az intercisztronikus régió az uORF
stopjától a főgén startjáig tart (Kozak, 2001). Az uORF stop körüli régiója szekvenciától függően
segítheti vagy gátolhatja, a hosszabb uORF gátolja, míg a hosszabb intercisztronikus régió segíti
a reiniciációt (Grant and Hinnebusch, 1994, Rajkowitsch et al., 2004, Sachs and Geballe, 2006).
Emlősökben és növényekben egyes konzervált uORF-ekről termelődő fehérjék transz
faktorként is tudják gátolni a főgén transzlációját, gyakran olyan génekét, amelyek túlzott
kifejeződése elrákosodásához vezetne (Iacono et al., 2005, Mehta et al., 2006, Tabuchi et al.,
2006).
Az uORF-eknek növényekben is fontos szabályozó szerepük lehet, hiszen a növényi
gének körülbelül 20%-a tartalmaz uORF-et. Konzervált uORF-eket elsősorban transzkripciós
faktorok, transzlációban részt vevő fehérjék és jelátviteli útvonalak fő összetevőinek génjében
találunk (Kochetov et al., 2002, Hayden and Jorgensen, 2007).
Az uORF stopja igen messze van az mRNS poliA-farkától, mert a kódoló régió és a
3'UTR is közéjük ékelődik, ráadásul jó eséllyel intron is található bennük. Ez pedig azt jelenti,
hogy mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD-nek célpontjai lehetnek ezek az
mRNS-ek. Az emlős uORF-ek így az mRNS NMD általi lebomlását okozhatják (Mendell et al.,
2004). Bár a növényi gének kb. 20%-ában van uORF, az NMD mutáns A. thaliana vonalakban
(upf1-5, upf3-1) mégis csak a gének kb. 2%-ának nő az expressziója. A megnövekedett
expressziójú géneknek viszont már 15%-a hordoz uORF-et. Hogy egy uORF okoz-e NMD-t, az a
méretétől függ, a túl rövid ORF-ek itt is hatékonyan terminálódnak. Olyan uORF, ami kedvező
pozícióban van és elég hosszú is, csak a gének kb. 2%-ában van (Kochetov et al., 2002, Hayden
and Jorgensen, 2007, Kurihara et al., 2009, Nyiko et al., 2009).
4.4.4. Az UPF1 foszforilációs ciklusa
Az UPF1 a központi NMD faktor, szerepe van az NMD minden döntő lépésében, és
létfontosságú az NMD-hez minden vizsgált organizmusban (Avery et al., 2011, Leeds et al., 1991,
Medghalchi et al., 2001, Riehs-Kearnan et al., 2012, Wittkopp et al., 2009). A nagyméretű UPF1
fehérjének (élesztőben 109 kDa, emberben 130 kDa, A. thaliana-ban 137 kDa) két fő doménje
van, egy ciszteinben és hisztidinben gazdag domén (CH-domén) közel az N-terminális véghez, és
tőle downstream irányban egy helikáz domén (Leeds et al., 1992, Altamura et al., 1992). Mindkettő
21
elengedhetetlenül fontos az NMD-hez (4. ábra a) (Bhattacharya et al., 2000, Sun et al., 1998, Weng
et al., 1996b, Weng et al., 1996a). A CH domén a helikáz domén szabályozásában vesz részt,
valamint kötőhelyül szolgál az UPF2 számára. A helikáz domén az mRNP remodelingben is részt
vesz (Fatscher et al., 2015).
Az élesztővel ellentétben az emlős UPF1 egy foszfoprotein, melynek foszforilációs
ciklusát az SMG faktorok: az SMG1, az SMG5, az SMG6, az SMG7, az SMG8 és az SMG9
szabályozzák (6. ábra). Állatokban a helikáz doménhez tud kötődni az SMG1, ami a rendezetlen
szerkezetű N-terminális és C-terminális régiót foszforilálja. Az N-terminális régió az SMG6-nak,
míg a C-terminális régió az SMG5/7 komplexnek szolgál kötőhelyül. A PNRC2 mind az N-, mind
a C-terminális régióhoz kötődhet (4. ábra a) (Fatscher et al., 2015). Növényeknél munkám
kezdetekor ezek közül csak az SMG7 volt ismert (Grimson et al., 2004, Ohnishi et al., 2003,
Yamashita et al., 2009, Yamashita et al., 2001, Kerenyi Z. et al., 2008).
Emlősökben a pioneer transzláció során, ha a transzláció terminációs kodon 5' irányban
van egy EJC-től vagy a 3'UTR szokatlanul hosszú, az SMG1 kináz komplex (SMG1C:
SMG1/SMG8/SMG9), az UPF1 helikáz és az eRF1 és eRF3 transzláció terminációs faktorok - a
CBC-t és PABC1-et tartalmazó - mRNP-hez kötődve kialakítják az SMG1C/UPF1/eRF1/eRF3
(SURF) komplexet (6. ábra b) (Kashima et al., 2006, Yamashita et al., 2009). Ebben a komplexben
a 410 kDa-os SMG1 a PIKK-doménjével kapcsolódik az UPF1 helikáz doménjéhez (4. ábra a, 5.
ábra a) (Clerici et al., 2014, Melero et al., 2014). Az eRF1 és eRF3 az UPF1 CH doménjéhez
kötődik. A CH domén pedig a helikáz doménhez kötődve gátolja annak aktivitását (4. ábra a)
(Ivanov et al., 2008, Wang et al., 2001, Czaplinski et al., 1998). A SURF-komplex
összeszerelődését a riboszómán egy, az UPF1 és a CBC80 közötti ideiglenes interakció is segíti
(Hosoda et al., 2005, Hwang et al., 2010). Az SMG1 a HEAT doménjéhez kötődő SMG8 és SMG9
(5. ábra a) gátlása alatt áll, hogy az UPF1-en nem kívánt foszforiláció ne történjen. Ezen kívül az
SMG8 az SMG1C SURF komplexbe kapcsolódásához is szükséges (Arias-Palomo et al., 2011,
Yamashita et al., 2009, Fernandez et al., 2011). A riboszómához kötődő SURF és az UPF2-UPF3-
EJC komplexek együtt alakítják ki az mRNS lebontását indukáló komplexet (decay inducing
complex, DECID) (6. ábra c) (Kashima et al., 2006, Yamashita et al., 2009). Ha a SURF
komplexhez kapcsolódni tud az EJC-kötött UPF2, az az UPF3-mal együtt a CH doménhez kötődve
egyrészt konformáció változást okoz az UPF1-en, ezáltal pedig az UPF1 helikáz funkcióját
aktiválja (4. ábra a, b, c) (Chakrabarti et al., 2011, Chamieh et al., 2008). Másrészt pedig az UPF1
foszforilációját indukálja (Pal et al., 2001, Schell et al., 2003, Kashima et al., 2006), ez pedig az
eRF1 és eRF3 disszociációjához vezet (6. ábra b, c) (Ohnishi et al., 2003). Az UPF1 foszforilációja
22
4. ábra. Az NMD fő faktorainak domén szerkezete.
(a) Az UPF1 sematikus domén szerkezete, az egyes domének feladata, a rajtuk található azonosított
kötőhelyek, és S/TQ foszforilációs motívumok. (b) Az UPF2 domén szerkezete és kötőhelyei. (c) Az UPF3
fehérjék domén szerkezete és kötőhelyeik. Az ábrát Fatscher és munkatársai összefoglaló munkája alapján,
módosításokkal közlöm (Fatscher et al., 2015).
23
mellett annak ATPáz/helikáz aktivitása is szükséges az NMD-hez, de a két funkció egymástól
független (Kashima et al., 2006, Franks et al., 2010, Isken and Maquat, 2008, Page et al., 1999).
Emlősökben az UPF1 N- és C-terminális régiójában lévő S/TQ motívumokat az SMG1
PIKK kináz UPF2-függően foszforilálja (4. ábra a, 5. ábra a; 6. ábra c, 1. szövegdoboz) (Denning
et al., 2001, Grimson et al., 2004, Page et al., 1999, Yamashita et al., 2001). Az SMG1 C-terminális
régiójának interakciója az UPF2-vel (4. ábra b, 5. ábra a) feltehetően indukálja az SMG8
disszociációját. Ezzel kiszabadítja a gátlás alól az SMG1-et, ami legalább négy S/TQ helyet
foszforilál az UPF1 fehérjén (T28, S1078, S1096 és S1116) (4. ábra a, 6. ábra c) (Matsuoka et al.,
2007, Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012, Yamashita et al., 2001). Az UPF2
fontossága mellett kimutatták azt is, hogy az NMD-target mRNS-ek egy része lebomlik UPF2
illetve UPF3a és UPF3b hiányos sejtekben is (Gehring et al., 2005, Gehring et al., 2003, Ivanov et
al., 2008, Chan et al., 2007). Ezek alapján elképzelhető, hogy az SMG1 aktiválására, és így az
UPF1 foszforilálciójára léteznek eddig még nem ismert, alternatív útvonalak is.
Az SMG5, SMG6 és SMG7 konzervált, rokon fehérjék, egy-egy 14-3-3-szerű
foszfoszerin kötő doménnel (5. ábra b, c, d), és mindhárman részt vesznek az NMD-ben (Anders
et al., 2003, Gatfield et al., 2003). A 14-3-3 fehérjék számos, eukarióta sejtben zajló folyamat
szabályozásában vesznek részt, mégpedig úgy, hogy interakciós partnerük foszforilált motívumait
ismerik föl (Sluchanko and Gusev, 2016). Az SMG5, SMG6 és SMG7 is ennek a 14-3-3 doménnek
a segítségével ismerik föl és kötődnek a foszforilált UPF1-hez. Az UPF1 N-terminális régiójában
a foszforilált T28-hoz az SMG6, míg a C-terminális S/TQ-gazdag régiójában a foszforilált S1096-
hoz az SMG5/SMG7 heterodimer kapcsolódik (4. ábra a, 5. ábra b, c, d; 6. ábra d) (Okada-
Katsuhata et al., 2012). A foszforilált UPF1-hez az SMG6 és az SMG5/SMG7 komplexek
egyszerre is tudnak kötődni. Az SMG5 és SMG7 faktorok heterodimert alkotva kötődnek a foszfo-
UPF1 C-terminális régiójában lévő S1096 foszfoszerinhez, majd deadenilációt és decappinget
okoznak (Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012, Yamashita et al., 2005). Az SMG6
leginkább az N-terminális régióban a foszforilált T28-hoz kötődik, és endonukleáz aktivitásával a
PTC közelében hasítja az mRNS-t (Eberle et al., 2009, Huntzinger et al., 2008, Okada-Katsuhata
et al., 2012). A humán PNRC2 heterodimert képez az SMG5-tel, és NR (nuclear receptor) boxán
keresztül az UPF1 C-terminálisán foszforilált S1073-hoz és S1078-hoz kötődve (6. ábra d; 4. ábra
a, 5. ábra e) deadenilációtól független decappinget indukál (Cho et al., 2012, Cho et al., 2009, Cho
et al., 2013, Lai et al., 2012). Az SMG5, az SMG6 és az SMG7 irányítja a defoszforilációt, aminek
következtében az UPF2, az UPF3 és az SMG1 disszociál. Az SMG5/SMG7 heterodimer a
tényleges defoszforilációt végző PP2A-t (protein phosphatase 2A) köti (5. ábra b, d, 6. ábra d). Az
24
1. szövegdoboz. Az emlős PIKK kinázok.
SMG6-ról egyelőre nem tudni, hogy közvetlenül köt-e egy foszfatázt, vagy közvetett hatása van
az UPF1 defoszforilációjára (Anders et al., 2003, Cali et al., 1999, Chiu et al., 2003, Fukuhara et
al., 2005, Ohnishi et al., 2003, Okada-Katsuhata et al., 2012). Egyelőre azt sem lehet tudni, hogy
a PNRC2-nek van-e szerepe (és ha igen, milyen) az UPF1 defoszforilációjában.
Az UPF1 defoszforilációja kiszabadítja az UPF1-et az NMD-komplexből, ami így egy
újabb NMD-ciklusba tud bekapcsolódni (6. ábra a) (Durand et al., 2007, Wilkinson, 2003). Az
UPF1 foszforilációs-defoszforilációs ciklusa az összekötő kapocs az NMD korai és kései lépései
között, ezért létfontosságú az NMD működéséhez (Anders et al., 2003, Durand et al., 2007,
Gatfield et al., 2003, Grimson et al., 2004, Yamashita et al., 2001, Ohnishi et al., 2003). Fentiek
alapján az mRNS degradációnak legalább három különböző, foszfo-UPF1 által indukált útja
lehetséges: SMG6 általi endonukleolitikus hasítás, SMG5/SMG7 által irányított deadeniláció
és/vagy decapping, valamint a PNRC2/SMG5 vezérelte decapping (7. ábra). Az egyelőre nem
ismert, hogy milyen mechanizmusok döntik el, hogy mikor melyik útvonal aktiválódik.
Az emlősöknek jelenleg hat ismert PIKK kinázuk (phosphatidylinositol 3-kinase related kinase)
van. Ezek közül egy (TRRAP) elvesztette kináz aktivitását. A másik öt a célfehérjékben lévő szerin
(Ser, S) és treonin (Thr, T) aminosavak foszforilálásával vesznek részt a jelátviteli folyamatokban.
Emlősökben az öt valóban kináz aktivitással rendelkező PIKK kináz közül négy (ATM, ATR,
DNA-PK és SMG-1) előszeretettel foszforilálja azokat a szerineket és treoninokat, amelyek után
közvetlenül egy glutamin (Gln, Q) van. Ezért ezeket a PIKK kinázokat S/TQ-specifikus kinázoknak
is szokták nevezni. Érdekesség, hogy ezen PIKK kinázok szubsztrát fehérjéi gyakran csoportokba
rendeződött S/TQ helyeket tartalmaznak, melyek közül legalább kettőt foszforilál valamelyik PIKK
kináz. Az ilyen S/TQ gazdag domének különösen a checkpoint és a DNS javító mechanizmusokban
részt vevő fehérjék között gyakoriak (Abraham, 2004). Az ötödik PIKK kináz (mTOR) - a másik
néggyel ellentétben - nem az S/TQ helyeket preferálja, hanem a kissé bonyolultabbnak tűnő
(W/Y)XX(A/P)(G/P)(S/T)*(F/P/L/W/Y/V)H motívumokat (a csillag a foszforilálódó szerint illetve
treonint jelöli) (Hsu et al., 2011). A négy S/TQ-specifikus PIKK kináz a genom és/vagy a
transzkriptom minőségbiztosításában játszik fontos szerepet, míg az mTOR az emlős sejtek
anyagcseréjének egyik központi szabályozója (Abraham, 2004).
25
5. ábra. Az UPF1 foszforilációs ciklusában szerepet játszó NMD faktorok domén szerkezete.
(a) Az SMG1 domén szerkezete és kötőhelyei. (b) Az SMG5 domén szerkezete és kötőhelyei. (c) Az SMG6
domén szerkezete és kötőhelyei. (d) Az SMG7 domén szerkezete és kötőhelyei. (e) A PNRC2 domén
szerkezete és kötőhelyei.
A foszfo-UPF1 interaktál a transzláció iniciációs komplex eIF3a alegységével is, ezáltal
gátolni tudja a transzláció iniciációját is (3. ábra c) (Isken et al., 2008). Ugyanakkor ez a
transzláció-gátlás csak mérsékelt lehet, hiszen SMG5, SMG6 vagy SMG7 hiányos sejtekben a
foszfo-UPF1 mellett a csonka, PTC-t tartalmazó mRNS által kódolt fehérjék is felhalmozódnak
(Page et al., 1999, Paillusson et al., 2005, Pulak and Anderson, 1993).
26
6. ábra. Az UPF1 foszforilációs-defoszforilációs ciklusa.
(a) Az UPF1 az NMD kulcsfaktora. (b) Korai stop kodonon elakadó riboszómán lévő eRF1-gyel, eRF3-
mal, valamint az SMG1C (SMG1/SMG8/SMG9) komplex-szel alakítja ki a SURF komplexet. A SURF
komplexhez pedig kötődni tud intronos NMD esetén az EJC-kötött, hosszú 3'UTR alapú NMD esetén a
feltehetően szabad UPF2/UPF3 komplex, ami a release faktorok disszociációjához vezet, valamint (c)
felszabadítja az SMG1-et az SMG-8 gátlása alól, így az foszforilálni tudja az UPF1 N- és C-terminális
S/TQ helyeit. (d) Ezekhez a foszforilált S/TQ helyekhez tud kapcsolódni az SMG6 (T28), az SMG5/SMG7
heterodimer (S1096), valamint a PNRC2 (S1073, S1078) (a PNRC2 ezen az ábrán nem szerepel; lásd 7.
ábra), elősegítve az SMG1C disszociációját. Az SMG5 köti a PP2A foszfatázt, ami egyrészt a transzkriptum
deadeniláció-függő decappingjét okozza, másrészt defoszforilálja az UPF1-et, ezáltal kiszabadítja az
NMD-komplexből, felhasználhatóvá téve egy újabb ciklus számára. Az SMG6 és a PNRC2 esetében még
nem ismert a defoszforiláció mikéntje. Az ábrát Kervestin és Jacobson összefoglaló munkája alapján,
módosításokkal közlöm (Kervestin & Jacobson 2012).
A növényi UPF1 foszforilációjáról munkám kezdetén igen keveset tudtunk. Csupán annyi
volt ismert, hogy az UPF1, az UPF2, az UPF3 és az SMG7 szükségesek az NMD-hez, valamint
hogy az UPF1 N- és C-terminális régiói funkcionálisan redundánsak (vagyis egyikük a másik
hiányában is elegendő az UPF1 NMD-ben betöltött szerepének végrehajtására), mindkettő részt
vesz az NMD-ben, és mindkét régió foszforilált (Kerenyi Z. et al., 2008, Merai et al., 2013)
27
4.4.5. Az NMD kései lépései
Az NMD korai szakaszában felismert és megjelölt PTC-t tartalmazó mRNS-ek lebontása a kései
szakaszban történik. A korai szakasz folyamatai és az abban részt vevő fehérjék konzerváltak, a
kései szakasz folyamatai és összetevői Drosophilában, emlősökben és növényekben többé-
kevésbé különbözőek.
Élesztőben, ha az NMD-komplex kialakult, az UPF1 deadeniláció-független decappinget
indukál. Ezután az XRN1, egy citoplazmatikus 5'-3' exonukleáz, lebontja az mRNS-t. Olykor,
deadenilációt követően, 3’-5’ irányú exoszomális degradáció is előfordulhat (Cao and Parker,
2003, Mitchell and Tollervey, 2003, Muhlrad and Parker, 1994). Az élesztő NMD targetek 5’-3’
irányú lebontása a még transzlálódó mRNS-eken is megkezdődhet (Hu et al., 2010, Hu et al.,
2009).
D. melanogasterben nincs SMG7, az SMG6 pedig a foszforilált UPF1-hez kötődve
endonukleolízissel vágja a hibásként felismert mRNS-t. Az 5' vágásterméket az exoszóma, a 3'
vágásterméket pedig az XRN1 bontja le (Eberle et al., 2009, Huntzinger et al., 2008, Rebbapragada
and Lykke-Andersen, 2009).
Emlősökben az UPF1-et az SMG1 PIKK-kináz foszforilálja, mégpedig az N-terminális
régiójában a konzervált treonin (T28), és a C-terminálisán régiójában konzervált szerin (S1096)
aminosavakat (Denning et al., 2001, Grimson et al., 2004, Yamashita et al., 2001). A foszforilált
UPF1 három, különböző lebontási útvonalat is beindíthat.
Az SMG6 az N-terminális 14-3-3 doménjével kötődik az UPF1 N-terminális
foszfotreoninjához (T28) (4. ábra a, 5. ábra c; 7. ábra a), majd a C-terminális PIN doménjével az
mRNS-t a korai stop közelében endonukleolitikusan elvágja (7. ábra b). Az így keletkezett 3’-végű
vágásterméket az exoszóma, az 5’-végű vágásterméket az XRN1 bontja le (Eberle et al., 2009,
Okada-Katsuhata et al., 2012). Az SMG6 foszforilációtól függetlenül is képes a helikáz doménhez
kötődni (Chakrabarti et al., 2014, Nicholson et al., 2014). Ráadásul az SMG6 N-terminális részén
két EBM (exon junction complex binding motif) is van, amik az UPF3b-hez hasonlóan az EJC-
hez kötődésért felel. Korábban azt gondolták, hogy ezek a motívumok szükségesek az NMD-hez,
de kiderült, hogy az endonukleolitikus hasításhoz nélkülözhetők (Kashima et al., 2010, Boehm et
al., 2014). Az eddigi eredmények alapján úgy tűnik, hogy az SMG6-nak legalább három
különböző útvonala létezik: (1) EJC-kapcsolódás az EBM-eken keresztül, (2) foszforiláltsági
állapottól független kötődés az UPF1 különböző régióihoz, (3) foszfo-specifikus kötődés az UPF1
N-terminális régiójához (T28) a 14-3-3 doménnel (Fatscher et al., 2015).
28
Az SMG7 az UPF1 C-terminális foszfoszerinjéhez szintén a 14-3-3 foszfoszerin kötő N-
terminális doménjével kötődik. A DCP2- és XRN1-függő gyors mRNS lebomlásért a C-terminális
régiója felel (4. ábra a, 5. ábra d; 7. ábra a, b). Az SMG7 kötődés az NMD kései, irreverzibilis
lépése (Fukuhara et al., 2005, Okada-Katsuhata et al., 2012, Unterholzner and Izaurralde, 2004).
Az SMG5/SMG7 komplex nélkülözhetetlen a riboszóma, az eRF1 és az eRF3, valamint az UPF2
és az EJC disszociációjához az UPF1-ről (Okada-Katsuhata et al., 2012). Az SMG5 PIN-
doménjének aktív centrumában két aminosav csere történt, ezért elvesztette endonukleáz
aktivitását, de kötni tudja a PP2A-t (5. ábra b, 7. ábra c) (Glavan et al., 2006, Ohnishi et al., 2003),
ami defoszforilálja az UPF1-et. A defoszforilált UPF1 felszabadul, és így reciklizálódva részt
vehet egy újabb NMD ciklusban (6. ábra d, a; 7. ábra c) (Wilkinson, 2003). Az SMG7 vezérelte
lebomlás első lépése a gyors deadeniláció a CCR4-NOT útvonalon keresztül, ami végső soron a
folyamatban nélkülözhetetlen decappinghez, és az azt követő XRN1 általi mRNS degradációhoz
vezet (Loh et al., 2013). Az NMD-hez szükség van mind a Pan, mind a CCR deadenilációs
komplexekre, mert a P-testekbe (lásd később) csak deadeniált mRNS-ek kerülnek be (Shyu et al.,
2008, Zheng et al., 2008). Ez az útvonal azonban akár ki is kerülhető. Bizonyos esetekben,
felgyorsított deadenilációt követően, az emlős NMD-targeteket degradálhatja az exoszóma is 3’-
5’ irányban (Lejeune et al., 2003).
Végül a foszfo-UPF1-et kötheti az SMG5-tel heterodimert képező PNRC2 fehérje is az
NR-boxon keresztül, amely a C-terminális prolin-gazdag régiójával a decapping komplexhez
kapcsolódva okoz deadenilációtól független decappinget, ami az mRNS gyors, XRN1 általi
lebontását eredményezi (4. ábra a, 5. ábra e; 7. ábra b) (Cho et al., 2009, Arribas-Layton et al.,
2013, Cho et al., 2013). Azt egyelőre nem tudjuk, hogy ha a PNRC2 útvonal aktiválódik, akkor
hogyan és mi defoszforilálja az UPF1-et.
A decappinghez és az 5'-3' irányú mRNS-bontáshoz szükséges fehérjék (DCP1, DCP2;
XRN1, XRN4) a P-testekben koncentrálódnak. Ezek a P-testek a citoplazmában vannak, membrán
nem határolja őket, összetevőik folyamatosan, dinamikusan változnak. Itt tárolódnak a transzlációs
gátlás alatt lévő mRNS-ek is az újrafelhasználásig vagy a lebontásig (Brengues et al., 2005, Goeres
et al., 2007, Kulkarni et al., 2010, Weber et al., 2008), köztük NMD-target mRNS-ek is (Durand
et al., 2007, Sheth and Parker, 2006). Több fő NMD faktorról is kimutatták, hogy főként ezekben
a P-testekben találhatóak meg: emberben az SMG5, SMG7, UPF1, UPF2 és UPF3, élesztőben az
SMG5 kivételével ugyanezek (Sheth and Parker, 2006, Unterholzner and Izaurralde, 2004).
29
7. ábra. Az NMD kései lépései: a PTC tartalmú mRNS lebontása.
(a) Az mRNS-bontást indukáló enzimek kötődése a foszfo-UPF1-hez. Az UPF1 foszforilációja után az
SMG6 a foszforilált T28-hoz, az SMG5/SMG7 heterodimer a foszforilált S1096-hoz, a PNRC2 pedig a
foszforilált S1073 és S1078 körüli részhez kötődik. (b) Különböző lebontási útvonalak. A különféle
faktorok különböző lebontási útvonalakat indukálnak. Az SMG6 endonukleolitikusan vágja az mRNS-t a
PTC közelében (piros csillag). Az SMG5/SMG7 heterodimer deadenilációt követően decappinget is
indukál, míg a PNRC2/SMG5 komplex deadenilációtól független decappinget okoz. A poli(A)-faroktól
és/vagy az 5' végi sapkától megfosztott mRNS-t az exoszóma és/vagy az XRN1 exonukleázok bontják. (c)
Az NMD-komplex szétszerelődése. Az NMD-komplex szétszerelődéséhez szükség van az UPF1 helikáz
aktivitására és defoszforilációjára. Az ábrát Schweingruber és munkatársai összefoglaló munkája alapján,
módosítva közlöm (Schweingruber et al., 2013).
30
Emlősökben az SMG7 túlexpressziója az egyébként citoplazmás UPF1-et a P-testekbe
relokalizálja (Unterholzner and Izaurralde, 2004). Az nem egyértelmű, hogy a P-testek a lebomlás
helyei vagy csak a transzlációsan gátolt, illetve degradációra kijelölt mRNS-ek tárhelyei (Eulalio
et al., 2007). Humán és élesztő sejttenyészetekben nincs feltétlenül szükség P-testekre ahhoz, hogy
az NMD targetek lebomoljanak (Decker et al., 2007, Rehwinkel et al., 2005a, Stalder and
Muhlemann, 2009). Ezt támasztja alá az is, hogy élesztőben azokat az mRNS-eket is degradálhatja
az NMD, amelyek még aktívan transzlálódnak, vagyis riboszómák kötődnek hozzájuk, de a P-
testekben nincsenek riboszómák (Hu et al., 2010).
Az SMG faktorok jelenléte állatokban is változhat, még akkor is, ha van UPF1
foszforeguláció. Pl. gerincesekben megvan az SMG5, az SMG6 és az SMG7 is, Drosophilában
nincs SMG7, míg növényekben SMG7-ből kettő is van, viszont nincs SMG5 és SMG6 (Benkovics
et al., 2011, Gatfield et al., 2003, Ohnishi et al., 2003). Növényekben ezen kívül még az SMG8,
SMG9 és PNRC2 faktorokat sem sikerült kimutatni. Az SMG1-et nemrég megtalálták minden
vizsgált növényben, az A. thaliana kivételével (Lloyd and Davies, 2013). Korábban már
bizonyítást nyert, hogy az SMG7 megtalálható növényekben is, és főleg a sejtmagban, valamint a
P-testekben lokalizál. A növényi SMG7 is tartalmaz egy 14-3-3-szerű foszfoszerin-kötő domént.
Ennek a doménnek a konzervált aminosavai feltétlenül szükségesek a növényi NMD-hez, ezért
valószínű, hogy a növényi SMG7 is ezzel doménnel köti a foszfo-UPF1-et (8. ábra). Az SMG7
kötődése az UPF1-en keresztül a PTC-hez feltehetően gyors deadenilációt okoz. A deadenilált
mRNS-eket valószínűleg az exoszóma bontja le, úgy tűnik, hogy ez a fő mRNS lebontási útvonal
a növényi NMD-ben. Olykor azonban egy kerülő útvonal is aktiválódhat, amelyben nincs szükség
az SMG7-re, az UPF1 és az XRN4 ugyanakkor nélkülözhetetlenek. Növényekben nincs SMG6,
és a PTC-tartalmú mRNS-ek endonukleolitikus hasítására sem utal semmilyen jel. Feltehetően a
növényi NMD-ben is fontos szerepet játszik az SMG7 UPF1 defoszforiláló szerepe, de ez még
nem bizonyított (8. ábra) (Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013).
31
8. ábra. A növényi NMD kései lépései.
Növényekben hiányzik az SMG5 és az SMG6 is, így valószínűleg az UPF1 N- és a C-terminális régióinak
foszforilált S/TQ helyeihez egyaránt az SMG7 kötődik, ami az UPF1-gyel együtt feltehetően a PTC
tartalmú mRNS-t is magával viszi a P-testekbe. A deadenilációt és/vagy decappinget követően az exoszóma
és/vagy az XRN1 növényi ortológja, az XRN4 bontják le az mRNS-t.
4.5. A növényi NMD vizsgálatára használt tesztrendszerek
A. thaliana-ban a leghatékonyabb módszer genetikai vizsgálatokra a T-DNS inzerciós
mutagenezis. Sok különböző mutáns hozható így létre, mivel a T-DNS véletlenszerűen épül be a
genomba. Ha a T-DNS egy gén promóterébe vagy kódoló régiójába ékelődik be, akkor jelentős
mértékben csökkenteni tudja az érintett gén működését, legtöbbször null mutációt okoz. Más
növények esetén azonban nem bizonyult sikeres módszernek (Winkler and Feldmann, 1998, Page
and Grossniklaus, 2002). Ha el akarjuk kerülni a rengeteg időt és munkát igénylő stabil,
homozigóta T-DNS mutáns növények használatát (amik aztán lehet, hogy nem is életképesek), a
tranziens génexpressziós rendszerek alkalmazása egyszerűbb és gyorsabb megoldást kínál.
32
4.5.1. Agroinfiltráción alapuló tranziens génexpresszió
Az emlős NMD vizsgálatai során nagyszerűen beváltak a tranziens expressziós módszerek, mert
kiválóan alkalmasak arra, hogy egyszerre több gént működését is megfigyeljük, és ez az NMD
tanulmányozásakor nagy előny. A növényi NMD vizsgálatához kifejlesztett tranziens
génexpressziós rendszer az agroinfiltráción alapuló tranziens NMD tesztrendszer (Kertesz et al.,
2006). A módszer lényege, hogy N. benthamiana növények leveleit agroinfiltráljuk. Riporter
génnek általában a GFP NMD-target illetve nem NMD-target konstrukcióit használjuk, így néhány
nap elteltével már szabad szemmel is könnyen értékelhető és összehasonlítható a riportergének
expressziója, és természetesen mRNS és fehérje szinten is. Ezzel a módszerrel azonosította
csoportunk a növényi NMD cisz elemeit és transz faktorait (Kertesz et al., 2006, Kerenyi Z. et al.,
2008, Nyiko et al., 2009). A rendszer hátránya, hogy a transzgének nem integrálódnak a genomba,
így csak néhány napig, és csak az infiltrált felületen expresszálódnak, a vizsgálatok ezért térben és
időben korlátozottak.
Az UPF1 helikáz doménjének egyik erősen konzervált argininjét ciszteinre cserélve
gombákban és állatokban is domináns-negatív mutációt kapunk: a helikáz aktivitás megszűnik
ugyan, de a fehérje képes beépülni az NMD-komplexbe, ami így szintén működésképtelenné válik
(Sun et al., 1998). A növényi UPF1-ben is megvan ez az arginin, amit ciszteinre cserélve (R863C)
a mutáns változat szintén domináns-negatívként hatva (U1DN) kikapcsolja a növényi NMD-t. Az
NMD rendszer tehát tranziensen kikapcsolható az U1DN együtt infiltrálásával (ko-infiltráció).
Ennek segítségével egy levélen összehasonlíthatóak az NMD tesztkonstrukciók expressziói NMD
hatás alatt és NMD hiányában (Kertesz et al., 2006).
Az agroinfiltrált transzgének expressziója növényekben indukálja az RNS interferenciát,
ami gyorsan lebontja a vad típusú és a korai stop kodont tartalmazó mRNS-eket is. Az együtt
infiltrált, Pothos latent virusból (PoLV) származó P14 silencing szupresszor ezt akadályozza meg
úgy, hogy közben nem befolyásolja az NMD működését (Kertesz et al., 2006, Merai et al., 2005).
Ezért P14 jelenlétében csak azok az mRNS-ek bomlanak le, amelyeket az NMD támadni tud. A
P14 ezen kívül a Northern- és Western-blot kísérletek során belső normalizációs kontrollként is
használható.
33
4.5.2. Agroinfiltráción alapuló VIGS-komplementációs tranziens NMD tesztrendszer
Az RNS interferencia egy nagyon specifikus géncsendesítési rendszer. A növények a
transzopzonok ellenőrzésére és a fejlődési folyamatok szigorú ellenőrzésére használják. Ezek
mellett rendkívül hatékony védekezési rendszer vírusok ellen is. Sok vírusban az evolúció során
kialakultak olyan fehérjék, amelyek e folyamat ellen hatnak. Ezek a fehérjék a silencing
szupresszorok, melyek lehetővé teszik a vírus számára, hogy hatékonyan szaporodjon a
gazdanövényben. Azok a vírusok, amelyeknek nincs ilyen fehérjéjük (vagy csak gyengén, illetve
időben vagy térben korlátozottan aktív), a fertőzés korai szakaszában szisztemikusan gyorsan
terjednek, ám néhány nap elteltével a RNS interferenciának köszönhetően a vírus szint
drasztikusan lecsökken a friss levelekben, majd a növény kigyógyul a fertőzésből (pl. Tobacco
Rattle Virus, TRV). Ha egy növényi gén egy darabját a TRV vírusba klónozzuk, és a növényt ezzel
fertőzzük, az RNS interferencia a vírus mellett támadni fogja azokat az endogén mRNS-eket is,
amelyek erősen homológok a vírusba beépített szekvenciával, vagyis a célgén expresszióját
csökkenti, csendesíti. Ez a leghatékonyabb növényi génexpressziót csökkentő, vagy esetenként
megszüntető rendszer, a vírus által indukált géncsendesítés (Virus Induced Gene Silencing, VIGS).
A VIGS ugyan nem okoz teljes génkiütést, de az általa előidézett fenotípus sokszor megegyezik a
null-mutáns fenotípusával, ami azt bizonyítja, hogy a VIGS rendkívül hatékony módszer
(Valentine et al., 2004, Ratcliff et al., 2001, Velasquez et al., 2009).
Ha N. benthamiana növényeket olyan rekombináns TRV-vírussal fertőzünk, amely
tartalmazza a karotinoid bioszintézisben résztvevő fitoén-deszaturáz (PDS) gén egy darabját, a
fertőzést követő 8-12. napra a felső levelekben a növényi PDS mRNS, és így a fehérje szint
drasztikus csökkenése miatt ezek a levelek kifehérednek. Ha a PDS mellett egy másik, csendesíteni
kívánt gén egy darabját is beépítjük a vírus genomjába, akkor mindkét génre hatni fog a VIGS, és
a PDS csendesedését RNS interferencia riporterként használhatjuk: amikor a felső levelek
fehérednek, a másik gén expressziója is csökken (Kerenyi Z. et al., 2008, Velasquez et al., 2009).
A VIGS-NMD kísérleti rendszer egy, a csoportunk által korábban kifejlesztett és sikerrel
alkalmazott hatékony depléciós-komplementációs rendszer, amely alkalmas a növényi NMD
transz faktorainak gyors azonosítására. Például UPF1 csendesített növényekben az NMD-riporter
GFP konstrukció magas expressziót mutatott. Ha az UPF1-csendesített levelekbe vad típusú
UPF1-et infiltráltak, az infiltrált foltban helyreállt az NMD, az NMD-riporter GFP konstrukció
expressziója alacsony volt. Mindez azt bizonyította, hogy az NMD-hez növényekben is
elengedhetetlen az UPF1. A PDS hiánya nincs hatással az NMD működésére, ezért használhatjuk
negatív kontrollként a csak PDS-csendesített növényeket. Ez a rendszer a megfelelő riporter
34
konstrukciók segítségével alkamas volt annak megállapítására is, hogy a vizsgált NMD faktor a
hosszú 3’UTR alapú vagy az intron alapú NMD útvonalhoz szükséges (Benkovics et al., 2011,
Kerenyi Z. et al., 2008, Merai et al., 2013). Munkám során a növényi NMD fő transz faktorának,
az UPF1-nek a funkcionális térképezésére használtam. A módszer hátránya az, hogy nem okoz
null mutációt, mert ha az akár radikálisan lecsökkent génexpresszió elég ahhoz, hogy a gén ellássa
feladatát, a valódi hatás csak nagyon nehezen vagy egyáltalán nem vizsgálható. Ha azonban a null
mutáció letális, ez már előny lehet.
Felmerül a kérdés, hogy a VIGS növények felülinfiltrálásakor, a vizsgálandó
konstrukciókkal együtt infiltrált P14 nem szünteti-e meg a VIGS-et az infiltrált foltban. A
tapasztalatok szerint nem (Kerenyi Z. et al., 2008, Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013). Ez
azért lehet így, mert a P14 valószínűleg a már kialakult RISC komplexeket nem, csak az újak
kialakulását gátolja.
35
5. ANYAG ÉS MÓDSZER
5.1. Növények
Az agroinfiltráláshoz és VIGS kísérletekhez üvegházban nevelt, 3 hetes, vad típusú N.
benthamiana növényeket használtam. VIGS infiltrálás vagy agroinfiltrálás után a növényeket
növénynevelő kamrában (Sony MLR- 351) tartottam, 24°C-on, hosszú nappalon (16 óra fény/8óra
sötét, 7000 lux).
5.2. Agrobaktérium törzs
A kanamicin rezisztens bináris vektorok agroinfiltrálásához az Agrobacterium tumefaciens
rifampicin és tetraciklin rezisztens C58C1 törzsét használtam. A bináris vektorokat három szülős
keresztezéssel juttattam az agrobaktériumba, a második szülő a bináris vektort eredetileg
tartalmazó E. coli DH5α törzse, a harmadik szülő a pRK Helper plazmidot hordozó szintén E. coli
törzs.
5.3. Expressziós vektorok és NMD tesztkonstrukciók
A vizsgált géneket a pBin61S bináris vektor HA-taggel módosított változatába (BinHASanyi), a
35S promóter és 35S terminátor közé építettem be (Silhavy et al., 2002). A BinP14 (P14) a TRV-
PDS, TRV-PDS-UPF1 vektorok, a BinU1DN (U1DN) NMD konstrukciók valamint a G-95 és G-
95I riportereket munkatársaim már korábban elkészítették és leírták (Kerenyi Z. et al., 2008,
Kertesz et al., 2006).
Az intront tartalmazó 3'UTR-ű GFP riporter konstrukciók (G-30I, G-40I, G-50I, G-60I,
G-70I és G-80I) klónozásához a pFF2R reverse és a 30cF, 40cF, 50cF, 60cF 70cF valamint a 80cF
forward primereket használtam a PCR-hez, templátként a G-95I plazmid szolgált. Restrikciós
endonukleáz (FastDigest, Thermo) emésztés után a fragmenteket BamHI/SalI helyre klónoztam a
pBin-GFP vektorba. A felhasznált primerek szekvenciáját a 2. melléklet tartalmazza.
5.4. PCR-mutagenezis
36
A PCR mutagenezist a „linker scanning mutagenesis” technikával végeztem (Sambrook and
Russell, 2001). Az egyes mutánsokhoz eredeti DNS-ként használt plazmidok és a felhasznált
primerek neveit a 3. melléklet, a primerek szekvenciáját a 2. melléklet tartalmazza. A primerek
neveiben a mutF illetve mutR jelöli a tervezett mutáció helyére a mutációt hordozó, de egyébként
komplementer primereket.
5.5. Agroinfiltrálás
A konstrukciókat tartalmazó agrobaktériumokat 5ml folyékony, szelektív LB táptalajba (25μg/ml
kanamicin, 5μg/ml tetraciklin, 10mM MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid] és 20μM
acetosziringon) oltottam le, és éjszakán át 30°C-on növesztettem. A baktériumokat centrifugáltam
(3000g), a csapadékot agrobaktérium visszaoldó folyadékban (10 mM MgCl2, 10 mM MES és
150 μM acetosziringon) szuszpendáltam. Spektrofotométerrel mértem a kultúrák koncentrációját,
majd a kívánt mértékben hígítottam (az infiltráló elegyben a baktérium szuszpenziók végső
koncentrációja P14 esetén OD600=0,2, minden más esetén OD600=0,4). Infiltrálás előtt a baktérium
szuszpenziót 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáltam. Az együtt infiltrálandó konstrukciókat egy
elegybe kevertem össze. Az elegyeket vad típusú (3-4 hetes) vagy VIGS-es (4-6 hetes) N.
benthamiana növények 2-2 felsőbb, fiatal leveleinek fonákján (a gázcserenyílásokon keresztül)
fecskendővel (BD Plastic) juttattam be. A növényeket 24°C-on, hosszú nappalon (16 óra fény, 8
óra sötét, 7000 lux), növénynevelő kamrában neveltem tovább. A harmadik napon lefényképeztem
az infiltrált leveleket, majd az infiltrált foltokból RNS-t és/vagy fehérjét vontam ki. A GFP
fluoreszcenciát kézi UV lámpa segítségével (UV Products, Upland) detektáltam és UV szűrőt
használva Nikon D200 digitális fényképezőgéppel dokumentáltam.
5.6. Vírus indukálta géncsendesítés és VIGS-komplementáció
Az UPF1 VIGS-es növények előállításához 3 hetes N. benthamiana növények 2-2 alsóbb levelét
három agrobaktérium kultúra (P14, TRV-RNA1, TRV-RNA2-PDS-UPF1) elegyével infiltráltam
(Ratcliff et al., 2001). A fertőzött növényeket 24°C-on, hosszú nappalon tartottam, majd kb. két
héttel később, mikor az újonnan kihajtó levelek kifehéredtek, a fehéredő friss levelek alatti
leveleket felülinfiltráltam olyan NMD riporter GFP konstrukcióval, melynek hosszú 3'UTR-jében
37
intron is van, így mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD támadja (Gc-I), mely
elegyítve volt P14 RNS interferencia szupresszorral és a vizsgált UPF1 mutáns konstrukciót
expresszáló agrobaktérium kultúrák egyikével (Kerenyi Z. et al., 2008). Az infiltrálás erős RNS
interferenciát vált ki, ami elfedhetné az NMD hatását. Ezt megelőzendő használtam a P14 RNS
interferencia szupresszort, amit aztán belső kontrollként használtam a Northern- és Western-
blotokhoz. Három nappal az infiltrálást követően a növényeket UV fényben vizuálisan értékeltem
és lefényképeztem, majd az infiltrált levélfoltokból RNS-t vontam ki.
5.7. RNS kivonás növényi szövetből
Az RNS-kivonásokat kb. 1 cm2 kiterjedésű infiltrált levélfoltokból végeztem. A levéldarabokat
folyékony nitrogén alatt összetörtem, majd kivonó pufferben (0,1 M glicin, 10 mM EDTA, 0,1 M
NaCl, 2% SDS) elkevertem. Ezután fenol és kloroform segítségével végeztem RNS kivonást a
korábban leírt módon (Szittya et al., 2002).
5.8. Northern-blot
Minden mintából 2 µg RNS-t futtattam agaróz gélben (1,5% agaróz, 0,8% formaldehid, 1x MAE),
MAE pufferben, 80 Volttal, szobahőn {1xMAE puffer összetétele: 20 mM MOPS [3-(N-
morpholino)propanesulfonic acid], 5 mM Na-acetát, 1 mM EDTA pH 7,0}. 20 percnyi 20x SSC-
ben áztatást követően az RNS mintákat kapilláris technikával blottoltam nitrocellulóz membránra
(Hybond-N, GE Healthcare) éjszakán át, 20x SSC-vel (saline-sodium citrate; 3 M nátrium-klorid,
3 mM trinátrium-citrát). Hibridizálás előtt membránokat 5x SSC-ben mostam, megszárítottam, az
RNS-eket UV keresztkötéssel a membránhoz rögzítettem. A hibridizáláshoz a próbát HexaLabel
kittel (Fermentas), α-32P izotóp (dCTP 0,74 MBq, Izotóp Int. Kft.) felhasználásával P14 és GFP
PCR termékről készítettem. A membránt a próbákat tartalmazó Church pufferben (0,5M NaPi, 7%
SDS, 1mM EDTA pH 8,0, 1%BSA,) 65 °C-on, éjszakán át hibridizáltam. Másnap a membránokat
2xSSC, 0,1% SDS oldatban mostam kétszer 15 percig 65 °C-on. A radioaktív jelet BAS Storage
Phosphor Screennel (GE Healthcare) detektáltam, Storm 840 szkennerrel (Amersham
Biosciences) olvastam le, és ImageQuant szoftverrel értékeltem. A GFP jeleket mindig a P14 jelre
normalizáltam.
38
5.9. Fehérje kivonás növényi szövetből
Az infiltrált levélfoltokból (ugyanazokból, melyekből RNS-t is izoláltam) kb. 1 cm2 területű
levéldarabokat folyékony nitrogén alatt eldörzsöltem, majd jéghideg feltáró puffert (25mM Tris
puffer (pH 7,6), 150mM NaCl, 10% glicerol, 2% PVPP, 0,15% Igepal, 5mM DTT, 1% Sigma
Plant Protease Inhibitor Cocktail) adtam hozzá. A mintákhoz 2x Laemmli oldatot (4%SDS, 20%
glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 0,004% brómfenolkék, 0,125M Tris HCl) adtam, 5 percig
forraltam, majd 5 perc centrifugálás (4°C, 15.000 rpm) után a felülúszót új eppendorf csőbe
pipettáztam és további felhasználásig -70°C-on tároltam.
5.10. Western-blot
A fehérje mintákat SDS poliakrilamid (12%) gélelektroforézissel (SDS-PAGE) elválasztottam
(Sambrook and Russell, 2001), majd 20% metanolt tartalmazó Tris-glicin pufferben (WTB puffer)
nitrocellulóz membránra (Hybond-C, GE Healthcare) blottoltam (Fastblot B33, Biometra). A
membránt 1 óráig 5%-os tejpor oldatban blokkoltam, majd monoklonális, HRP-konjugált, HA
specifikus ellenanyaggal (anti-HA peroxidase, Roche), illetve poliklonális, nyúlban termeltetett
anti-P14 ellenanyaggal 1 órán át inkubáltam. Jelölés után 1x PBST oldatban 4x10 percig mostam.
Az ECL-kit (ECL+ Western Blotting Reagent, GE Healthcare) segítségével kapott
kemilumineszcens jeleket röntgen filmmel detektáltam.
5.11. Immunprecipitáció (IP)
Az expresszáltatni kívánt UPF1 mutánsokat (P14-gyel együtt) hat-hat, 3 hetes N. benthamiana 2-
2 levelébe agroinfiltráltam, majd három nap múlva leszedtem a leveleket, folyékony nitrogénben
eldörzsöltem és jéghideg IP puffert [25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 10% glicerol, 2%
PVPP, 0,15% Igepal, 5mM DTT, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1% plant protease inhibitor (Sigma), 1
tabletta cOmplete Mini (Roche)] (Baumberger and Baulcombe, 2005) adtam hozzá és jégre tettem.
A durva extraktumot centrifugáltam (13400 rpm, 10 perc, 4°C), a felülúszót új csőbe tettem, majd
megismételtem a centrifugálást. 50 μl centrifugált extraktumot áttettem új csőbe, majd 2xLaemli
pufferrel kezeltem: 5 perc forralás után 2 perc jégbehűtés, centrifugálás (13400 rpm, 5 perc, RT).
A felülúszót óvatosan új csőbe tettem. 50 μl HA agaróz gyöngyhöz (Anti-HA Affinity Matrix,
39
Roche) 400 μl IP puffert adtam, centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), és a felülúszót pipettával
óvatosan eltávolítottam. A gyöngyökhöz adtam 175 μl IP puffert és 800 μl mintát, majd 1 órán át
síkrázón (140 rpm) inkubáltam. A csöveket centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), a felülúszót
eltávolítottam. Ezután kétszer mostam az alábbiak szerint: rámértem 800 μl jéghideg IP puffert,
rázattam (120 rpm, 1min, 4°C), centrifugáltam (13400 rpm, 30 sec, 4°C), és a felülúszót pipettával
óvatosan eltávolítottam. A mosott gyöngyöket 50 μl 2xLaemli-vel kezeltem és az így eluált mintát
új csőbe pipettáztam.
5.12. Foszfofestés
Az expresszáltatott UPF1 mutáns fehérjék foszforiláltsági állapotát megvizsgálandó minden
eluátumot kétfelé osztottam, az egyik részt alkalikus foszfatáz enzimmel (FastAPTM, Fermentas),
a másikat - kontrollként - annak hiányában inkubáltam (1 óra, 37°C). A kezelt és kezeletlen
mintákat SDS-PAGE után ProQ Diamond foszfospecifikus festékkel (ThermoFisher) festettem a
gyártó utasításai szerint, majd PageBlueTM (ThermoFisher) festéssel határoztam meg az egyes
mintákban az összes fehérje mennyiségét, és a foszfofestéssel kapott jelet ehhez normalizáltam.
40
6. EREDMÉNYEK
Munkám során a növényi NMD szabályozásának két fontos elemét vizsgáltam. Az egyik a 3'UTR-
ben helyeződő intronok hatása a növényi NMD hatékonyságára. A másik az UPF1 fehérje
foszforilációjának szerepe az NMD által támadott mRNS-ek lebontásában.
6.1. Növényi mRNS-ek 3’ nem transzlálódó régiójában helyeződő intronok finomtérképezése
Emlősökben a stop kodontól 3' irányban legalább 50 nukleotidra lévő intronok NMD-t indukálnak
(Nagy and Maquat, 1998). Csoportunk korábbi munkájából a növényi intron alapú NMD-ről csak
azt tudtuk, hogy ha az intron 28 nukleotidra van a stop kodontól, az nem okoz NMD-t, viszont ha
99 nukleotidra, az igen (Kertesz et al., 2006). Ezért felmerült a kérdés, hogy a növényekben mi az
a kritikus távolság az intron és a stop kodon között, ami már NMD-t indukál. Tisztázni szerettük
volna azt is, hogy az emlősökéhez hasonlóan egy igen/nem válaszról van-e szó, vagy pedig
növényekben a távolság növekedésével változik az NMD hatékonysága is. Ezen kérdések
megválaszolására hat különböző riporter konstrukciót készítettünk, melyekben a burgonya LS
intront 30, 40, 50, 60, 70, vagy 80 nukleotid távolságra klónoztuk a GFP riporter génünk stop
kodonjától 3’ irányba (G-30I, G-40I, G-50I¸ G-60I, G-70I, G-80I) (9. ábra a). A stop kodontól 95
nukleotid távolságra (G-95I) intront tartalmazó konstrukciót munkatársaim már korábban
elkészítették. A 30cF, 40cF, 50cF, 60cF, 70cF és 80cF forward és a pFF2 rev reverse primerekkel
a G95I plazmid alapján létrehozott PCR termékeket BamHI-SalI helyre építettük be a pBin-GFP
bináris vektorba. A konstrukciókat úgy terveztük, hogy bár az intron távolsága a stop kodontól
változott, a teljes beépített szekvencia hossza minden konstrukció esetén azonos volt.
Konstrukcióinkat N. benthamiana agroinfiltrációs rendszerben teszteltük. Az adott
konstrukció NMD érzékenysége domináns-negatív UPF1-gyel (U1DN) együtt infiltrált mintákhoz
viszonyítva vizsgálható, mivel az U1DN fehérje inaktiválja az NMD-t (lásd 4.5.1. fejezet). Minél
erősebben támadja az NMD az adott riporterkonstrukciót, annál jobban megnövekedik a GFP
expressziója U1DN hatására. Ezért a teszt konstrukciókat önmagukban (kontroll), illetve U1DN-
val együtt egymás mellé infiltráltuk, normalizációs kontrollnak minden esetben a szintén együtt
infiltrált, az RNS interferenciát szupresszáló P14-et használtuk (Merai et al., 2005).
41
9. ábra. Növényekben a stop kodontól downstream több mint 50 nukleotidra helyeződő intronok
NMD-t okoznak.
(a) A felhasznált konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az NMD riporter konstrukciók
transzkriptumként, míg az együtt expresszáltatott konstrukciók fehérjeként szerepelnek az ábrán. A riporter
mRNS-ek 35s 3’UTR-je a 35s terminátor szekvencia 3’UTR-je. (b) Az LS intron a stop kodontól 50
nukleotidnál messzebbre klónozva intron alapú NMD-t indukál. GFP alapú NMD riporter konstrukciókat
(amik 30-95 nukleotid hosszúságú töltelékszekvenciát hordoznak a stop kodon és az LS intron között; G-
30I, G-40I, G-50I, G-60I, G-70I, G-80I és G-95I), valamint egy intront nem tartalmazó kontroll
konstrukciót együtt infiltráltunk P14 silencing szupresszorral (-) vagy P14-gyel és az UPF1 domináns-
negatív mutáns verziójával (U1DN). A P14-et azért infiltráltuk, hogy megakadályozzuk a transzgén által
indukált RNS interferenciát, továbbá belső normalizációs kontrollként használtuk a Northern-blothoz. A
blotokat P14 és GFP próbákkal hibridizáltuk. Az RNS minták mennyiségi meghatározását úgy végeztük,
hogy minden mintában az NMD riporter mRNS GFP próbával adott jelét a neki megfelelő P14 jelhez
normalizáltuk (GFP/P14). Az átlagértékek három független kísérlet eredményeiből származnak. A (-)
mintát egynek vettük, az U1DN-t ehhez viszonyítottuk (a ± a szórást jelzi). Az oszlopdiagram ezeket a
számított értékeket ábrázolja minden konstrukció esetén.
42
A G-30I és G-40I konstrukciók szintje gyakorlatilag megegyezik a kontrollban és az
U1DN-val együtt infiltrált mintákban, jelezve, hogy ezeket a mRNS-eket nem támadja az NMD
(8. ábra b). Ezzel szemben a G-50I¸ G-60I, G-70I, G-80I és G-95I konstrukciók esetében az U1DN
koexpresszált minták a GFP relatív expressziója jóval magasabb. Azaz ezeket a mRNS-eket az
NMD hatékonyan támadja. U1DN nélkül a konstrukciók expressziója a stop kodon és az intron
közötti távolság növekedésével egyre gyengébb, az U1DN expressziót növelő hatása így egyre
erőteljesebb (9. ábra b). Vagyis 50 és 95 nukleotid között az intron és a stop kodon közötti távolság
növekedése fokozatosan erősíti az NMD hatékonyságát. Negatív kontrollnak olyan konstrukciót
használtunk, melynek 95 nukleotid hosszú 3’UTR-je van, viszont intront nem tartalmaz (G-95, 9.
ábra a). U1DN-val együtt infiltrálva nem változott az expressziója (8. ábra b), vagyis nem támadja
az NMD. Ez pedig azt mutatja, hogy riporter-konstrukcióinkat pusztán a hossza miatt nem támadja
az NMD. Fentieket egybevetve megállapíthatjuk, hogy növényekben a 3’UTR-ben lévő intronok
pozíciója döntően befolyásolja az mRNS NMD érzékenységét, hiszen (1) csak a stop kodontól
legalább 50 nukleotidra helyeződő intronok indukálnak NMD-t; és (2) minél messzebb van a
3’UTR intron a stop kodontól, annál erősebben hat az NMD.
6.2. A növényi UPF1 foszforegulációja
Az UPF1 fehérje egy-egy konzervált cisztein- és hisztidin-gazdag régiót (CH domén) és ATP-
áz/helikáz domént, valamint egy többé-kevésbé konzervált N-terminális és egy kevésbé konzervált
C-terminális, S/TQ foszfohelyekben gazdag régiót tartalmaz (4. ábra a; 10. ábra). Ezek az S/TQ
helyek a PIKK-kinázok lehetséges célpontjai. Csoportunk korábban megmutatta, hogy
növényekben az N- és C-terminális régiók az NMD szempontjából funkcionálisan redundánsak,
de legalább az egyikre szükség van. Ha mind az N-, mind a C-terminális régió hiányzik (ΔNΔC),
a csonka UPF1 nem képes ellátni a feladatát, ha viszont csak a C- (U1ΔC) vagy csak az N-
terminális (U1ΔN) régió hiányzik, akkor ez az egyik oldalról csonka UPF1 már képes
komplementálni az UPF1-csendesített növényeket. Szintén csoportunk korábbi munkájából
tudjuk, hogy az N- és a C-terminális régió is foszforilált (Merai et al., 2013). Azonban az, hogy
Az UPF1 N- és C- terminális régióiban mely aminosavak foszforiláltak, és hogy ez a foszforiláció
kell-e a növényi NMD-hez, nem volt ismert.
43
10. ábra. Az A. thaliana UPF1 szerkezete.
(a) Az A. thaliana UPF1 sematikus domén szerkezete. Az S/TQ helyeket piros vonal jelzi. (b) Az A.
thaliana UPF1 szekvenciája. Az S/TQ helyek pirossal szedve. A két részre osztott N-terminális régió Nn
része feketével, az Nc része kékkel van aláhúzva, a négy részre osztott C-terminális régióban a C1 rész
szürkével, a C2 rész sárgával, a C3 rész narancssárgával, míg a C4 rész rózsaszínnel van aláhúzva. A
csillagok azon NMD-releváns S/TQ helyeket jelzik, amiket NMD-komplementációs kísérletekben
azonosítottunk. Az MS-analízis által azonosított foszforilációs helyeket a fekete téglalapok jelzik. A szürke
téglalapok a foszforilált szerineket jelölik. Megemlítendő, hogy a C-terminális régió C2, C3 és C4 részében
lévő S/TQ helyek esetleges szerepét az NMD-ben nem vizsgáltuk, ahogy foszforiláltsági állapotukat sem.
6.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának S/TQ potenciális foszfohelyei részt vesznek az NMD-ben
Hogy megvizsgáljuk és megértsük az UPF1 N-terminális régiója foszforilációjának szerepét az
NMD-ben, az A. thaliana UPF1-ben az N-terminális potenciális S/TQ foszfohelyeket rontottuk
vagy távolítottuk el. Ehhez különféle deléciós és pontmutánsokat, illetve ezek kombinációit hoztuk
létre, majd ezek aktivitását a munkatársaim által korábban már eredményesen alkalmazott VIGS-
komplementációs rendszerben vizsgáltuk (lásd 4.5.2. fejezet). Mivel az N- és C-terminális régiók
csupán egyikének jelenléte is elegendő a hatékony NMD-hez, az N-terminális régiót olyan mutáns
44
fehérjében teszteltük, amelyikből hiányzott a C-terminális rész (U1ΔC). VIGS segítségével UPF1-
csendesített N. benthamiana növényeket hoztunk létre. Ezek szisztemikus leveleibe együtt
infiltráltuk az NMD riporter GFP konstrukciónkat (Gc-I) - melynek 3'UTR-je 200 nt hosszú volt
és egy intront is tartalmazott, ezért mind a hosszú 3'UTR alapú, mind az intron alapú NMD
felismeri és lebontja -, valamint az UPF1 különböző N-terminális mutánsait (11. ábra). Pozitív
kontrollként U1ΔC-t infiltráltunk együtt a Gc-I-vel. Minthogy az NMD az UPF1-csendesített
növényekben nem működik, ha a Gc-I-t önmagában, vagy egy funkcióját betölteni képtelen UPF1
mutánssal (ami így komplementálni sem tudja az UPF1 hiányát) együtt infiltráljuk, akkor a Gc-I
mRNS expressziós szintje magas lesz és erős zöld fluoreszcenciát látunk. Ha viszont a Gc-I-t egy
működőképes UPF1 mutánssal infiltráljuk együtt, akkor az komplementálja az UPF1 hiányát, és
az NMD hatékonyan tudja támadni az Gc-I mRNS-t. Következésképpen a Gc-I mRNS
expressziója alacsony lesz és gyenge zöld fluoreszcenciát látunk (11. ábra). Minden mintával
együtt infiltráltuk a P14 silencing szupresszort, hogy megakadályozzuk az agroinfiltráció által
indukált RNS interferenciát. A P14-et belső kontrollként is használtuk a Northern- és Western-
blot kísérletekben.
11. ábra. UPF1-VIGS N. benthamiana növények leveleinek infiltrálása, komplementáció.
a) Ha vad típusú növény levelébe infiltráljuk a hosszú 3'UTR-t, és abban intront is tartalmazó GFP
konstrukciót (Gc-I), azt az NMD hatékonyan támadja, ami alacsony GFP expressziót eredményez. b) Ha a
Gc-I konstrukciót UPF1-VIGS növény levelébe infiltráljuk, magas GFP expressziót tapasztalunk, mivel
UPF1 hiányában az NMD nem működik. Ha a Gc-I konstrukcióval együtt infiltráljuk a vad típusú UPF1-
et, az az infiltrált foltban helyreállítja az NMD-t, így újra alacsony GFP expressziót látunk. c) UPF1-VIGS
növények levelébe Gc-I konstrukcióval különböző mutánsokat együtt infiltrálva megállapítható, hogy az
adott mutáns be tudja-e tölteni az NMD-hez szükséges funkcióját.
45
Állatokban az UPF1-et az SMG1 PIKK kináz foszforilálja (Yamashita, 2013). Az első
három PIKK kináz target S/TQ hely és környezete konzervált, nem csak a növények között, hanem
a növények és az ember között is (4. melléklet). Ezért az A. thaliana UPF1 N-terminális régiójában
ezeket az S/TQ helyeket mutáltattuk (1. táblázat, 12. ábra a). Az A. thaliana UPF1 N-terminális
régiója négy S/TQ helyet tartalmaz: S3, S13, T29 és S105 (P1, P2, P3, P4). Megvizsgálandó ezen
helyek szerepét az NMD-ben, három pontmutánst és egy deléciós mutánst készítettünk. A
mutánsok neveiben az N utal arra, hogy N-terminálison létrehozott mutációról van szó, a P pedig
a foszfohelyeket jelöli, sorrendben 1-től 4-ig. Így az NP1-4A mutánsban mind a négy S/T
aminosavat alaninra cseréltük (a név tehát az N-terminal region Phosphorylation sites 1-4 Alanine
change rövidítése). Az NP1-2AP4A mutánsban az S3, S13 és S105 (P1, P2 és P4) szerineket
alaninra cseréltük, a T29 treonin maradt, míg az NP3A mutánsban csak a T29 treonint cseréltük
alaninra, a szerineket meghagytuk. Az NΔNn deléciós konstrukcióban az N-terminális régió N-
terminális részét - 1-35 aminosav - távolítottuk el (1. táblázat, 10. ábra b, 12. ábra a). A Western-
blot igazolta, hogy ezek a kostrukciók hasonló mértékben expresszálódnak (12. ábra d).
S3 (P1) S13 (P2) T29 (P3) S105 (P4) NMD
U1ΔC S S T S + NP1-4A A A A A -
NP1-2AP4A A A T A + NP3A S S A S + NΔNn - - - S -
1. táblázat. Az A. thaliana UPF1 N-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt
konstrukciók I.
Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt, vagy kivágott aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.
Ahogy vártuk, az U1ΔC-t Gc-I-vel (és P14-gyel) együtt infiltrálva UPF1-csendesített
levelekbe gyenge zöld fluoreszcenciát és alacsony Gc-I mRNS szintet tapasztalunk. Ez megerősíti
azt a korábbi eredményt, hogy az UPF1 a C-terminális régió hiányában funkcióképes, hiszen
hatékonyan komplementálja az UPF1 hiányát (12. ábra b, c) (Merai et al., 2013). Ezzel ellentétben,
ha az NP1-4A mutánst infiltráljuk együtt Gc-I-vel, akkor erős GFP expressziót és magas Gc-I
mRNS szintet látunk. Ez annak köszönhető, hogy az NP1-4A nem képes komplementálni az UPF1
hiányát, vagyis elvesztette az NMD-hez szükséges funkcióját (12. ábra b, c). Ebből pedig az
következik, hogy az N-terminális S/TQ helyeknek, vagy legalábbis némelyiküknek, fontos szerepe
van a növényi NMD-ben. Állatokban az SMG6-nak kötőhelyül szolgáló T28 foszforilációja
46
12. ábra. Az A. thaliana UPF1 N-terminális régiójának funkcionális térképezése.
(a) A kísérletekhez használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az NMD riporter Gc-
I erős NMD-target: 3’UTR-je hosszú, és hatékonyan kivágódó intront tartalmaz. A Gc-I mRNS-ként, a
tesztelt UPF1 mutánsok fehérjeként vannak ábrázolva. A λN és HA tagek a fehérjék egyszerű kimutatása
és más kísérletek megkönnyítése miatt vannak fuzionáltatva. (b), (c) Az N-terminális régió mutánsainak
VIGS-komplementációs vizsgálata. Az N-terminális régiót a C-terminális hiányában térképeztük (U1ΔC).
Az U1ΔC konstrukcióban vagy mind a négy (NP1‐4A), vagy három (NP1‐2A4A), vagy egy (NP3A) N-
terminális S/TQ hely lett elrontva. Az NΔNn konstrukcióban az Nn rész (1-35 aminosav, benne az első
három S/TQ hely) lett eltávolítva. (b) A funkcionális térképezéshez a konstrukciókat a Gc-I-vel és P14-
gyel infiltráltuk együtt UPF1-csendesített növények (VIGS:U1) leveleibe. A pozitív kontroll az U1ΔC volt.
Az erős fluoreszcencia inaktív NMD-t jelez, vagyis az infiltrált UPF1 mutáns nem tudja komplementálni
az endogén UPF1 hiányát. A gyenge fluoreszcencia azt mutatja, hogy az infiltrált UPF1 mutáns hatékony
NMD-re képes. (c) A Northern-blot GFP és P14 próbákkal van hibridizálva. Minden mintában a GFP jelét
a P14 jelhez normalizáltuk (GFP/P14). Az átlagok három független kísérletből adódnak, a ± a szórást jelöli.
Az U1ΔC normalizált értékét vettük egynek, a többi mintát ehhez viszonyítottuk. A mintavétel infiltrálás
után 3 nappal történt. (d) A kísérletekhez használt konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden UPF1
mutáns konstrukciónk végén HA-tag volt, így anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső
kontrollnak a P14-et használtuk.
létfontosságú az NMD szempontjából (Okada-Katsuhata et al., 2012). A növényekben a T29 felel
meg az állati T28-nak (4. melléklet). Annak kiderítésére, hogy ez a treonin a növényi UPF1-ben
is hasonlóan fontos szerepet játszik-e, illetve hogy a többi N-terminális S/TQ hely részt vesz-e a
növényi NMD-ben, a különböző pontmutánsok komplementációs képességét vizsgáltuk.
47
Megnéztük, hogyan viselkednek azon UPF1 mutánsok, melyekben vagy csak ez a treonin
volt elrontva (NP3A), vagy csak ezt hagytuk meg (NP1-2A4A). Mindkét mutáns képes volt
komplementálni az UPF1 hiányát (12. ábra b, c). Az N-terminális S/TQ helyek tehát funkciójukat
tekintve redundánsak. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a T29 (amely megfelel az állati
T28-nak) bár elégséges, hiszen egyedül is elegendő a funkció megtartásához, de nem feltétlenül
szükséges, mert a többi SQ hely a T29 hiányában is képes erre. Tehát az állatokkal ellentétben ez
a három szerin (vagy közülük valamelyik) is részt vesz az NMD-ben. Az NΔNn mutáns nem
komplementálja az UPF1 hiányát, ami azt mutatja, hogy az eltávolított Nn részben lévő három
S/TQ helynek fontos szerepe van az NMD-ben (12. ábra b, c).
6.2.2. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része erősen foszforilált, de nincs szerepe az NMD-
ben
Munkatársaim korábbi munkáiból tudjuk, hogy az UPF1 N-terminális régiója foszforilált (Merai
et al., 2013), most pedig megmutattuk, hogy az itt található S/TQ potenciális foszfohelyek részt
vesznek az NMD-ben. Ezek alapján azt feltételeztük, hogy ezek az NMD-releváns S/TQ
potenciális foszfohelyek az N-terminális régióban valóban foszforiláltak. E hipotézisünkből
kiindulva összehasonlítottuk a fent említett mutánsaink foszforiláltsági állapotát (13. ábra a, b).
Az NP1-4A, NP1-2A4A, NP3A és NΔNn konstrukciókat infiltráltuk vad típusú N. benthamiana
növények leveleibe, majd a levelekben expresszálódó fehérjéket HA ellenanyaggal (minden
konstrukciónk végén HA tag volt) immunoprecipitáltuk (IP). Az IP minták egyik felét alkalikus
foszfatázzal kezeltük, másik felét kontrollként csak pufferben inkubáltuk. A mintákat akrilamid
13. ábra. Az UPF1 N-terminális régiójának Nc része foszforilált.
(a) Az U1ΔC és pontmutáns változatai (NP1-4A, NP1-2A4A, NP3A) hasonló mértékben foszforiláltak. (b)
Az NΔNn deléciós mutáns, melyből hiányzik az első három, NMD-releváns potenciális foszfohely, szintén
erősen foszforilált.
gélen megfuttattuk, és festettük vagy ProQ Diamond foszfoprotein festékkel vagy kontrollként
PageBlue nem specifikus fehérjefestékkel. Pozitív kontrollnak az U1ΔC, míg negatív kontrollnak
48
a mindkét végén csonka, N- és C-terminális régióitól is megfosztott UPF1 (ΔNΔC) konstrukciót
használtuk. Az alkalikus foszfatázzal kezelt és a kezeletlen minta festődése közötti különbség
mutatja meg az adott konstrukció foszforiláltságának mértékét.
Munkatársaim korábbi eredményeivel összhangban, miszerint az UPF1 N-terminális
régiója foszforilált (Merai et al., 2013), azt találtuk, hogy az U1ΔC fehérje erősen foszforilált, míg
a ΔNΔC csak gyenge háttérfestődést mutatott (13. ábra a, b). A vizsgált mutánsok esetében viszont
várakozásainkkal ellentétben azt tapasztaltuk, hogy mindegyik, még az NP1-4A konstrukció is
(ebben az összes lehetséges S/TQ foszfohely el van rontva), valamint az NΔNn konstrukció is
(melyből az első három S/TQ hely hiányzik) erősen foszforilált (13. ábra a, b). Ezek az
eredmények pedig azt mutatják, hogy az UPF1 N-terminális régiójának C-terminális része (a
továbbiakban Nc) erősen foszforilált, és hogy legalább egy, nem S/TQ hely is foszforilált az UPF1
N-terminális régiójában.
6.2.3. Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő S/TQ helyek valóban foszforiláltak, és
szükségesek az NMD-hez
Megvizsgáltuk, hogy ennek az erősen foszforilált Nc résznek van-e szerepe az NMD-ben. Ehhez
egy újabb mutánst készítettünk, amelyikből az Nc részt távolítottuk el az U1ΔC konstrukcióból (2.
táblázat, 14. ábra a). Az NΔNc mutáns hatékonyan, az U1ΔC-vel azonos mértékben
komplementálta az UPF1 hiányát (14. ábra b, c). Ez a megfigyelés, valamint az a már fentebb
említett eredmény, miszerint az NΔNn mutáns nem komplementálta az UPF1 hiányt, azt mutatja,
hogy az Nc rész nem fontos az NMD-hez, s így a negyedik foszfohely sem (S105).
2. táblázat. Az A. thaliana UPF1 N-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt
konstrukciók II.
Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt vagy kivágott aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.
Az NΔNc mutáns fehérjéből hiányzik az erősen foszforilált rész, de tartalmazza az összes,
NMD szabályozásában szerepet játszó foszforilációs helyet, ezért komplementálni tudja az UPF1
S3 (P1) S13 (P2) T29 (P3) S105 (P4) NMD
U1ΔC S S T S + NΔNc S S T - +
NΔNcP1-3A A A A - - NΔNcP1-2A A A T - +
NΔNcP3A S S A - +
49
hiányt. Ebben a mutánsban is megvizsgáltuk az NMD-releváns S/TQ helyeket. Ezekben a
konstrukciókban ugyanolyan szisztéma szerint rontottuk el ezeket az S/TQ potenciális
foszfohelyeket, mint a teljes N-terminális rész esetén (2. táblázat, 14. ábra a). Hasonlóképpen
UPF1-VIGS növényekben vizsgáltuk, hogy képesek-e komplementálni az UPF1 hiányát, valamint
tanulmányoztuk a foszforiláltsági állapotukat is. Amikor mindhárom helyet (S3, S13, T29)
elrontottuk (NΔNcP1-3A), akkor ez a fehérje UPF1-VIGS-es növényekben nem komplementálta
az UPF1 hiányát (14. ábra b, c). Ezzel szemben a csak a harmadik (NΔNcP3A), vagy csak az első
két (NΔNcP1-2A) S/TQ foszfohelyen elrontott mutánsok az infiltrált foltban képesek voltak
helyreállítani az NMD-t (2. táblázat, 14. ábra b, c). Ezek az eredmények alátámasztják a 6.2.1.
fejezetben leírtakat, vagyis azt, hogy ez a három S/TQ hely, az S3, az S13 és a T29 szerepet
játszanak az NMD-ben. Ezek a helyek ráadásul funkciójukat tekintve redundánsak, hiszen vagy az
S3 és S13 együtt, vagy a T29 önmagában elegendő volt a megfelelő működéshez.
Ezek után ezen mutánsok (NΔNc, NΔNcP3A, NΔNcP1-2A, NΔNcP1-3A)
foszforilációját vizsgáltuk ProQ Diamond foszfofestéssel. Negatív kontrollként a ΔNΔC, pozitív
kontrollként az U1ΔC konstrukciót használtuk. Azt tapasztaltuk, hogy az NΔNc mutáns fehérje
gyengébben bár, mint az U1ΔC, de foszforilált (14. ábra e). Ebből az következik, hogy az Upf1
fehérje N-terminális régiójának Nn és Nc része is foszforilált. Az NΔNcP1-3A fehérje csak a
ΔNΔC-vel megegyező háttérfestődést mutatta, vagyis ez a fehérje nem foszforilált (14. ábra e).
Ebből az eredményből pedig az következik, hogy az Nn régióban csak az S/TQ helyek
foszforiláltak. Ezt az is megerősíti, hogy a másik két részleges mutáns (NΔNcP1-2A, NΔNcP3A)
az NΔNc-nél gyengébben bár, de jól láthatóan foszforiláltak (14. ábra e). Ezek az eredmények
együttesen pedig azt mutatják, hogy az S3, S13 és T29 NMD-releváns helyek foszforiláltak. Ezen
eredményeinket a munkatársaim által elvégzett tömegspektrometriás elemzés is megerősítette
(lásd a Következtetések és javaslatok fejezetben). A tömegspektrometriával több foszforilációs
helyet is azonosítottak, többek között az Nc részben is (10. ábra b, 5. melléklet) ám a két kísérlet
együttesen azt mutatja, hogy az NMD-ben csak az S3, S13 és T29 helyek foszforilációja játszik
szerepet (Kerenyi F. et al., 2013).
50
14. ábra. Az NMD-releváns N-terminális S/TQ helyek foszforiláltak.
(a) A kísérletekhez használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b), (c) Az Nc résztől
megfosztott UPF1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. Az U1ΔC konstrukcióból kivágtuk az Nc
részt, majd pontmutánsokat készítettünk három, kettő, vagy egy S/TQ hely elrontásával (NΔNcP1-3A,
NΔNcP1-2A és NΔNcP3A) (lásd 2. táblázat). A vizsgálat menete és a minták által adott jelek értékelése a
6.3. ábrával azonos módon történt. A (-) minta a csak Gc-I-vel és P14-gyel lett infiltrálva. (d) A
kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk
tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et
használtuk. (e) Az UPF1 N-terminális régiójának Nn részén lévő, NMD-releváns S/TQ helyek
foszforiláltak. A (-) minta a csak pufferrel, a (+) minta az alkalikus foszfatázzal (AP) kezelt minta. Az
NΔNc minta foszforilált, míg az NΔNcP1-3A minta (amelyikben mind a három S/TQ hely el van rontva)
nem foszforilált. Az NΔNcP1-2A és az NΔNcP3A gyengébben bár, mint az NΔNc, de foszforiláltak.
Az aszparaginsav (Asp, D) a negatív töltése miatt hasonlít a foszforilált szerinre és a
foszforilált treoninra, ezért a szerin/treonin foszforiláció mimikálására szokták használni (Hiscott
et al., 1999, Jean et al., 2010). Megvizsgáltuk, hogy a T29 esetében a foszforiláció mimikálása
(T29D, NΔNP1-2P3D; 15. ábra a) elegendő-e az NMD-hez, vagy a valóban foszforilált treoninra
van hozzá szükség. Kísérleteink azt bizonyították, hogy a foszforiláció mimikálása nem elég az
NMD-hez (15. ábra b, c).
51
15. ábra. A foszforilációt mimikáló (T29D) mutáns UPF1 nem komplementálja az UPF1 hiányát.
(a) A kísérletben használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. Az első 26 aminosavat
(a P1 és P2 hellyel együtt) eltávolítottuk az U1ΔC-ből (NΔP1-2). Az NΔP1-2-ben T29-et alaninra (NΔP1-
2P3A) vagy foszforilált treonint mimikáló aszparaginsavra cseréltük (NΔP1-2P3D). (b, c) A deléciós-
aminosav cserés N-terminális UPF1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített N.
benthamiana levelekbe infiltráltunk Gc-I NMD riportert P14-gyel és valamelyik UPF1 mutánssal. A T29A
és a T29D mutációk nem képesek komplementálni az endogén UPF1 hiányát. (d) A kísérletekhez használt
UPF1 mutáns konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így
anti-HA ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk. Megjegyzendő, hogy
bár a NΔP1-2P3A alig detektálható mértékben expresszálódik, mégis domináns-negatív hatása van (lásd
6.2.4. fejezet, 16. ábra).
6.2.4. A funkcióját vesztett N-terminális UPF1 mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van
A PDS-VIGS kontroll növényekben úgy láttuk, hogy azok a mutánsok, melyek nem képesek
komplementálni az UPF1 hiányát, emelik a Gc-I expressziót, ami arra utalt, hogy esetleg
domináns-negatív hatásuk van. Ezért vad típusú N. benthamiana leveleibe együtt infiltráltuk az
NP1-4A, az NP3A és az NΔNn mutánsokat a Gc-I-vel (és P14-gyel), illetve az U1ΔC pozitív
kontrollt, és vizsgáltuk a Gc-I expressziót. Azt tapasztaltuk, hogy a funkcióvesztéses NP1-4A és
NΔNn mutánsokkal együtt infiltrált Gc-I lényegesen erősebben expresszálódott, mint az U1ΔC
vagy a funkcióját megtartott NP3A mellett (16. ábra a, b). Sőt, ahogy a többi NMD-inkompetens
mutáns, az NΔNn, az NΔNP1-2P3D, valamint az igen alacsony expressziójú (15. ábra d) NΔNP1-
2P3A is domináns-negatív hatású (16. ábra c, d). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a
funkcióvesztéses N-terminális mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van. Feltehető, hogy az
UPF1 foszforilációja nem a komplexbe épüléshez, hanem a komplex aktivitásához szükséges.
52
16. ábra. Az UPF1 hiányát komplementálni nem tudó mutánsoknak domináns-negatív hatásuk van.
A domináns-negatívként viselkedő mutánsok emelik a Gc-I expressziót. Vad típusú N. benthamiana
levelekbe infiltráltunk Gc-I NMD riportert P14-gyel és valamelyik UPF1 mutánssal. (a), (b) Az NΔNn és
az NP1-4A mutánsok emelik a GFP expressziót, vagyis domináns-negatívként hatnak, szemben az U1ΔC
és NP3A konstrukciókkal. (c), (d) Az NΔNP1-2P3D, valamint az NΔNP1-2P3A is domináns-negatív
hatású. Megemlítendő, hogy bár az NΔP1-2P3A mutáns fehérje alig detektálható mértékben expresszálódik
(lásd 15. ábra d), mégis domináns-negatív hatása van.
Összefoglalva az UPF1 N-terminális régióját érintő vizsgálatainkat, elmondhatjuk, hogy
a mutációs és foszforilációs kísérleteink szerint az UPF1 S3, S13 és T29 helyek foszforiláltak és
fontos szerepet játszanak az NMD-ben (NMD-relevánsak). Foszforilációjuk valószínűleg nem az
NMD-komplexbe való beépüléshez, hanem a komplex aktivitásához szükséges. Ezek az NMD-
releváns foszforilált helyek mind S/TQ kontextusban vannak, így valószínűsíthetően PIKK kináz
target helyek. Ezzel szemben az Nc részben található foszforilált aminosavak nem PIKK kináz
target S/TQ helyek, és nem is vesznek részt az NMD-ben.
6.2.5. Az UPF1 fehérje C-terminális régiója funkciójukat tekintve redundáns részekre bontható
Az emlős UPF1 C-terminális doménjében több S/TQ potenciális foszfohely van, de ezek közül
csak a S1096 szolgál az SMG7 kötőhelyeként, és elengedhetetlen az NMD-hez (Okada-Katsuhata
et al., 2012). A növényi UPF1 C-terminális régiójában szintén több S/TQ hely van. Hogy
meghatározzuk, mely potenciális foszfohelyek játszanak szerepet az NMD-ben, térképeztük a C-
53
terminális régiót. Ehhez egy olyan, az UPF1 hiány komplementálására képes mutáns
konstrukcióból indultunk ki, amelynek a teljes N-terminális régiója hiányzott (ΔNU1).
A C-terminális régiót először négy, nagyjából egyforma részre bontottuk (C1, C2, C3,
C4), majd a teljes C-terminális régiót ezen részek valamelyikével helyettesítettük (ΔNU1C1,
ΔNU1C2, ΔNU1C3, ΔNU1C4; 17. ábra a; 2. és 3. melléklet). Western-blottal igazoltuk, hogy ezek
a konstrukciók hasonló mértékben expresszálódnak (17. ábra d). Mindegyik rész négy vagy öt
S/TQ potenciális foszfohelyet tartalmazott. A konstrukciókat a már bemutatott VIGS-
komplementációs rendszerben vizsgáltuk. Mind a négy mutáns képes volt komplementálni az
endogén UPF1 hiányát (17. ábra b, c). Ez azt mutatja, hogy az UPF1 C-terminális régiója
funkcionálisan redundáns részekből áll.
17. ábra. Az UPF1 C-terminális régiója redundáns S/TQ-gazdag részekből áll.
(a) Az UPF1 C-terminális deléciós konstrukcióinak sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A C-
terminális régiót négy kb. egyforma hosszúságú részre vágtuk (C1, C2, C3 és C4), majd az egyes részeket
az N-terminális részétől megfosztott UPF1 konstrukció (ΔNU1) C-terminális régiójának helyére klónoztuk
(ΔNU1C1, ΔNU1C2, ΔNU1C3 és ΔNU1C4). (b), (c) Az UPF1 C-terminális deléciós mutánsainak VIGS-
komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített levelekbe (VIGS:U1) infiltráltuk a mutáns konstrukciókat
Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Negatív kontrollként a ΔNΔC-t használtuk. Mind a
négy konstrukció komplementálja az UPF1 hiányát. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns
konstrukciók fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA
ellenanyaggal könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.
54
6.2.6. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén különböző funkciójú S/TQ helyek vannak
Mivel az UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan redundáns részekből áll, a továbbiakban csak
a C1 részt vizsgáltuk részletesen. A C1 részben négy S/TQ potenciális foszfohely van: S1013,
T1056, S1076 és S1085 (C1P1, C1P2, C1P3, C1P4). Három pontmutánst készítettünk: az
egyikben mind a négy helyet alaninra cseréltük (C1P1-4A), a másikban csak az első kettőt (C1P1-
2A), a harmadikban csak a második kettőt (C1P3-4A) (3. táblázat, 18. ábra a). A VIGS-
komplementációs teszt eredményei megmutatták, hogy ha mind a négy helyet elrontjuk (C1P1-
4A), akkor ez az UPF1 mutáns konstrukció nem képes komplementálni az NMD hiányát (18. ábra
b, c). Hasonlóképp nem volt képes komplementálni az a pontmutáns sem, amelyikben csak a
harmadik és negyedik helyet rontottuk el (C1P3-4A). Az első két S/TQ helyén elrontott
konstrukciónk viszont komplementálta az UPF1 VIGS-et (18. ábra b, c). Ezen eredmények alapján
arra következtettünk, hogy a C1 régió harmadik és negyedik foszfohelyei közül vagy az egyik
vagy mindkettő szükséges az UPF1 aktivitásához, az első kettő viszont nem.
S1013 (C1P1) T1056 (C1P2) S1076 (C1P3) S1085 (C1P4) NMD
ΔNU1C1 S T S S + C1P1-4A A A A A - C1P1-2A A A S S + C1P3-4A S T A A - C1P1-3A A A A S -
C1P1-2A4A A A S A +
3. táblázat. Az A. thaliana UPF1 C-terminális S/TQ helyeinek funkcionális térképezéséhez használt
konstrukciók.
Zölddel az eredeti, pirossal a cserélt aminosavakat jelöltem. A - alanin, S - szerin, T - treonin.
Hogy kiderítsük, elegendő-e az S1076 és S1085 helyek közül az egyik az UPF1 NMD-
ben betöltött funkciójának ellátásához, további pontmutánsokat készítettünk, melyekben az első
kettő mellett vagy a harmadik (C1P1-3A) vagy a negyedik (C1P1-2AP4A) foszfohelyet is
elrontottuk (3. táblázat, 19. ábra a). UPF1-VIGS komplementációs rendszerünkben az S1085
(C1P1-3A) jelenléte nem komplementálta az UPF1 hiányát, míg az S1076 (C1P1-2AP4A)
jelenléte igen (19. ábra b, c). Azaz az UPF1 C1 régió S/TQ helyei közül a harmadik, az S1076
megléte kell az UPF1 működéséhez az NMD-ben. Mivel azonban ez a konstrukció gyengébben
komplementál, mint amiben a harmadik és a negyedik foszfohely is megvan (C1P1-2A), arra
55
18. ábra. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részében az S/TQ helyek funkciója különböző.
(a) A C1 deléciós mutáns konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A pontmutánsokban
mind a négy helyet elrontottuk (C1P1‐4A), vagy csak az első kettőt (C1P1‐2A), vagy csak a harmadikat és
negyediket (C1P3‐4A), úgy, hogy a szerint és/vagy a treonint alaninra cseréltük. (b), (c) Az UPF1 C1
mutánsainak VIGS-komplementációs vizsgálata. A mutáns konstrukciókat UPF1-csendesített levelekbe
(VIGS:U1) infiltráltuk Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Pozitív kontrollként a
ΔNU1C1-et, negatív kontrollként a ΔNΔC-t használtuk. A C1P1‐4A és a C1P3‐4A nem komplementálja
az UPF1 hiányát, míg a C1P1‐2A igen. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók fehérje
szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal könnyen
kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.
következtethetünk, hogy a negyedik foszfohelynek is van valami szerepe az NMD-ben. Ezt az is
alátámasztja, hogy az UPF1 C-terminális részén található S1076 és S1085 SQ helyek
konzerválódtak, és mind növényben, mind emberben megtalálhatók (4. melléklet).
Az UPF1 C-terminális mutánsok esetleges domináns-negatív hatását is megvizsgáltuk. A
Gc-I NMD-érzékeny riporter konstrukciónkat együtt infiltráltuk az NMD-kompetens (ΔNU1C1,
C1P1-2A) és NMD-inkompetens (C1P3-4A, C1P1-4A) mutánsokkal vad típusú N. benthamiana
leveleibe. A kísérlet eredményei azt mutatják, hogy az NMD-inkompetens mutánsok domináns-
negatív hatásúak, mivel mind a C1P1-4A, mind a C1P3-4A mutáns valamelyest emelte a Gc-I
expressziót az NMD-kompetens konstrukciókhoz viszonyítva (20. ábra a, b). Ez pedig, ahogy az
N-terminális régió esetében is, azt mutatja, hogy az UPF1 S/TQ helyeinek a foszforilációjának
valószínűleg nincs szerepe az NMD-komplex kialakulásában, annak aktivitásában viszont jelentős
szerepet játszik.
56
19. ábra. Az A. thaliana UPF1 S1076 szerinje szükséges az UPF1 NMD funkciójának betöltéséhez.
(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. A C1P1-3A és a C1P1-2AP4A
konstrukciók létrehozásához a C1P1 (S1013), C1P2 (T1056) és C1P3 (S1076) helyeket vagy a C1P1, C1P2
és C1P4 (S1085) helyeket rontottuk el úgy, hogy a szerineket és a treonint alaninra cseréltük.
(b) (c) Az UPF1 C1 mutánsok VIGS-komplementációs vizsgálata. UPF1-csendesített levelekbe infiltráltuk
az egyes mutánsokat Gc-I NMD riporterrel és P14 silencing szupresszorral. Pozitív kontrollnak a ΔNU1C1-
et, negatív kontrollnak a ΔNΔC-t használtuk. Az S1076 (C1P1-2AP4A) sokkal hatékonyan komplementálja
az UPF1 hiányát, míg az S1085 (C1P1-3A) nem. (d) A kísérletekhez használt UPF1 mutáns konstrukciók
fehérje szintű expressziója. Minden konstrukciónk tartalmaz egy HA-taget, így anti-HA ellenanyaggal
könnyen kimutathatók. Belső kontrollnak a P14-et használtuk.
20. ábra. Az NMD-inkompetens C1 mutánsok domináns-negatívként hatnak.
(a), (b) Vad típusú N. benthamiana leveleibe infiltráltuk a C1 mutáns konstrukciókat Gc-I NMD riporterrel
és P14-gyel. A ΔNU1C1, C1P1-2A funkcióképes konstrukciókkal szemben a C1P3-4A és C1P1-4A NMD-
inkompetens mutánsok emelik a GFP expressziót, domináns-negatív hatásuk van.
57
6.2.7. Az UPF1 C-terminális régiójának C1 részén az S/TQ potenciális foszfohelyek valóban
foszforiláltak
Mivel az UPF1 C-terminális régiójának C1 része tartalmaz olyan S/TQ helyeket, melyek részt
vesznek az NMD-ben, ezért megvizsgáltuk, hogy ezek a foszfohelyek valóban foszforiláltak-e. A
ΔNU1C1, a C1P1-4A és negatív kontrollként a ΔNΔC konstrukciókat expresszáltattuk,
immunoprecipitáltuk és az így kapott fehérjemintákat ProQ Diamond foszfofestéssel vizsgáltuk.
A ΔNU1C1 erősen foszforilált, míg a ΔNΔC csak a már korábban is tapasztalt háttérfestődést
mutatja. A C1P1-4A mutáns konstrukció a ΔNU1C1-hez képest gyengén foszforilált (21. ábra).
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a C1 régió S/TQ helyei foszforiláltak.
21. ábra A C1 rész S/TQ helyei foszforiláltak.
A ΔNU1C1 erősen, míg a C1P1‐4A mutáns csak gyengén, a ΔNΔC-hez hasonló mértékben foszforilált.
58
6.3. Új tudományos eredmények
Kísérleteimben a növényi gének 3’ UTR-jében található intronok pozíciójának a növényi NMD-
ben játszott szerepét, illetve az NMD kulcs faktorának, az UPF1-nek a foszforilációját vizsgáltam.
E kísérletek eredményeként kapott új tudományos eredmények a következők:
1. Növényekben az mRNS-ek 3'UTR-jében a stop kodontól legalább ötven nukleotidra lévő
intronok okoznak csak NMD-t.
2. A növényi intron alapú NMD a kritikus távolságon túl fokozatosságot is mutat: minél nagyobb
a stop kodon és az intron közötti távolság, az NMD annál hatékonyabb.
3. A növényi UPF1 N-terminális régiójának mindkét része, az Nn és az Nc rész is foszforilált, de
a két rész foszforilációjának jellege, és az NMD-ben betöltött szerepe alapvetően különbözik. Az
Nn rész S/TQ helyei foszforiláltak és fontosak az UPF1 aktivitásához az NMD-ben; míg az NMD-
t nem befolyásoló Nc rész erős foszforilációja nem S/TQ helyekhez kapcsolódik.
4. A növényi UPF1 C-terminális régiója NMD-ben betöltött funkciójukat tekintve redundáns
részekből áll.
5. A növényi UPF1 C-terminális régiója C1 részének S/TQ potenciális foszfohelyei valóban
foszforiláltak, ezek közül az S1076 biztosan, az S1085 nagy valószínűséggel fontos az UPF1
működéséhez az NMD-ben.
6. A vizsgált NMD-inkompetens UPF1 mutáns konstrukciók domináns-negatív hatásúak.
59
7. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK
7.1. A stop kodon és a 3'UTR-ben helyeződő intron közötti távolság szerepe a növényi NMD-
ben
Az mRNS-ek szokatlanul hosszú 3'UTR-je NMD-t indukál növényekben, gombákban,
gerinctelenekben és kisebb hatékonysággal bár, de gerincesekben is, míg a 3'UTR-ben helyeződő
intronok csak gerincesekben és növényekben. Eddig két eukarióta NMD evolúciós modell látott
napvilágot. Az egyik szerint a hosszú 3'UTR alapú NMD az ősi, míg az intron alapú a
gerincesekben fejlődött ki a hibás alternatív splicing termékek hatékony eliminálására (Durand
and Lykke-Andersen, 2011). Egy másik modell szerint az eukarióták utolsó közös ősében mindkét
típusú NMD jelen volt, és az intron alapú NMD-t az EJC szabályozta (Kerenyi Z. et al., 2008,
Kertesz et al., 2006, Lynch and Kewalramani, 2003). Ez utóbbi modell szerint az EJC a növényi
intron alapú NMD-ben is fontos szerepet játszik.
Csoportunk eredményei a második modellt támasztják alá, vagyis azt, hogy a
növényekben, akárcsak a gerincesekben, az intron alapú NMD-t az EJC szabályozza. A gerinces
EJC az intron kivágódás helyétől 20-25 nukleotidra 5' irányban rakódik az mRNS-re. Emlős
sejtekben igazolták, hogy a riboszóma a stop kodontól 3' irányba 20-25 nukleotid távolságra
nyúlik, vagyis ekkora távolságban még el tudja távolítani a különböző fehérjéket, fehérje
komplexeket, köztük az EJC-t is az mRNS-ről. E kettő következményeként az NMD-t indukáló
intronok a stop kodontól legalább 50 nukleotidra vannak az mRNS 3'UTR-jében. Növényeken
végzett kísérleteink hasonló eredményt adtak: a 3'UTR-ben legalább 50 nukleotidra kell, hogy
legyen a stop kodontól az intron kivágódás helye ahhoz, hogy NMD-t indukáljon. Ez pedig arra
utal, hogy a növényi NMD-t szintén egy fehérje komplex szabályozza, ami 25 nukleotidra
upstream rakódik az mRNS-re az exon-exon határtól. Ez a fehérje komplex valószínűleg az EJC,
mivel csoportunk azonosította az emlős EJC mind a négy fő összetevőjének (Y14, Mago, Barentsz,
eIF4AIII) növényi ortológját is, és bizonyította, hogy ezek növényekben szükségesek az intron
alapú NMD-hez, de a hosszú 3'UTR alapúhoz nem. Bizonyítást nyert az is, hogy a PYM nevű, az
EJC szétszerelődéséért felelős fehérje túltermeltetése a gerincesekhez hasonlóan a növényekben
is meggátolja az intron alapú NMD-t, ahogy az is, hogy szintén a gerincesekhez hasonlóan az
UPF2 és UPF3 fehérjék a növényekben is szerepet játszanak az intron alapú NMD-ben (Kerenyi
Z. et al., 2008, Nyiko et al., 2013, Gehring et al., 2009). Fentiek alapján valószínű, hogy a növényi
EJC a gerincesekhez hasonlóan az UPF2 és UPF3 fehérjék megkötésével segíti elő az NMD-
60
komplex összeszerelődését. Gerincesekben a DHX34 nevű fehérje nem csak segíteni, hanem
helyettesíteni is tudja az UPF2 funkcióját (Hug and Caceres, 2014, Melero et al., 2016), ami
megmagyarázná, hogy egyes kísérletekben miért működik az NMD UPF2 hiányában is (Gehring
et al., 2005, Gehring et al., 2003, Ivanov et al., 2008, Chan et al., 2007). Azt nem tudni, hogy
növényekben is vannak-e hasonló alternatív NMD útvonalak.
Eredményeink alapján tehát valószínű, hogy az EJC mind a növényi, mind a gerinces
intron alapú NMD-ben kulcsszerepet játszik. Bár feltételezhetjük, hogy mechanizmusát tekintve
az intron alapú NMD növényekben és gerincesekben igen hasonló lehet, van egy fontos különbség.
A gerincesektől eltérően növényekben az intron alapú NMD-ben fokozatosság is megfigyelhető:
minél messzebb van az intron a stop kodontól, az NMD annál hatékonyabb. Emlősökben az újabb
eredmények azt a modellt támasztják alá, ami szerint az UPF1 több helyen is kötődik az mRNS-
hez, függetlenül attól, hogy az NMD-target-e vagy sem, és leginkább a 3'UTR-ben vannak, ahol a
transzláló riboszóma már nem tudja őket eltávolítani (Hurt et al., 2013, Kurosaki and Maquat,
2013, Zund et al., 2013, Lee et al., 2015). Ha ez növényekben is így van, az megmagyarázná az
intronos NMD pozíció-függő hatékonyságát: minél messzebb van az intron, és így az EJC a stop
kodontól, annál több UPF1 kötődhet az mRNS 3'UTR-jéhez a stop és az EJC között, ez pedig
növelné az UPF1 bekötődésének esélyét az abnormálisan termináló riboszómához kapcsolódó
SURF-komplexbe. Ez a modell megmagyarázza a növényi intron alapú NMD fokozatosságát, bár
nem világos, hogy akkor gerincesekben ez miért nincs meg. Bármi is a különbség oka, az intronos
NMD eltérése fontos szabályozási eltéréshez vezet, a fokozatos növényi intron alapú NMD
alkalmas finomszabályozásra, az igen-nem jellegű gerinces intron alapú NMD pedig nem.
A növényi intronos NMD pozíció-függő hatékonysága lehetőséget ad a vad típusú,
3'UTR-jükben intront hordozó endogén géntermékek expressziójának finomszabályozására is.
Érdekes, hogy növényekben mind az SMG7, mind a Barentsz NMD faktor hordoz intront a 3'UTR-
jében, ami ezáltal az NMD autoregulációját is jelenti: a túl erős NMD csökkenti, míg a túl gyenge
emeli két faktorának expresszióját (Nyiko et al., 2013). Bár számos gerinces NMD faktor mRNS-
e szintén NMD érzékeny, ezek mindig hosszú 3’UTR-t tartalmaznak és nem 3’UTR intront.
A fenti eredmények, illetve csoportunk és más csoportok további eredményei arra
engednek következtetni, hogy az EJC növényekben is splicing hatására szerelődik össze, és a
3'UTR-ben lévő EJC, ha a stop kodontól legalább 50 nukleotidra van, a gerincesekhez hasonlóan
növényekben is NMD-t okozhat (Koroleva et al., 2009a, Koroleva et al., 2009b, Mufarrege et al.,
2011, Nagy and Maquat, 1998). Mindezek, illetve az, hogy az eukarióták közös ősében is nagy
valószínűséggel sok intron volt (Koonin et al., 2013), pedig azt a modellt támasztják alá, amelyik
61
szerint az eukarióták közös ősében is működött az intron alapú NMD, és azokból a szervezetekből,
amelyekből ma már hiányzik (élesztő, Drosophila), az evolúció során veszett el.
7.2. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben
Állatokban az UPF1 foszforilációja a kapocs a PTC felismerése nyomán felépülő NMD-komplex
és a hibás transzkriptum lebontási lépései között.
Csoportunk korábbi eredményei alapján, miszerint (i) az UPF1 S/TQ helyekben gazdag
N- és C-terminális régiói bár funkciójukat tekintve redundánsak, de mindketten részt vesznek az
NMD-ben, (ii) az UPF1 N- és C-terminális régiója foszforilált, (iii) az SMG7 14-3-3 foszfoszerin-
kötő doménje létfontosságú a növényi NMD-hez, valamint (iv) az SMG7 magával tudja vinni az
UPF1-et a P-testekbe (Benkovics et al., 2011, Merai et al., 2013), feltételeztük, hogy az UPF1 N-
és C-terminális S/TQ helyek foszforilációja kulcs szerepet játszik az NMD-komplex
felépülésében, és az SMG7 által szabályozott lebontási lépésekben. Munkám során ezen S/TQ
helyek szerepét és foszforiláltságát vizsgáltam a növényi NMD-ben. Elképzeléseinkkel
összhangban azt találtuk, hogy bizonyos S/TQ helyek az N- és a C-terminális régióban
foszforiláltak és fontos szerepük van a növényi UPF1 NMD-ben betöltött funkciójának
ellátásában. Továbbá bebizonyosodott az is, hogy az S/TQ helyek úgy az N-, mint a C-terminális
régióban szerepet játszanak az SMG7 megkötésében (lásd később).
A növényi UPF1 NMD-releváns foszforilációs helyeinek meghatározásához különféle
funkcionális NMD vizsgálati rendszereket (NMD VIGS-komplementációs rendszer, domináns-
negatív teszt) és foszforilációs vizsgálatot (foszfofestés) használtam. Ezen kísérletek eredményeit
a csoportunkkal együttműködő lengyel kutatók további vizsgálatai - MS (mass spectrometry,
tömegspektrometria), kolokalizációs vizsgálatok, FRET-FLIM (fluorescence resonance energy
transfer - fluorescence lifetime imaging) - egészítették ki (Kerenyi F. et al., 2013).
7.2.1. Az UPF1 N-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben
Habár a növényi UPF1 N-terminális régiójának Nn és Nc része is foszforilált, az Nc rész nem
szükséges az NMD-hez, míg az Nn rész igen. Az Nn részben lévő mindhárom S/TQ hely (S3, S13,
T29 - potenciális PIKK kináz célpontok) szerepet játszik az NMD-ben és ezek a helyek
foszforiláltak (10. ábra b; 12. ábra; 13. ábra, 14. ábra). A foszforilációs vizsgálatok eredményeit
62
kollégáim MS vizsgálata is megerősítette (5. melléklet) (Kerenyi F. et al., 2013). Ezért arra
következtettünk, hogy nem csupán maguk az S3, S13 és T29 S/TQ motívumok, hanem azok
foszforilációja is fontos szerepet játszik a növényi NMD-ben. Ezzel összhangban van az is, hogy
az egy- és kétszikűek között az UPF1 N-terminális régiójának Nn része jól konzervált, míg az Nc
rész sokkal kevésbé (4. melléklet). Kollégáim A. thaliana protoplaszt tenyészetben az UPF1 és az
SMG7 kolokalizációjának vizsgálatai, és szintén e két fehérjével végzett FRET-FLIM (fluorescent
resonance energy transfer - fluorescent life time imaging) kísérletei azt is megmutatták, hogy az
22. ábra. Az UPF1 N-terminális régiójában lévő S/TQ helyek szükségesek az SMG7 kötődéséhez.
(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b) Az SMG7-CFP (S7-C) (balra,
kék) és a különféle UPF1-YFP (középen, sárga) fúziós fehérjék kolokalizációja A. thaliana mezofil
protoplasztban. A jobb oldali képek a két jel átfedését mutatják, valamint a kloroplasztiszok vörös
autofluoreszcenciáját. A YFP különféle UPF1 konstrukciókhoz lett fuzionáltatva: egy vad típusú UPF1-
hez (U1-Y), egy C-terminális régiójától megfosztott UPF1-hez (U1ΔC-Y), valamint egy olyan C-terminális
régiójától megfosztott UPF1-hez, aminek az N-terminális S/TQ helyei el vannak rontva (NP1-4A-Y). Az
U1-Y és az U1ΔC-Y nagy része az S7-C-vel kolokalizál a P-testekben, míg az NP1-4A-Y legfőképpen a
citoplazmában akkumulálódik. Bar 5 µm. (c) SMG7-CFP-vel és a különféle UPF1-YFP-vel együtt
transzfektált A. thaliana protoplasztokban végzett FRET-FLIM mérések eredménye. Az oszlopdiagram az
S7-C konstrukció P-testekben mért átlagos FLIM értékét ábrázolja. Az oszlopok alján (n) a megmért P-
testek mennyisége, mellette zárójelben az ehhez megvizsgált sejtek mennyisége. Az oszlopok felett az
átlagos FLIM érték (τ), a FRET hatékonysága (E) és a szignifikancia (P) van feltüntetve. Az U1-Y és az
U1ΔC-Y S7-C-vel együtt expresszáltatva csökkenti a CFP fluoreszcenciájának átlagos élethosszát, míg az
NP1-4A-Y nem.
63
N-terminális S/TQ helyeknek fontos szerepük van a növényi NMD mRNS lebontási lépéseit
irányító SMG7 megkötésében [22. ábra, részletesebb kísérleti leírásért lásd (Kerenyi F. et al.,
2013)]. Az ép S/TQ helyekkel rendelkező U1ΔC-hez tud kötődni az SMG7, míg az NP1-4A
konstrukcióhoz (melyben minden szerin és treonin alaninra volt cserélve) nem. Ezen
eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy az SMG7 a 14-3-3 foszfoszerin/foszfotreonin-
kötő doménjén keresztül kötődik az UPF1 N-terminális foszforilált S/TQ helyeihez.
Korábban azt feltételeztük, hogy a foszforiláció és a defoszforiláció is szükséges a
növényi NMD működéséhez (Merai et al., 2013). Ezzel összhangban azt az eredményt kaptuk,
hogy ha kicseréltük a 29. pozícióban lévő treonint a foszforilációt sokszor utánzó aszparaginsavra
(T29D) (Jean et al., 2010), az nem volt képes komplementálni az UPF1 hiányát UPF1-VIGS
növényekben (NΔP1-2P3D, 15. ábra). Feltételezésünk szerint azért, mert a foszforilációt utánzó
T29D mutáns egy funkcióját vesztett fehérje és nem képes teljesíteni a foszforilációs-
defoszforilációs ciklust. Ehhez hasonlóan, a többi NMD-inkompetens mutáns is valószínűleg azért
hathat domináns-negatívként, mert bár ezek a mutánsok beépülnek az NMD-komplexbe, de
funkciójukat nem képesek ellátni, ezért "befagyasztják" az NMD-komplexet.
7.2.2. Az UPF1 C-terminális régiójának szerepe a növényi NMD-ben
Az állati és növényi UPF1 C-terminális régiója rendezetlen szerkezetű, és kevésbé
konzervált (Kalmar et al., 2012). Habár az állati és növényi UPF1 C-terminális régiója számos
S/TQ helyet tartalmaz, az emlős UPF1 C-terminális régiójában ezek közül – a kísérleteink, illetve
azok publikálásának időszakában – csak néhányról bizonyították (S1073, S1078, S1096), hogy
fontos szerepük van (Cho et al., 2013, Cho et al., 2009, Lai et al., 2012, Okada-Katsuhata et al.,
2012). Ezzel szemben mi azt találtuk, hogy a növényi UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan
redundáns szakaszokból áll (17. ábra). Ugyanakkor a C-terminális régió C1 részének
finomtérképezése azt is felfedte, hogy C1 régióban lévő S/TQ helyek funkciója nem azonos: az
S1013 és T1056 nem vesznek részt az NMD-ben, míg az S1076-nak fontos szerep jut, és
valószínűleg az S1085 is szóhoz jut (18. ábra; 19. ábra). A foszforilációs vizsgálatok azt mutatták,
hogy a C-terminális C1 részén lévő S/TQ helyek foszforiláltak (21. ábra). A kolokalizációs és
FRET-FLIM vizsgálatok bebizonyították, hogy az SMG7 az UPF1 C-terminális régiójához is tud
kötődni (23. ábra) (Kerenyi F. et al., 2013). Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a
növényi UPF1 C-terminális régiójában - az N-terminálishoz hasonlóan - az S/TQ helyek
foszforiláltak és az SMG7 valószínűleg ezen foszforilált S/TQ helyek némelyikéhez (pl. S1076)
kötődik.
64
23. ábra. A növényi UPF1 C-terminális régiójának fontos szerepe van az UPF1-SMG7 kötődés
kialakulásában.
(a) A használt konstrukciók sematikus (nem méretarányos) szerkezete. (b) Az SMG7-CFP (S7-C) (balra,
kék) kolokalizációs vizsgálata az N-terminális régióban elrontott S/TQ helyeket hordozó, teljes hosszúságú
UPF1-YFP (NP1-4A-U1-Y) (középen, sárga) fúziós fehérjével A. thaliana mezofil protoplaszt
tenyészetben. A jobboldali kép mutatja a két konstrukciótól származó jel átfedését. A piros a
kloroplasztiszok autofluoreszcenciája. (c) SMG7-CFP-vel és az NP1-4A-UPF1-YFP-vel együtt
transzfektált A. thaliana protoplasztokban végzett FRET-FLIM mérések eredménye. Az NP1-4A-U1-Y
együtt expresszáltatva csökkenti a CFP fluoreszcenciájának átlagos élethosszát (a C-terminális szerepének
megértéséhez vesd össze a 22. ábra, NP1-4A-Y konstrukcióval). A részletes magyarázatot lásd a 22.
ábránál, illetve (Kerenyi F. et al., 2013).
Annak alapján, hogy gerincesekben az UPF1 N és C-terminális régiójának számos S/TQ
helye közül csak a N- terminális T28-nak, illetve a C- terminális S1096-nak van igazi szerepe az
NMD-ben, míg növényekben az N- és C terminális régió számos S/TQ helye foszforilált, és ezek
redundánsak, azt gondoltuk, hogy a gerinces és növényi UPF1 foszforiláció szabályozása
alapvetően különbözik. Feltételeztük, hogy gerincesekben az SMG1 PIKK kináz nagyon
szigorúan szabályozott, és csak két helyen foszforilálja az UPF1-et, míg növényekben mind az
N-, mind a C- terminálison tömegfoszforiláció folyik.
Egy egészen friss publikáció alapján azonban valószínű, hogy a növényi és gerinces
UPF1 foszforiláció hasonlóbb, mint gondoltuk. Kiderült, hogy emlősökben sem csak néhány
kitüntetett S/TQ hely foszforilálódik, hanem több, melyek közül némelyik nagyobb, mások kisebb
szerepet játszanak az NMD-ben (Durand et al., 2016). Azaz a gerinces UPF1 – a növényi UPF1-
hez hasonlóan – az NMD során tömegfoszforiláción esik át (lásd még később).
65
7.2.3. Az UPF1 foszforilációjának szerepe a növényi NMD-ben
A kolokalizációs és FRET-FLIM vizsgálatok megmutatták, hogy az SMG7 közvetlenül
kötődik az UPF1-hez, és hogy a két fehérje a P-testekben kolokalizálódik (Kerenyi F. et al., 2013).
Az UPF1 N- vagy a C-terminális régiója önmagában elegendő az UPF1-SMG7 komplex
kialakításához, nagy valószínűséggel foszforiláltságtól függően. Azt gyanítjuk, hogy az SMG7 a
14-3-3 doménjén keresztül tudja kötni az UPF1 foszforilált S/TQ helyeit akár az N-, akár a C-
terminális régióban, ezután pedig az SMG7 a C-terminális doménje segítségével magával viszi az
UPF1-et és vele együtt a lebontásra kijelölt mRNS-t a P-testekbe, ahol aztán az SMG7 hatására a
transzkriptum gyorsan lebontásra kerül. Nemrég kimutatták az UPF1-et a silencing-testekben is
(Moreno et al., 2013). Elképzelhető, hogy az UPF1-kötött mRNS-ek lebontása ezeken a helyeken
is megtörténik.
Emlősökben az SMG1 foszforilálja az NMD-releváns T28 és S1096 helyeket az UPF1
N- és C-terminális régiójában. Ezeket a helyeket kötik aztán a 14-3-3 doménjükkel az SMG6
(T28), az SMG5-SMG7 komplex (S1096), valamint az SMG5-höz kötődő PNRC2 (S1073, S1078)
(Okada-Katsuhata et al., 2012, Cho et al., 2013, Cho et al., 2009, Lai et al., 2012). A legfrissebb
kutatások szerint azonban nem kizárólag ezek a helyek foszforilálódnak, hanem egy, a növényihez
némileg hasonlító tömegfoszforiláció történik: minél lassabb az NMD (például valamelyik, az
mRNS lebontásához szükséges faktor hiánya miatt), annál több ideje van az SMG1-nek
foszforilálni az UPF1-et. És minél tovább dolgozhat az SMG1, annál több helyen foszforilálja az
UPF1-et, ami egyre több útvonal aktiválása révén egyre hatékonyabb mRNS lebontást
eredményez, kompenzálva az NMD lelassulását (Durand et al., 2016). A növényi UPF1 N- és C-
terminális régiója hasonlóképpen működhet: az NMD-releváns S/TQ helyek (S3, S13, T29, S1076
és feltehetően még néhány a C-terminális régióban) foszforilációja következtében az SMG7
kötődni tud az UPF1-nek akár az N-, akár a C-terminális régiójához, ami megmagyarázza a két
régió redundanciáját. Az is elképzelhető, hogy a növényekben is annál hatékonyabb az SMG7
kapcsolódása az UPF1-hez, minél több helyen van foszforilálva. A tömegfoszforiláció jelensége a
korábban gondoltnál is nagyobb hasonlóságot jelent az állati és növényi UPF1 foszforilációjában
és ezáltal az NMD szabályozásában is.
Mivel növényekben is minden NMD-releváns foszfohely egyúttal S/TQ hely is,
feltételezzük, hogy az állatokhoz hasonlóan egy PIKK kináz foszforilálja ezeket a helyeket.
Ugyanakkor A. thaliana-ban nincs SMG1, igaz, minden más vizsgált növényben (így A. lyrata-
ban is) sikerült beazonosítani az ortológokat (Lloyd and Davies, 2013, Yamashita, 2013), ami azt
jelzi, hogy A. thaliana-ban ez egy viszonylag friss génvesztés lehet. N. benthamiana-ban – a
66
csoport előzetes eredményei alapján – úgy tűnik, hogy az SMG1 expresszió kikapcsolása után is
működött az NMD. Mindez pedig akkor lehetséges, ha egy vagy több másik fehérje ki tudja váltani
az SMG1 egyébként fontos foszforilációs feladatait. Ezért azt feltételezzük, hogy nagy
valószínűséggel redundáns módon több növényi PIKK kináz is képes foszforilálni az UPF1-et.
Hogy ez valóban így van-e, és ha igen, melyek ezek a PIKK kinázok, hogy magát a foszforilációt
mik és hogyan szabályozzák, továbbá hogy a defoszforilációt mely enzimek és milyen szabályozás
alatt végzik, további kísérletek hivatottak tisztázni.
67
8. ÖSSZEFOGLALÁS
A Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) egy létfontosságú eukarióta
minőségbiztosítási rendszer, ami felismeri és lebontja a korai stop kodont tartalmazó, hibás
transzkriptumokat, valamint részt vesz egyes endogén gének expressziójának szabályozásában is.
Az NMD a hibás mRNS-eket a transzláció terminációja során ismeri föl. Élesztőben a szokatlanul
hosszú 3'UTR, gerincesekben a 3'UTR-ben a stop kodontól legalább 50 nukleotidra lévő intron az
NMD indukáló cisz-elem. Ha a termináció lassú, a PABP helyett az UPF1 NMD faktor kötődik az
eRF3-hoz a terminációs komplexben, majd az UPF1 megköti az UPF2 és az UPF3 faktorokat.
Ennek következtében gerincesekben - az UPF1-UPF2-UPF3 komplexben - az UPF2 az UPF1
SMG1 általi foszforilációját indukálja. Az UPF1 foszforilált S/TQ helyeihez tud kötődni az SMG6
(T28), az SMG5/SMG7 heterodimer (S1096) és a PNRC2 (S1073 és S1078). Ezek a faktorok
segítik elő az NMD által támadott mRNS-ek lebomlását.
Munkám kezdetén növényekben ezek a folyamatokat nem ismertük ennyire részletesen.
Azt már tudtuk, hogy a 3'UTR-ben lévő intronok 28 nukleotidra a stop kodontól nem okoznak
NMD-t, míg 99 nukleotidra igen. Azt is tudtuk, hogy a növényi UPF1 N- és C-terminális régiói
funkcionálisan redundánsak, és hogy az N- és C-terminális régió is foszforilált.
Hogy megvizsgáljuk, hogy az intron távolsága hogyan befolyásolja az NMD-indukáló
hatást, olyan mutánsokat készítettünk, amikben az intront különböző távolságra klónoztuk az
NMD riporter GFP konstrukció 3'UTR-jébe a stop kodontól. Kimutattuk, hogy növényekben, a
gerincesekhez hasonlóan, a stop kodontól legalább 50 nukleotidra lévő intronok NMD-t okoznak.
Azonban az is kiderült, hogy - a gerincesektől eltérően - növényekben minél messzebb van az
intron a stop kodontól, az NMD annál hatékonyabb. Ez szabályozási szempontból igen fontos
különbség, hiszen a fokozatosan működő növényi intron alapú NMD alkalmas
finomszabályozásra, míg a gerinces intron alapú NMD nem.
Az UPF1 foszforilációjának növényi NMD-ben betöltött szerepét tisztázandó UPF1
mutánsokat készítettünk és vizsgáltuk ezek foszforiláltságát, illetve azt, hogy képesek-e elvégezni
a vad típusú UPF1 feladatát az NMD-ben. Megerősítettük, hogy a növényi UPF1 N- és C-
terminális régiói alapvető, de redundáns szerepet töltenek be az NMD-ben. Megmutattuk, hogy
bár az UPF1 N-terminális régiójában számos foszforilált hely van, az UPF1 NMD-ben betöltött
funkciójához ezek közül csak három foszforilált S/TQ hely (S3, S13 és T29) szükséges. Igazoltuk
azt is, hogy az UPF1 C-terminális régiója funkcionálisan redundáns S/TQ-gazdag részekből áll,
valamint azt, hogy az S1076 - és valószínűleg az S1085 is - fontosak az UPF1 működéséhez az
68
NMD-ben. Minden NMD-ben részt vevő foszforilált hely egyben S/TQ hely is. Mivel a
kolokalizációs és a FRET-FLIM kísérletek szerint az SMG7 az UPF1 N-terminális foszfo-S/TQ
helyeihez kötődik és nagy valószínűséggel a C-terminális foszfo-S/TQ helyekhez is,
eredményeink alátámasztják azt a feltételezést, miszerint a gerincesekhez hasonlóan növényekben
is az UPF1 foszforilációja az összekötő kapocs az PTC-t tartalmazó transzkriptum felismerése és
annak SMG7 által irányított lebontása között: az SMG7 az UPF1 foszforilált S/TQ helyeihez
kötődve indukálja a target transzkriptum lebontását.
69
9. SUMMARY
The Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) is an essential eukaryotic quality control
system that recognizes and degrades aberrant transcripts containing premature termination codons
(PTC) and regulates the expression of several normal transcripts. NMD-targets are selected during
translational termination. In yeasts, unusually long 3'UTRs act as NMD cis element, whereas in
vertebrates, NMD is induced by introns located >50 nt downstream from the stop codon. If
termination is slow, instead of PABP, the UPF1 NMD factor binds the eRF3 protein of the
termination complex and then recruits UPF2 and UPF3. Consequently, in the UPF1-2-3 NMD
complex UPF2 induces phosphorylation of UPF1 by SMG1. Phosphorylated S/TQ residues of
UPF1 are bound by SMG6 (T28), and/or SMG5/SMG7 heterodimer (S1096) or PNRC2 (S1073
and S1078) and then these factors induce degradation of the target mRNA.
Previously our group has shown that introns in the 3'UTR located 28 nt from the stop
codon do not induce NMD while located 99 nt from the stop codon it does, and that the N- and C-
terminal domains of UPF1 act redundantly and that both the N- and C-terminal domains are
phosphorylated.
To assess the NMD-inducing effect of the distance between the stop codon and the intron
we created NMD reporter GFP constructs with introns in their 3'UTR in different distance from
the stop codon. We demonstrated that in plants, like in vertebrates, introns located >50 nt from the
stop can induce NMD. But, unlike in vertebrates, the farther the intron is located from the stop
codon the more effective the NMD. Thus we propose that in plants, unlike in mammals, intron-
based NMD could play a role in fine tuning of gene expression.
To clarify the role of UPF1 phosphorylation in plant NMD, we generated UPF1 mutants
and analyzed their phosphorylation status and the NMD competency of these mutants. We
confirmed that the N- and C- terminal regions of plant UPF1 are heavily phosphorylated, and that
these regions play an essential but redundant role in plant NMD. We show that although several
residues in the N-terminal domain of UPF1 are phosphorylated, only three phosphorylated amino
acids, S3, S13 and T29, play a role in NMD. Moreover, we found that the C-terminal domain
consists of functionally redundant S/TQ-rich segments and that S1076 is involved in NMD. All
NMD-relevant phosphorylation sites were in the S/TQ context. Since co-localization and FRET-
FLIM assays suggest that the N-terminal and probably the C-terminal phosphorylated S/TQ
residues create binding platform for SMG7, our data support the hypothesis that phosphorylation
of UPF1 connects the PTC recognition and the SMG7-mediated target transcript degradation steps
70
of NMD in plants. SMG7 binds the phosphorylated S/TQ sites of the UPF1 component of the
NMD complex and then induces the degradation of the NMD target mRNA.
71
M1. FELHASZNÁLT IRODALOM
ABRAHAM, R. T. 2004. PI 3-kinase related kinases: 'big' players in stress-induced signaling pathways. DNA
Repair (Amst), 3, 883-7.
ALONSO, C. R. 2005. Nonsense-mediated RNA decay: a molecular system micromanaging individual gene
activities and suppressing genomic noise. Bioessays, 27, 463-6.
ALTAMURA, N., GROUDINSKY, O., DUJARDIN, G. & SLONIMSKI, P. P. 1992. NAM7 nuclear gene
encodes a novel member of a family of helicases with a Zn-ligand motif and is involved in mitochondrial
functions in Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol, 224, 575-87.
AMRANI, N., DONG, S., HE, F., GANESAN, R., GHOSH, S., KERVESTIN, S., LI, C., MANGUS, D. A.,
SPATRICK, P. & JACOBSON, A. 2006. Aberrant termination triggers nonsense-mediated mRNA
decay. Biochem Soc Trans, 34, 39-42.
AMRANI, N., GANESAN, R., KERVESTIN, S., MANGUS, D. A., GHOSH, S. & JACOBSON, A. 2004. A
faux 3'-UTR promotes aberrant termination and triggers nonsense-mediated mRNA decay. Nature, 432,
112-8.
ANDERS, K. R., GRIMSON, A. & ANDERSON, P. 2003. SMG-5, required for C.elegans nonsense-mediated
mRNA decay, associates with SMG-2 and protein phosphatase 2A. EMBO J, 22, 641-50.
ARIAS-PALOMO, E., YAMASHITA, A., FERNANDEZ, I. S., NUNEZ-RAMIREZ, R., BAMBA, Y., IZUMI,
N., OHNO, S. & LLORCA, O. 2011. The nonsense-mediated mRNA decay SMG-1 kinase is regulated
by large-scale conformational changes controlled by SMG-8. Genes Dev, 25, 153-64.
ARRIBAS-LAYTON, M., WU, D., LYKKE-ANDERSEN, J. & SONG, H. 2013. Structural and functional
control of the eukaryotic mRNA decapping machinery. Biochim Biophys Acta, 1829, 580-9.
ATKINSON, G. C., BALDAUF, S. L. & HAURYLIUK, V. 2008. Evolution of nonstop, no-go and nonsense-
mediated mRNA decay and their termination factor-derived components. BMC Evol Biol, 8, 290.
AVERY, P., VICENTE-CRESPO, M., FRANCIS, D., NASHCHEKINA, O., ALONSO, C. R. & PALACIOS,
I. M. 2011. Drosophila Upf1 and Upf2 loss of function inhibits cell growth and causes animal death in
a Upf3-independent manner. RNA, 17, 624-38.
BAULCOMBE, D. 2005. RNA silencing. Trends Biochem Sci, 30, 290-3.
BAUMBERGER, N. & BAULCOMBE, D. C. 2005. Arabidopsis ARGONAUTE1 is an RNA Slicer that
selectively recruits microRNAs and short interfering RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 11928-33.
BEHM-ANSMANT, I., GATFIELD, D., REHWINKEL, J., HILGERS, V. & IZAURRALDE, E. 2007a. A
conserved role for cytoplasmic poly(A)-binding protein 1 (PABPC1) in nonsense-mediated mRNA
decay. EMBO J, 26, 1591-601.
BEHM-ANSMANT, I., KASHIMA, I., REHWINKEL, J., SAULIERE, J., WITTKOPP, N. & IZAURRALDE,
E. 2007b. mRNA quality control: an ancient machinery recognizes and degrades mRNAs with nonsense
codons. FEBS Lett, 581, 2845-53.
BELOSTOTSKY, D. A. & SIEBURTH, L. E. 2009. Kill the messenger: mRNA decay and plant development.
Curr Opin Plant Biol, 12, 96-102.
BENKOVICS, A. H., NYIKO, T., MERAI, Z., SILHAVY, D. & BISZTRAY, G. D. 2011. Functional analysis
of the grapevine paralogs of the SMG7 NMD factor using a heterolog VIGS-based gene depletion-
complementation system. Plant Mol Biol, 75, 277-90.
BHATTACHARYA, A., CZAPLINSKI, K., TRIFILLIS, P., HE, F., JACOBSON, A. & PELTZ, S. W. 2000.
Characterization of the biochemical properties of the human Upf1 gene product that is involved in
nonsense-mediated mRNA decay. RNA, 6, 1226-35.
BOEHM, V., HABERMAN, N., OTTENS, F., ULE, J. & GEHRING, N. H. 2014. 3' UTR length and messenger
ribonucleoprotein composition determine endocleavage efficiencies at termination codons. Cell Rep, 9,
555-68.
BRENGUES, M., TEIXEIRA, D. & PARKER, R. 2005. Movement of eukaryotic mRNAs between polysomes
and cytoplasmic processing bodies. Science, 310, 486-9.
CALI, B. M., KUCHMA, S. L., LATHAM, J. & ANDERSON, P. 1999. smg-7 is required for mRNA
surveillance in Caenorhabditis elegans. Genetics, 151, 605-16.
CAO, D. & PARKER, R. 2003. Computational modeling and experimental analysis of nonsense-mediated decay
in yeast. Cell, 113, 533-45.
CELIK, A., KERVESTIN, S. & JACOBSON, A. 2015. NMD: At the crossroads between translation termination
and ribosome recycling. Biochimie, 114, 2-9. CHAKRABARTI, S., BONNEAU, F., SCHUSSLER, S., EPPINGER, E. & CONTI, E. 2014. Phospho-
dependent and phospho-independent interactions of the helicase UPF1 with the NMD factors SMG5-
SMG7 and SMG6. Nucleic Acids Res, 42, 9447-60.
72
CHAKRABARTI, S., JAYACHANDRAN, U., BONNEAU, F., FIORINI, F., BASQUIN, C., DOMCKE, S.,
LE HIR, H. & CONTI, E. 2011. Molecular mechanisms for the RNA-dependent ATPase activity of
Upf1 and its regulation by Upf2. Mol Cell, 41, 693-703.
CHAMIEH, H., BALLUT, L., BONNEAU, F. & LE HIR, H. 2008. NMD factors UPF2 and UPF3 bridge UPF1
to the exon junction complex and stimulate its RNA helicase activity. Nat Struct Mol Biol, 15, 85-93.
CHAN, W. K., HUANG, L., GUDIKOTE, J. P., CHANG, Y. F., IMAM, J. S., MACLEAN, J. A., 2ND &
WILKINSON, M. F. 2007. An alternative branch of the nonsense-mediated decay pathway. EMBO J,
26, 1820-30.
CHAN, W. K., BHALLA, A. D., LE HIR, H., NGUYEN, L. S., HUANG, L., GECZ, J. & WILKINSON, M. F.
2009. A UPF3-mediated regulatory switch that maintains RNA surveillance. Nat Struct Mol Biol, 16,
747-53.
CHANG, Y. F., IMAM, J. S. & WILKINSON, M. F. 2007. The nonsense-mediated decay RNA surveillance
pathway. Annu Rev Biochem, 76, 51-74.
CHIBA, Y. & GREEN, P. J. 2009. mRNA Degradation Machinery in Plants. J. Plant Biol., 52, 114-124.
CHIU, S. Y., SERIN, G., OHARA, O. & MAQUAT, L. E. 2003. Characterization of human Smg5/7a: a protein
with similarities to Caenorhabditis elegans SMG5 and SMG7 that functions in the dephosphorylation
of Upf1. RNA, 9, 77-87.
CHO, H., HAN, S., CHOE, J., PARK, S. G., CHOI, S. S. & KIM, Y. K. 2013. SMG5-PNRC2 is functionally
dominant compared with SMG5-SMG7 in mammalian nonsense-mediated mRNA decay. Nucleic Acids Res, 41, 1319-28.
CHO, H., KIM, K. M., HAN, S., CHOE, J., PARK, S. G., CHOI, S. S. & KIM, Y. K. 2012. Staufen1-mediated
mRNA decay functions in adipogenesis. Mol Cell, 46, 495-506.
CHO, H., KIM, K. M. & KIM, Y. K. 2009. Human proline-rich nuclear receptor coregulatory protein 2 mediates
an interaction between mRNA surveillance machinery and decapping complex. Mol Cell, 33, 75-86.
CLERICI, M., DENIAUD, A., BOEHM, V., GEHRING, N. H., SCHAFFITZEL, C. & CUSACK, S. 2014.
Structural and functional analysis of the three MIF4G domains of nonsense-mediated decay factor
UPF2. Nucleic Acids Res, 42, 2673-86.
CZAPLINSKI, K., RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., PAUSHKIN, S. V., HAN, X., WENG, Y., PERLICK, H. A.,
DIETZ, H. C., TER-AVANESYAN, M. D. & PELTZ, S. W. 1998. The surveillance complex interacts
with the translation release factors to enhance termination and degrade aberrant mRNAs. Genes Dev,
12, 1665-77.
DECKER, C. J., TEIXEIRA, D. & PARKER, R. 2007. Edc3p and a glutamine/asparagine-rich domain of Lsm4p
function in processing body assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol, 179, 437-49.
DENNING, G., JAMIESON, L., MAQUAT, L. E., THOMPSON, E. A. & FIELDS, A. P. 2001. Cloning of a
novel phosphatidylinositol kinase-related kinase: characterization of the human SMG-1 RNA
surveillance protein. J Biol Chem, 276, 22709-14.
DOMA, M. K. & PARKER, R. 2006. Endonucleolytic cleavage of eukaryotic mRNAs with stalls in translation
elongation. Nature, 440, 561-4.
DOSTIE, J. & DREYFUSS, G. 2002. Translation is required to remove Y14 from mRNAs in the cytoplasm.
Curr Biol, 12, 1060-7.
DURAND, S., COUGOT, N., MAHUTEAU-BETZER, F., NGUYEN, C. H., GRIERSON, D. S., BERTRAND,
E., TAZI, J. & LEJEUNE, F. 2007. Inhibition of nonsense-mediated mRNA decay (NMD) by a new
chemical molecule reveals the dynamic of NMD factors in P-bodies. J Cell Biol, 178, 1145-60.
DURAND, S., FRANKS, T. M. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2016. Hyperphosphorylation amplifies UPF1
activity to resolve stalls in nonsense-mediated mRNA decay. Nat Commun, 7, 12434.
DURAND, S. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2011. SnapShot: Nonsense-mediated mRNA decay. Cell, 145, 324-
324 e2.
DZIKIEWICZ-KRAWCZYK, A., PIONTEK, P., SZWEYKOWSKA-KULINSKA, Z. & JARMOLOWSKI, A.
2008. The nuclear cap-binding protein complex is not essential for nonsense-mediated mRNA decay
(NMD) in plants. Acta Biochim Pol, 55, 825-8.
EBERLE, A. B., LYKKE-ANDERSEN, S., MUHLEMANN, O. & JENSEN, T. H. 2009. SMG6 promotes
endonucleolytic cleavage of nonsense mRNA in human cells. Nat Struct Mol Biol, 16, 49-55.
EULALIO, A., BEHM-ANSMANT, I., SCHWEIZER, D. & IZAURRALDE, E. 2007. P-body formation is a
consequence, not the cause, of RNA-mediated gene silencing. Mol Cell Biol, 27, 3970-81.
FAN, J., YANG, X., WANG, W., WOOD, W. H., 3RD, BECKER, K. G. & GOROSPE, M. 2002. Global
analysis of stress-regulated mRNA turnover by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci U S A, 99,
10611-6.
FATSCHER, T., BOEHM, V. & GEHRING, N. H. 2015. Mechanism, factors, and physiological role of
nonsense-mediated mRNA decay. Cell Mol Life Sci, 72, 4523-44.
73
FERNANDEZ, I. S., YAMASHITA, A., ARIAS-PALOMO, E., BAMBA, Y., BARTOLOME, R. A.,
CANALES, M. A., TEIXIDO, J., OHNO, S. & LLORCA, O. 2011. Characterization of SMG-9, an
essential component of the nonsense-mediated mRNA decay SMG1C complex. Nucleic Acids Res, 39,
347-58.
FILICHKIN, S. A., PRIEST, H. D., GIVAN, S. A., SHEN, R., BRYANT, D. W., FOX, S. E., WONG, W. K. &
MOCKLER, T. C. 2010. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana.
Genome Res, 20, 45-58.
FRANKS, T. M., SINGH, G. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2010. Upf1 ATPase-dependent mRNP disassembly
is required for completion of nonsense- mediated mRNA decay. Cell, 143, 938-50.
FRISCHMEYER, P. A., VAN HOOF, A., O'DONNELL, K., GUERRERIO, A. L., PARKER, R. & DIETZ, H.
C. 2002. An mRNA surveillance mechanism that eliminates transcripts lacking termination codons.
Science, 295, 2258-61.
FUKUHARA, N., EBERT, J., UNTERHOLZNER, L., LINDNER, D., IZAURRALDE, E. & CONTI, E. 2005.
SMG7 is a 14-3-3-like adaptor in the nonsense-mediated mRNA decay pathway. Mol Cell, 17, 537-47.
FUNAKOSHI, Y., DOI, Y., HOSODA, N., UCHIDA, N., OSAWA, M., SHIMADA, I., TSUJIMOTO, M.,
SUZUKI, T., KATADA, T. & HOSHINO, S. 2007. Mechanism of mRNA deadenylation: evidence for
a molecular interplay between translation termination factor eRF3 and mRNA deadenylases. Genes
Dev, 21, 3135-48.
GARNEAU, N. L., WILUSZ, J. & WILUSZ, C. J. 2007. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 113-26.
GATFIELD, D., UNTERHOLZNER, L., CICCARELLI, F. D., BORK, P. & IZAURRALDE, E. 2003.
Nonsense-mediated mRNA decay in Drosophila: at the intersection of the yeast and mammalian
pathways. EMBO J, 22, 3960-70.
GEHRING, N. H., KUNZ, J. B., NEU-YILIK, G., BREIT, S., VIEGAS, M. H., HENTZE, M. W. & KULOZIK,
A. E. 2005. Exon-junction complex components specify distinct routes of nonsense-mediated mRNA
decay with differential cofactor requirements. Mol Cell, 20, 65-75.
GEHRING, N. H., LAMPRINAKI, S., KULOZIK, A. E. & HENTZE, M. W. 2009. Disassembly of exon
junction complexes by PYM. Cell, 137, 536-48.
GEHRING, N. H., NEU-YILIK, G., SCHELL, T., HENTZE, M. W. & KULOZIK, A. E. 2003. Y14 and hUpf3b
form an NMD-activating complex. Mol Cell, 11, 939-49.
GLAVAN, F., BEHM-ANSMANT, I., IZAURRALDE, E. & CONTI, E. 2006. Structures of the PIN domains
of SMG6 and SMG5 reveal a nuclease within the mRNA surveillance complex. EMBO J, 25, 5117-25.
GOERES, D. C., VAN NORMAN, J. M., ZHANG, W., FAUVER, N. A., SPENCER, M. L. & SIEBURTH, L.
E. 2007. Components of the Arabidopsis mRNA decapping complex are required for early seedling
development. Plant Cell, 19, 1549-64.
GONZALEZ, C. I., RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., VASUDEVAN, S., HENRY, M. F. & PELTZ, S. W. 2000.
The yeast hnRNP-like protein Hrp1/Nab4 marks a transcript for nonsense-mediated mRNA decay. Mol Cell, 5, 489-99.
GRANT, C. M. & HINNEBUSCH, A. G. 1994. Effect of sequence context at stop codons on efficiency of
reinitiation in GCN4 translational control. Mol Cell Biol, 14, 606-18.
GRIMSON, A., O'CONNOR, S., NEWMAN, C. L. & ANDERSON, P. 2004. SMG-1 is a phosphatidylinositol
kinase-related protein kinase required for nonsense-mediated mRNA Decay in Caenorhabditis elegans.
Mol Cell Biol, 24, 7483-90.
GUAN, Q., ZHENG, W., TANG, S., LIU, X., ZINKEL, R. A., TSUI, K. W., YANDELL, B. S. &
CULBERTSON, M. R. 2006. Impact of nonsense-mediated mRNA decay on the global expression
profile of budding yeast. PLoS Genet, 2, e203.
HAYDEN, C. A. & JORGENSEN, R. A. 2007. Identification of novel conserved peptide uORF homology
groups in Arabidopsis and rice reveals ancient eukaryotic origin of select groups and preferential
association with transcription factor-encoding genes. BMC Biol, 5, 32.
HE, F., LI, X., SPATRICK, P., CASILLO, R., DONG, S. & JACOBSON, A. 2003. Genome-wide analysis of
mRNAs regulated by the nonsense-mediated and 5' to 3' mRNA decay pathways in yeast. Mol Cell, 12,
1439-52.
HILLMAN, R. T., GREEN, R. E. & BRENNER, S. E. 2004. An unappreciated role for RNA surveillance.
Genome Biol, 5, R8.
HISCOTT, J., PITHA, P., GENIN, P., NGUYEN, H., HEYLBROECK, C., MAMANE, Y., ALGARTE, M. &
LIN, R. 1999. Triggering the interferon response: the role of IRF-3 transcription factor. J Interferon
Cytokine Res, 19, 1-13.
HOGG, J. R. & GOFF, S. P. 2010. Upf1 senses 3'UTR length to potentiate mRNA decay. Cell, 143, 379-89.
HOSODA, N., KIM, Y. K., LEJEUNE, F. & MAQUAT, L. E. 2005. CBP80 promotes interaction of Upf1 with
Upf2 during nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells. Nat Struct Mol Biol, 12, 893-901.
74
HOUSELEY, J. & TOLLERVEY, D. 2009. The many pathways of RNA degradation. Cell, 136, 763-76.
HSU, P. P., KANG, S. A., RAMESEDER, J., ZHANG, Y., OTTINA, K. A., LIM, D., PETERSON, T. R., CHOI,
Y., GRAY, N. S., YAFFE, M. B., MARTO, J. A. & SABATINI, D. M. 2011. The mTOR-regulated
phosphoproteome reveals a mechanism of mTORC1-mediated inhibition of growth factor signaling.
Science, 332, 1317-22.
HU, W., PETZOLD, C., COLLER, J. & BAKER, K. E. 2010. Nonsense-mediated mRNA decapping occurs on
polyribosomes in Saccharomyces cerevisiae. Nat Struct Mol Biol, 17, 244-7.
HU, W., SWEET, T. J., CHAMNONGPOL, S., BAKER, K. E. & COLLER, J. 2009. Co-translational mRNA
decay in Saccharomyces cerevisiae. Nature, 461, 225-9.
HUG, N. & CACERES, J. F. 2014. The RNA helicase DHX34 activates NMD by promoting a transition from
the surveillance to the decay-inducing complex. Cell Rep, 8, 1845-56.
HUNTZINGER, E., KASHIMA, I., FAUSER, M., SAULIERE, J. & IZAURRALDE, E. 2008. SMG6 is the
catalytic endonuclease that cleaves mRNAs containing nonsense codons in metazoan. RNA, 14, 2609-
17.
HURT, J. A., ROBERTSON, A. D. & BURGE, C. B. 2013. Global analyses of UPF1 binding and function
reveal expanded scope of nonsense-mediated mRNA decay. Genome Res, 23, 1636-50.
HUTVAGNER, G. & SIMARD, M. J. 2008. Argonaute proteins: key players in RNA silencing. Nat Rev Mol
Cell Biol, 9, 22-32.
HWANG, J. & MAQUAT, L. E. 2011. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in animal embryogenesis: to
die or not to die, that is the question. Curr Opin Genet Dev, 21, 422-30.
HWANG, J., SATO, H., TANG, Y., MATSUDA, D. & MAQUAT, L. E. 2010. UPF1 association with the cap-
binding protein, CBP80, promotes nonsense-mediated mRNA decay at two distinct steps. Mol Cell, 39,
396-409.
IACONO, M., MIGNONE, F. & PESOLE, G. 2005. uAUG and uORFs in human and rodent 5'untranslated
mRNAs. Gene, 349, 97-105.
INACIO, A., SILVA, A. L., PINTO, J., JI, X., MORGADO, A., ALMEIDA, F., FAUSTINO, P., LAVINHA,
J., LIEBHABER, S. A. & ROMAO, L. 2004. Nonsense mutations in close proximity to the initiation
codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem, 279, 32170-80.
ISKEN, O., KIM, Y. K., HOSODA, N., MAYEUR, G. L., HERSHEY, J. W. & MAQUAT, L. E. 2008. Upf1
phosphorylation triggers translational repression during nonsense-mediated mRNA decay. Cell, 133,
314-27.
ISKEN, O. & MAQUAT, L. E. 2008. The multiple lives of NMD factors: balancing roles in gene and genome
regulation. Nat Rev Genet, 9, 699-712.
IVANOV, P. V., GEHRING, N. H., KUNZ, J. B., HENTZE, M. W. & KULOZIK, A. E. 2008. Interactions
between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian
NMD pathways. EMBO J, 27, 736-47.
IWAKAWA, H. O., TAJIMA, Y., TANIGUCHI, T., KAIDO, M., MISE, K., TOMARI, Y., TANIGUCHI, H.
& OKUNO, T. 2012. Poly(A)-binding protein facilitates translation of an uncapped/nonpolyadenylated
viral RNA by binding to the 3' untranslated region. J Virol, 86, 7836-49.
JEAN, A., GUTIERREZ-HARTMANN, A. & DUVAL, D. L. 2010. A Pit-1 threonine 220 phosphomimic
reduces binding to monomeric DNA sites to inhibit Ras and estrogen stimulation of the prolactin gene
promoter. Mol Endocrinol, 24, 91-103.
JEONG, H. J., KIM, Y. J., KIM, S. H., KIM, Y. H., LEE, I. J., KIM, Y. K. & SHIN, J. S. 2011. Nonsense-
mediated mRNA decay factors, UPF1 and UPF3, contribute to plant defense. Plant Cell Physiol, 52,
2147-56.
KALMAR, L., ACS, V., SILHAVY, D. & TOMPA, P. 2012. Long-range interactions in nonsense-mediated
mRNA decay are mediated by intrinsically disordered protein regions. J Mol Biol, 424, 125-31.
KASHIMA, I., JONAS, S., JAYACHANDRAN, U., BUCHWALD, G., CONTI, E., LUPAS, A. N. &
IZAURRALDE, E. 2010. SMG6 interacts with the exon junction complex via two conserved EJC-
binding motifs (EBMs) required for nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 24, 2440-50.
KASHIMA, I., YAMASHITA, A., IZUMI, N., KATAOKA, N., MORISHITA, R., HOSHINO, S., OHNO, M.,
DREYFUSS, G. & OHNO, S. 2006. Binding of a novel SMG-1-Upf1-eRF1-eRF3 complex (SURF) to
the exon junction complex triggers Upf1 phosphorylation and nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 20, 355-67.
KERENYI, F., WAWER, I., SIKORSKI, P. J., KUFEL, J. & SILHAVY, D. 2013. Phosphorylation of the N-
and C-terminal UPF1 domains plays a critical role in plant nonsense-mediated mRNA decay. Plant J,
76, 836-48.
KERENYI, Z., MERAI, Z., HIRIPI, L., BENKOVICS, A., GYULA, P., LACOMME, C., BARTA, E., NAGY,
F. & SILHAVY, D. 2008. Inter-kingdom conservation of mechanism of nonsense-mediated mRNA
decay. EMBO J, 27, 1585-95.
75
KERTESZ, S., KERENYI, Z., MERAI, Z., BARTOS, I., PALFY, T., BARTA, E. & SILHAVY, D. 2006. Both
introns and long 3'-UTRs operate as cis-acting elements to trigger nonsense-mediated decay in plants.
Nucleic Acids Res, 34, 6147-57.
KERVESTIN, S. & JACOBSON, A. 2012. NMD: a multifaceted response to premature translational
termination. Nat Rev Mol Cell Biol, 13, 700-12.
KOCHETOV, A. V., SYRNIK, O. A., ROGOZIN, I. B., GLAZKO, G. V., KOMAROVA, M. L. & SHUMNYI,
V. K. 2002. [Context organization of mRNA 5'-untranslated regions of higher plants]. Mol Biol (Mosk),
36, 649-56.
KOONIN, E. V., CSUROS, M. & ROGOZIN, I. B. 2013. Whence genes in pieces: reconstruction of the exon-
intron gene structures of the last eukaryotic common ancestor and other ancestral eukaryotes. Wiley
Interdiscip Rev RNA, 4, 93-105.
KOROLEVA, O. A., BROWN, J. W. & SHAW, P. J. 2009a. Localization of eIF4A-III in the nucleolus and
splicing speckles is an indicator of plant stress. Plant Signal Behav, 4, 1148-51.
KOROLEVA, O. A., CALDER, G., PENDLE, A. F., KIM, S. H., LEWANDOWSKA, D., SIMPSON, C. G.,
JONES, I. M., BROWN, J. W. & SHAW, P. J. 2009b. Dynamic behavior of Arabidopsis eIF4A-III,
putative core protein of exon junction complex: fast relocation to nucleolus and splicing speckles under
hypoxia. Plant Cell, 21, 1592-606.
KOZAK, M. 2001. Constraints on reinitiation of translation in mammals. Nucleic Acids Res, 29, 5226-32.
KULKARNI, M., OZGUR, S. & STOECKLIN, G. 2010. On track with P-bodies. Biochem Soc Trans, 38, 242-
51.
KURIHARA, Y., MATSUI, A., HANADA, K., KAWASHIMA, M., ISHIDA, J., MOROSAWA, T., TANAKA,
M., KAMINUMA, E., MOCHIZUKI, Y., MATSUSHIMA, A., TOYODA, T., SHINOZAKI, K. &
SEKI, M. 2009. Genome-wide suppression of aberrant mRNA-like noncoding RNAs by NMD in
Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A, 106, 2453-8.
KUROSAKI, T. & MAQUAT, L. E. 2013. Rules that govern UPF1 binding to mRNA 3' UTRs. Proc Natl Acad
Sci U S A, 110, 3357-62.
KUZMIAK, H. A. & MAQUAT, L. E. 2006. Applying nonsense-mediated mRNA decay research to the clinic:
progress and challenges. Trends Mol Med, 12, 306-16.
LAI, T., CHO, H., LIU, Z., BOWLER, M. W., PIAO, S., PARKER, R., KIM, Y. K. & SONG, H. 2012. Structural
basis of the PNRC2-mediated link between mrna surveillance and decapping. Structure, 20, 2025-37.
LE HIR, H., IZAURRALDE, E., MAQUAT, L. E. & MOORE, M. J. 2000. The spliceosome deposits multiple
proteins 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions. EMBO J, 19, 6860-9.
LEE, S. R., PRATT, G. A., MARTINEZ, F. J., YEO, G. W. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2015. Target
Discrimination in Nonsense-Mediated mRNA Decay Requires Upf1 ATPase Activity. Mol Cell, 59,
413-25.
LEEDS, P., PELTZ, S. W., JACOBSON, A. & CULBERTSON, M. R. 1991. The product of the yeast UPF1
gene is required for rapid turnover of mRNAs containing a premature translational termination codon.
Genes Dev, 5, 2303-14.
LEEDS, P., WOOD, J. M., LEE, B. S. & CULBERTSON, M. R. 1992. Gene products that promote mRNA
turnover in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 12, 2165-77.
LEJEUNE, F., LI, X. & MAQUAT, L. E. 2003. Nonsense-mediated mRNA decay in mammalian cells involves
decapping, deadenylating, and exonucleolytic activities. Mol Cell, 12, 675-87.
LEJEUNE, F. & MAQUAT, L. E. 2005. Mechanistic links between nonsense-mediated mRNA decay and pre-
mRNA splicing in mammalian cells. Curr Opin Cell Biol, 17, 309-15.
LEWIS, B. P., GREEN, R. E. & BRENNER, S. E. 2003. Evidence for the widespread coupling of alternative
splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, 189-92.
LIU, Q., FENG, Y. & ZHU, Z. 2009. Dicer-like (DCL) proteins in plants. Funct Integr Genomics, 9, 277-86.
LLAVE, C. 2010. Virus-derived small interfering RNAs at the core of plant-virus interactions. Trends Plant Sci,
15, 701-7.
LLOYD, J. P. & DAVIES, B. 2013. SMG1 is an ancient nonsense-mediated mRNA decay effector. Plant J, 76,
800-10.
LOH, B., JONAS, S. & IZAURRALDE, E. 2013. The SMG5-SMG7 heterodimer directly recruits the CCR4-
NOT deadenylase complex to mRNAs containing nonsense codons via interaction with POP2. Genes Dev, 27, 2125-38.
LONGMAN, D., PLASTERK, R. H., JOHNSTONE, I. L. & CACERES, J. F. 2007. Mechanistic insights and
identification of two novel factors in the C. elegans NMD pathway. Genes Dev, 21, 1075-85.
LYNCH, M. & KEWALRAMANI, A. 2003. Messenger RNA surveillance and the evolutionary proliferation of
introns. Mol Biol Evol, 20, 563-71.
MARTIN, K. C. & EPHRUSSI, A. 2009. mRNA localization: gene expression in the spatial dimension. Cell,
136, 719-30.
76
MATSUOKA, S., BALLIF, B. A., SMOGORZEWSKA, A., MCDONALD, E. R., 3RD, HUROV, K. E., LUO,
J., BAKALARSKI, C. E., ZHAO, Z., SOLIMINI, N., LERENTHAL, Y., SHILOH, Y., GYGI, S. P. &
ELLEDGE, S. J. 2007. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive
to DNA damage. Science, 316, 1160-6.
MCILWAIN, D. R., PAN, Q., REILLY, P. T., ELIA, A. J., MCCRACKEN, S., WAKEHAM, A. C., ITIE-
YOUTEN, A., BLENCOWE, B. J. & MAK, T. W. 2010. Smg1 is required for embryogenesis and
regulates diverse genes via alternative splicing coupled to nonsense-mediated mRNA decay. Proc Natl
Acad Sci U S A, 107, 12186-91.
MEAUX, S., VAN HOOF, A. & BAKER, K. E. 2008. Nonsense-mediated mRNA decay in yeast does not
require PAB1 or a poly(A) tail. Mol Cell, 29, 134-40.
MEDGHALCHI, S. M., FRISCHMEYER, P. A., MENDELL, J. T., KELLY, A. G., LAWLER, A. M. & DIETZ,
H. C. 2001. Rent1, a trans-effector of nonsense-mediated mRNA decay, is essential for mammalian
embryonic viability. Hum Mol Genet, 10, 99-105.
MEHTA, A., TROTTA, C. R. & PELTZ, S. W. 2006. Derepression of the Her-2 uORF is mediated by a novel
post-transcriptional control mechanism in cancer cells. Genes Dev, 20, 939-53.
MELERO, R., HUG, N., LOPEZ-PERROTE, A., YAMASHITA, A., CACERES, J. F. & LLORCA, O. 2016.
The RNA helicase DHX34 functions as a scaffold for SMG1-mediated UPF1 phosphorylation. Nat
Commun, 7, 10585.
MELERO, R., UCHIYAMA, A., CASTANO, R., KATAOKA, N., KUROSAWA, H., OHNO, S.,
YAMASHITA, A. & LLORCA, O. 2014. Structures of SMG1-UPFs complexes: SMG1 contributes to
regulate UPF2-dependent activation of UPF1 in NMD. Structure, 22, 1105-19.
MENDELL, J. T., SHARIFI, N. A., MEYERS, J. L., MARTINEZ-MURILLO, F. & DIETZ, H. C. 2004.
Nonsense surveillance regulates expression of diverse classes of mammalian transcripts and mutes
genomic noise. Nat Genet, 36, 1073-8.
MERAI, Z., BENKOVICS, A. H., NYIKO, T., DEBRECZENY, M., HIRIPI, L., KERENYI, Z., KONDOROSI,
E. & SILHAVY, D. 2013. The late steps of plant nonsense-mediated mRNA decay. Plant J, 73, 50-62.
MERAI, Z., KERENYI, Z., MOLNAR, A., BARTA, E., VALOCZI, A., BISZTRAY, G., HAVELDA, Z.,
BURGYAN, J. & SILHAVY, D. 2005. Aureusvirus P14 is an efficient RNA silencing suppressor that
binds double-stranded RNAs without size specificity. J Virol, 79, 7217-26.
MILLER, J. N. & PEARCE, D. A. 2014. Nonsense-mediated decay in genetic disease: friend or foe? Mutat Res
Rev Mutat Res, 762, 52-64.
MITCHELL, P. & TOLLERVEY, D. 2003. An NMD pathway in yeast involving accelerated deadenylation and
exosome-mediated 3'-->5' degradation. Mol Cell, 11, 1405-13.
MOORE, M. J. & PROUDFOOT, N. J. 2009. Pre-mRNA processing reaches back to transcription and ahead to
translation. Cell, 136, 688-700.
MORENO, A. B., MARTINEZ DE ALBA, A. E., BARDOU, F., CRESPI, M. D., VAUCHERET, H., MAIZEL,
A. & MALLORY, A. C. 2013. Cytoplasmic and nuclear quality control and turnover of single-stranded
RNA modulate post-transcriptional gene silencing in plants. Nucleic Acids Res, 41, 4699-708.
MUFARREGE, E. F., GONZALEZ, D. H. & CURI, G. C. 2011. Functional interconnections of Arabidopsis
exon junction complex proteins and genes at multiple steps of gene expression. J Exp Bot, 62, 5025-36.
MUHLEMANN, O. 2008. Recognition of nonsense mRNA: towards a unified model. Biochem Soc Trans, 36,
497-501.
MUHLEMANN, O., EBERLE, A. B., STALDER, L. & ZAMUDIO OROZCO, R. 2008. Recognition and
elimination of nonsense mRNA. Biochim Biophys Acta, 1779, 538-49.
MUHLEMANN, O. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2010. How and where are nonsense mRNAs degraded in
mammalian cells? RNA Biol, 7, 28-32.
MUHLRAD, D. & PARKER, R. 1994. Premature translational termination triggers mRNA decapping. Nature, 370, 578-81.
NAGY, E. & MAQUAT, L. E. 1998. A rule for termination-codon position within intron-containing genes:
when nonsense affects RNA abundance. Trends Biochem Sci, 23, 198-9.
NARSAI, R., HOWELL, K. A., MILLAR, A. H., O'TOOLE, N., SMALL, I. & WHELAN, J. 2007. Genome-
wide analysis of mRNA decay rates and their determinants in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 19, 3418-
36.
NICHOLSON, P., JOSI, C., KUROSAWA, H., YAMASHITA, A. & MUHLEMANN, O. 2014. A novel
phosphorylation-independent interaction between SMG6 and UPF1 is essential for human NMD.
Nucleic Acids Res, 42, 9217-35.
NICHOLSON, P. & MUHLEMANN, O. 2010. Cutting the nonsense: the degradation of PTC-containing
mRNAs. Biochem Soc Trans, 38, 1615-20.
NYIKO, T., KERENYI, F., SZABADKAI, L., BENKOVICS, A. H., MAJOR, P., SONKOLY, B., MERAI, Z.,
BARTA, E., NIEMIEC, E., KUFEL, J. & SILHAVY, D. 2013. Plant nonsense-mediated mRNA decay
77
is controlled by different autoregulatory circuits and can be induced by an EJC-like complex. Nucleic
Acids Res, 41, 6715-28.
NYIKO, T., SONKOLY, B., MERAI, Z., BENKOVICS, A. H. & SILHAVY, D. 2009. Plant upstream ORFs
can trigger nonsense-mediated mRNA decay in a size-dependent manner. Plant Mol Biol, 71, 367-78.
OHNISHI, T., YAMASHITA, A., KASHIMA, I., SCHELL, T., ANDERS, K. R., GRIMSON, A., HACHIYA,
T., HENTZE, M. W., ANDERSON, P. & OHNO, S. 2003. Phosphorylation of hUPF1 induces
formation of mRNA surveillance complexes containing hSMG-5 and hSMG-7. Mol Cell, 12, 1187-200.
OKADA-KATSUHATA, Y., YAMASHITA, A., KUTSUZAWA, K., IZUMI, N., HIRAHARA, F. & OHNO,
S. 2012. N- and C-terminal Upf1 phosphorylations create binding platforms for SMG-6 and SMG-
5:SMG-7 during NMD. Nucleic Acids Res, 40, 1251-66.
PAGE, D. R. & GROSSNIKLAUS, U. 2002. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nat Rev Genet, 3, 124-36.
PAGE, M. F., CARR, B., ANDERS, K. R., GRIMSON, A. & ANDERSON, P. 1999. SMG-2 is a phosphorylated
protein required for mRNA surveillance in Caenorhabditis elegans and related to Upf1p of yeast. Mol Cell Biol, 19, 5943-51.
PAILLUSSON, A., HIRSCHI, N., VALLAN, C., AZZALIN, C. M. & MUHLEMANN, O. 2005. A GFP-based
reporter system to monitor nonsense-mediated mRNA decay. Nucleic Acids Res, 33, e54.
PAL, M., ISHIGAKI, Y., NAGY, E. & MAQUAT, L. E. 2001. Evidence that phosphorylation of human Upfl
protein varies with intracellular location and is mediated by a wortmannin-sensitive and rapamycin-
sensitive PI 3-kinase-related kinase signaling pathway. RNA, 7, 5-15.
PALUSA, S. G., ALI, G. S. & REDDY, A. S. 2007. Alternative splicing of pre-mRNAs of Arabidopsis
serine/arginine-rich proteins: regulation by hormones and stresses. Plant J, 49, 1091-107.
PERALES, R. & BENTLEY, D. 2009. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus
for nuclear transactions. Mol Cell, 36, 178-91.
PULAK, R. & ANDERSON, P. 1993. mRNA surveillance by the Caenorhabditis elegans smg genes. Genes
Dev, 7, 1885-97.
RAJKOWITSCH, L., VILELA, C., BERTHELOT, K., RAMIREZ, C. V. & MCCARTHY, J. E. 2004.
Reinitiation and recycling are distinct processes occurring downstream of translation termination in
yeast. J Mol Biol, 335, 71-85.
RATCLIFF, F., MARTIN-HERNANDEZ, A. M. & BAULCOMBE, D. C. 2001. Technical Advance. Tobacco
rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. Plant J, 25, 237-45.
RAYSON, S., ARCIGA-REYES, L., WOOTTON, L., DE TORRES ZABALA, M., TRUMAN, W., GRAHAM,
N., GRANT, M. & DAVIES, B. 2012. A role for nonsense-mediated mRNA decay in plants: pathogen
responses are induced in Arabidopsis thaliana NMD mutants. PLoS One, 7, e31917.
REBBAPRAGADA, I. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2009. Execution of nonsense-mediated mRNA decay: what
defines a substrate? Curr Opin Cell Biol, 21, 394-402.
REHWINKEL, J., BEHM-ANSMANT, I., GATFIELD, D. & IZAURRALDE, E. 2005a. A crucial role for
GW182 and the DCP1:DCP2 decapping complex in miRNA-mediated gene silencing. RNA, 11, 1640-
7.
REHWINKEL, J., LETUNIC, I., RAES, J., BORK, P. & IZAURRALDE, E. 2005b. Nonsense-mediated mRNA
decay factors act in concert to regulate common mRNA targets. RNA, 11, 1530-44.
REHWINKEL, J., RAES, J. & IZAURRALDE, E. 2006. Nonsense-mediated mRNA decay: Target genes and
functional diversification of effectors. Trends Biochem Sci, 31, 639-46.
RIEHS-KEARNAN, N., GLOGGNITZER, J., DEKROUT, B., JONAK, C. & RIHA, K. 2012. Aberrant growth
and lethality of Arabidopsis deficient in nonsense-mediated RNA decay factors is caused by
autoimmune-like response. Nucleic Acids Res, 40, 5615-24.
RUIZ-ECHEVARRIA, M. J., GONZALEZ, C. I. & PELTZ, S. W. 1998. Identifying the right stop: determining
how the surveillance complex recognizes and degrades an aberrant mRNA. EMBO J, 17, 575-89.
SACHS, M. S. & GEBALLE, A. P. 2006. Downstream control of upstream open reading frames. Genes Dev,
20, 915-21.
SAMBROOK, J. & RUSSELL, D. W. 2001. Molecular cloning : a laboratory manual, New York, Cold Spring
Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory.
SAUL, H., ELHARRAR, E., GAASH, R., ELIAZ, D., VALENCI, M., AKUA, T., AVRAMOV, M.,
FRANKEL, N., BEREZIN, I., GOTTLIEB, D., ELAZAR, M., DAVID-ASSAEL, O., TCHERKAS, V.,
MIZRACHI, K. & SHAUL, O. 2009. The upstream open reading frame of the Arabidopsis AtMHX
gene has a strong impact on transcript accumulation through the nonsense-mediated mRNA decay
pathway. Plant J, 60, 1031-42.
SAULIERE, J., HAQUE, N., HARMS, S., BARBOSA, I., BLANCHETTE, M. & LE HIR, H. 2010. The exon
junction complex differentially marks spliced junctions. Nat Struct Mol Biol, 17, 1269-71.
78
SCHELL, T., KOCHER, T., WILM, M., SERAPHIN, B., KULOZIK, A. E. & HENTZE, M. W. 2003.
Complexes between the nonsense-mediated mRNA decay pathway factor human upf1 (up-frameshift
protein 1) and essential nonsense-mediated mRNA decay factors in HeLa cells. Biochem J, 373, 775-
83.
SCHWEINGRUBER, C., RUFENER, S. C., ZUND, D., YAMASHITA, A. & MUHLEMANN, O. 2013.
Nonsense-mediated mRNA decay - mechanisms of substrate mRNA recognition and degradation in
mammalian cells. Biochim Biophys Acta, 1829, 612-23.
SHETH, U. & PARKER, R. 2006. Targeting of aberrant mRNAs to cytoplasmic processing bodies. Cell, 125,
1095-109.
SHUM, E. Y., JONES, S. H., SHAO, A., DUMDIE, J., KRAUSE, M. D., CHAN, W. K., LOU, C. H.,
ESPINOZA, J. L., SONG, H. W., PHAN, M. H., RAMAIAH, M., HUANG, L., MCCARREY, J. R.,
PETERSON, K. J., DE ROOIJ, D. G., COOK-ANDERSEN, H. & WILKINSON, M. F. 2016. The
Antagonistic Gene Paralogs Upf3a and Upf3b Govern Nonsense-Mediated RNA Decay. Cell, 165, 382-
95.
SHYU, A. B., WILKINSON, M. F. & VAN HOOF, A. 2008. Messenger RNA regulation: to translate or to
degrade. EMBO J, 27, 471-81.
SILVA, A. L., PEREIRA, F. J., MORGADO, A., KONG, J., MARTINS, R., FAUSTINO, P., LIEBHABER, S.
A. & ROMAO, L. 2006. The canonical UPF1-dependent nonsense-mediated mRNA decay is inhibited
in transcripts carrying a short open reading frame independent of sequence context. RNA, 12, 2160-70.
SILVA, A. L., RIBEIRO, P., INACIO, A., LIEBHABER, S. A. & ROMAO, L. 2008. Proximity of the poly(A)-
binding protein to a premature termination codon inhibits mammalian nonsense-mediated mRNA
decay. RNA, 14, 563-76.
SINGH, G., REBBAPRAGADA, I. & LYKKE-ANDERSEN, J. 2008. A competition between stimulators and
antagonists of Upf complex recruitment governs human nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Biol, 6, e111.
SIWASZEK, A., UKLEJA, M., & DZIEMBOWSKI, A. 2014. Proteins involved in the degradation of
cytoplasmic mRNA in the major eukaryotic model systems, RNA Biology, 11, 1122-1136.
SLUCHANKO, N. N. & GUSEV, N. B. 2016. Moonlighting chaperone-like activity of the universal regulatory
14-3-3 proteins. FEBS J.
SONENBERG, N. & HINNEBUSCH, A. G. 2009. Regulation of translation initiation in eukaryotes:
mechanisms and biological targets. Cell, 136, 731-45.
SOURET, F. F., KASTENMAYER, J. P. & GREEN, P. J. 2004. AtXRN4 degrades mRNA in Arabidopsis and
its substrates include selected miRNA targets. Mol Cell, 15, 173-83.
SPRIGGS, K. A., BUSHELL, M. & WILLIS, A. E. 2010. Translational regulation of gene expression during
conditions of cell stress. Mol Cell, 40, 228-37.
STALDER, L. & MUHLEMANN, O. 2008. The meaning of nonsense. Trends Cell Biol, 18, 315-21.
STALDER, L. & MUHLEMANN, O. 2009. Processing bodies are not required for mammalian nonsense-
mediated mRNA decay. RNA, 15, 1265-73.
SUN, X., PERLICK, H. A., DIETZ, H. C. & MAQUAT, L. E. 1998. A mutated human homologue to yeast Upf1
protein has a dominant-negative effect on the decay of nonsense-containing mRNAs in mammalian
cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 95, 10009-14.
SUZUKI, Y., ISHIHARA, D., SASAKI, M., NAKAGAWA, H., HATA, H., TSUNODA, T., WATANABE, M.,
KOMATSU, T., OTA, T., ISOGAI, T., SUYAMA, A. & SUGANO, S. 2000. Statistical analysis of the
5' untranslated region of human mRNA using "Oligo-Capped" cDNA libraries. Genomics, 64, 286-97.
SWISHER, K. D. & PARKER, R. 2009. Related mechanisms for mRNA and rRNA quality control. Mol Cell, 34, 401-2.
SZITTYA, G., MOLNAR, A., SILHAVY, D., HORNYIK, C. & BURGYAN, J. 2002. Short defective
interfering RNAs of tombusviruses are not targeted but trigger post-transcriptional gene silencing
against their helper virus. Plant Cell, 14, 359-72.
TABUCHI, T., OKADA, T., AZUMA, T., NANMORI, T. & YASUDA, T. 2006. Posttranscriptional regulation
by the upstream open reading frame of the phosphoethanolamine N-methyltransferase gene. Biosci
Biotechnol Biochem, 70, 2330-4.
TAKAHASHI, S., ARAKI, Y., OHYA, Y., SAKUNO, T., HOSHINO, S., KONTANI, K., NISHINA, H. &
KATADA, T. 2008. Upf1 potentially serves as a RING-related E3 ubiquitin ligase via its association
with Upf3 in yeast. RNA, 14, 1950-8.
THARUN, S. 2009. Roles of eukaryotic Lsm proteins in the regulation of mRNA function. Int Rev Cell Mol
Biol, 272, 149-89.
THEIN, S. L., HESKETH, C., TAYLOR, P., TEMPERLEY, I. J., HUTCHINSON, R. M., OLD, J. M., WOOD,
W. G., CLEGG, J. B. & WEATHERALL, D. J. 1990. Molecular basis for dominantly inherited
inclusion body beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 87, 3924-8.
79
UNTERHOLZNER, L. & IZAURRALDE, E. 2004. SMG7 acts as a molecular link between mRNA surveillance
and mRNA decay. Mol Cell, 16, 587-96.
VALENTINE, T., SHAW, J., BLOK, V. C., PHILLIPS, M. S., OPARKA, K. J. & LACOMME, C. 2004.
Efficient virus-induced gene silencing in roots using a modified tobacco rattle virus vector. Plant
Physiol, 136, 3999-4009.
VELASQUEZ, A. C., CHAKRAVARTHY, S. & MARTIN, G. B. 2009. Virus-induced gene silencing (VIGS)
in Nicotiana benthamiana and tomato. J Vis Exp, (28), e1292.
VOINNET, O. 2008. Use, tolerance and avoidance of amplified RNA silencing by plants. Trends Plant Sci, 13,
317-28.
VOINNET, O. 2009. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs. Cell, 136, 669-87.
WANG, W., CZAPLINSKI, K., RAO, Y. & PELTZ, S. W. 2001. The role of Upf proteins in modulating the
translation read-through of nonsense-containing transcripts. EMBO J, 20, 880-90.
WASSENEGGER, M. & KRCZAL, G. 2006. Nomenclature and functions of RNA-directed RNA polymerases.
Trends Plant Sci, 11, 142-51.
WEBER, C., NOVER, L. & FAUTH, M. 2008. Plant stress granules and mRNA processing bodies are distinct
from heat stress granules. Plant J, 56, 517-30.
WELLS, S. E., HILLNER, P. E., VALE, R. D. & SACHS, A. B. 1998. Circularization of mRNA by eukaryotic
translation initiation factors. Mol Cell, 2, 135-40.
WEN, J. & BROGNA, S. 2010. Splicing-dependent NMD does not require the EJC in Schizosaccharomyces
pombe. EMBO J, 29, 1537-51.
WENG, Y., CZAPLINSKI, K. & PELTZ, S. W. 1996a. Genetic and biochemical characterization of mutations
in the ATPase and helicase regions of the Upf1 protein. Mol Cell Biol, 16, 5477-90.
WENG, Y., CZAPLINSKI, K. & PELTZ, S. W. 1996b. Identification and characterization of mutations in the
UPF1 gene that affect nonsense suppression and the formation of the Upf protein complex but not
mRNA turnover. Mol Cell Biol, 16, 5491-506.
WILKINSON, M. F. 2003. The cycle of nonsense. Mol Cell, 12, 1059-61.
WINKLER, R. G. & FELDMANN, K. A. 1998. PCR-based identification of T-DNA insertion mutants. Methods Mol Biol, 82, 129-36.
WITTKOPP, N., HUNTZINGER, E., WEILER, C., SAULIERE, J., SCHMIDT, S., SONAWANE, M. &
IZAURRALDE, E. 2009. Nonsense-mediated mRNA decay effectors are essential for zebrafish
embryonic development and survival. Mol Cell Biol, 29, 3517-28.
WOLF, J. & PASSMORE, L. A. 2014. mRNA Deadenylation by Pan2/Pan3. Biochem Soc Trans, 42, 184–187.
YAMASHITA, A., OHNISHI, T., KASHIMA, I., TAYA, Y. & OHNO, S. 2001. Human SMG-1, a novel
phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase, associates with components of the mRNA
surveillance complex and is involved in the regulation of nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev,
15, 2215-28.
YAMASHITA, A., CHANG, T. C., YAMASHITA, Y., ZHU, W., ZHONG, Z., CHEN, C. Y. & SHYU, A. B.
2005. Concerted action of poly(A) nucleases and decapping enzyme in mammalian mRNA turnover.
Nat Struct Mol Biol, 12, 1054-63.
YAMASHITA, A., IZUMI, N., KASHIMA, I., OHNISHI, T., SAARI, B., KATSUHATA, Y., MURAMATSU,
R., MORITA, T., IWAMATSU, A., HACHIYA, T., KURATA, R., HIRANO, H., ANDERSON, P. &
OHNO, S. 2009. SMG-8 and SMG-9, two novel subunits of the SMG-1 complex, regulate remodeling
of the mRNA surveillance complex during nonsense-mediated mRNA decay. Genes Dev, 23, 1091-105.
YAMASHITA, A. 2013. Role of SMG-1-mediated Upf1 phosphorylation in mammalian nonsense-mediated
mRNA decay. Genes Cells, 18, 161-75.
YOINE, M., NISHII, T. & NAKAMURA, K. 2006a. Arabidopsis UPF1 RNA helicase for nonsense-mediated
mRNA decay is involved in seed size control and is essential for growth. Plant Cell Physiol, 47, 572-
80.
YOINE, M., OHTO, M. A., ONAI, K., MITA, S. & NAKAMURA, K. 2006b. The lba1 mutation of UPF1 RNA
helicase involved in nonsense-mediated mRNA decay causes pleiotropic phenotypic changes and
altered sugar signalling in Arabidopsis. Plant J, 47, 49-62.
ZHANG, Z., XIN, D., WANG, P., ZHOU, L., HU, L., KONG, X. & HURST, L. D. 2009. Noisy splicing, more
than expression regulation, explains why some exons are subject to nonsense-mediated mRNA decay.
BMC Biol, 7, 23.
ZHENG, D., EZZEDDINE, N., CHEN, C. Y., ZHU, W., HE, X. & SHYU, A. B. 2008. Deadenylation is
prerequisite for P-body formation and mRNA decay in mammalian cells. J Cell Biol, 182, 89-101.
ZUND, D., GRUBER, A. R., ZAVOLAN, M. & MUHLEMANN, O. 2013. Translation-dependent displacement
of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nat Struct Mol Biol, 20, 936-43.
80
M2. Primerek listája
Primer neve szekvencia
Az introntávolság hatását vizsgáló konstrukciók elkészítéséhez használt primerek
30c BI F CATGGATTCATCCTCTAGAAGATCTTATCC
40c BI F CATGGATCCCTCAACCAAATCCTCTAGAAG
50c BI F CATGGATCCGCCACCTTCGCCCTCAACCAA
60c BI F CATGGATCCTTGAATCTCGCCAACTTCGCC
70c BI F CATGGATCCTCTGAAGCTTTGAATCTCGCC
80c BI F CATGGATCCTGGCACCACATCTGAAGCTTTGA
pFF2 rev AATTCCCTTATCTGGGAACTACTCAC
Primer neve szekvencia
Az Arabidopsis UPF1 N-terminális régióját térképező konstrukciók elkészítéséhez
használt primerek
U1N-terF1 for CACAGGATCCATGGATTCTCAACAGAGCGAT
U1N-terF4 rev CACAGGATCCTGCATCAACCTGACTACTACTAC
U1-F3 ala cserelo R GAATCGCCTTGAGCATTGAATTCCA
U1-F3 ala cserelo F TGGAATTCAATGCTCAAGGCGAATC
UPF1 Nterm F1-F2 ala
mut F
CACAGGATCCGATGCTCAACAGAGCGATCTCTTTGAC
ACCGCAGCGCAGCCG
U1N-terF4ala mut rev CACAGGATCCTGCATCAACCTGAGCACTACTACTAAC
ACC
U1N-terF3DS for CACAGGATCCGATTACCAGGATTTTGGATCG
U1 F3 ΔDS rev CACAGGATCCGAACTCTGAATCGCCTTG
U1N-terF3 for CACAGGATCCGAATTCAATACTCAAGGCGATTC
U1N-terF3ala mut for CACAGGATCCGAATTCAATGCTCAAGGCGATTC
U1N-terF3asp mut for CACAGGATCCGAATTCAATGATCAAGGCGATTC
81
Az Arabidopsis UPF1 C-terminális régióját térképező konstrukciók elkészítéséhez
használt primerek
U1 F.F5 CACACCTAGGGGTCCGCTAGCCCAACCTG
U1-R.F8 CACATCTCGAGCTAATGTGCTCCTTGTGTGGCATA
U1 F.F10 CACACCTAGGTTTCCTGGAAACTTTATGAATCAG
U1-R.F12 CACATCTCGAGCTATCCATCATCCTGGGATGA
U1 F.F14 CACACCTAGGAATCCTTATGGTGTGAACAATCC
U1 R.full CACACTCGAGTCAGCCATTGTAAGGATGTTTTG
Upf1 seq3 GCATGGTACAGTTTCAGA
U1 Cter F1 cserelo rev CGTATGGCTGAGCAGGAGGA
U1 Cter F1 cserelo for TCCTCCTGCTCAGCCATACG
U1-R.F4 CACATCTCGAGTCAAGGTTGGGATAGCGGACCACCA
U1 Cter F3-F4 ala mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGCTAGCGGACCACCAGGT
GAAGGTGAAGGCTGGGCATTCGGACT
U1 Cter F2 cserelo rev ACATTATGTTGGGCGGCTTG
U1 Cter F2 cserelo for CAAGCCGCCCAACATAATGT
U1 Cter F3A mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGATAGCGGACCACCAGGT
GAAGGCTGGGCATTCGGACT
U1 Cter F4A mut rev CACACACTCGAGCTATTGGGCTAGCGGACCACCAGGT
GAAGGCTGGCTATTCGGACT
82
M3. Az Arabidopsis UPF1 N- és C-terminális S/TQ gazdag régióinak
funkcionális térképezéséhez használt konstrukiók és a megépítésükhöz
felhasznált primerek és minták
Konstrukció neve
A PCR-hez használt primerek
Forward primer Reverse primer
PCR-hez használt
minta
Az Arabidopsis UPF1 N-terminális régiójának térképezéséhez használt konstrukciók
U1ΔC U1N-terF1 for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
NP3A
U1N-terF1 for
U1-F3 ala cserelo F
U1-F3 ala cserelo R
U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
NP1-2A4A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1N-terF4ala mut rev Bin Hada-Upf1
NP1-4A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1N-terF4ala mut rev NP3A
NΔNn U1N-terF3DS for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
NΔNc U1N-terF1 for U1 F3 ΔDS rev Bin Hada-Upf1
NΔcP3A U1N-terF1 for U1 F3 ΔDS rev NP3A
NΔcP1-2A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1 F3 ΔDS rev Bin Hada-Upf1
NΔcP1-3A UPF1 Nterm F1-F2 ala mut F U1 F3 ΔDS rev NP3A
NΔP1-2 U1N-terF3 for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
NΔP1-2P3A U1N-terF3ala mut for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
NΔP1-2P3D U1N-terF3asp mut for U1N-terF4 rev Bin Hada-Upf1
Az Arabidopsis UPF1 C-terminális régiójának térképezéséhez használt konstrukciók
ΔNU1C2 U1 F.F5 U1-R.F8 Bin Hada-Upf1
ΔNU1C3 U1 F.F10 U1-R.F12 Bin Hada-Upf1
ΔNU1C4 U1 F.F14 U1 R.full Bin Hada-Upf1
C1P1-2A
Upf1 seq3
U1 Cter F1 cserelo for
U1 Cter F1 cserelo rev
U1-R.F4 C1P2A*
C1P3-4A Upf1 seq3 U1 Cter F3-F4 ala mut rev Bin Hada-Upf1
C1P1-4A Upf1 seq3 U1 Cter F3-F4 ala mut rev C1P1-2A
C1P1-3A Upf1 seq3 U1 Cter F3A mut rev C1P1-2A
C1P1-2AP4A Upf1 seq3 U1 Cter F4A mut rev C1P1-2A
*C1P2A Upf1 seq3
U1 Cter F2 cserelo for
U1 Cter F2 cserelo rev
U1-R.F4
Bin Hada-Upf1
83
M4. Az Arabidopsis, szőlő, rizs és humán UPF1 N- és C-terminális régióinak
összehasonlítása
Az UPF1 N-terminális régiója szekvenciáinak összehasonlítása. Arabidopsis thaliana, szőlő (Vitis
vinifera), rizs (Oryza sativa) és humán UPF1 homológok szekvenciái. A mindegyikben konzervált
aminosavak feketével, amelyek nem mindegyikben konzerváltak, szürkével jelölve. Az összehasonlítás
T-Coffee-val készült, az ábrázolás GenDoc-kal. Piros téglalappal a vizsgálatainkkal azonosított, a
növényi NMD-ben szerept játszó aminosavak vannak bekeretezve. Szürke és fekete nyilak jelölik az
Arabidopsis UPF1 MS-analízissel azonosított foszforilált helyeit. A fekete nyíl a konzervált foszforilált
T29-et jelöli. Emlősökben az ennek megfelelő T28-at az SMG1 foszforilálja és az SMG6 kötődik hozzá.
Az NMD-releváns Nn rész piros vonallal, az NMD-irreleváns Nc rész szürkével jelölve. Az Nn rész
viszonylag erősen konzervált a nyitvatermők között, és sok hasonlóságot mutat a humánnal is, míg az
Nc rész igen változatos még a növények között is.
Az UPF1 C-terminális C1 része szekvenciáinak összehasonlítása. Arabidopsis thaliana, szőlő (Vitis
vinifera), rizs (Oryza sativa) és humán UPF1 homológok szekvenciái. A mindegyikben konzervált
aminosavak feketével, amelyek nem mindegyikben konzerváltak, szürkével jelölve. Az
összehasonlítás T-Coffee-val készült, az ábrázolás GenDoc-kal. Pirossal az S1076 S/TQ hely van
bekeretezve, amelyről kimutattuk, hogy szerepe van az NMD-ben. Zölddel az S1085, aminek lehet
szerepe az NMD-ben. Csillag jelöli az MS-analízissel azonosított foszforilációs helyeket. A C1 rész
növények között erősen konzervált, míg humánban csak a már említett két S/TQ hely és a környező
szekvencia hasonló.
84
M5. A foszforilált szerinek és treoninok azonosítása
tömegspektrometriával.
A tömegspektrometriás mérésekhez az N-terminális mutánsokat vad típusú N. benthamiana leveleiben
expresszáltattuk, a fehérjéket anti-HA ellenanyaggal immunoprecipitáltuk és SDS-PAGE módszerrel
futtattuk. A Coomassie-Blue-val festett fehérjesávokat kivágtuk, a gélben tripszinnel vagy pedig
tripszinnel és pepszinnel emésztettük. A foszfopeptideket titán-oxid gyantán dúsítottuk, majd LC-
MS/MS-sel elemeztük.
A vastaggal szedett aminosavak a potenciális PIKK kináz célpontok. Az Nc régió (36-109 aa) erősen
foszforilált, míg a CH és helikáz domén alig (109-1011 aa). Az Nn régió (1-35 aa) mindhárom S/TQ
helye (S3, S13, T29), melyek fontosak az NMD-hez, foszforilált.
Részletes kísérleti leíráshoz lásd még (Kerenyi F. et al., 2013).
85
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Nagy-nagy köszönettel tartozom Dr. Silhavy Dánielnek a lehetőségért, hogy a csoportjában
dolgozhattam, iránymutatásaiért és tanácsaiért, végtelen türelméért, és a pénteki focikért.
Köszönöm a Növényi RNS Biológia csoport valamennyi munkatársának munkámhoz nyújtott
önzetlen segítségét.
Köszönet illet mindenkit, aki bármilyen mértékben és minőségben hozzájárult a dolgozat
elkészültéhez.
86
A doktori disszertáció alapját képező publikációk
„Peer reviewed” folyóiratokban megjelent cikkek
Kerenyi, F; Wawer, I; Sikorski, PJ; Kufel, J; Silhavy, D: Phosphorylation of the N- and C-
terminal UPF1 domains plays a critical role in plant nonsense-mediated mRNA decay (2013)
PLANT JOURNAL Volume: 76 Issue: 5 Pages: 836-848.
Nyiko, T; Kerenyi, F; Szabadkai, Levente; Benkovics A, Major P, Sonkoly B, MeraiZ, Barta E,
Niemiec E, Kufel J and Silhavy D: Plant nonsense-mediated mRNA decay is controlled by
different autoregulatory circuits and can be induced by an EJC-like complex (2013)
NUCLEIC ACIDS RESEARCH Volume: 41 Issue: 13 Pages: 6715-6728.
Konferencia absztraktok
Kerényi F, Wawer I, Kufel J, Silhavy D: UPF1 phosphorylation is essential for Nonsense
Mediated mRNA Decay (NMD) in plants. „Jövőnk” konferencia, Keszthely, 2013.
Más, a disszertáció témájához nem kapcsolódó publikációk
„Peer reviewed” folyóiratokban megjelent cikkek
Bakó J, Kerényi F, Hrubi E, Varga I, Daróczi L, Dienes B, Csernoch L, Gáll J, and Hegedűs C:
Poly-γ-Glutamic Acid Nanoparticles Based Visible Light-Curable Hydrogel for Biomedical
Application (2016) JOURNAL OF NANOMATERIALS Volume 2016 (2016), Article ID
7350516.
Kerényi, F; Tarapcsák, S; Hrubi, E; Baráthne, SÁ; Hegedüs, V; Balogh, S; Bágyi, K; Varga, G;
Hegedüs, C: Comparison of sorting of fluorescently and magnetically labelled dental pulp
stem cells [Fogbél eredetű őssejtek fluoreszcens és mágneses válogatásának összehasonlító
vizsgálata] (2016) FOGORVOSI SZEMLE Volume 109, Issue 1, Pages 29-33.
Kuttor, A; Szaloki, M; Rente, T; Kerenyi, F; Bako, J; Fabian, I; Jenei, A; Lazar, I; Hegedus, C:
Preparation and application of highly porous aerogel-based bioactive materials in dentistry
(2014) FRONTIERS OF MATERIALS SCIENCE Volume: 8 Issue: 1 Pages: 46-52.
Deák, T; Hoffmann, S; Bodor, P; Kerényi, F; Bisztray, GD; Kozma, P: Marker assisted selection
for Seedlessness in a Multiresistant table grape hybrid family (2014) ACTA
HORTICULTURAE Volume 1046, Pages 485-492.
87
Konferencia absztraktok
Kerényi, F; Tombácz, I; Lázár, I; Hegedűs, C: Silica based aerogel composites as potential bone
regenerating scaffold materials (előadás); European Advanced Materials Congress 2016,
Stockholm, Sweden, 2016
Kerényi, F; Kuttor, A; Tombácz, I; Baráthné, SÁ; Lázár, I; Hegedűs, C: Highly porous silica
aerogel-based bioactive composite materials as potential scaffolds for bone regeneration
(poszter); 27th European Conference on Biomaterials ESB2015, Kraków, Poland, 2015.
Kerényi, F; Kuttor, A; Tombácz, I; Baráthné, SÁ; Tarapcsák, S; Lázár, I; Hegedűs, C: Behaviour
of STRO-1 sorted dental pulp stem cells on a highly porous silica aerogel-based bioactive
composite material (előadás); BIT’s 7th Annual World Congress of Regenerative Medicine
and Stem Cells, Haikou, China, 2014.
Bakó, J; Szepesi, M; Kuttor, A; Kerényi, F; Jenei, A; Hegedűs, C: Drug release from visible-
light curable biodegradable nanocomposite hydrogelsystems (poszter); 6th International
Conference on Drug Discovery and Therapy, Dubai, UAE, 2014.
Kerényi, F; Hrubi, E; Szalóki, G; Jenei, A; Hegedűs, C: Diverse effect of BMP-2 on various cells
able to differentiate to osteoblast (poszter); 3rd Biotechnology World Congress, Dubai, UAE,
2014.