a b c d

10° 20° 30° 40° 50° T(°C)

(287nm)

a) pH = 1.13 b) pH = 2.10 c) pH = 2.77 d) pH = 3.15

forma nativaforma nativa

forma denaturataforma denaturata

RibonucleasiRibonucleasiP.M.=14000P.M.=14000

K]N[]D[]D[]N[

]N[

1

1

1

1

Denaturazione termica della Chimotripsina (pH=2.0)

N N ⇄ D⇄ D

N N ⇄ D⇄ D

Denaturazione termica della Ribonucleasi A (pH=2.1)

STHG

dTCH p 0 dTT

CS p

0

)D(C)N(CC ppp000

A pH=2.5, T=303K, p=1 atm:

1257 molkcal.H 1186 molcalS13 90018630310257 molcal.G

1]N[

]D[K Predomina la forma nativa

A pH=2.5, T=313K, p=1 atm:

1176 molkcal.H 1260 molcalS13 4526030310176 molkcal..G

Predomina la forma denaturata1]N[

]D[K

Parametri termodinamici per la denaturazione termica della Ribonucleasi A (pH=2.5)

G°(D)

G°(N)

20° 40° 60° 80° T(°C)

20° 40° 60° 80° T(°C)

Tm

Tm

ΔG°= G°(D)-G°(N)

N

DlnRTKlnRTG

Forma nativaForma nativa

Forma denaturataForma denaturata

dTCH p 0 dTT

CS p

0

(N)C - (D)C C 0P

0PP 0

La variazione di capacità termica del processo di denaturazione è data dalla differenza tra le rette caratteristiche della forma nativa e denaturata:

Dall’integrazione della curva sperimentale si ottengono la variazione entalpica ed entropica del processo:

• Le variazioni entalpiche ed entropiche con la temperatura sono grandi e positive. Il contributo entalpico è sfavorevole al processo di denaturazione e l’intero processo è quindi guidato dal contributo entropico favorevole.

• G0 è piccolo a causa di effetti di compensazione tra effetti entalpici ed entropici. Bastano piccole variazioni nei contributi entalpici ed entropici per far variare il segno complessivo dell’energia libera standard. L’aumento di pH sfavorisce il processo di denaturazione (G0 > 0), il punto di flesso delle curve di transizione (G0=0, H0 = Tm S0) si sposta a temperature maggiori. ;

• La capacità termica è relativamente elevata (ΔCp°≈2kcal·mol-1), come conseguenza della elevata dipendenza dei termini entalpici ed entropici dalla temperatura.

2

0

P RT

H

T

K ln

0

P

0

S - T

G

L’andamento è in accordo con quanto previsto dall’equazione di Van’t Hoff:

Poiché H0>0 la reazione di denaturazione è favorita da un aumento di temperatura. Analogamente, poiché:

l’aumento di temperatura favorisce lo stato a entropia maggiore (forma denaturata).

Le proteine tendono ad essere più stabili intorno al punto isoelettrico (carica nulla).

1. Il pH influenza gli equilibri di deprotonazione dei residui polari (Lys, Gln, Asp) e determina la carica totale sulla superficie proteica (repulsione elettrostatica tra i gruppi ionizzabili).

2. Determina inoltre la rottura dei ponti salini tra gruppi ionizzati di diverso segno (Ex. Asp70 e His31 nella lisozima).

Come risultato molte proteine denaturano in maniera irreversibile a valori estremi di pH (pH<5 o pH>10).

La denaturazione di una proteina può essere anche indotta mediante l’aggiunta di agenti chimici in grande eccesso, come l’urea o lo ione guanidinio.

- formazione di legami idrogeno competitivi con i gruppi peptidici;

- stabilizzazione dello stato denaturato attraverso l’interazione preferenziale con la superficie proteica. Infatti l’urea e lo ione guanidinio aumentano la solubilità di tutti i residui, sia polari che apolari, diminuendo di circa il 30% l’entità del contributo idrofobico, con un conseguente aumento della superficie esposta.

Ferritina umanaFerritina umana

L’insieme di questi effetti è dovuto in larga parte a fenomeni di L’insieme di questi effetti è dovuto in larga parte a fenomeni di solvatazione. solvatazione.

Glu Arg

Phe Ile Leu Val

LysLys

Arg

Lys

Arg

ArgGluLys

Phe

Ile LeuVal

Forma nativa Forma denaturata

Formazione di clusters di acqua intorno ai residui apolari

All’aumentare della temperatura cresce il peso del contributo entropico favorevole, favorendo il processo di denaturazione. Inoltre all’aumentare della temperatura le strutture ordinate di solvente tendono a rompersi, rilasciando molecole libere di muoversi liberamente in soluzione.

Questo comporta un ulteriore aumento di entropia e anche una variazione entalpica associata alla parziale distruzione dei legami idrogeno che stabilizzavano le strutture a clusters.

Il risultato dell’insieme di questi processi è una forte dipendenza dei contributi entalpici ed entropici dalla temperatura.

N N ⇄ MG ⇄ ⇄ MG ⇄ DD

Il Molten Globule rappresenta una struttura intermedia tra la forma nativa e quella denaturata. E’ caratterizzato da un contenuto di struttura secondaria paragonabile a quello della forma nativa, ma con un volume molare molto più grande (~50%).

Le caratteristiche principali di uno stato molten globule sono:

(i) le dimensioni totali di questo stato sono minori di quelle associate ad un gomitolo statistico e sono solo lievemente maggiori di quelle dello stato nativo;

(ii) il contenuto di struttura secondaria è confrontabile con quello dello stato nativo;

(iii) le interazioni con il solvente (cioè la superficie esposta al solvente) sono molto maggiori di quelle dello stato nativo, ma molto minori dello stato completamente denaturato;

(iv) l’interconversione molten globule stato denaturato è rapida e non cooperativa, mentre l’interconversione molten globule stato nativo è lenta e cooperativa.

Fluttuazioni intorno allo stato nativo

Il numero di conformazioni possibili per un polipeptide composto da n residui è:

2 n

dove ω rappresenta il numero di conformazioni popolato da ogni residuo. L’esponente (n-2) tiene conto del fatto che i due residui terminali restano comunque liberi in qualunque conformazione.

Dall’approssimazione degli isomeri rotazionali: ω=9. Quindi per n=100 (miniproteina):

9398 1039

Sperimentalmente si è trovato che in media: ω=3.5.

5398 10253 .

Assumendo ΩN≈1 per una proteina nel suo stato nativo e calcolando la variazione entropica per mole di proteina:

D

Nlnk)D(S)N(SS

1153

244102

1

KmolcallnRS

La variazione di entropia conformazionale è di ca. -2.4 cal·mol-1·K-1 per residuo!

Paradosso di LevinthalParadosso di Levinthal

Ipotizzando che un sistema popoli ciascuna conformazione per un tempo dell’ordine di 1 ps ci vorrebbero ca. 6·1033 anni per analizzare tutte le possibili conformazioni. Proteine (in vivo e in vitro) raggiungono la conformazione nativa in un tempo che varia tra 0.1 e 1000 secondi.

Il processo di folding deve essere un processo guidato attraverso Il processo di folding deve essere un processo guidato attraverso un cammino non casuale!un cammino non casuale!

ΦΦ = Frazione di molecole che raggiungono rapidamente lo stato nativo

1-1-ΦΦ =Frazione di molecole che raggiungono stati metastabili(minimi locali di energia)

kkDD

N N ⇄ D⇄ D kkFF

Es. Lisozima

• kD e kF rappresentano rispettivamente le costanti cinetiche del processo di denaturazione (ND) e del processo di folding (ND).• Perché valga questo tipo di modello gli stati intermedi devono essere tutti fortemente instabili.

[D] k - [N] k td

[N] d - FD

Da un punto di vista cinetico:

Dividendo entrambi i membri per la concentrazione totale [N] + [D]:

DFNDN f k - f k

td

f d -

[D][N]

[N] fN

[D][N]

[D] fD

Introducendo la variazione delle frazioni molari della forma nativa e denaturata dai valori di equilibrio:

fN = fN – fN(eq) fD = fD – fD(eq)

DFD(eq)FNDN(eq)DN f k - f k -f k f k

td

f d -

All’equilibrio: kD fN(eq) = kF fD(eq)

DNNDN f k - f k

td

f d -

A tutti i tempi (conservazione di massa): fN = - fD

f )k (k td

f d - NFD

N

La cui soluzione è:

FD0NN k k t) exp(- f f

FD0DD k k t) exp(- f f

In un meccanismo a due stati la cinetica di denaturazione e di folding avvengono con la stessa costante cinetica .

N N ⇄⇄ X X ⇄⇄ D D

Es. Ribonucleasi

veloce lento

Lo stato intermedio X presenta regioni strutturalmente ordinate che assumono la funzione di centri di nucleazione attorno ai quali si completa il folding proteico.

Il modello più semplice prevede un solo stato intermedio:

k1 k2

N ⇄ X ⇄ D k-1 k-2

La soluzione dell’equazione cinetica è:

t) exp(- C t) exp(- C f 2211N

t) exp(- C t) exp(- C f 2413D

Le cinetiche di folding e unfolding per un processo a tre stati non sono le stesse.

A)A) Nucleazione e crescita rapidaNucleazione e crescita rapida

D ⇄ I1 I2 I3 I4 I5 N Nucleazione (lenta) crescita (rapida)

In questo modello vi è un primo evento di nucleazione verso l’intermedio corretto che porterà alla strutturazione nativa. Questo primo passo è lento e il processo di sampling delle conformazioni casuale. Gli stadi successivi (crescita) sono rapidi e portano irreversibilmente alla struttura nativa.

U1

U2

U3

U4

U5

I1

I2

I3

I4 N

B) Modello generaleB) Modello generale

statistatiunfoldedunfolded

statistatiintermediintermedi

intermediointermediopre-foldato (MG)pre-foldato (MG)

strutturastrutturanativanativa

II

IIII

IIIIII

I. Collasso veloce della catena proteica in una conformazione compatta (Molten globule)I tempi sono dell’ordine dei microsecondi.

II. Esplorazione delle strutture compatte

III. Transizione tra stati misfolded e struttura nativa (lento)

La transizione tra stati misfolded e struttura nativa è un processo attivato, generalmente lento.Per una barriera di energia dell’ordine di 7 kcal·mol-1, il tempo stimato necessario alla transizione è dell’ordine di qualche secondo.

Cinetica bifasica di un processo di folding

Collasso veloceCollasso veloce

Processi attivatiProcessi attivati