8.  vaja  –  Imunološke  metode  –  določanje  govejih  IgG  v  siru  

 

Matevž  Korenč  

Pro;telesa  

=  

Imunoglobulin  G  (IgG),  kot  bi  ga  videli  pod  elektronskim  mikroskopom.  

Kvartarna  struktura  imunoglobulina  G  (IgG),  s  poudarjenimi  terciarnimi  strukturami.    

Pro@telo  (IgG)  z  obarvanimi  verigami;  modro  in  rdeče  težki  verigi,  rumeno  in  zeleno  lahki  verigi  

Vezavno  mesto  za  an;gen  

Vezavno  mesto  za  an;gen  Pro;telesa  

• so  glikoproteini  iz  naddružine  imunoglobulinov      • fragmenta  Fab  in  Fc    sestavljajo  pro@telo  oblike  črke  Y    • sestavljeni  iz  dveh  iden@čnih  težkih  (modrih)  in  dveh  iden@čnih  lahkih  (rdečih)  verig    • disulfidne  vezi  med  težko  in  lahko  verigo  in  dvema  težkima  verigama  (označene  z  rumeno)    • Klasično  pro@telo  tvorijo  ponavljajoče  se  imunoglobulinske  domene,  vsaka  domena  (na  sliki  označena  kot  kvadratek)  ima  značilno  imunoglobulinsko  zvitje  

•   konstantne  (CH1,  CH2,  CH3,  CL)  in  variabilne  (VH,  VL)  domene    •   variabilni  domeni  težke  in  lahke  verige  (VH  in  VL)  z  šes@mi  hipervariabilnimi  zankami  tvorita  vbočeno  vezavno  mesto  za  an;gen  

Shematski  prikaz  strukture  pro@telesa  IgG  s  težko  in  lahko  verigo.      

Fab=  (angl.  fragment  an@gen  binding)  Fc=  (angl.  fragment  cristallizable)      C  =  (angl.  constant  (domain))  V=  (angl.variable  (domain))  H  1,2,3  =  (angl.  heavy  (chain))  L  =  (angl.light  (chain))    Primer:  VH  =  variabilna  domena  težke  verige                                CL=  konstantna  domena  lahke  verige  

Pro;telesa  Nastanejo  kot  odziv  na  prisotnost  tuje  snovi  –  an;gena  

An;gen  je  lahko:      • protein  • polisaharid  • nukleinske  kisline  • lipidi  • druge  molekule    Mesto  na  an;genu,  kamor  se  veže  pro@telo  =  epitop  Velike  molekule  imajo  več  različnih  epitopov.  

hVp://student.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit4/an@gens/u3fg9a.html  

Za  pro@telesa  je  značilno,  da  se  z  veliko  afiniteto  vežejo  samo  na  @ste  an@gene,  pro@  katerim  so  bila  ustvarjena,  se  pravi  da  je  vezava  STROGO  SPECIFIČNA!  

Mesto  na  pro;telesu,  kamor  se  veže  epitop  =  paratop  

paratop

Monoklonska  in  poliklonska  pro;telesa  Pro@telesa  se  site@zirajo  v  limfoci;h,  ki  so  celice  imunskega  sistema.  Vsak  limfocit  je  zmožen  izdelova@  le  eno  vrsto  pro@teles  in  vsako  prepoznava  le  eno  an@gensko  determinanto.  Taka  pro@telesa  imenujemo  monoklonska  pro;telesa  (pridobljena  iz  ene  celične  linije).      Z  imunizacijo  živali  pa  lahko  dobimo  poliklonski  an;serum.  Pro@telesa  nastala  pro@  enemu  an@genu,  s  katerim  smo  imunizirali  žival,  so  produk@  različnih  limfocitov  B  in  posledično  reagirajo  z  različnimi  epitopi  tega  an@gena.      Pro@telesa  se  razlikujejo  po  specifičnos@  in  afinite@  vezave  na  epitop.  Pri  uporabi  poliklonskih  pro;teles  lahko  nastanejo  številne  težave  (na  primer  nastanek  navzkrižnih  reakcij),  zato  se  v  raziskavah  pogosteje  uporabljajo  monoklonska  pro;telesa  

hVp://qwikstep.eu/search/monoclonal-­‐polyclonal-­‐an@body.html  

Shema  pridobivanja  nesmrtnih  celičnih  linij  limfocitov  in    monoklonskih  pro@teles  

Detekcija  proteinov  s  pro;telesi  

hVp://qwikstep.eu/search/monoclonal-­‐polyclonal-­‐an@body.html  

Izhajamo  iz  dejstva,  da  se  pro@telesa  specifično  vežejo  na  točno  določen  an@gen  

Pro@telesa  uporabljamo  pri  tehnikah:    •   prenos  western  •   afinitetna  kromatografija  •   točkovni  prenos  /  črtovni  prenos  •   flurescenčna  mikroskopija  •   ELISA  

Membrane  za  imobilizacijo  proteinov  

Nitrocelulozna  (NC)  in  polivinilidendifluoridna  (PVDF)  membrana  •   visoka  nespecifična  afiniteta  do  aminokislin  • nastanejo  močne  hidrofobne  interakcije,  ki  držijo  proteine  na  membrani   hVp://en.wikipedia.org/wiki/File:Nitrocellulose-­‐2D-­‐skeletal.png  

nitrocelulozna  

polivinilidendifluorid  Površina  PVDF  membrane  pod  elektronskim  mikroskopom  

hVp://en.wikipedia.org/wiki/Polyvinyl_fluoride  

Prenos  western  (angl.  Western  bloeng)  

hVp://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot  

•     Pro@telesa  so  prevelika,  da  bi  po  ločbi  proteinov  na  PAGE  prodrla  v  poliakrilamidni  gel,  zato  proteine  s  pomočjo  električnega  toka  najprej  prenesemo  na  membrano  (nitrocelulozno  (NC)  ali  polivinilidendifluoridno  (PVDF)).    

•   Nega@vno  nabi@  proteini  bodo  potovali  pro;  pozi;vni  anodi.  • Primerno  za  prenos  proteinov    na  membrano  po  na@vni  ali  NaDS  –  PAGE.    •     Proteini  vezani  na  membrano  so  primerni  za  nadaljnje  analize  (npr.  detekcija  s  pro@telesi).  

• Glej  animacijo:  hVp://www.youtube.com/watch?v=aGu-­‐NKvKIoA  

Western  prenos  (detekcija  s  pro@telesi)  

•   po  elektroforeznem  prenosu  vsa  nezasedena  mesta  na  membrani  blokiramo  (blocking  buffer)  s  proteini,  na  katere  se  pro@telo  ne  bo  vezalo.  S  tem  preprečimo  nespecifično  vezavo  pro;telesa  na  membrano,  za  blokacijo  največkrat  uporabimo  protein  BSA  ali  pa  kazein    •   speremo  nevezane  proteine  in  dodamo  primarna  pro;telesa,  ki  se  bodo  specifično  vezala    na  točno  določen  an@gen    • speremo  nevezana  primarna  pro@telesa  in  dodamo  sekundarna  pro;telesa,  ki  se  specifično  vežejo  samo  na  Fc  regijo  primarnih  pro;teles.  Najpogosteje  je  na  sekundarna  pro@telesa  kovalentno  vezan  encim,  ki  ob  inkubaciji  membrane  v  razstopini  brezbarvnega  kromogenega  substrata  nastane  na  mestu  vezave  sekundarnih  pro@teles  obarvan  produkt  • Glej  animacijo:  hVp://www.youtube.com/watch?v=aGu-­‐NKvKIoA  

hVp://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot  

Western  prenos  (detekcija  s  pro@telesi)  

hVp://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm  

Imunološka  detekcija  proteinov  po  elektroforezi  

NaDS-­‐PAGE  

Imunološka  detekcija  proteinov  po  NaDS-­‐PAGE  na  nitrocelulozni  membrani  

hVp://employees.csbsju.edu/hjakubowski/classes/ch331/Techniques/TechElectrophoresis.htm  

Točkovni  prenos  (angl.  dot  blot)  Soroden  prenosu  western,  le  da  proteine  na  membrano  nanesemo  v  obliki  točke.  Dobimo  le  kvan@ta@vno  informacijo  o  iskanem  an@genu.  Prednost  metode  je  hitrost:  ni  potrebna  elektroforezna  ločitev  in  prenos  na  membrano.  

• vzorec  nanesemo  diretno  na  membrano  • blokriramo  nezasedena  mesta  • detek@ramo  s  pro@telesi    

Močnejša  pika  pomeni  večjo  koncentracijo  iskanega  an@gena  

Točkovni  prenos  (angl.  dot  blot)  Pozi;vna  in  nega;vna  kontrola  

Preverimo,  če  se  uporabljena  pro@telesa  vežejo  na  naš  an@gen  in  koliko  bodo  k  intenzite@  lise  prispevala  nespecifično  vezana  pro@telesa.  

Primer  uporabe  pro;teles  v  afinitetni  kromatografiji  

• na  agarozni  nosilec  vežemo  protein  (streptavidin),  ki  močno  veže  molekulo  bio@na  

• na  Fc  regiji  pro@telesa,  kovalentno  vežemo  molekulo  bio@na    • preko  interakcije  streptavidin-­‐bio@n  imobiliziramo  pro@telo  na  nosilec    

• Imobilizirano  pro@telo  bo  specifično  vezalo  an@gen  

• nosilec  speremo  

• pro@telo  z  vezanim  an@genom  eluiramo  z  visoko  koncentracijo  bio@na  

Fluorescenčna  mikroskopija  S  fulescenčnimi  proteini  (npr.  GFP)  konjugirana  pro@telesa  vezana  na  an@gene  v  eukariontski  celici.    

ELISA  (angl.  Enzyme-­‐linked  immunosorbent  assay)  

 indirektna  ELISA  –  določanje  pro;teles                 Na   nosilec   vezan   an@gen,   dodamo   vzorec   s  

preiskovanimi  pro@telesi.        

Indirektna  ELISA  

hVp://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=12065  

ELISA  (angl.  Enzyme-­‐linked  immunosorbent  assay)  

Direktna  ali  sendvič  ELISA  –  določanje  an;genov                  Na  nosilec  vezana  pro@telesa  dodamo  vzorec  s  

preiskovanimi   an@geni,   speremo   nespecifično  vezane  an@gene,  dodamo  specifična    pro@telesa,  ki  so  označena.  

 Uporabno  za  večje  molekule,  ki  imajo  dva  ločena  epitopa,  ki  

se  ne  prekrivata.  

Direktna  ali  sendvič  ELISA http://blog.leinco.com/wp-content/uploads/2010/06/sandwichELISA.gif