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265
7. Séquençage des protéines
Protéine inconnue
Structure primaire
séquençage des acides aminés
structure secondaire structure tertiaire structure quaternaire
266
7.1 Stratégie de séquençage d’une protéine
Stratégie de base développée par Frederick Sanger en 1953 (Prix Nobel 1958)
Étapes impliquées dans le séquençage d’une protéine:• Détermination du nombre de chaînes polypeptidiques (sous-unités)
dans la protéine• Coupure des liens disulfures (inter- ou intramoléculaires)• Détermination de la composition des acides aminés de chaque chaîne
polypeptidique• Les chaînes polypeptiques sont souvent trop longues pour être
directement séquencées; elles doivent avant être coupées en des plus petits fragments peptidiques par des réactions spécifiques.
• Détermination de la séquence de chacun des fragments peptidiques par la dégradation d’Edman
• Élucidation de la séquence de chacune des chaînes polypeptidiques par recouvrement des séquences des différents fragments
• Détermination de la structure de la protéine entière, incluant les liens disulfures entre les sous-unités
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7.2 Analyse des résidus terminaux
Puisque chaque chaîne polypeptidique possède un résidu N-terminal et C-terminal, le nombre de sous-unités distinctes dans une protéine peut être déterminé en identifiant le nombre de chacun des résidus terminaux.
NN
N COO-
O
NH3+
HR
H
R H
O
H
H R
O
H
R H
résidu N-terminal résidu C-terminal
268
7.2.1 Analyse N-terminal
Réaction avec du chlorure dansyl (réagit avec des α-amines):
N(CH3)2
SCl
OO
HN CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
O
N(CH3)2
SO2
H2N CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
O
H3O+
HN CH C OHR1
O
N(CH3)2
SO2
HCl
NH3 CH C OHR2
O
HN CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
O
N(CH3)2
SO2
NH3 CH CR3
OOH
+
chlorure dansyl
polypeptide dansyl
+ ++ + + ...
...
...
...
acide aminé dansyl acides aminés libres
(espèce fluorescente)
269
Dégradation d’Edman (analyse séquentielle):
=
phényl isothiocyanate (PITC)
(séquençage de peptides constitués de 40 à 60 résidus)
270
NCS
NH CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
ONH
C
S
H3O+
H2N CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
O
2. traitement avec H3O+NH3 CH C NH
R2
OCH CR3
O
HN N
OR1
PhS
N S
O
NHPh
R1
+
PITC polypeptide
... ...
dérivé phénylthiohydantoin dérivé thiazolinone
acide trifluoroacétique
...++
répétition du cycle
λmax = 296 nm
1. extraction dans un solvant organique
PITC
271
Séquençage automatisé par dégradation d’Edman
272
Réaction enzymatique (exopeptidase):
L’utilité des aminopeptidases pour l’analyse des résidus N-terminalest limitée puisque ces enzymes agissent spécifiquement sur certains acides aminés et avec des vitesses de réaction différentes.
H2N CH C NH CH C NHR1
O R2
OCH CR3
O...
aminopeptidaseH2N CH C O-
R1
ONH3 CH C NH
R2
OCH CR3
O...+
+
273
7.2.2 Analyse C-terminal
Il n’y pas de processus comparable à la dégradation d’Edman pour l’analyse séquentielle des résidus C-terminal.
Réaction enzymatique (exopeptidase):
Due à la nature sélective des carboxypeptidases, certains résidus sont résistants aux coupures ou sont coupés très lentement.
HN CH C NH CH C NHR3
O R2
OCH CO-
R1
O...
carboxypeptidaseH3N CH C O-
R1
ONH CH C NH
R2
OCH CO-
R3
O... +
+
274
Réaction chimique (ex. hydrazinolyse):
NH CH C NHRn-1
OCH CO-
Rn
OH3N CH C
R1
O
NH2-NH2
NH3 CH C NHRn-1
ONH2H3N CH C O-
Rn
OH3N CH C NH-NH2
R1
O+
+
...
polypeptide
90°C, 20-100 h
++
+... +
acide aminé libre hydrazines aminoacyles
conditions légèrement acide
+
275
7.3 Coupure des liens disulfures
+H3N CH
CH2
COO-
SH
+H3N CH
CH2
COO-
HS
+H3N CH
CH2
COO-
S
+H3N CH
CH2
COO-
S
Cystéine Cystéine Cystine
+
Insuline Les liens disulfuresdoivent être coupésavant le séquençage pour séparer et déplier les sous-unités.
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Oxydation avec de l’acide performique:
Toutes les cystéines dans une protéine sont oxydées (celles qui sont liées ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol).
L’acide performique réagit aussi avec d’autres résidus; ex. le groupement indole de la Trp est partiellement détruit et les résidus Met sont oxydés.
H C CH2 S S CH2 C H
N H
CO
NH
C O
C O OH
O
HH C CH2 SO3
-NH
C O
-O3S CH2 C H
N H
CO
Cystine
+
Acide cystéique
NH CH C
O
(CH2)2
S
CH3
C O OH
O
HNH CH C
O
(CH2)2
S
CH3
OO
Méthionine
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Réduction avec du dithiothréitol (DTT) ou du 2-mercaptoéthanol:
H C CH2 S S CH2 C HN H
CO
NH
C O2 HSCH2CH2OH CH2OH
CH2SH
CHOHCH2SH
H C CH2 SHNH
C OS
SHO
HOHS CH2 C H
N H
CO
SCH2CH2OHSCH2CH2OH
Cystine
+ ou
+ ou
Cystéines
278
H C CH2 SH
NH
C O
ICH2COO- H C CH2 SCH2COO-NH
C O
+
Cystéine
Iodoacétate
alkylation
Cystéine protégée
+ HI
Pour empêcher la ré-oxydation de la cystéine formée:
279
7.4 Détermination de la composition d’acides aminés d’une protéine
Le nombre de chaque acide aminé dans une chaîne polypeptidique est un paramètre caractéristique de chaque protéine. Une protéine inconnue peut souvent être identifiée en mesurant le pourcentagerelatif des différents acides aminés et en comparant avec des bases de données.
Premièrement, les liens peptidiques dans une protéine sont hydrolysés par traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides aminés libérés sont ensuite séparés et quantifiés.
Traitement acide: polypeptides + 6 M HCl, reflux à 100-120°C pour 24 hres sous vide.
280
Des temps de réaction plus long sont nécessaires pour une hydrolyse complète des résidus Leu, Val et Ile.
Par contre, certains résidus sont dégradés dans ces conditions sévères. Trp est considérablement dégradée. La vitesse de dégradation de certains résidus, tels que Thr, Tyr et Ser peut être mesurée et un facteur de correction peut être inclut pour tenir compte de la perte de ces acides aminés en fonction du temps d’hydrolyse.
De plus, l’hydrolyse acide convertit Asn à Asp et Gln à Glu, respectivement (du NH4
+ est éliminé). Pour déterminer la quantité de ces acides aminés, la teneur totale de Asx (Asn + Asp), Glx (Gln + Glu) et NH4
+ (Asn + Gln) doit être mesurée et comparée.
Puisque des conditions optimales pour l’hydrolyse acide sont difficiles à établir, la réaction est effectuée plusieurs fois dans des conditions différentes et la composition des acides aminés est déduite à partir des différentes expériences d’hydrolyse.
281
Hydrolyse basique: Polypeptides + 6 M NaOH, reflux à 100°C pendant 4 à 8 hres. L’hydrolyse basique est seulement utilisée dans des cas spéciauxpuisqu’elle est plus problématique que l’hydrolyse acide.Dans ces conditions, Arg, Cys, Ser et Thr sont décomposées et d’autres résidus sont dé-aminés et racémisés. Ceci limite l’utilisation de l’hydrolyse basique à la détermination de la teneur en Trp.
Les méthodes enzymatiques sont surtout utilisées pour la détermination de l’Asn, de la Gln et du Trp. Puisque les exopeptidases et endopeptidases exhibent des spécificités élevées, il est essentiel d’utiliser un mélange d’enzymes pour assurer l’hydrolyse de tout les liens peptidiques. Des faibles concentrations d’enzymes doivent être utilisées (~1%) puisqu’elles sont aussi des protéines qui peuvent être dégradées et contaminées le mélange réactionnel.
282
Après hydrolyse, les acides aminés libres sont séparés par chromatographie à échange d’ions ou par HPLC à phase inversée.
Exemple: composition des acides aminés dans un peptide(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)
Les acides aminés peuvent être identifiés selon leur temps de rétention et quantifiés selon leur volume d’élution.
HN CH C OHR1
O
N(CH3)2
SO2
CH C OHR1
ON
SCH2CH2OH
dérivés fluorescents
283
7.5 Coupure spécifique des liens peptidiques
7.5.1 Fragmentation enzymatique
Exopeptidases: Coupure d’un acide aminé N- ou C-terminal d’une chaîne peptidique
Endopeptidases: Coupure spécifique de liens peptidiques à l’intérieure d’une chaîne
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trypsine
Protection de la Lys et de l’Arg contre l’hydrolyse par la trypsine
285
La charge positive sur ce dérivé de la cystéine rend cet acide aminé plus susceptible à l’hydrolyse par la trypsine.
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Br-
H2O
7.5.2 Fragmentation chimique
Le CNBr coupe les liens peptidiques du côté C-terminal d’un résidu Met.
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7.6 Détermination de l’ordre des fragments peptidiques
La séquence des fragments peptidiques individuels est déterminé en établissant l’ordre dans lequel ils étaient connectés.
La séquence des acides aminés dans un 1er set de fragments est comparé avec celui d’un 2è set de fragments pour lequel les points de coupure sont différents.
Un recouvrement de quelques résidus est généralement suffisant pour identifier un point de connexion.
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7.7 Détermination des positions des liens disulfures
Fragmentation de la protéine native => mélange de fragments peptidiques, dont certains sont liés par des ponts disulfures
Le mélange peptidique est analysé par électrophorèse sur gel en 2D en utilisant les mêmes conditions de séparation dans les deuxdirections.
Après séparation dans la 1ère direction, la matrice est exposée à l’acide performique pour couper tout les liens disulfures existants.
Ensuite la séparation est effectuée dans la 2è directions. Les fragments qui ne contiennent pas de liens disulfures sont positionnés sur la diagonale puisque leur vitesse de migration dans le deux directions est identique.
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L’électrophérogramme des fragments contenant des liens disulfuresmontrera 2 points pour les fragments produits par oxydation qui sont positionnés on dehors de la diagonale.
Les fragments liés par des ponts disulfures peuvent être isolés du gel et identifiés par séquençage. La séquence des acides aminés est ensuite comparer avec celle de la protéine entière, permettant ainsi l’identification de la position des liens disulfures.