7. genetica microbiana
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INTRODUCCIÓN
La función genética constituye la base de la función celular.
Se necesita de su conocimiento para comprender cómo funcionan los microorganismos.
Los microorganismos sintetizan compuestos y suministran sistemas relativamente simples para el estudio de fenómenos genéticos en otros organismos (humano y animales).
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• Los microorganismos se usan para el aislamiento y duplicación de genes específicos de otros organismos (clonación molecular)
• Los microorganismos pueden someterse a
manipulación genética para aumentar los
rendimientos de procesos industriales en los
que intervienen.
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Los mecanismos de patogenicidad de los
microorganismos son regulados genéticamente. El
conocimiento de su genética permite su control.
El conocer los mecanismos de transferencia de
genes específicos, como los que otorgan la
resistencia a antibióticos entre microorganismos,
sirven para el manejo de transferencia de genes
entre individuos o especies.
CONCEPTOS DE GENÉTICA MICROBIANA
Genética: estudio de la variabilidad y la herencia de las características de un organismo (hombre, animales, plantas y m.o)
Genotipo: se refiere a la dotación total de genes que posee la célula. Representa la capacidad total potencial de la célula
Fenotipo: representa las características por las cuales se expresa el genotipo. Influido por el ambiente.
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GENÉTICA MICROBIANA: CONCEPTOS
Cromosoma: estructura filamentosa del núcleo que contiene los genes
Gen: segmento de cromosoma, unidad de información genética
Gen estructural: codifica cadenas polipetídicas
Gen regulador: actúan activando o deteniendo la actividad de los genes estructurales
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GENÉTICA MICROBIANA: CONCEPTOS
Genoma: serie completa de genes
Mutación: Cambio estable de un gen, transmisible por herencia a los descendientes
Mutante: organismo con un cambio en el genoma
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Nucleótidos(monómeros de losácidos nucleicos)
1. Azúcar tipo pentosadesoxirribosa en ADNRibosa en ARN
2. Bases nitrogenadasPúricas: A y GPirimidínicas: C, T, U
3. Un grupo fosfato: Ortofosfato
La hidrólisis química o enzimática completa de un ácido nucleico (ADN y ARN) da lugar a una mezcla equimolar de:
Material genético: Ácidos nucleicos
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ON
NN
N
NH2
OHOH
CH2
OP-O
O
O-
H
H H
Pentosa Base
NucleósidoFosfato
Nucleótido
OrtofosfatoBase nitrogenada
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N
N
N
NH
1
2
3
4
56 7
8
9
N
N1
2
3
4
5
6
Purinas Pirimidinas
Bases nitrogenadas
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N
N N
NH
NH2
N
HN N
NH
O
H2N
Adenina: 6-amino purina
Guanina: 2-amino 6-oxo purina
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N
N
O
NH2
N
HN
O
O
N
HN
O
O
CH3
Citosina:2-oxo 4-amino
pirimidina
Uracilo:2,4-dioxopirimidina
Timina:2,4-dioxo5-metil
pirimidina
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O N
NN
N
NH2
OH
CH2OP
O-
O N
NN
N
NH2
OH
CH2OP
O-
O N
NN
N
NH2
OH
CH2OP
O-
O
O
O
O
O
O
Polinucleótido
Enlacefosfodiéster
Enlaceb-glicosídico
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O N
N
N
N
NH2
OHOH
CH2OP
O-O
O-
O N
N
N
N
NH2
OHOH
CH2OP
O
O
O-
P
O
O
O-
O N
N
N
N
NH2
OHOH
CH2OP
O
O
O-
P
O
O
O-
P
O-O
O-
Nucleótido polifosfatos
5’-Adenosinamonofosfato, AMP
5’-Adenosinadifosfato, ADP
5’-Adenosinatrifosfato, ATP
DIFERENCIA ENTRE ADN Y ARN
ADN Bicatenario: dos
hebras de nucleótidos
Bases: C, G, A, T Desoxirribosa
ARN Monocatenario:
una sola hebra de nucleótidos
Bases: C, G, A, U Ribosa
ARNm ARNr ARNt
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ADN: BICATENARIO, DOBLE HÉLICE
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Unión de la cadena de nucleótidosUnión de la cadena de nucleótidos
COVALENTE NO COVALENTE
Enlace glucosídico
Puentes dehidrógeno
Enlace Fosfodiester
5’- 3’
1
23
4
5 6
1’
2’
4’
2’
1’ 4’1
23
4
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posiciones en las bases
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La ausencia de enlaces covalentes entre las cadenas complementarias hace posible que el ADN pueda ser manipulado in vitro.
Desnaturalización: Proceso mediante el cual dos hebras se separan cuando se rompen los puentes de hidrógeno
Estructura primaria: secuencia de nucleótidos.
Estructura secundaria: estructura de doble hélice.
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Transferencia de
Información en
Biología
Molecular
Transferencia de
Información en
Biología
Molecular
Dogma CentralDogma Central
Transcripción
Traducción Síntesis de polipéptido
por el RNAm
Retrotranscripción
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2a posición intermedia Aminoácidos
Ala=alanina
Arg=arginina
Asn=asparagina
Asp=aspartato
Cys=cisteína
Gln=glutamina
Glu=glutamato
Gly=glicina
His=histidina
Ile=isoleucina
Leu=leucina
Lys=lisina
Met=metionina
Phe=fenilalanina
Pro=prolina
Ser=serina
Thr=treonina
Trp-triptofano
Tyr=tirosina
Val=valina
U
C
A
G
GGU
GGC
GGA
GGG
GAU
GAC
GAA
GAG
GCU
GCC
GCA
GCG
GUU
GUC
GUA
GUG
G
U
C
A
G
AGU
AGC
AGA
AGG
AAU
AAC
AAA
AAG
ACU
ACC
ACA
ACG
AUU
AUC
AUA
AUG
A
U
C
A
G
CGU
CGC
CGA
CGG
CAU
CAC
CAA
CAG
CCU
CCC
CCA
CCG
CUU
CUC
CUA
CUG
C
U
C
A
G
UGU
UGC
UGA
UGG
UAU
UAC
UAA
UAG
UCU
UCC
UCA
UCG
UUU
UUC
UUA
UUG
U
GA C U
Leu
Phe
Ile
Val
Met
Stop
Cys
Arg
Arg
Ser
Asp
Glu
Asn
Lys
Gln
His
TyrSer
Pro
Thr
Ala
Leu
Gly
TrpStop
1ra posición, extremo 5´ 3a posición, extremo 3´
CODIGO GENETICO
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Met ThrHis Stop
5´ 3´UAG CG G GA U A ACC U
CODIGO GENETICO
GENOMA BACTERIANO
Una sola molécula circular de ADN cerrada covalentemente distribuida en el interior de la célula
No rodeada de membrana nuclear Unido a membrana citoplásmica o
mesosomas
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VARIACIONES GENÉTICAS BACTERIANAS
Caracteres fenotípicos (no heredables) Mediados por la influencia del
medio ambiente externo Abarca a la mayoría de los
individuos de la población Por modificación del medio,
regresa al fenotipo original
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VARIACIONES GENÉTICAS BACTERIANAS
Modificaciones morfológicas Morfología celular: cambia de acuerdo a la
edad del cultivo Modificaciones de cultivo
producción de pigmento: Serratia marcescens produce pigmento rojo ladrillo a temperatura ambiente pero No a 37 °C
Modificaciones en las características fisiológicas y bioquímicas Aumento o producción de penicilinasa por
algunos estafilococos ante la presencia de penicilina 24
Clasificacion de Mutaciones:
No selectivas: se detectan por screening de grandes poblaciones de organismos. Puede ser difícil reconocer los fenotipos mutados, ej. Pérdida del color en una bacteria pigmentada
Selectivas: confiere al mutante una ventaja bajo ciertas condiciones ambientales, ej. Resistencia a antibióticos.
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Algunas mutaciones
Pérdida de movilidad
No cápsula
No esporas
Tipo de colonia
Resistencia a: virus,
determinados antibióticos, a
la temperatura26
BASES MOLECULARES DE LA MUTACIÓN
Mutaciones espontáneas: surgen por errores en la replicación o por acción de agentes naturales como las radiaciones cósmicas.
Pueden ocurrir durante la replicación, como resultado de errores en el apareamiento de bases. (1 cada 106-1010
replicaciones).
Mutaciones sin sentido, la sustitución da origen a un codón de terminación.
Terminación anticipada de la síntesis de la proteína27
BASES MOLECULARES DE LA MUTACIÓN
Mutaciones puntuales : implica una modificacion en un par de bases o unos pocos pares de bases. El resultado en el fenotipo depende de dónde haya sido el cambio en el gen y qué producto codifique.Ej, Triptofano sintetasa en E. coli.
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AISLAMIENTO DE MUTANTES
Filtración (m.o. filamentosos) Medios con antibióticos en
concentraciones letales para cepas silvestres
Exposición a altas temperaturas Exposición a altas concentraciones
de virus virulentos Crecimiento en medios limitados
por una fuente de carbono (ej. Lactosa)
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Mutación del ADN: sustitución (transición, transversión)
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
Daño
Sustitución de un par de bases
GCG ATT TTC AAT CGG ATGCGC TAA AAG TTA GCC TAC
SUSTITUCIONES DE PARES DE BASES
Mutaciones silenciosas: Podría no tener efecto aparente. Ocurren en la tercera base del codón
Mutaciones con sentido erróneo: el sentido químico del triplete ha cambiado si se tienen cambios en la primera o segunda base del codón. La proteína resultante puede ser inactiva o
mostrar actividad reducida Una mutación con sentido erróneo puede
originar una enzima que sea sensible a la temperatura (mutación temperatura-sensible)
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SUSTITUCIONES DE PARES DE BASES
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UAC
CAC UAG UAU
Codón de tirosina
Codón de histidina
Codón de terminación
Codón adicional de tirosina
Proteína defectuosa
Proteína incompleta
Proteína normal
Contrasentido Sin sentido Silenciosa
MUTACIONES POR DESFASE DEL MARCO DE LECTURA
Delecciones o inserciones de bases en el ADN, producen un corrimiento en la lectura del mismo y la traducción del gen resulta alterada.
Se restaura parcialmente la función del gen por la inserción de otra base cerca de la deleccionada, se puede lograr traducir la proteína normal o con cierta actividad biológica.
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Mutación del ADN: desplazamiento del marco de lectura (Inserción)
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
GCG GAT TTG CAA TCG GAT CGC C TA AAC GTT AGC CTA
Daño
inserción de un par de bases
G
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Mutación del ADN: desplazamiento del marco de lectura (deleción)
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
GCG ATT TGC AAT CGG ATGCGC TAA ACG TTA GCC TAC
GCG TTT GCA ATC GGA TGCGC AAA CGT TAG CCT AC
Daño
Pérdida de un par de bases
AT
REVERSIONES
Se presenta cuando una cepa mutante muestra restaurado su fenotipo, que había sido alterado en el mutante.
La mutación restaura el fenotipo por modificación del mismo sitio en el que ocurrió la mutación.
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REVERSIONES
Revertientes de segundo sitio: la mutación ocurre en un sitio diferente del ADN.
* la mutación puede originar otra enzima que puede reemplazar a la mutada usando una vía metabólica diferente de la usada por la cepa mutante
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MUTACIONES DEBIDAS A MUCHOS PARES DE BASES Deleciones: se ha eliminado una
región de ADN. Pueden implicar la pérdida de
cientos o miles de pares de bases. Pueden afectar a varios genes. Pueden ser letales.
Las delecciones no pueden restaurarse por otras mutaciones sino sólo a través de recombinación genética. 38
MUTACIONES DEBIDAS A MUCHOS PARES DE BASES
Inserciones: se añaden nuevas bases al ADN. Microinserciones. Son secuencias específicas de
ADN entre 700-1400 pares de bases.
Translocaciones: largos trozos de ADN que se llevan a una nueva localización.
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SISTEMA SOS
Se activa en respuesta al daño hecho al DNA iniciando procesos de reparación.
Muchas veces el mismo proceso de reparación del ADN origina una mutación.
SOS se activa por daños que aparecen en el ADN.
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Mutágenos Químicos1.- Análogos de bases: 5-Bromo Uracilo = Timina2.- Agentes alquilantes:
A) Mono funcionales: reaccionan con una cadena del ADN: **etilmonosulfonato: CH3 CH2 - O - S (O-O)- CH3
alquila el N de Guanina B) Bifuncionales: reaccionan con las dos
cadenas haciendo difícil la desespirilización del ADN:
**Gas mostaza: Cl-CH2-CH2 -S-CH2CH2-Cl
**Nitrosoguanidina
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Agentes que inducen la mutación
MUTÁGENOS QUÍMICOS
3. Productores de corrimiento de lectura:
*Acridinas. Son agentes intercalantes , se insertan entre dos pares de bases e inducen mutaciones por desfase.
4. Acción química sobre ADN
* Ácido nitroso: desamina bases, cambia AT por GC
* Hidroxilamina: reacciona con citosina forma AT en lugar de CG (tautomería)
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MUTACIÓN POR RADIACIONES
Las radiaciones son altamente mutagénicas. Penetra fácilmente el vidrio y otros materiales.
Radiaciones ionizantes, Rayos X, Rayos Cósmicos, Rayos Gama.
Efecto: ionización del agua y otras sustancias.
Los radicales libres formados (OH) reaccionan con el ADN del m.o, inactivándolo.
Con altas dosis de radiación puede ocurrir la muerte celular.
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MUTÁGENO: RADIACIONES
Radiaciones no ionizantes (electromagnéticas)Son las más usadas en genética microbiana. Ej. Radiación UV.Las bases pirimidínicas y púricas absorben intensamente la radiación ultravioleta. La radiación UV produce:
dimerización de las bases pirimidina, provocando que en la replicación la ARN-polimerasa inserte un nucleótido incorrecto en esa posición. enlaces estables de ADN con proteínas hidratación de citosina
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MUTÁGENOS BIOLÓGICOS Mutagénesis por transportón:
Se produce mediante la inserción de un elemento transponible (bases) dentro de un gen, perdiendo la función del gen. Los elementos transponibles
pueden integrase al cromosoma en varias localizaciones
Bacterófago : puede servir como mutágeno alterando la secuencia del gen en el que se inserte.
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PLÁSMIDOS
Son pequeñas moléculas circulares de DNA que se replican independientemente del cromosoma del hospedador.
No tienen una forma extracelular
Tamaño variable, de 1000 a más de 106 pares de bases.
Está en forma súper enrollada.
Pueden observarse por microscopía electrónica
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PLÁSMIDOS
Se replican en forma similar al cromosoma, ocurre muy rápidamente.
La entrada de un segundo plásmido a la célula puede ser “incompatible” por lo que se pierde en la segunda replicación.
A veces pueden eliminarse de la célula hospedadora: “curación”. Se utilizan colorantes de acridina para aumentar el efecto.
Transferencia del plásmido de una célula a otra por contacto o Conjugación.
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PLASMIDO VECTOR
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RECOMBINACIÓN GENÉTICA
Proceso por el cual los elementos genéticos de dos células diferentes se reúnen en una sola unidad.
Transformación: el ADN libre es insertado directamente en una célula receptora
Transducción: implica la transferencia de ADN bacteriano a otra dentro de un virus o de una partícula viral defectuosa
Conjugación: transferencia de ADN mediante un contacto célula-célula entre la receptora y la donadora, por medio de pilis.
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TRANSFORMACIÓN (ADN LIBRE ES INSERTADO DIRECTAMENTE EN UNA CÉLULA RECEPTORA)
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TRANSDUCCIÓN TRANSFERENCIA DE ADN BACTERIANO A OTRA DENTRO DE UN VIRUS
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CONJUGACIÓN transferencia de ADN mediante un contacto célula-célula
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Inició su desarrollo en la década de los 70s. Con esta tecnología, se pueden aislar los genes, manipularlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.
INGENIERÍA GENÉTICA
INGENIERIA GENÉTICA
Clonación: consiste en extraer un gen de su genoma de origen (cromosoma o plásmido) e insertarlo en un vehículo adecuado (fago o plásmido) para pasarlo a otra célula viva.
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En la genética, clonar es multiplicar idénticamente un gen o un trozo de ADN. Los individuos que se forman a partir de la clonación resultan ser idénticos o casi idénticos.
Forma de reproducción asexual entre individuos genéticamente idénticos.
CLONAR
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REPRODUCCION ASEXUAL
Es cualquier método de reproducción que no implique fecundación (poca variabilidad genética).
El nuevo individuo deriva de células somáticas del progenitor.
Sólo intervienen procesos mitóticos. Los individuos nuevos son muy
semejantes al progenitor. Pueden surgir a partir de un fragmento
de él o a partir de una sola célula.
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PRINCIPALES TIPOS DE REPRODUCCIÓN ASEXUAL
BIPARTICION =SIMPLE DIVISIÓN, =FISIÓN.
GEMACION =YEMACIÓN. DIVISIÓN MÚLTIPLE
=FRAGMENTACIÓN=ESCISIÓN. ESPORULACION
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MÉTODOS DE CLONACIÓN
Hay dos métodos: Natural y artificial.
Natural: Es la que se produce por la propia naturaleza. Un ejemplo es el caso de dos gemelos que provienen de un óvulo fecundado pero que en sus primeras etapas de desarrollo se divide en dos individuos idénticos.
Artificial: Se manipula el material genético y se crea un nuevo ser.
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Clonación Artificial : Es una técnica basada en la transferencia nuclear, en la que participan dos células; la que dona su material genético y la que lo acepta. Esta última suele ser un ovocito al que se le ha extraído sus cromosomas que se encuentran en el citoplasma.
Clonación de Organismos: Es crear un nuevo organismo con la misma información genética. Es un método de reproducción asexual, donde la fertilización no ocurre.
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Clonación Molecular: proceso de aislar una secuencia de ADN de interés, insertarlo en un plásmido y obtener múltiples copias de ella en un organismo (generalmente procariota) por acción de la DNA polimerasa.
CLONACIÓN ARTIFICIAL
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POR QUÉ ES POSIBLE CLONAR Se planteó con el descubrimiento del ADN
y el conocimiento en la trasmisión y expresión de la información genética.
Todos los individuos están formados por millones de células las cuales contienen ADN. Todas ellas derivan de una principal llamada zigoto. Éste contiene toda la información del nuevo ser la cual se transformará en otro ser.
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Fragmentación: El ADN de interés necesita ser fragmentado para proveer un segmento de un buen tamaño de ADN. La preparación de los fragmentos para la clonación se obtiene frecuentemente del PCR, pero también puede hacerse por medio de la digestión con enzimas de restricción y a veces fraccionando con electroforesis en gel.
La clonación de cualquier secuencia de ADN incluye los siguientes pasos:
Ligación: El fragmento amplificado se inserta en un vector. Dicho vector (que generalmente es circular) se convierte en una secuencia lineal utilizando enzimas de restricción, y es incubado con el fragmento de interés bajo las condiciones apropiadas con una enzima llamada ADN ligasa.
Transfección: Después de la ligación, el vector con el gen de interés se transfecta a una célula, mediante la electroporación.
Selección: Finalmente, las células transfectadas se cultivan y son identificadas las colonias de las células que han sido exitosamente transfectadas con el vector que contiene el gen deseado.
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Bibliotecas Genómicas
• Es el set completo de miles de clones plásmidos recombinantes, cada uno con una copia de un segmento particular del genoma inicial.
• Vectores: Plásmidos, bacteriófagos.
Biblioteca de
plasmidos
PRODUCTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
1. Fermentaciones microbianas Producción de antibióticos Mayores rendimientos Antibióticos modificados
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PRODUCTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
2. Vacunas virales Clonación de genes de la envoltura
proteica del virus y expresarlos en bacterias Antígeno de la superficie del virus de
la hepatitis B glucoproteína G del virus de la rabia Hemaglutinina del virus de la influenza Envoltura del virus de la
inmunodeficiencia humana SIDA
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PRODUCTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
3. Proteínas de mamíferos Proteínas sanguíneas
Activador del plasminógeno factores VII, VIII y IX Eritropoyetina (anemia)
Hormonas Insulina crecimiento paratiroidea β-endorfina
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PRODUCTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
4. Plantas transgénicos Jitomate, tabaco, soya, alfalfa,
algodón, lechuga Álamo, castaño y manzano
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Se limitan principalmente a la resistencia a herbicidas o a determinados patógenos y pestes. En varios países hay millones de hectáreas cultivadas con plantas modificadas genéticamente, tales como: frijol de soya (Glycine max), algodón (Gossypium hirsutum), tabaco, papa y maíz, en Estados Unidos (en 1999, 8.7 millones de hectáreas), Argentina (6.7 millones de hectáreas), Canadá (4 millones de hectáreas), China (0.3 millones de hectáreas).
MODIFICACIONES GENETICAS EN VEGETALES (Primera Generación)
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ARROZ con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora.ARROZ fortificado con un gen de la ferritina del frijol de soya. TOMATE Flavor Savor (ADN con gen de la poligalacturonasa que degrada las pectinas en la maduración). TOMATE con tres veces y medio de beta caroteno.
ALIMENTOS DE MEJOR CALIDAD2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS
PRODUCTOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
5. Biotecnología ambiental genes para degradación de:
plaguicidas clorados clorobencenos naftaleno tolueno
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• Producción de polímeros de ácidos grasos (estólidos), componentes de fluidos hidráulicos, epoxy o derivados acetilénicos, componentes de pinturas y recubrimientos.
• Canola con detergente (de alto ácido laúrico) para uso industrial y otras variedades para producir polihidroxibutirato para plásticos biodegradables.
• Frijol de soya con ácido oleico incrementado para huevo de gallina.
INDUSTRIA Y MEDIO AMBIENTE2a. GENERACIÓN DE TRANSGÉNICOS
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• Maíz con aprotinina (polipéptido serina inhibidor de proteasis, reduce hemorragias y la necesidad de hemotransfusiones) para la industria farmacéutica.
• Frijol de soya con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV).
• Tabaco con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.
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• Xenotransplantes en cerdos: inactivación del gen 1,3 galactosil transferasa, disminución de la expresión del gen antiVCAM, y transferencia del gen humano de anticoagulación.
• Producción de proteína C humana en leche de cerdos, para tratar desórdenes como hemofilia.
• Expresión de precursor de la hormona de crecimiento proteasa resitente en tejido de músculo de cerdo.
• Secresión de hormonas de crecimiento humano en tejido seminal de cerdo.
• Producción de lisostafina en glandulas mamarias de ratones que previene mastitis por S. aureus.
6. MODIFICACIONES GENETICAS EN ANIMALES
La principales investigaciones en CLONACIÓN TERAPÉUTICA HUMANA van dirigidas a conseguir tejidos para trasplante a personas adultas, MEDICINA REPARADORA, obviando el riesgo de rechazo.
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