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公募研究：2000, 2003～2004年度

喘息の感受性遺伝子の多変量解析的アプローチ

●鈴木洋一

千葉大学大学院医学研究院公衆衛生学（旧：東北大学大学院医学研究科遺伝病学分野）

〈研究の目的と進め方〉本研究の目的は、小児並びに成人の喘息の疾患感受性

遺伝子の同定と同定された複数の遺伝子多型から、喘息発症のリスクをどの程度まで推定できるのかを明らかにすることである。

申請期間中に日本人のコントロール、小児喘息、成人喘息(アトピー型)の各群300例以上の検体を用い、これまで喘息と関連があると報告された、またはこの期間中に報告されるであろう新たな遺伝子を含め、約50遺伝子多型を目標に解析を行う。個人ごとに複数の喘息感受性遺伝子の一塩基多型（SNP）と繰り返し多型等を決定し、多変量解析の手法を用いて、喘息発症リスクの予測に有用な遺伝子多型の組み合わせと相互作用を明らかにし、その遺伝子多型組み合わせから、リスク予想がどの程度まで可能か評価する。

〈研究開始時の研究計画〉(1) 12番染色体における連鎖解析からの新規喘息感受性

遺伝子同定12番染色体上、特に12q14から12q24.1の領域の遺伝

子が、日本人小児の喘息とアトピー素因の病態に関与しているか否かを明らかにする。そのために、日本人小児の喘息患者とその家族、両親の12番染色体上のマイクソサテライトマーカーと候補遺伝子内の一塩基置換多型（SNP）を調べ、疾患と有意の連鎖または関連を示すかを調べる。15才未満発症の喘息またはアトピーを示す患者を対象発端者とし、本人と家族の末梢血を採取する。喘息の病型としてはアトピー型を対象にする。相関研究の対照には小児期の喘息、アトピー性皮膚炎の既往のない成人ボランティアを用いる。アトピー素因の確認と血清IgE値と遺伝子領域との量的形質遺伝子座マッピング法による連鎖解析のため、非特異的IgEとヤケヒョウダニ、猫のふけ、カンジダなどに対する特異的IgEを測定する。候補遺伝子アプローチとしてインターフェロンγ、STAT6、ステムセルファクター、アセチルCoAカルボキシラーゼなどSNPまたはマイクロサテライトマーカーを利用し連鎖、相関が疾患との間に存在するかの検定を行う。12番染色体をカバーするResearch Genetics 社のプライマーセットを用いて、これまで報告された領域が本研究の対象患者でも有意の連鎖を示すかを確認する。

(2) 候補遺伝子アプローチによる、新規喘息感受性遺伝子の同定大阪地区の症例（小児喘息約400例、成人喘息約500

例、成人コントロール約600例）を利用し、自然免疫系に関係する遺伝子を中心にSNPについての症例対照研究を行う。候補遺伝子としては、補体（C3、C5、C3R、C5ARなど11遺伝子）、Toll-like receptors (TLRs:7遺伝子)、TLRとサイトカインのシグナル伝達系の分子（Myd88、RIP2、IRAKM、TRAFなど15遺伝子）、IgE受容体、サイトカイン・ケモカインとその受容体

（22遺伝子）、炎症のメディエータとその受容体

(CYSLT1、CYSLT2など7遺伝子)、プロテアーゼ（Serpna1、MMP9など4遺伝子）のSNPなどのタイピングを行い、単独 SNP、ハプロタイプレベルの相関解析を行う。

(3) 複数感受性遺伝子の遺伝子相互作用の検討(2)で検討した遺伝子について、SNP、ハプロタイプ

レベルでの、相互作用のスクリーニングを行う。相互作用の検出には、２つの遺伝子のペアについて、一方の遺伝子の多型（SNPまたはハプロタイプ）による層化をする前後の遺伝子多型テーブルの分布をχ2乗適合度検定を行い、P

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意に低かった（Pc=0.030）。この多型が他の人種集団においても，疾病と相関しているとの報告があり。NOS1は人種をこえた喘息感受性遺伝子であると思われた。本研究から、日本人の集団において、STAT6とNOS1遺伝子座の小児喘息との相関と、12q24.23から12q24.33までの領域と喘息との連鎖が示唆された。

(2) 候補遺伝子アプローチによる、新規喘息感受性遺伝子の同定これまで70を超える候補遺伝子を調べたが、10遺伝

子は小児喘息との相関を示し、9遺伝子は成人喘息との相関を示した。以下に論文として発表したものを中心に要約する。

喘息モデルマウスにおいて、Ca2+依存性Cl-チャネルファミリーに属するgob-5遺伝子が喘息の病態に関与していることが報告されている。ヒトのgob-5ホモログと考えられているhCLCA1 (human chloridechannel, calcium activated, family member 1)遺伝子の検討を行った2。日本人におけるhCLCA1遺伝子の一塩基多型 (single- nucleotide polymorphism: SNP)のスクリーニングにおいて見つかったSNPの中から8つのSNPを選び、相関研究を行った。その結果、ハプロタイプ解析において、コントロール群と小児喘息群、コントロール群と成人喘息群それぞれにおいて、ハプロタイプ全体の頻度分布の偏りを認めた (それぞれP

〈0.0001、P＝0.0031)。また、小児喘息となるリスクを下げるハプロタイプ (P＝0.00010)と、小児喘息となるリスクを上げるハプロタイプ (P＝0.0014)を認めた。

気道の過敏性を中心とする喘息の病態にC3、C3a受容体、C5などの補体系が関与していることが示唆されている。我々は、これらの遺伝子の多型が喘息発症のリスクに関係しているかどうかを明らかにするため、C3、C5、C3a受容体 (C3AR1)、C5a受容体 (C5R1)の遺伝子の一塩基多型 (SNP)を検索し、喘息発症に与える影響について検討した3。SNP単独では、C3 4896C/Tとアトピー性小児喘息 (P＝0.0078)、成人喘息 (P＝0.010)との相関が認められた。そして、喘息群を高IgE群に絞った場合に、C3 4896C/Tと成人喘息 (P＝0.0016)との相関がより明らかに認められた。また、喘息群のみを用いた相関研究において、C3AR1 1526G/Aと小児喘息の重症度との相関も認められた (P＝0.0057)。C3では、小児喘息 (P＝0.0021)、成人喘息(P＝0.0058)の発症リスクを上げるハプロタイプの存在が明らかになり、成人喘息 (P＝0.00011)の発症リスクを下げるハプロタイプの存在が明らかになった。C5では、小児喘息 (P＝1.40×10-6)、成人喘息 (P＝0.00063)の発症リスクを下げるハプロタイプの存在が明らかになった児喘息の発症時期に関与していることを認めた(P＝0.019)。

喘息の罹患同胞対解析で、最も連鎖が強く、再現性の高い結果を示しているのが、5q31-33領域である。この領域はIL-4、IL-13などのサイトカインクラスターや、喘息の病態に関連しそうな遺伝子が集積している。IL-12B遺伝子はこの領域にあり、IL-12がT細胞の分化に関係する重要なサイトカインであることから、候補遺伝子として検討を行った。IL-12B遺伝子とそのプロモーター領域から、13個の遺伝子多型を同定した。それらの多型について、小児喘息、成人喘息との相関を検討したところ、3’非翻訳領域の10841C>A多型が小児喘息との相関があった（P= 0 . 0 0 0 6 2）。また-6415CTCTAA/GCは、単独では、小児喘息との相関は弱かったが（P=0.051）、これら2つの多型で形成され

る ハ プ ロ タ イ プ は 疾 患 と の 強 い 相 関 を 示 し た(P=0 .00078)。10841C>AはmRNAの安定性に、-6415CTCTAA/GCは転写活性に影響を与えることが、実験的に証明され、この2つの機能的多型は小児喘息の発症と関わっていることが示唆された。

TLRsの検討では、小児喘息と強い相関を示すものが見つかっているが、現在、多型の機能に与える影響を検討中である。TLRのシグナル伝達系分子の遺伝子IRAKMとSIGIRRについて、小児喘息ないし成人喘息との相関を検討したが、有意な相関はなかった4。RIP2についても、喘息発症との強い相関見出せなかった5。

(3) 複数感受性遺伝子の遺伝子相互作用の検討これまで検討してきた、複数の遺伝子間の相互作用

があるかどうかを検討したところ、IL-4とKIF3の強い相互作用が示唆されたが、これは、機能的な相互作用ではなく、遺伝子座が近く、同じLDブロック内に存在し、ある特定のハプロタイプが疾患と相関を示しているためであった。機能的な相互作用（P

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〈今後の課題〉更なる疾患感受性遺伝子の発掘が必要であるが、症例

対照研究においては、患者や対照の環境要因を解析に含めることが感度と疾患発症予想の成績を上げるため必要であると考えられ。環境要因、中間表現型などの情報をもった新たなサンプルの収集が望まれる。

〈研究期間の全成果公表リスト〉1. Shao, C., Suzuki, Y., Kamada, F., Kanno, K., Tamari, M.,

Hasegawa, K., Aoki, Y., Kure, S., Yang, X., Endo, H.,Takayanagi, R., Nakazawa, C., Morikawa, T., Morikawa,M., Miyabayashi, S., Chiba, Y., Karahashi, M., Saito, S.,Tamura, G., Shirakawa, T. & Matsubara, Y., Linkage andassociation of childhood asthma with the chromosome12 genes, J Hum Genet, 49, 115-122 (2004).

2. Kamada, F., Suzuki, Y., Shao, C., Tamari, M., Hasegawa,K., Hirota, T., Shimizu, M., Takahashi, N., Mao, X.Q.,Doi, S., Fujiwara, H., Miyatake, A., Fujita, K., Chiba, Y.,Aoki, Y., Kure, S., Tamura, G., Shirakawa, T. &Matsubara, Y., Association of the hCLCA1 gene withchildhood and adult asthma, Genes Immun, 5, 540-547(2004).

3. Hasegawa, K., Tamari, M., Shao, C., Shimizu, M.,Takahashi, N., Mao, X.Q., Yamasaki, A., Kamada, F.,Doi, S., Fujiwara, H., Miyatake, A., Fujita, K., Tamura,G., Matsubara, Y., Shirakawa, T. & Suzuki, Y., Variationsin the C3 , C3a receptor, and C5 genes affectsusceptibility to bronchial asthma, Hum Genet, 115, 295-301 (2004).

4. Nakashima, K., Hirota, T., Obara, K., Shimizu, M., Jodo,A., Kameda, M., Doi, S., Fujita, K., Shirakawa, T.,Enomoto, T., Kishi, F., Yoshihara, S., Matsumoto, K.,Saito, H., Suzuki, Y., Nakamura, Y. & Tamari, M., Anassociation study of asthma and related phenotypes withpolymorphisms in negative regulator molecules of theTLR signaling pathway, J Hum Genet, in press (2006).

5. Nakashima, K., Hirota, T., Suzuki, Y., Matsuda, A.,Akahoshi, M., Shimizu, M., Hasegawa, K., Jodo, A., Doi,S., Fujita, K., Ebisawa, M., Yoshihara, S., Enomoto, T.,Shirakawa, T., Obara, K., Kishi, F., Nakamura, Y. &Tamari, M., Association of the RIP2 gene with childhoodatopic asthma, Allergology International, in press,(2006).

6. Tamari, M., Hirota, T., Hasegawa, K., Obara, K.,Matsuda, A., Akahoshi, M., Nakashima, K., Doi, S.,Fujita, K., Suzuki, Y., Nakamura, Y. & Shirakawa, T.,Association between ADAM33 polymorphisms and adultasthma in the Japanese population, Clin Exp Allergy, inpress, (2006).

7. Hirota, T., Suzuki, Y., Hasegawa, K., Obara, K., Matsuda,A., Akahoshi, M., Nakashima, K., Cheng, L., Takahashi,N., Shimizu, M., Doi, S., Fujita, K., Enomoto, T.,Ebisawa, M., Yoshihara, S., Nakamura, Y., Kishi, F.,Shirakawa, T. & Tamari, M., Functional haplotypes of IL-12B are associated with childhood atopic asthma, JAllergy Clin Immunol, 116, 789-795 (2005).

8. Tomita, Y., Tomida, S., Hasegawa, Y., Suzuki, Y.,Shirakawa, T., Kobayashi, T. & Honda, H., Artificialneural network approach for selection of susceptiblesingle nucleotide polymorphisms and construction ofprediction model on childhood allergic asthma, BMC

Bioinformatics, 5, 120 (2004).9. Hirota, T., Obara, K., Matsuda, A., Akahoshi, M.,

Nakashima, K., Hasegawa, K., Takahashi, N., Shimizu,M., Sekiguchi, H., Kokubo, M., Doi, S., Fujiwara, H.,Miyatake, A., Fujita, K., Enomoto, T., Kishi, F., Suzuki,Y., Saito, H., Nakamura, Y., Shirakawa, T. & Tamari, M.,Association between genetic variation in the gene fordeath-associated protein-3 (DAP3) and adult asthma, JHum Genet, 49, 370-375 (2004).

10. Tomida, S., Hanai, T., Koma, N., Honda, H., Suzuki, Y.& Kobayashi, T., Artifical Neural Network predictivemodel for allergic disease using single nucleotidepolymorphisms data, J Biosci Bioeng, 93, 470-478 (2002).