6.PROCESODECALIBRACIÓN.RESUMEN(Figura3.5)

1.Ajusteconfiltrototal.Medianteunfiltrodeabsorcióntotal,seinterfierelaradiaciónprocedentedelalámparadeformaquenoalcancealdetectorelectrónicosituadodespuésdelacubeta.Enestasituaciónlaescaladetransmitanciadeberíamarcarel0%,denoserasísedebeajustar.

2.Lecturadel“blanco”.Colocamosun“blanco”yobservamosquelatransmitanciaobtenidanoesdel100%,estosedebealapequeñaabsorcióndeluzporpartedelaguaydelosposiblesreac[vosquecontengael“blanco”.Enestasituacióndeberemosajustarel100%detransmitancia(cerode

absorbancia).

3.Lecturadelaabsorbanciadelasoluciónpatrón.Medianteunacubetaquecontengaunadisoluciónpatróndeconcentraciónconocida,seleeelvalordeabsorbanciaquelecorresponde(Ap).

4.Lecturadelaabsorbanciadelamuestra.Colocandounacubetaquecontengalamuestra,seprocedealeerelvalordeabsorbanciaquelecorresponde(Ax).

FIGURA3.5Procesodecalibración.Resumen.

Algunos ejemplos del texto:

Losespectrofotómetrosdedoblehazenel[empoposeenunosinterruptoresluminosos(figura5.12),quealcerrarseconsiguen reflejarelhazensen[docontrarioaldelhazincidenteobligándoleapasarporlacubeta,

mientras que cuando el interruptor permanece abierto, el haz lo atraviesa haciendo que derive hacia el detector sin pasar por la cubeta. El ciclo de apertura y cierre del interruptor se repite en el [empo enviando

alterna[vamenteloshacesproblemayreferenciahaciaeldetector.Laexistenciadeunespejosemiplateadopermitequesereflejeysetransmitalaradiación.

Obsérvesequelosespejosplanosnotransmitenradiación,sólolareflejan,mientrasquelosespejossemiplateadosreflejanlaradiaciónquelesllegaporelotrolado.

FIGURA5.11Espectrofotómetrodedoblehazenelespacio.

10mg1L

·1g

103mg·

106μg1g

·1L

103m L= 10μg /m L

10.UNEJEMPLO:DETERMINACIÓNDELARIBOFLAVINAENDISOLUCIÓNACUOSA

Seprocederásegúnlossiguientespasos:

1)Soluciónestándar:disolver10mgderiboflavina*(8)en1litrodedisolucióndeácidoacé[coal1%.(conservarenlugarsecoyoscuro).

2)Cálculodelaconcentracióndeladisoluciónestándar:

3.Preparacióndeladiluciónseriada:preparar9tubosquecontengan0,5mLdeaguacadaunoysituarlosenserie,añadir0,1mLdesoluciónstandardauntuboquecontenga0,9mLdeagua(tubonº1)conloquesu

FIGURA6.8Fluorímetrodedoblehaz.

3.CROMATOGRAFIADEPAPEL

Eslamásan[guadetodaslastécnicascromatográficas*(3).Laseparacióndelassustanciassellevaatérminosobreunostrozosdepapeldefiltroespecialmentediseñados.El

papeldefiltroestácons[tuidoporfibrasdecelulosahúmedas.

Graciasalaexistenciadelfenómenodelapar[ción,lassustanciasserepartenentrelasfibrasdecelulosadelpapelyeldisolventequeseviertesobreellas,apareciendoel

llamadocromatogramaoconjuntodesustanciasseparadassobreelpapel.

Procederemosdelmodosiguiente:conunamicropipetasedepositalamuestrasobreelpapel,éstesesujetaver[calmenteenunsoportemetálicoespecial,(figura14.2).En

elfondodelacubetaseencuentraeleluyentequeporcapilaridadimpregnaráalpapelemigrandohaciasuextremosuperior.

Elpapelpuedeadoptarformasytamañosdis[ntos,porejemplopuedeserdeformacircular(disco),rectangular([ra)oenformadehoja.

Silassustanciasseparadasaparecendecolor,quedaránperfectamentediferenciadasunasdeotras,peroenelcasoderesultarincolorassetendráquerecurriraalgunadelas

siguientesopciones:

1)Lámparadeluzultravioletaqueprovocalafluorescenciadealgúncomponentedelasustanciaseparada.

2)Tinciónconcolorantes:usaremoseladecuadoparacadacaso.Porejemploconnihidrinaal0,1%se[ñendecolorazul-moradolosaminoácidosyotrassustancias.Conel

kalatodeanilinase[ñenlosazúcaresetc.

Separacióndeaminoácidosporcramatogralaenpapel:

Describamosunejemplodecromatograladepapel.Enprimerlugaru[lizaremoscomofasemóvil,lacons[tuidaporlossiguientescomponentes:

1)ácidoetanoico............4partes(envolumen)

2)1-butanol...............…..1parte

3)agua....................…….5partes

Ensegundolugaru[lizaremoscomofaseestacionariapapeldefiltroconagua.

Unavezobtenidoelcromatograma,pulverizaremosconnihidrinayobservaremosdecolorpúrpura,lasmanchas(spots),correspondientesalosdis[ntosaminoácidos.

FIGURA14.2Cromatograladepapel.

4.SOUTHERNBLOTTING

Fuedescritaen1975porSouthern.Deformaesquemá[caconsisteenlossiguientespasos,(figura17.5):

1)ExtraccióndeDNAyfragmentaciónconenzimasderestricción

2)Separacióndelosfragmentosporelectroforesisengel(vercapítulo12)

3)Transferencia(blo+ng)*(5)aunamembranainerteofiltro(denylononitrocelulosa)mediantecapilaridadoporaplicacióndeuncampoeléctrico.Latransferenciasehaceporque

losgelessonmuydelicadosynosepuedenmanipular.

4)Desnaturalización

5)Hibridaciónconsonda

6)Revelado

7)Observacióndirectamediantemicroscopiodondegeneralmenteseobservanzonasconfluorescenciadebidaalmarcadorquepreviamentesehaunidoalasonda.

Figura17.5Southernblopng.

1)Unbuenanfolitodebeposeer:

a.granpoderdeamor[guación

b.conduc[vidadeléctricauniformeyconstante

c.bajaabsorbanciaalasradiacionesUV

d.todassonciertas

2)ParaobtenerungradientelinealdepHenelectroforesisporisoelectroenfoque,el[empoóp[moesde:

a.1minuto

b.1hora

c.1segundo

d.24horas

3)Paraanularelefectoplateau,podemosoptarpor:

a.usodeinmobilinas

b.aplicarelanfolitodurante24horas

c.usodeunaanfolinasinmás

d.usodeunamezcladeácidosdébilesypép[dossinmás

Ejemplo de preguntas tipo test:

Respostescorrectes:1d-2b-3a

PROBLEMAS

1)Calcularelnúmerodeampliconesobtenidosteóricamentealfinaldelciclo24deunensayoconPCR.

2)Calcularelnúmerototaldeproductosteóricosobtenidosalfinaldelciclo25deunensayoconPCR.

3)Calcularelnúmerodeproductossecundariosobtenidosteóricamentealfinaldelciclo150deunensayoconPCR.

Ejemplo de problemas planteados:

1)

Númerodeamplicones=(2n-2n)x=(224-2·24)·1=16777168

2)

Productostotalesteóricos=2nx=225·1=33554432

3)

Productossecundarios=x(2n–2)=1(2·150-2)=298

Soluciones de los problemas:

CONTENIDOS

Fundamentosdelisoelectroenfoque

Conceptodeanfolito

Propiedadesdelosanfolitos

Metodologíadelisoelectroenfoque

Aplicacionesdelisoelectroenfoque

Electroforesisdeflujolibre.Fundamentos

Descripcióndelequipo

Factoresparalaop[mizacióndelaelectroforesisdeflujolibre

Aplicacionesdelaelecxtroforesisdeflujolibre

Inmunoelectroforesis.Fundamentosyaplicaciones

OBJETIVOSESPECIFICOS

Comprenderelprincipiogeneraldelisoelectroenfoque

Describirlosdis[ntos[posdeanfolitosysupreparación

Conocerelalcanceylasaplicacionesdelisoelectroenfoque

Comprenderelprincipiodelaelectroforesisdeflujolibre

Saberlosfactoresquemodificanlosresultadosdelatécnica

Saberlasaplicacionesdelaelectroforesisdeflujolibre

Comprenderelfuncionamientodelainmunoelectroforesis

Ejemplo de descripción de contenidos y objetivos específicos:

CRITERIOSYACTIVIDADESDEEVALUACION

Seproponeestablecerunaac[vidaddevaloracióndelprocesodeenseñanzayaprendizajedesarrolladoenestaunidad,enrelacióna:

• Explicarelfuncionamientodelisoelectroenfoque,haciendoénfasisenlasdiferenciasfundamentalesconlaelectroforesisconvencional.

• Sabercualeslafinalidaddeunanfolitoyelaborarunlistadodelasclasesdeanfolitosmásu[lizadosresaltandosusdiferencias.

•Conocerlasventajaseinconvenientesmásimportantesentreelisoelectroenfoqueylaelectroforesisconvencional.

•Describirencorrectoordenlospasosaseguiralponerenprác[calatécnicadelisoelectroenfoque.

•Describirlascondicionesóp[masquedebencumplirlosanfolitos.

• Elaborarunlistadodeaplicacionesclínicasdelisoelectroenfoque.

•Describirlaspartesysuscome[dosencuantoaloselementosquecomponenunequipodeelectroforesisdeflujolibre.

• Saberlametodologíaaseguirenlatécnicadelaelectroforesisdeflujolibre.

•Relacionarlosfactoresqueintervienenenlaop[mizaciónderesultadosalaplicarlaelectroforesisdeflujolibre.

•Conocerlasaplicacionesclínicasdelaelectroforesisdeflujolibre.

•Conocerelfuncionamientodelainmunoelectroforesis,consusvariantesysusaplicacionesprác[cas.

PROPOSICIÓNDEACTIVIDADDEREFUERZO

Contestardetalladamentealassiguientespreguntas:

1)¿Enquéconsisteelllamadoefectoplateau?¿Dequémanerassepuedesolucionar?

2)¿Cómosepuededeterminarelángulodedeflexión?¿Quéu[lidad[enesabersuvalor?

3)¿Cuáleslamisióndelllamado“carrierbuffer”?

4)¿Quépropiedadesdebetenerunbuenanfolito?

5)¿QuérelaciónexisteentreelgradientedepHdeunanfolitoyelpIdeunelementoaseparar?

6.¿Porquéenelisoelectroenfoquenoexisteelproblemadeladifusión?

7.¿Enquéconsistelainmunoelectroforesisenhusoo“rocket”?

Ejemplo de algunos criterios y actividades de evaluación: