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I.- INTRODUCCIÓN
Las Infecciones del Tracto Urinario constituyen un problema de salud a escala mundial y
representa la más común de las etiologías extraintestinales ocasionadas por Escherichia coli,
que a su vez, es la principal causa de la enfermedad. El proceso de infección tiene lugar a
partir de un prerrequisito esencial que es la adhesión bacteriana a receptores específicos del
uroepitelio; además, estas cepas con el transcurso del tiempo y por abusos de antibióticos,
han presentado resistencia a antimicrobianos, esto, por la diseminación de los genes de
resistencia que es común que se localicen en plásmidos, los cuales tienen la capacidad de
transferirse de una cepa bacteriana a otra mediante el proceso de conjugación, mecanismo
que incluso puede ocurrir entre bacterias de diferentes género. Es conocido que las
enfermedades que disminuyen las defensas del individuo lo predisponen a infecciones por
organismos oportunistas.
El propósito de este proyecto será el estudio y comparación de cepas de E. coli aisladas de
orina de pacientes con VIH, con respecto a pacientes inmunocompetentes. Es interés de
este proyecto conocer si estas dos poblaciones de cepas poseen factores de virulencia
similares, y si el análisis de variabilidad genética permite encontrar polimorfismos
específicos relacionados con su virulencia.
1
II. ANTECEDENTES
2.1 Virus de la Inmunodeficiencia humana (VIH) Taxonomía, historia y epidemiología
El VIH (acrónimo de Virus de Inmunodeficiencia Humana) es el agente infeccioso
determinante del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). Según el Comité
Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV) el VIH se incluye en el género Lentivirus,
encuadrado en la subfamilia Orthoretrovirinae de la familia Retroviridae.
Fue descubierto e identificado como el agente de la naciente epidemia de SIDA por el equipo
de Luc Montagnier en Francia en 1983. El virión es esférico, dotado de una envoltura y con
una cápside proteica. Su genoma en una cadena de ARN monocatenario que debe copiarse
provisionalmente a ADN para poder multiplicarse e integrarse en el genoma de la célula que
infecta. Los antígenos proteicos de la envoltura exterior se acoplan de forma específica con
proteínas de la membrana de las células infectables, especialmente de los linfocitos T4.
El proceso de conversión de ARN en ADN es una característica principal de los retrovirus y
se lleva a cabo mediante acciones enzimáticas de transcriptasa inversa. Con la
demostración de la existencia de la transcriptasa inversa, se inició, en la década de 1970 la
búsqueda de los retrovirus humanos, que permitió el aislamiento en 1980 del virus de la
Leucemia de células T del adulto, HTLV-I. (Heeney y cols 2006)
El VIH tiene un diámetro de aproximadamente 100 nanómetros. Su parte exterior es la
"cubierta", una membrana que originalmente pertenecía a la célula de donde el virus
emergió. En la cubierta se encuentra una proteína del virus, la gp41, o "glicoproteína
transmembrana". Conectada a la gp41 está la gp120, la cual puede unirse al receptor CD4
localizado en la superficie de los linfocitos T para penetrar en ellos. El núcleo tiene la
"cápside", compuesta por la proteína p24. En su interior está el ARN, la forma de información
genética del VIH.
En diciembre de 2006, de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, había 39,5
millones de personas con VIH en el mundo, de las cuales 24,7 millones vivian en África
Subsahariana. (Jannsen-Cilag,2008)
2.2 Formas de transmisión del VIH
Hasta el momento, sólo se han demostrado y documentado tres formas de transmisión:
Sexual. (Acto sexual sin protección). El contagio se produce por el contacto de secreciones
infectadas con la mucosa genital, rectal u oral de la otra persona.
Parenteral (por sangre). Es una forma de contagio a través de jeringuillas contaminadas que
se da por la utilización de drogas intravenosas o cuando los servicios sanitarios, como ha
ocurrido a veces en países pobres, no usan las mejores medidas de higiene. También en
personas, como hemofílicos, que han recibido una transfusión de sangre contaminada o
productos contaminados derivados de la sangre; y en menor grado trabajadores de salud
que estén expuestos a la infección en un accidente de trabajo como puede ocurrir si una
herida entra en contacto con sangre contaminada; también durante la realización de
piercings, tatuajes y escarificaciones.
Vertical (de madre a hijo). El contagio puede ocurrir durante las últimas semanas del
embarazo, durante el parto, o al amamantar al bebé. De estas situaciones, el parto es la más
problemática. Se puede tratar a la madre con antivirales en torno al parto para reducir
considerablemente la probabilidad de contagio del bebé (a menos del 1%). (Donegan y cols
1990)
2.3 Mecanismo de infección y replicación del VIH
Las células que el VIH invade son esencialmente los linfocitos T CD4+, pero también en
menor medida los monocitos/macrófagos, las células dendríticas, las células de Langerhans
y las células de microglía del cerebro. La replicación viral por lo tanto tiene lugar en tejidos
diversos (de ganglios linfáticos, intestino, cerebro, timo, etc). Los órganos linfoides, sobre
todo los ganglios linfáticos, constituyen la principal sede de su replicación. El virus está
presente en numerosos líquidos del organismo, en particular la sangre y las secreciones
genitales. (Smith y cols 2005)
La replicación del virus se desarrolla en las siguientes etapas:
La fijación representa la primera etapa en la invasión de una célula. Se basa en el
reconocimiento mutuo y acoplamiento de proteínas de la envoltura del virión, las gp120 y
gp41, y los receptores de la célula blanco, los linfocitos CD4. Este reconocimiento no es
posible sin ayuda de coreceptores propios de las células susceptibles de ser invadidas; en el
caso de los macrófagos son los CCR5 y en el caso de los LT4, los CXCR4, que interactúan
con la proteína superficial. Macrófagos y LT4 tienen en común su principal receptor: el
receptor CD4. Este reconocimiento es condición obligada para que el virus llegue a penetrar
en la célula y continuar con el proceso de infección.
La penetración es el segundo paso: una vez reconocido el virión por los receptores de
superficie, se vacía dentro de la célula fusionándose la envoltura lipídica del virión con la
membrana plasmática de la célula. Protegidos por la cápside y las nucleocápsides, los dos
ARN mensajeros que forman el genoma viral y sus proteínas asociadas se encuentran ahora
en el citoplasma listo para ser procesado. (Medtempus 2007)
La transcripción inversa del ARN vírico para formar ADNc (ADN complementario,
monocatenario) con la misma información. Cada una de las dos moléculas de ARN llega
desde el virión asociada a una molécula de transcriptasa inversa que se ocupa del proceso.
Las dos moléculas de ADNc se asocian para formar una molécula de ADN, que es la forma
química de guardar la información que una célula eucariota es capaz de procesar.
El paso siguiente es la integración del genoma vírico en el genoma de la célula huésped,
para ello penetra en el núcleo y se inserta en el ADN celular con ayuda de una integrasa,
que procede del virión infectante. La transcripción del ADN vírico se realiza por los
mecanismos normales de la célula. El resultado de la transcripción es un ARNm (ARN
mensajero).
El ARNm obtenido es complejo, constituido por una sucesión de intrones (partes no
informativas) y exones (partes informativas). Debe ser procesado por cortes y reempalmes
antes de que la información que contiene pueda servir para fabricar las proteínas
correspondientes. Una vez procesado, el ARNm puede salir del núcleo a través de los poros
nucleares. (The body 2004)
Una vez en el citoplasma, el ARNm proporciona la información para la traducción, es decir, la
síntesis de proteínas, que es realizada a través del aparato molecular correspondiente, del
que forman la parte fundamental los ribosomas. El resultado de la traducción no consiste
inmediatamente en proteínas funcionales, sino en poliproteínas que aún deben ser cortadas
en fragmentos. Por acción de proteasas específicas del VIH, las poliproteínas producto de la
traducción son procesadas, cortándolas, para formar las proteínas constitutivas del virus.
Las proteínas víricas fabricadas se ensamblan, junto con ARN provirales, para formar los
componentes internos de la estructura del virión, los que constituyen la cápside y su
contenido.
El último paso es la gemación, cuando los nucleoides víricos se aproximan a la membrana
plasmática y se hacen envolver en una vesicula que termina por desprenderse, formando un
nuevo virión o partícula infectante. En cada célula infectada, se ensamblan varios miles de
nuevos viriones, aunque muchos son incompletos y no pueden infectar. (Atman 2000)
2.4. Infecciones oportunistas en pacientes con VIH
Las infecciones bacterianas son reconocidas como una causa importante de morbilidad y
mortalidad en los pacientes infectados con el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH),
aunque la verdadera incidencia es difícil de discernir y muy variada en comparación con la
población no inmunosuprimida. La incidencia es muy alta en pacientes con conteo de
linfocitos CD4 por debajo de 200 células/mm3, y con neutropenia grave menor que 500
neutrófilos µ/l (Currier y cols 2001).
El daño del sistema inmunitario derivado del VIH puede dar lugar al desarrollo de infecciones
oportunistas (Norgren y cols 1987). Se trata de infecciones comunes en casos de VIH/SIDA
que se producen cuando el sistema inmunitario del cuerpo está debilitado.
Los recuentos de células CD4 pueden jugar un importante papel a la hora de determinar el
riesgo de contraer una infección. Algunos factores, como la raza o el compartir agujas para el
consumo de drogas, también plantean un riesgo mayor de contraer diferentes enfermedades.
La buena noticia es que los medicamentos para el VIH utilizados en un régimen TARGA
(terapia antirretroviral de gran actividad) pueden ayudar a reducir el riesgo de infección.
(Jannser-Cilag 2008)
Los pacientes inmunosuprimidos tienen una gran susceptibilidad a sufrir de infecciones
oportunistas, la más frecuente es la Infección del Tracto Urinario (ITU) en la cual E. coli es el
patógeno oportunista aislado con más frecuencia. Las ITU son generalmente infecciones
ascendentes causadas por cepas presentes en la microbiota normal intestinal que presentan
factores de virulencia que les permiten invadir, colonizar y dañar el tracto urinario
provocando bacteriuria asintomática, cistitis o pielonefritis.
Las mujeres sufren más de este tipo de infecciones que los hombres, debido a la localización
tan estrechamente cercana entre el ano y el aparato genital, haciendo asi que una
autoinfección sea muy común. (Blanco y cols 1991)
Las infecciones del aparato genitourinario reciben diferente nombre según el órgano que sea
afectado:
Se define Bacteriuria Asintomática (BA) cuando se presentan dos exámenes de urocultivo
positivos consecutivos, con el mismo germen, con recuento de colonias >100 000/mL, en
ausencia de sintomatología. Su incidencia es del 3 al 10%, dependiendo del nivel
socioeconómico de las pacientes. Se piensa que el origen de las bacterias sería el riñón, ya
que 25-50% de estos casos tienen antígeno O de la bacteria presente, prueba de
fluorescencia positiva para anticuerpos de la pared bacteriana y enzima B glucoronidasa en
concentraciones variables. Alrededor del 40% de las pacientes con BA no tratada desarrollan
pielonefritis aguda.
Por otro lado, la cistitis Aguda (CA): o también llamada infección urinaria baja, se caracteriza
por sintomatología de poliquiuria, disuria y disconfort pélvico de grado variable, en ausencia
de fiebre y/o dolor costolumbar. El cultivo de orina es el examen que certifica esta infección,
aunque hay controversia con respecto al número de colonias. Muchos piensan que,
independientemente del número, habiendo sintomatología, la infección debe calificarse como
cistitis y, por lo tanto, tratarse como tal. Cuando existe sintomatología y se encuentra
sedimento urinario compatible con infección y urocultivo positivo, independiente del número
de colonias, se inicia tratamiento. A diferencia de bacteriuria asintomática, el 94% de estas
pacientes presenta prueba de fluorescencia negativa para anticuerpos bacterianos,
indicando que la vejiga es el sitio de infección. (Medline 2008)
Se define a la Pielonefritis Aguda (PA): o infección urinaria alta, como la forma más grave de
presentación de la infección del tracto urinario. El cuadro clínico se caracteriza por fiebre,
que puede llegar a ser muy elevada (arriba de 39 °C), escalofríos intensos, y, en 85% de los
casos, dolor en región costolumbar.
La bacteriuria es siempre significativa, y en el 7-10% de las pacientes se produce
bacteremia. El hecho más significativo es que 2-3% de ellas desarrollará shock séptico, con
la consiguiente gravedad para madre y feto. Menos frecuentemente, la PA se ha asociado a
síndrome de dificultad respiratoria del adulto, complicación muchas veces mortal.
La mayoría de las infecciones urinarias altas se producen en los dos últimos trimestres de la
gestación (67%) y 20% ocurren en el puerperio. Muchas pacientes con esta infección
experimentan contracciones uterinas frecuentes e intensas, debido a que la mayoría de los
gérmenes involucrados contienen fosfolipasa A2, enzima fundamental para la síntesis de
prostaglandinas, sustancias involucradas en el inicio del trabajo de parto.
La BA no tratada evoluciona a PA en el 13,5 al 65% de los casos. Con tratamiento, en
cambio, esos porcentajes disminuyen del 0-5,3%. De las pacientes con PA, 28% desarrolla
bacteriuria recurrente y 10% presenta nuevamente PA durante el mismo embarazo. (Romero
y cols 1989)
2.5 Escherichia coli como agente oportunista
Para que la bacteria E. coli pueda invadir, colonizar y dañar el tracto urinario debe de tener
diversos factores de patogenicidad que le permitan hacer daño al tracto uroepitelial, entre los
factores de patogenicidad más importantes se incluyen sideróforos (aerobactina), la
presencia de adhesinas que permiten su adhesión al uroepitelio, la capacidad de
estructurarse en biopelículas, la liberación de toxinas (hemolisinas, factor citotóxico
necrotizante), las invasinas u otros como las islas de patogenicidad (genes responsables de
los factores de virulencia que se encuentran agrupados en fragmentos de DNA muy
particulares llamados también PAI [Pathogenicity Islands]). Una cepa de E.coli es tanto más
virulenta cuantos más factores de virulencia concurren en ella. (Jonson, 1991).
El principal factor de virulencia de las cepas uropatogénicas de E. coli que causan ITU en
seres humanos es la fimbria P (ó fimbria Pap de Pyelonephritis Associated Pili) que está
presente en la mayor parte de las cepas aisladas de pacientes con pielonefritis y urosepsis
(septicemias de origen urinario). La fimbria P le permite a la bacteria fijarse a los receptores
celulares y colonizar el epitelio urinario sin ser arrastrada por la orina. Dicha fimbria está
codificada en los operones cromosómicos pap y sfa respectivamente. Un tercer operon (afa)
codifica para una adhesina afimbrial (Afa) que se encuentra en muy pocas cepas. En las
infecciones extraintestinales, el hierro se convierte en uno de los principales factores que
limitan el crecimiento bacteriano. Esta limitación se debe, en gran parte, al hecho de que casi
todo el hierro está secuestrado en hemoproteínas, como la hemoglobina y la mi oglobina, o
en proteínas quelantes de hierro involucradas en su transporte, como la transferrina o la
lactoferrina. Para poder incorporar el hierro, la mayoría de las cepas de E. coli causantes de
infecciones extraintestinales poseen el sideróforo aerobactina, formado por un compuesto
quelante de hierro que la bacteria excreta y puede volver a captar. La bacteria secreta el
sideróforo cuando hay poco hierro disponible, y cuando el complejo hierro-sideróforo alcanza
la superficie celular, se une a una proteína receptora del sideróforo que se encuentra en la
membrana externa de la pared celular. Una vía alternativa para que la bacteria adquiera
hierro es la hemólisis provocada por la -hemolisina (Hly). Muchas cepas uropatogénicas y
septicémicas humanas producen -hemolisina y el factor de necrosis celular cnf-1. Se han
caracterizado varias islas de patogenicidad cromosómicas que contienen los genes que
codifican para la fimbria P (Pap), fimbrias P-like (Prs, P-related sequence), cnf-1 y/ó Hly.
Además, los genes para Hly pueden ser plásmidicos. (Márquez 2007)
En estudios experimentales se ha observado que las bacterias uropatógenas invaden las
células superficiales de la vejiga y que en el interior de éstas células crean biopeliculas.
Estas estructuras, contendrían bacterias bañadas en una matriz rica en polisacáridos
rodeadas por una envoltura de uroplactina las cuales podrían constituir un nuevo reservorio
para los microorganismos productores de las ITU recurrentes. (Lindsay y cols 2003)
2.6 Infecciones del tracto urinario (ITU)
El tracto genitourinario normal es estéril hasta la parte distal de la uretra. La bacteriuria
asintomática generalmente ocurre por ascenso de las bacterias de la uretra a la vejiga y que
en ocasiones llegan a ascender hasta el riñón. Las bacterias aisladas de pacientes con
bacteriuria asintomática generalmente se originan de microbiota que se encuentra en
intestino, vagina o área periuretral. Para pacientes expuestos a instrumentación del tracto
urinario, las bacterias se introducen a través de instrumentos urológicos contaminados o
fluidos que son llevados al tracto urinario del paciente sin éste estar colonizado
anteriormente. Estos organismos permanecen en el tracto urinario sin ser eliminados por el
hospedero y sin una respuesta suficiente para producir síntomas o causar erradicación.
Existen factores tales como predisposición genética, vaciamiento incompleto de la vejiga o
presencia de un cuerpo extraño provocando la persistencia de los organismos. (Medline
2008)
E. coli es el organismo que con más frecuencia se aísla de sujetos con bacteriuria
asintomática. Sin embargo existe un rango amplio de otras bacterias aisladas. En adultos
mayores y pacientes manejados con cateterización intermitente, E. coli es el agente aislado
con menor frecuencia en hombres que en mujeres. En personas con anormalidades
estructurales o funcionales del tracto urinario, a menudo con cuerpos extraños o con manejo
antimicrobiano repetitivo, frecuentemente se aíslan otras enterobacterias y microorganismos
gram-negativos tales como Pseudomona aeruginosa, organismos gram-positivos incluyendo
Enterococcus spp y Staphylococcus coagulasa negativo y otros como Staphylococcus
saprophyticus podrían ser aislados mas frecuentemente en pacientes con bacteriuria
asintomática que con los que muestran signos de infección. A menudo, el huésped presenta
una respuesta local urinaria aún en ausencia de síntomas. La piuria se reporta en bacteriuria
asintomática en 43% de las niñas en edad escolar, 32% en mujeres jóvenes sanas, 78% en
mujeres diabéticas, 25% a 80% en mujeres embarazadas y 90% en hombres y mujeres
ancianos. Los niveles totales de leucocitos en orina son variables, pero los pacientes
podrían tener altos niveles de leucocitos en orina (piuria) acompañando constantemente a la
bacteriuria asintomática por años. La bacteriuria debida a gram-positivos esta asociada con
bajos niveles de piuria. Otros marcadores inmunológicos o inflamatorios tales como las
citocinas e inmunoglobulinas urinarias podrían estar presentes. Los resultados y significado
clínico de esta respuesta local aun no esta bien comprendida. (Bryan y Reynold 1984)
2.7 Antibioticos
El tratamiento antibiótico adecuado y oportuno de las ITU soluciona el problema en forma
eficiente en la gran mayoría de los casos y evita la aparición de complicaciones como
infecciones recurrentes, infecciones del parénquima renal e infecciones sistémicas. (Johnson
y cols 2005).
El tratamiento antibiótico se inicia inmediatamente después de la toma de muestra de orina,
de forma empírica según consideraciones epidemiológicas, debiendo escogerse un
antimicrobiano efectivo contra el microorganismo más probablemente involucrado, tomando
en cuenta los antecedentes del paciente. Esto implica que es necesario conocer la
susceptibilidad in vitro de los agentes etiológicos de ITU, frente a los antimicrobianos de uso
habitual, debido al fenómeno dinámico y en constante aumento de la resistencia bacteriana.
(Madigan y cols 2000)
III.- OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Comparar los factores de virulencia y moleculares de cepas de Escherichia coli aisladas a
partir de orina de pacientes con VIH y personas inmunocompetentes.
3.2. Objetivos particulares
1. Aislar e identificar cepas de E. coli a partir de muestras de orina obtenidas de
pacientes con y sin VIH.
2. Caracterizar las cepas de acuerdo a sus patrones de susceptibilidad a drogas
3. Caracterizar las cepas de E. coli por factores de virulencia
4. Determinar la capacidad de adherencia y de defensa que tiene la E. coli mediante la
determinación de formación de biopelículas.
5. Tipificar genéticamente las cepas de E. coli mediante RAPD´s
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.Muestras
Se tomaron muestras de orina de pacientes inmunocompetentes y de seropositivos para VIH
(los cuales contaron con el estudio de carga viral y de conteo de linfocitos), atendidos en las
siguientes instituciones de salud: Instituto Mexicano del Seguro Social, Hospital General “Dr.
Zubirán”, Hospital Clinica del Centro y Hospital Christus Muguerza del Parque de la ciudad
de Chihuahua Chihuahua.
4.2 Cepas
Se aisló una cepa de Escherichia coli de un pacientes seropositivo con ITU, la cual se
etiquetó como 1VIH. Se agregaron al estudio 9 cepas de Escherichia coli anteriormente
incluidas en otros estudios etiquetadas como: 2VIH, 3VIH, 4VIH, 5VIH, 6VIH, 7VIH, 8VIH,
9VIH y 10VIH.
El Instituto Mexicano del Seguro Social, proporcionó las muestras de orina a partir de las
cuales se aislaron 9 cepas de Escherichia coli de pacientes sin inmunosupresión, que se
etiquetaron como 2C, 4C, 5C, 6C, 7C, 8C, 9C, 11C y 12C.
Los siguientes Hospitales donaron muestras de orina de pacientes sin VIH, a partir de las
cuales se aislaron cepas de Escherichia coli: Hospital del Centro (14 cepas), Hospital
General “Dr. Zubirán” (5 cepas) y Hospital Christus Muguerza del Parque (6 cepas); las
cuales fueron etiquetadas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24 y 25.
Como referencia se usó la cepa de Escherichia coli ATCC 25922
4.3 Recolección de datos del expediente de los pacientes con VIH
Se recolectaron los valores de carga viral, analizados mediante la técnica RT-PCR y los
valores de linfocitos CD4 analizados por citometría de flujo.
4.4 Toma, manejo y transporte de la muestra
Se tomaron 3 muestras de 30 mL de orina obtenidas durante la primera micción de la
mañana y recolectadas a la mitad del chorro. Las muestras proporcionadas en el hospital se
transportaron a temperatura ambiente al laboratorio de Biotecnología de la Facultad de
Ciencias Químicas donde se les realizó el estudio, mediante análisis microbiológico y
molecular.
4.5 Materiales y equipo
4.5.1 Materiales
Bata de laboratorio de manga larga, guantes de polietileno chicos AMBIDERM, asas de
nicromio circular y estéril, espátula, tubos de ensaye 13*100, gradilla para tubos 13*100,
tapas de rosca, tubos de ensaye de fondo plano, cajas petri de plastico estériles desechables
100*15 mm, mechero, matraces Erlen Meyer (250 mL y 500 mL), papel aluminio, papel
estraza, micropipetas de 0.5-10 μL, 10-100 μL y 100-1000 μL, puntas para micropipeta de
10, 100 y 1000 μL, pipetas serologicas de 2 mL- 5 mL -10 mL, tubos eppendorf 1.5 μL,
gradilla para tubos eppendorf, tripie, tela de asbesto, papel filtro WHATMAN, embudo,
probetas 50 mL, 100 mL y 250 mL, vaso de precipitado 100 mL y 250 mL, frascos de vidrio
ambar y transparentes, cinta scotch, adhesiva y testigo, parafilm, propipetero, frascos con
gotero, algodón, marcador permanente sharpie , matraz aforado de 100 mL.
4.5.2 Equipo
Microscópio óptico de campo claro (Olympus CX31), autoclave (Barnstead Internacional),
balanza analítica (Explorer Ohaus, AE ADAM®), cámara de electroforesis (Owl Separation
Systema ,Inc), campana de extracción (Labconco), congelador (Fischer Scientific),
refrigerador ((VWR Scientific), horno de microondas (Mabe), incubadora (fischer scientific),
microcentrífuga (Eppendorf 5804 R), termociclador (Perkin Elmer/ Gene Amp PCR System
2400), transiluminador UV (Epi Chemi II Darkroon-UVP Laboratory Products), vortex
(Thermolyne), equipo de fotografía (Kodak), baño maría (Labnet), microcentrífuga
(microcentrifuge CE).
4.5.3 Reactivos
Agarosa (Sigma), agua destilada, agua inyectable, bromuro de etidio (Sigma), cajas de agar
sangre preparado (BD BBL), agar Mac Conkey (Bioxon), agar Mueller Hilton (Bioxón), caldo
de soya tripticaseína (Becton Dickinson de México S.A. de C.V.), cloroformo (Baker
Analyzer), dNTP’s (Gibco BRL), EDTA (Gibco BRL), etanol absoluto anhidro (Sigma), fenol,
hielo, isopropanol (Sigma), marcadores de peso molecular 100 pb ladder, proteínasa K
(invitrogen), lisozima (10 mg/mL), CTAB (sigma), SDS (Sigma), Taq ADN polimerasa
recombinante (Invitrogen), dNTP’s (Invitrogen), trizma base (Sigma), buffer (Invitrogen),
cloruro de magnesio (Invitrogen), antibiòticos (Gentamicina, Nitrofurantoina, Ceftriaxona,
Trimetropima con sulfametoxasol, Amikacina, Cefuroxima, Ampicilina), metanol 99%, cristal
violeta1%, acido acético glacial 33%, safranina, TAE 1X, buffer de carga, fenol cloroformo
isoamílico 25:24:1, iniciadores ( CNF-s, CNF-as, afa-1, afa-2, sfa-1, sfa-2, pap-1, pap-2,
OPL-04, OPA-07, P-05).
4.6. Métodos
4.6.1 Análisis microscópico
A las muestras de orina se les realizó análisis microscópico por medio de la tinción de Gram.
Se tomó 1 mL de orina, se centrifugó a 5000 rpm por 20 min y el sobrenadante se descartó.
El precipitado, se extendió en un portaobjetos, la muestra se dejó secar al aire, y se pasó a
través de la flama, para fijarla, después se procedió a su tinción.
Las bacterias crecidas en agar Mac Conkey se analizaron en microscopio también mediante
la tinción de Gram, colocando una gota de solución salina en un portaobjetos suspendiendo
las bacterias de una colonia, se dejó secar y se fijó a la flama del mechero (pasando tres
veces el portaobjetos de la punta hacia la base). Para la tinción al portaobjetos se le añadió
cristal violeta dejando actuar por 1 minuto, se enjuagó con agua y se le adicionó yodo lugol
(1 minuto), se enjuagó y se decoloró con alcohol acetona, por último se le agregó safranina
(1 minuto), se enjuagó y se observó en el microscopio. Las bacterias gram positivas se
observan de color morado y las gram negativas de color rosa.
4.6.2 Cultivo y Pruebas bioquímicas
Urocultivo
Del sedimento de la orina se inoculó en condiciones estériles en agar sangre, Mac Conkey y
EMB, se incubó a 37ºC por 24 horas para su cultivo.
Pruebas bioquímicas
Las colonias del agar Mac Conkey se analizaron bioquímicamente con el BBL CRYSTAL y el
combo urine de MICRO SCAN para identificar a los microorganismos presentes. Para
utilizar este sistema se debe identificar si la bacteria es Gram negativo o positivo para
escoger de acuerdo a esto el juego de bioquímicas que se utilizaría. En el caso de el juego
para Gram negativas se realiza catalasa, OF, fermentación de glucosa, indol, fenilalanina
desaminasa, producción de H2S, descarboxilación de lisina, descarboxilación de ornitina,
citrato, arabinosa, sorbitol, rojo de metilo y Vogues Proskauer.
4.6.3 Suceptibilidad a drogas (Madigan y cols 2000)
Se empleó el método de Kirby-Bauer; en los microorganimos identificados, se tomaron
colonias y se suspendieron en solución salina disolviéndolas lentamente (para no formar
grumos), hasta que se visualizara la misma turbidez del tubo 0.5 del Nefelómetro de Mac
Farland (se compara la turbidez con el apoyo de un fondo blanco – negro). Con un hisopo
estéril se tomó una muestra de la suspensión bacteriana y se realizó la descarga en uno de
los cuadrantes del agar Mueller Hinton con la finalidad de estriar de forma cerrada para que
el agar se impregne total de la suspensión. Se colocaron los sensidiscos con el dispensor de
antimicrobianos. Se incubó a 37°C por 24 horas en condiciones de aerobiosis y se midió el
halo de inhibición, posteriormente se determinó la susceptiblidad y la resistencia a los
antimicrobianos.
4.6.4 Extracción de ADN (Honore- Bouakline y cols 2003)
Se agregaron colonias de Escherichia coli en 3 mL de caldo enriquecido Tripticasa soya por
24 horas a 37º C. Se tomó un mililitro de caldo con crecimiento y se colocó en un tubo
eppendorf (1.5 μL), se centrifugó por 3 minutos y se descartó el sobrenadante, se agregó el
siguiente mililitro de caldo con crecimiento y se centrifugó nuevamente, esto se repitió hasta
que se logró compactar en una pastilla todo el caldo con crecimiento. La pastilla se mezcló
con 200 μL de agua estéril y se calentó a 100º C por 10 min para inactivar las cepas.
Finalizado este tiempo, se centrifugó nuevamente a 5000 rpm por 3 min, para lisar a las
bacterias. 100 μL se traspasaron a un tubo nuevo eppendorf para utilizarse como DNA stock.
4.6.5 Detección del cnf-1 (Van Bost y cols 2003)
En la tabla 1, se muestran las condiciones para la reacción de PCR usadas para la detección
del cnf-1.
Tabla 1. Condiciones de la reacción de PCR para la detección del gen cnf-1
Stock [final] Vol (μL)
Buffer 10 X 1 X 2.5MgCl2 30mM 2.0mM 1.0DNTPs 2.5mM 0.05 mM 0.5
Cnf-s 200 pmol 8 pmol 1.0
Cnf-as 200 pmol 8 pmol 1.0Agua 3.0DNA 15.0
Taq polimerasa 500 U 2.5 U/μL 1.0
El programa de amplificación que se aplicó: 3 min. de desnaturalización inicial a 94 ºC,
seguido de 30 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 60 ºC, 1 min a 72 ºC y un tiempo de extensión
final de 7 min a 72 ºC, la conservación de la muestra se llevó a 4ºC. En la figura 1 se
muestra el diagrama del las condiciones del termociclador.
Figura 1. Diagrama de amplificación del gen cnf-1
30 ciclos
60ºC
94ºC 94ºC72ºC 72ºC
3’ 1’
1’
1’ 7’
4.6.6 Detección de la producción de Alfa Hemolisina (Beutin y cols 1989)
Las cepas aisladas e identificadas, se sembraron en el medio agar sangre y se incubaron por
18 horas a 37ºC, después se les analizó la producción de alfa hemolisina, por medio de la
presencia de un halo hemolítico alrededor de la colonia.
4.6.7 Capacidad de adherencia (Stepanovic y cols 2000)
Para medir la capacidad de adherencia de las cepas de E. coli, se realizó el ensayo de
microtitulación en placa, utilizando placas de ELISA. Se resuspendió una colonia bacteriana
en 1 mL caldo tripticasa soya, se tomaron 200 l y se colocaron por triplicado en los pozos
de la placa, posteriormente se cubrieron e incubaron en condiciones aerobias a 37ºC por 24
horas. Después el contenido de cada pozo se aspiró y se lavó 3 veces con 250 l de
solución fisiológica, las placas se agitaron vigorosamente para quitar las bacterias que no se
adhirieron a la placa. Posteriormente se añadieron 200 l de metanol al 99% y se dejó 15
min para fijar las bacterias, luego se dejó secar para ser teñida con 0.2 ml cristal violeta al
2% por 5 min, después se enjuagó al chorro de agua para quitar el exceso de colorante. Se
dejó secar y se adicionaron 160 l de ácido acético glacial al 33% (v/v). Por último se leyó la
Densidad Óptica (OD) a 570 nm.
En base a esto se clasificaron a las bacterias en cuatro categorías:
* No adheribles OD ODc (0),
* Débil mente adheribles ODc < OD 2 X ODc (+)
* Moderadamente adheribles 2 X ODc < OD 4 X ODc (++)
* Fuertemente adheribles 4 X ODc < OD (+++).
4.6.8 Detección de gen pap, afa y sfa (Le Bouguenec y cols 1992)
Para la amplificación se utilizaron las siguientes condiciones:
Stock [final] Vol (μL)
BufferTris HCl 100 mM
KCl 500 mM
Tris HCl 10 mM
KCl 50 mM1.25
MgCl2 30 mM 1.5 mM 1.25
pap 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
pap 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
sfa 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
sfa 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
afa 1 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
afa 2 10 mg/mL 0.45 μM 2.25
dNTPs 2.5 mM 0.2mM 2.0
Agua 7.75
DNA 5
Taq 500 u 1.2 u 1.0
*Las secuencias de los iniciadores utilizados fueron los siguientes: pap 1 (5’ – GACGGCTGTACTGCAGGGTGTGGCG-3’),pap 2 (5’-ATATCCTTTCTGCAGGGATGCAATA-3’ ), con un peso de 328 pb; sfa1 (5’-CTCCGGAGAACTGGGTGCATCTTAC-3’), sfa2 (5’-CGGAGGAGTAATTACAAACCTGGCA-3’) con un peso de 410 pb; afa 1 (5’-GCTGGGCAGCAAACTGATAACTCTC-3’ ), afa 2 (5’-CATCAAGCTGTTTGTTCGTCCGCCG-3’), con un peso de 750 pb.
Los ciclos de la amplificación comprendieron: 3 min de desnaturalización inicial a 94 ºC,
seguido de 25 ciclos de 2 min a 94 ºC, 1 min a 65 ºC, 2 min a 72 ºC y un tiempo de extensión
final de 7 min a 72 ºC, en la figura 2 se muestra el diagrama del las condiciones del
termociclador.
Figura 2. Diagrama de las condiciones del termociclador para la amplificación de los genes de adherencia pap, afa y sfa.
4.6.9 Formación de biopelículas (Rivera y Mendez 2005)
Se agregó a un tubo con 2 mL de caldo tripticasa soya estéril una colonia de E. coli,
incubándose 24 horas a 37ºC. Se aspiró el contenido con una pipeta sin tocar las paredes
del tubo. Se tiñó con colorante de safranina para observar la formación de un halo rosa en
las paredes del tubo.
4.6.10 Polimorfismos de Fragmentos Amplificados al Azar (RAPD) (Bernal y cols 2004)
Para los RAPDs se utilizaron los siguientes iniciadores: OPL4 5´- GACTGCACAC-3, P5 5´-
CGGCCCCGGT-3, OPA 07 5´-GAAACGGGTG-3´. En las tablas 2, 3 y 4, se muestran las
condiciones de los RAPDs para cada iniciador.
25 ciclos
65ºC3’ 2’
1’
2’ 7’
94ºC 94ºC 72ºC 72ºC
Tabla 2. Condiciones para RADP con el iniciador OPL4
Tabla 3. Condiciones para RADP con el iniciador P5
Stock [final] Vol(l)
Agua 14.0
P5 5 M 0.5 M 2.5
dNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5
MgCl2 30 mM 2.4 mM 2.0
Buffer Tris-HCl: 100 mM
KCl: 500 mM
Tris-HCl: 10 mM
KCl: 50 mM
2.5
Taq polimerasa 500 U 5U/l 1.5
DNA 300 ng/l 24 ng/l 2.0
Stock [final] Vol(l)
Agua 14.0
OPL4 5 M 0.5 M 2.5
DNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5
MgCl2 30 mM 2.4 mM 2.0
Buffer Tris-HCl: 100 mM
KCl: 500 mM
Tris-HCl: 10 mM
KCl: 50 mM
2.5
Taq polimerasa 500 U 5U/l 1.5
DNA 300 ng/l 24 ng/l 2.0
Tabla 4. Condiciones para RADP con el iniciador OPA07
La mezcla de reacción se realizó en un tubo para PCR estéril de 0.5 mL. El programa de
amplificación usado para RAPD`s comprendió: 5 min. de desnaturalización inicial a 94ºC,
seguido de 30 ciclos de 30 seg a 94 ºC, 30 seg a 36 º y 30 seg a 72 ºC, y un tiempo de
extensión final de 4 min a 72 ºC, la conservación de la muestra se llevó a 4ºC. En la figura 3
se muestra el diagrama de amplificación. Los productos de amplificación se visualizaron
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
Figura 3. Diagrama de amplificación para RAPD
4.6.11 Análisis de datos.
Los patrones de bandeo generados por PCR-RAPD fueron analizados con un QuantityOne
de Biorad para obtener el dendograma.
Stock [final] Vol(l)
Agua 12.5
OPA 07 3 M 0.6 M 5.0
dNTPs 2.5 mM 0.05 mM 0.5
MgCl2 50 mM 2.0 mM 1.0
Buffer 10 X 1X 2.5
Taq polimerasa 500 U 5U/l 1.5
DNA 300 ng/l 24 ng/l 2.0
30 ciclos
36ºC5’ 30s
30s
30s 4’
94ºC 94ºC 72ºC 72ºC
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el presente estudio se analizaron muestras de orina de pacientes con y sin VIH que
presentaban infección del tracto urinario, las cuales fueron cultivadas en agares selectivos y
enriquecidos. Se realizó la tinción de Gram en búsqueda de bacilos Gram negativos, luego
las colonias se analizaron bioquímicamente en microplacas de los sistemas BBL CRYSTAL y
el combo Micro Scan para identificar a la bacteria Escherichia coli.
Se obtuvieron un total de 28 cepas de pacientes inmunocompetentes y 1 cepa de pacientes
inmunosuprimidos. Al estudio se añadieron 18 cepas de E. coli uropatógena (9 de población
inmunosuprimida y 9 de población inmunocompetente) que ya habían sido aisladas e
identificadas en otro proyecto. De esta manera se contó con 47 cepas de E. coli
uropatógena, 37 de pacientes sin VIH y 10 cepas de pacientes inmunosuprimidos.
Con el fin de comparar su patogenicidad se sometieron a diferentes pruebas, para conocer
cuál grupo poseía más factores de virulencia y propiedades que conferían a la bacteria el
poder de invadir y permanecer en el tracto urinario.
5.1 Susceptibilidad a drogas
Se realizó una investigación previa para determinar los antimicrobianos que más se recetan
en las ITU, esto con el fin de seleccionar y evaluar la susceptilibidad que tienen las cepas de
Escherichia coli de pacientes con y sin VIH a estas drogas. Para determinar si las cepas
eran resistentes, intermedias o sensibles a la acción del antibiótico, se utilizaron las medidas
establecidas en la tabla descrita por BD BBL SENSI DISC (Tabla 5).
Tabla 5. Valores de la concentración mínima inhibitoria para la interpretación de la sensibilidad.
* BD BBL TM SENSI-DISC TM ANTIMICROBIAL SUCEPTIBILITY TEST DISCS
En la tabla 6 se muestran los resultados obtenidos al analizarse la lectura de los halos de
inhibición al desarrollar el método de Kirby- Bauer.
Tabla 6. Lectura de halos de inhibición de las cepas de E.coli de pacientes con y sin VIH
Cepas control aisladas de pacientes sin
VIH n=37
Cepas aisladas de pacientes con VIH
n=10
Drogas ResistentesResistencia intermedia
Sensibles ResistentesResistencia intermedia
Sensibles
Amikacina 3/37 (8.1%) 1/37 (2.7 %) 33/37 (89.1%) 9/10(90%) ********** 1/10 (10%)
Ampicilina 33/37 (89.1%) ********** 4/37 (10.8%) 10/10(100%) ********** **********
Ceftriaxona 7/37 (18.9 %) 2/37 (5.4 %) 28/37 (75.7%) 9/10 (90%) ********** 1/10 (10%)
Cefuroxima 9/37 (24.32 %) 1/37 (2.7 %) 27/37 (72.9%) 9/10 (90%) 1/10 (10%) **********
Gentamicina 11/37 (29.7 %) ********** 26/37 (70.2%) 10/10(100%) ********** **********
Nitrofurantoina 6/37 (16.2 %) 4/37 (10.8%) 27/37 (72.9%) 10/10 (100%) ********** **********
Trimetroprim Sulfametoxazol
28/37 (75.7%) ********** 9/37 (24.32 %) 10/10 (100%) ********** **********
Antibiótico Resistente (cm) Intermedio (cm) Susceptible (cm)
Amikacina ≤ 1.4 1.5-1.6 ≥ 1.7
Ampicilina ≤ 1.3 1.4-1.6 ≥ 1.7
Ceftriaxona ≤ 1.3 1.4-2.0 ≥ 2.1
Cefuroxima ≤ 1.4 1.5-1.7 ≥1.8
Gentamicina ≤ 1.2 1.3-1.4 ≥ 1.5
Nitrofurantoína ≤ 1.4 1.5-1.6 ≥ 1.7
Trimetroprim sulfametoxazol ≤ 1.0 1.1-1.5 ≥ 1.6
Los resultados se dividieron en dos secciones: la susceptiblidad de las cepas provenientes
de pacientes sin inmunosupresión y la susceptibilidad de las cepas de pacientes con
inmunosupresión.
Al analizar los resultados de los pacientes sin VIH, se puede observar que existe una gran
resistencia a la ampicilina (89.1%) que es un derivado de la penicilina y a trimetroprim
sulfametoxazol (75.7%) incluido en el grupo de las sulfonamidas; ambos son medicamentos
que se otorgan de primera elección, es decir, que cuando se detecta una ITU, ambas drogas
se dan sin un estudio previo. Esto explica la alta drogorresistencia de la bacteria, además,
ambas drogas son de amplio espectro, es decir, se dan para diversas infecciones, por lo que
al estar la bacteria en constante contacto con los antibióticos, adquiere resistencia contra los
mismos.
En el caso de los pacientes con VIH los resultados son aún mas alarmates, ya que se
encontró una resistencia total a 4 de las 7 drogas utilizadas y las 3 restantes presentaron un
90% de ineficacia; concordando con lo expuesto en el estudio realizado por la organización
de CONASIDA, ya que éste tipo de pacientes son constantemente blanco de infecciones, por
lo que frecuentemente se encuentran en tratamiento con antibióticos, esto puede explicar la
resistencia que existe actualmente a las drogas. (Jannsen-Cilag 2008)
En el caso de los estudios sobre patrones de susceptibilidad se encuentra el de Gordon y
colaboradores (2003) en el que evaluaron la resistencia a antibióticos de las bacterias más
comunes que causan ITU. En el estudio encontraron que el principal patógeno fue E.coli
(47%) y que mostró una alta resistencia a la ampicilina (55%) y a la trimetroprim
sulfametoxazol (23%); los resultados del presente mostraron más resistencias a éstas
drogas.
Sin embargo, en estudios como el de Jonson y colaboradores (2005), la ampicilina y el
trimetroprim sulfametoxazol fueron de alta sensibilidad ante las bacterias. Lo que permite
observar la gran patogenicidad que las cepas de este estudio tienen, ya que esos dos
antibióticos fueron a los que mas resistencia mostraron las bacterias del presente estudio. La
gran dificultad que representa su erradicación y la peligrosidad en los pacientes
inmunosuprimidos representan un foco potencial para su diseminación sistémica y además
es importante mencionar que estos pacientes pueden convertise en hospedadores de cepas
drogorresistentes.
5.2 Producción de alfa hemolisina y factor de necrosis celular (cnf-1).
El cnf-1 es una toxina de 2900 pb que produce necrosis en tejido, en la figura 4, se muestra
una sección de la secuencia del gen así como la región donde híbridan los dos iniciadores, el
CNF-s [5`-TTATATAGTCAAGATGGA-3`], que esta de color azulverde y el iniciador CNF-as
[5`-CACTAAGCTTTACAATATTGA-3`] es la región color azul, la parte amarilla es el producto
de amplificación de 633 pb.
Figura 4. Secuencia del gen que codifica para el cnf-1. Producto de 633 pb (Falbo y cols, 1993)
Entre los factores de patogenicidad más importantes se encuentran la -hemolisina (Figura
5) y el cnf-1 (Figura 6), ya que su presencia simultánea alerta sobre la capacidad de
invasión y diseminación.
Fig. 5 Hemólisis alfa producida por la cepa 22 en el medio agar sangre.
Fig. 6 Detección del cnf-1. Carril 1: marcador de 100pb, carriles 2-6: factor de necrosis positivo para las cepas 2, 11, 13, ATCC y HIV1. Gel de agarosa al 2% donde se observa la banda de 600 pb.
Cepa 22
600 pb
1 2 3 4 5 6
En el tabla 7 se muestran los resultados obtenidos al comparar las cepas provenientes de
pacientes con y sin VIH respectivamente, encontrándose que los dos factores se presentaron
de manera simultanea en el 10% de las cepas de pacientes con VIH y solo en el 5.4% de las
cepas de pacientes inmunocompetentes, lo que sugiere una mayor patogenicidad de las
cepas de los pacientes con VIH.
El cnf-1 estuvo presente en el 100% de las cepas de pacientes con VIH en comparación
con las de los pacientes sin VIH que sólo se presentó en el 35.1%, esto refleja la
potencialidad de diseminación que tienen las cepas provenientes de los pacientes
inmunosuprimidos.
La alfa hemolisina se presentó de forma individual sólo en las cepas de los pacientes
inmunocompetentes. En ninguna de las cepas de pacientes con VIH se encontró sólo la
hemolisina. En la tabla 8 se muestran las cepas de E.coli que presentaron estos factores.
Tabla 7. Frecuencia de - hemolisina y cnf-1 en cepas de Escherichia coli proveniente de pacientes con y sin VIH
-hemolisina cnf-1Cepas provenientes de pacientes con VIH
n=10
Cepas provenientes de pacientes sin VIH
n=37
+ + 1/10 (10%) 2/37 (5.4%)
+ - 0/10 (0%) 2/37 (5.4%)
- + 9/10 (90%) 11/37(29.7%)
- - 0/10 (0%) 22/37 (59.5)
Tabla 8. Cepas de Escherichia coli provenientes de pacientes con y sin VIH que portan los genes hemolisina y cnf-1 individual o simultáneamente.
-hemolisina cnf-1Cepas provenientes de pacientes con VIH
n=10
Cepas provenientes de pacientes sin VIH
n=37
+ + H6 cepa11, cepa 13
+ - ******* cepa 14, cepa 22
- +H1,H2,H3,H4,H5,H7,
H8,H9,H10
cepa2, 1C,4C,5C,6C,7C,8C,9C,
10C,11C,12C
- - *******cepas(1,3,4-10,12,15-
21,23-25)C2 Y C3
Los resultados obtenidos por Caprioli y col (1989) e Island y col (1989) son diferentes, ya que
ellos encontraron que las cepas de E.coli causantes de ITU eran hemolíticas y presentaban
también el gen cnf-1. El encontrar el gen cnf-1 en todas las cepas de pacientes
inmunosuprimidos, muestra el potencial de estas cepas de provocar infecciones sistémicas,
ya que se le adjudica una alta virulencia a este factor, debido a que es por medio de el gen
cnf-1 que la bacteria logra la invasión al tejido, con la consecuencia de múltiples efectos que
van desde daño al tejido (cambios en la polarización de las fibras de actina del citoesqueleto)
causando la incapacidad de movimiento en las células, lisis de eritrocitos e inducción de la
formación de células multinucleadas; provocando necrosis por invasión y colonización del
tejido sin que se encuentre resistencia alguna por parte del huésped. (Caprioli y col., 1987,
Oswald y col., 1991 y Elliott y col., 1998).
5.3 Capacidad de adherencia
Otra manera de poder evaluar y comparar la virulencia de las cepas de E. coli es medir su
capacidad de adherencia, la cual impide a la bacteria que la orina la arrastre y ésta pueda
colonizar, invadir y dañar el epitelio urinario. Las cepas más patógenas cuentan con una alta
adherencia. Para realizar este ensayo, primero se hizo una curva de calibración del
colorante cristal violeta, esto con el fin de estandarizar la prueba. Se tomaron distintas
concentraciones del colorante en partes por millón (ppm) 5, 10, 15, y 20, por triplicado y se
colocaron en una placa de ELISA, se leyó en el espectrofotómetro y en base a las
densidades ópticas obtenidas se calculó la ecuación de la recta Y= 0.0179X – 0.0457 con un
coeficiente de relatividad de R2= 0.9947, ésto nos indica que los datos están correctos y la
prueba tiene validez.
En la figura 7 se observa la placa de ELISA con el ensayo de microtitulación en donde se
aprecia la capacidad de adherencia de las cepas (intensidad de coloración del cristal violeta),
podemos ver en las muestras por triplicado que se obtiene la misma intensidad de coloración
del cristal violeta, lo que indica que no hubo contaminación en las muestras.
Fig. 7 Ensayo de microtitulación en placa, los controles se colocaron por triplicado en la primera fila a la izquierda asi como los blancos en la ultima fila a la derecha. Las muestras estan colocadas a partir de la segunda fila por triplicado
.
Muestras
X1, X2, X3Blancos
Controles
Una vez obtenidas las densidades ópticas se determinó la media y la desviación estándar del
control a partir de la ecuación de la recta obtenida en la curva de calibración, obteniéndose
una media de X=107 (promedio de las tres repeticiones) y una desviación estándar de
0.00365, para poder posteriormente clasificar las bacterias con base a la capacidad de
adherencia:
ODc= X + 3Desviaciones estándar
ODc= 107 + 3(0.00365)
ODc= 0.1180
No adherentes = OD ≤ ODc = OD ≤ 0.1180
Débil adherencia = ODc < OD ≤ 2ODc = 0.1180 < OD ≤0.236
Moderada adherencia =2ODc < OD≤ 3ODc = 0.236<OD ≤ 0.354
Fuerte adherencia =3ODc < OD ≤ 4 ODc = 0.354 <OD ≤ 0.472
En la tabla 9 se observan las densidades ópticas obtenidas en el lector de microplacas y en
base a esto la clasificación de capacidad de adherencia de las distintas cepas.
Tabla 9. Densidades ópticas obtenidas en el lector de ELISA, así como la clasificación de las cepas con base a su capacidad de adherencia. No adherentes (0), Debilmente adherentes (+), Moderadamente adherentes (++) y Fuertemente adherentes (+++)
ORIGEN DE LAS CEPAS OD CLASIFICACION
Cepa de pacientes con VIH
Control 0.107
1V 0.160 +
2V 0.144 +
3V 0.321 ++
4V 0.173 +
5V 0.152 +
6V 0.143 +
7V 0.188 +
8V 0.120 +
9V 0.127 +
10V 1.666 +++
Cepa de pacientes sin VIH
Control 0.112
1C 0.174 +
2C 0.114 +
3C 0.355 +
4C 0.383 ++
5C 0.112 0
6C 0.368 ++
7C 0.171 +
8C 0.246 ++
9C 0.147 ++
10C 0.114 +
11C 0.079 0
12C 0.494 +++
Control 0.107
1 0.087 0
2 0.102 0
3 0.112 +
4 0.135 +
ORIGEN DE LAS CEPAS OD CLASIFICACION
Cepa de pacientes sin VIH
5 0.102 0
6 0.106 0
7 0.125 +
8 0.162 +
9 0.173 +
10 0.137 +
Control 0.107
11 0.142 +
12 0.140 +
13 0.115 0
14 0.213 +
15 0.116 0
16 0.117 0
17 0.091 0
18 0.109 0
19 0.133 +
20 0.127 +
21 0.160 +
22 0.292 ++
23 0.121 +
24 0.132 +
25 0.584 +++
ATCC25922 0.346 ++
Al analizar los resultados, se observa que en las cepas de los pacientes con VIH el 100% de
las cepas tiene capacidad de adherirse, el 80% presentaron adherencia débil, el 10%
moderada y el 10% fuerte adherencia.
En las cepas de los pacientes sin VIH solo el 71.61% presentaron adherencia, siendo el 50%
débilmente adherentes, el 15.8% moderadamente adherentes y el 5.3% fuertemente
adherentes. (Figura 8)
Fig. 8 Frecuencia de adherencia en cepas provenientes de las dos poblaciones estudiadas en los que se representan como barras azules las cepas de pacientes con VIH y en rojo las cepas de los pacientes sin VIH.
Los resultados obtenidos difieren de artículos como el de Mardh y col. en 1979, en los que se
describe que las cepas uropatógenas de E. coli son fuertemente adherentes a comparación
de los obtenidos en este estudio, dónde prevalecen las cepas con adherencia débil; esta
difencia de adherencias puede deberse a que la E. coli estudiada se tratara de una cepa
causal de cistitis o pielonefritis (en estos casos las cepas poseen una adherencia alta con la
cuál migran, colonizan e invaden el tracto urinario de forma ascendente sin ser arrastradas
por la orina).
Las cepas que se utilizaron en el presente estudio no reflejan una gran capacidad de
adherencia en su mayoría, sin embargo, el sólo hecho de que haya aunque sea una débil
adherencia, es un factor que impide que la orina arrastre la bacteria permitiéndole la
colonización del tejido y originar que la infección pueda ascender.
5.4 Determinación de genes de adherencia: pap, sfa y afa.
Los operones pap, sfa y afa codifican para genes de adherencia y se han encontrado
principalmente en E. coli asociada a las infecciones del tracto urinario. En la figura 9 se
muestra una sección de la secuencia del gen así como la región donde híbrida los tres
iniciadores.
a) b)
Figura 9. Secuencias de las regiones de hibridación de los iniciadores de adherencia. a). Iniciadores usados en PCR. Diagrama de la organización genética de los operones pap, afa y sfa. b) Secuencias de DNA de los fragmentos específicos de los operones pap, afa y sfa y los iniciadores amplificados. (A) Secuencia interna de DNA de 1.1-kb PstI fragmento específico del operón afa: la secuencia intermedia aproximadamente de 60 pb muestra el sitio PapI. (B) Secuencia de DNA de 0.8-kb PapI fragmento específico del operon sfa. Las secuencias de los iniciadores (afa l, afa2, sfa l, and sfa2) están simbolizadas por flechas. Las regiones en las cuales las secuencias de nucleótidos no fueron determinadas están simbolizadas por líneas punteadas. (Daigle y cols 1994)
En los resultados obtenidos se observaron cepas en los que se encontraban dos de los tres
genes (pap y sfa), al igual que otros estudios como el de Daigle y cols en 1994, ninguna de
las cepas mostró la presencia de los tres genes.
La presencia simultanea del gen pap (que codifica para la fimbria P) y la de el gen sfa (que
codifica para la fimbria S) se detectó en el 11.8% de las cepas de los pacientes sin VIH y en
el 10% de las cepas de los pacientes con VIH. La frecuencia de los genes individuales en
cepas de pacientes con y sin VIH fue 11.8% y 20% respectivamente. Se encontró en el
5.8% y 10% respectivamente el gen afa solo se detectó unicamente en el 3% de las cepas
de los pacientes sin VIH. El 67.6% y el 60% de las cepas sin y con VIH no presentaron
ninguno de los 3 factores. (Tabla 10, Fig. 10 y Fig. 11)
Tabla 10 Frecuencia de los genes de adherencia pap, sfa y afa, en cepas de pacientes con y sin VIH
Frecuencia de genes de adherencia
Gen pap Gen sfa Gen afaMuestras sin VIH
(n=34)
Muestras con VIH
(n=10)
+ + + 0/34 (0%) 0/10 (0%)
+ + - 4/34 (11.8%) 1/10 (10%)
+ - - 4/34 (11.8%) 2/10 (20%)
- + - 2/34 (5.8%) 1/10 (10%)
- - + 1/34 (3.0%) 0/10 (0%)
- - - 23/34 (67.6%) 6/10 (60%)
Fig. 10 Frecuencia de los genes de adherencia pap, afa y sfa
Fig. 11 Presencia de genes de adherencia (pap y sfa). Carril 1: marcador de 100pb ladder carriles 2-15 cepas portadoras de los genes afa y sfa. Gel de agarosa al 2%
400 pb
Marc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Los resultados mostrados en el presente trabajo de investigación concuerdan con los
obtenidos por Chantal Le Bouguenec y col en 1992, donde el gen más frecuente en las
cepas de E. coli uropatógenas fue el pap, ya que la fimbria P es uno de los factores de
virulencia mas importantes de esta bacteria, debido a que le confiere la capacidad de migrar
hacia la parte superior del tracto urinario provocando pielonefritis; se encontró la presencia
de los genes pap y sfa, pero al igual que el presente estudio, la presencia simultánea de los
tres genes no fue detectada.
5.5 Formación de Biopelículas
Las biopelículas juegan un papel esencial en la resistencia de las bacterias en el tracto
urinario, ya que gracias al exopolisacárido que estas liberan pueden formar una matriz con la
capacidad para defenderse de los ataques del huésped, de los antibióticos, e incluso poder
comunicarse entre éstas para poder transferirse genes de resistencia.
En éste estudio se evaluó la capacidad de E. coli para formar biopelículas (Figura 12). Los
resultados se observan en la tabla 11.
Figura 12. Formación de Biopelículas, teñidas con safranina.
Tabla 11. Presencia de biopelículas por cepa y porcentaje final de las cepas positivas de pacientes con y sin VIH
ORIGEN DE LAS CEPAS FORMACIÓN DE BIOPELICULASCEPA DE PACIENTES SIN
VIH2-16
18-25C4, C6, C7, C12
ATCC 25922
Sí
1, 17, C2, C5, C8,C9 y C11.
No
CEPA DE PACIENTES CON VIH
1 H Sí2H Sí3H Sí4H Sí5H Sí6H Sí7H Sí8H Sí9H Sí
10H No
*En este estudio solo se contó con 34 cepas ya que se eliminaron 3 que se habían contaminado
CEPAS SIN VIH
n=34 *
CEPAS CON VIH
n=10
27/34
(77.1%)
9/10
(90%)
Las cepas de los pacientes sin VIH presentaron formación de biopelículas en un 77.1%, en
cambio de las cepas de pacientes con VIH el 90% presentaron este factor de virulencia, lo
cuál sugiere la mayor patogenicidad de las últimas, razón por la cual las bacterias están
protegidas en el tracto urinario y los antibióticos no pueden erradicarlas, haciendo así que
estas cepas sean potencialmente más patógenas y que representen un foco potencial para
su diseminación sistémica. Ver tabla 11.
Al hacer una comparación de la capacidad de adherencia (Tabla12) en microplaca y en tubo
(biopelícula) se observa una gran similitud en los resultados obtenidos, ya que de la
población de cepas provenientes de pacientes con VIH, el 100% mostró adherencia y el 90%
formó biopelículas; mientras que en las cepas de pacientes inmunocompetentes el 70.3%
fueron adherentes y el 77.1% formó biopelículas. Esto refleja que una bacteria que es
adherente tiene la capacidad de formar biopelículas, donde antibióticos y células de defensa
del hospedador, resultan ineficaces, permitiendo a la bacteria crear reservorios que son
difíciles de eliminar.
Tabla 12. Capacidad de adherencia en microplaca y en tubo (biopeliculas) de las cepas provenientes de pacientes con y sin VIH
Capacidad de adherencia
En microplaca En biopeliculas
Muestras VIH (n=10)
Muestras sin VIH (n=37)
Muestras VIH (n=10)
Muestras sin VIH (n=37)
Adherentes 10/10 (100%) 26/37 (70.3%) 9/10 (90%) 27/35 (77.1%)
5.6. Analisis de los RAPD´s (Random Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico
amplificado al azar)
Para conocer la variabilidad genética de las cepas de Escherichia coli se realizó el análisis
de los RAPDs con tres iniciadores diferentes para poder comparar en este aspecto también a
las cepas de pacientes con y sin VIH.
5.6.1. Utilizando el iniciador OPA 07
Figura 13. Patrones de la amplificación con el iniciador OPA 07. De Izquierda a derecha (marcador, control negativo, cepas 1-12 sin VIH, marcador, cepas 13-25 sin VIH, marcador) iniciador OPA07
Figura 14. Patrones de la amplificación con el iniciador OPA 07. De izquierda a derecha (marcador, control negativo, cepas control sin VIH (2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador, cepas con VIH(1-10), marcador) iniciador OPA07
Figura 15 Dendograma con el inciador OPA 07. Describe el porcentaje de similitud de la totalidad de cepas estudiadas, la palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con VIH se indican con las siglas VIH.
Al analizar el dendograma obtenido se observa una gran variabilidad genética ya que
ninguna de las cepas tiene un 100% de similitud con otra, pero si se observan 3 grandes
conglomerados en los que se dividen las cepas. Las cepas que resultaron con una mayor
similitud (92%) fueron la 8 y 9 de pacientes con VIH; al observar esto, se revisaron los
factores analizados anteriormente, observándose que coinciden en casi todos ya que ambas
Dice(fuzzy) (Opt:2.00%) (Tol 2.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
RAPD´s OPA7
100
959085807570656055504540
RAPD´s OPA7
2 HIV+
3 HIV+
ctrl 12
8
1 HIV+
5 HIV+
4 HIV+
20
19
23
17
18
ctrl 11
ctrl 9
ctrl 8
ctrl 2
8 HIV+
9 HIV+
7 HIV+
6 HIV+
ctrl 4
ctrl 5
crtl 7
10 HIV+
22
25
1
24
2
11
13
21
14
4
5
12
10
3
9
6
7
15
16
ctrl 6
presentan una resistencia total a los antibióticos, no presentan α hemolisina, tienen débil
adherencia y formaron biopelícula. Además, presentan el gen cnf-1, en lo único que se
diferencian es en que la cepa 9 presenta el gen de adherencia pap y la cepa 8 no tiene
ninguno de los genes.
5.6.2 Utilizando el iniciador p5
Figura.16 Patrones de la amplificación con el iniciador P5. Dirección de izquierda a derecha (cepas 1-14 sin VIH, marcador, cepas 15-25 sin VIH, ATCC 25922 y marcador) Iniciador P5
Figura 17. Patrones de la amplificación con el iniciador P5. De izquierda a derecha (marcador, Control negativo, controles sin VIH(2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador, cepas con VIH (1-10) , ATCC 25922, marcador) Iniciador P5
Figura 18 Dendograma del iniciador p5. Se describe el porcentaje de similitud de la totalidad de cepas estudiadas la palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con inmunosupresión contienen la leyenda VIH.
En este dendograma se observa la formación de 4 conglomerados y aunque también se
observa una variabilidad genética importante, con este iniciador hay varias cepas que tienen
Pearson correlation (Opt:2.00%) [0.0%-100.0%]
RAPD´s P5
100
908070605040302010
RAPD´s P5
16
17
4 HIV+
6 HIV+
1 HIV+
ctrl 6
7
4
6
1
2
3
13
14
15
25
22
21
8 HIV+
ctrl 5
23
9 HIV+
crtl 7
12
20
24
10 HIV+
11
5
ctrl 2
3 HIV+
5 HIV+
9
ctrl 8
10
18
8
2 HIV+
ctrl 11
19
ctrl 12
7 HIV+
ctrl 4
ctrl 9
alto porcentaje de similitud; en el primer conglomerado (de arriba hacia abajo) vemos que no
hay gran similitud entre las cepas ya que el porcentaje mayor es del 88% entre las cepas
VIH-1 y Ctrl 6 que solo tienen en común la formación de biopelículas, presencia del gen cnf-1
y la ausencia de α hemolisina.
En el segundo conglomerado existe una gran similitud de las cepas y llama la atención que
en este grupo la mayoría son cepas provenientes de pacientes sin VIH, pero las únicas que
tienen el 100% de similitud son las cepas 1 y 2 las cuales coinciden en su alta sensibilidad a
drogas, la ausencia de α hemolisina y en la nula capacidad de adherencia.
En el tercer conglomerado, la mayor similitud se da entre las cepas provenientes de
pacientes con VIH 5 y 3 las cuales presentan un 92% de similitud, fue interesante recordar
que ambas cepas solamente difieren en la presencia de genes de adherencia ya que la
cepa 5 presentó los genes pap y sfa y la cepa 3 no posee ninguno de estos genes.
Finalmente, en el último conglomerado la mas alta similitud se dio entre la cepa de pacientes
sin VIH 11 y la cepas de paciente con VIH 2 con un porcentaje del 92% de similitud, pero a
diferencia del caso anterior ambas cepas presentaron la presencia del gen cnf-1 y la
ausencia de la α hemolisina.
5.6.3. Utilizando el iniciador OPL-04
Figura 19. Patrones de la amplificación con el iniciador OPL-04. De izquierda a derecha (cepas sin VIH 2-12, marcador, cepas sin VIH 13-24) Iniciador: OPL-04
Figura 20 . Patrones de la amplificación con el iniciador OPL-04. De izquierda a derecha (marcador, control negativo, cepa 1sin VIH, cepa 25 sin VIH, controles sin VIH(2,4,5,6,7,8,9,11,12), marcador ,cepas con VIH(1-10), marcador) Iniciador OPL-04
Figura 21. Dendograma del iniciador OPL-04. Se describe el porcentaje de similitud de la totalidad de cepas estudiadas. La palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con inmunosupresión contienen la leyenda VIH.
Este iniciador no mostró ser muy polimórfico, en general se observan 2 conglomerados, en
el primero se observa casi el 100% de similitud en todas las cepas y en el segundo
conglomerado la similitud es un poco menos en porcentaje, pero aun así no es tan marcada
la variablidad como con los dos primeros iniciadores por lo que a este análisis no se le dará
mucho seguimiento.
Different bands(fuzzy) (Opt:1.00%) (Tol 5.0%-6.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
RAPD´s OPL4
100
999897
RAPD´s OPL4
18
9
21
25
7
ctrl 5
1 HIV+
17
4
8
15
19
10
22
23
6 HIV+
7 HIV+
5 HIV+
8 HIV+
ctrl 6
ctrl 4
ctrl 2
ctrl 8
ctrl 9
12
13
11
9 HIV+
crtl 7
20
24
14
16
2 HIV+
3 HIV+
6
4 HIV+
10 HIV+
ctrl 11
ctrl 12
5
2
3
1
Análisis de los tres iniciadores juntos
Figura 22. Dendograma de los tres iniciadores: OPL4, P5 y OPA07. Se describen el porcentaje de similitud de la totalidad de cepas estudiadas, la palabra Ctrl representa a las cepas provenientes de pacientes sin VIH y las cepas obtenidas de pacientes con inmunosupresión contienen la leyenda VIH.
El poder observar este árbol analizando las cepas estudiadas con los tres iniciadores
utilizados nos permite visualizar de una manera mas clara las cepas que tienen una mayor
similitud, y también poder comprender la gran variabilidad genética que estas cepas tienen.
En este dendograma se observan 3 conglomerados, observándose en el primero de ellos
la mayor similitud de las cepas y cabe destacar que en este se encuentran la mayoría de las
cepas provenientes de pacientes con VIH
Con este estudio se pudo observar que las cepas analizadas tanto de pacientes con VIH y
sin VIH mostraron una gran variabilidad genética.
RAPD´s OPA7+RAPD´s OPL4+RAPD´s P5matriz general
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
matriz generalRAPD´s P5 RAPD´s OPL4 RAPD´s OPA7
2 HIV+
ctrl 12
ctrl 2
12
18
3 HIV+
ctrl 11
4 HIV+
5 HIV+
ctrl 9
1 HIV+
8 HIV+
9 HIV+
25
10 HIV+
7 HIV+
6 HIV+
ctrl 4
3
5
4
9
15
crtl 7
ctrl 5
ctrl 6
19
23
17
8
11
13
21
22
20
10
6
14
7
1
2
24
16
ctrl 8
VI. CONCLUSIONES
Las infecciones urinarias representan una alerta en pacientes con VIH, ya que el estado
inmunológico deprimido de los pacientes los hace más susceptibles a infecciones de
bacterias patógenas y oportunistas. Escherichia coli representa el patógeno oportunista más
frecuente de las bacterias asociadas a este tipo de infecciones. Debido a los tratamientos
inadecuados y a la poca respuesta que tienen los pacientes con inmunosupresión hace
suponer el origen de reservorios que generan cepas drogo resistentes.
La creciente presencia de E. coli en las muestras de orina de los pacientes con VIH, la
resistencia casi del 100% a las drogas comúnmente utilizadas, la presencia de CNF-1 y de
los genes de adherencia en mucha mayor proporción en las cepas provenientes de
pacientes con VIH comparada con aquellos que no lo tienen, alertan sobre la gran
patogenicidad que esta bacteria tiene, la cual requerirá de esquemas más estrictos de
tratamiento para evitar su diseminación tanto endógena como exógena.
La determinación de factores de virulencia describe a E. coli como una bacteria uropatógena
en pacientes con y sin VIH.
Se justifica realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos a todas las cepas de
E.coli uropatógena (ECUP) con la finalidad de disminuir la creciente aparición de cepas
resistentes y lograr tratamientos más eficientes.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bernal M., Poutou R.A., Máttar S. (2004). Utilización del rapd para detectar clonalidad entre
cepas de escherichia. Universitas médica vol. 45 nº 1 1658-1768.
Beutin, L., M.A. Montenegro, L. Orskov, F. Orskov, J. Prada, S. Zimmermann, and R.
Stephan., (1989). Close association of verotoxin (shiga-like toxin) production with
enterohemolysin production in strains of Escherichia coli, J. Clin. Microbiol. Vol. 27.
2559-2564.
Blanco J, Alonso MP, Blanco M, González EA. (1991) Mecanismos de patogénesis de
Escherichia coli causantes de infecciones extraintestinales. Enferm Infecc Microbiol
Clin; Vol. 9: 640-651
Bryan CS, Reynolds KL. (1984)Community acquered bacterenic urinry tract infection:
Epidemiology and outcome. J Urol Vol. 132: 490.
Caprioli A., Falbo V., Ruggeri F., Baldassarri l., Bisicchia R., Ippolito G., Romoli E. y Donelli
G., (1987), Cytotoxic Necrotizing Factor Production by Hemolytic Strains of Escherichia
coli Causing Extraintestinal Infection, Journal of Clinical Microbiology, Vol 25 No1, pp
146-149.
Caprioli A., Falbo V., Ruggeri F., Minelli F., Ørskov I. and Donelli G., (1989), Relationship
between Cytotoxic Necrotizing Factor production and Serotype in Hemolytic Escherichia
coli, Journal of Clinical Microbiology,Vol 27 No 4, pp 758-761.
Currier JS, Williams P, Feinberg J, Becker S, Owens S, Fichtenbaum C, et al. (2001) Impact
of prophylaxis for Mycobacterium avium complex on bacterial infections in patients with
advance human immunodeficiency virus disease. Clin Infect Dis ;Vol 32:1615-22.
Daigle, F., J. Harel, and J. M. Fairbrother. (1994). Expression and detection of pap-, sfa-, and
afa-encoded fimbrial adhesin systems among uropathogenic Escherichia coli. Can. J.
Microbiol. Vol.40: 286–291
Donegan, E., Stuart, M., Niland, J. C., Sacks, H. S., Azen, S. P., Dietrich, S. L., Faucett, C.,
Fletcher, M. A., Kleinman, S. H., Operskalski, E. A., et al. (1990). "Infection with human
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) among recipients of antibody-positive blood
donations". Ann. Intern. Med. Vol.113 No. 10: 733-739.
Elliott S., Srinivas S., Albert M., Alam K., Robins-Brownw, Gunzburg S., Mee B. y Chang B.,
(1998), Characterization of the Roles of Hemolysin and Other Toxin in Enteropathy
Caused by Alpha-Hemolytic Escherichia coli Linked to Human Diarrhea, Infection and
Immunity, Vol 66 No.5, pp 2040-2051.
Falbo V., Pace T., Picci L., Pizza E., Caprioli A., (1993), Isolation and Nucleotide Sequence
of the Gene Encoding Cytotoxic Necrotizing Factor 1 of Escherichia coli, Infection and
Immunity, Vol. 61 No.11, pp 4909-4914
Gordon K. A., Jones R. N., SENTRY Participant Groups, (2003), Susceptibility patterns of
orally administered antimicrobials among urinary tract infection pathogens from
hospitalized patients in North American: comparison report to Europe and Latin
American. Results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program
(2000),Diagnostic microbiology and infectious disease, Vol. 45, pp 295-301
Heeney, J. L., Dalgleish, A. G. & Weiss, R. A. (2006). "Origins of HIV and the evolution of
resistance to AIDS". Science 313 Vol. 5786: pp 462-466.
Honore-Bouakline S, Vincensini JP, Giacuzzo V, Lagrange PH, Herrmann JL.,(2003) Rapid
Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis by PCR: Impact of Sample Preparation and
DNA Extraction, Journal of Clinical Microbiology, Vol.41 No. 6, pp 2323-2329
Island M., Cui X., Foxman B., Marrs C., Stamm W., Stapleton A., Warren J., (1998),
Cytotoxicity of hemolytic, Cytotoxic Necrotizing factor 1-Positive and –Negative
Escherichia coli to Human T24 Bladder Cell, Infection and Immunity, Vol.66 No.7, pp
3384-3389.
Johnson JR.(2001) Virulence factors in E. coli urinary tract infections. Clin Microbiol Rev; Vol.
4 No. 80-128. 1991
Johnson J., Kuskowski M., O’Bryan T., Colodner R. y Raz R., (2005), Virulence Genotype
and Phylogenetic Origin in Relation to Antibiotic Resistance Profile among Escherichia
coli Urine Sample Isolates from Israeli Women with Acute Uncomplicated Cystitis,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 49No.1, pp 26-31.
Le Bouguenec C, M Archambaud and A Labigne. (1992). Rapid and specific detection of the
pap, afa, and sfa adhesin-encoding operons in uropathogenic Escherichia coli strains by
polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbioly.: Vol. 3 1189-1193
Lindsay E. Nicolle,(2003) MD, Asymptomatic bacteriuria. When to screen and when, to treat,
Infect Dis Clin N Am Vol.17 367–394
Madigan T. M, Martínez J, Parker J. (2000) Brock Biología de los microorganismos. Metodo
de Kirby Bauer. Pearson Prentice Hall. 2004;Vol.13. 807-808
Márquez J. L, (2006) Efecto de la Formación de Biopelículas en la Resistencia de Bacterias
Aisladas de Especimenes Clínicos. Tesis de Licenciatura. Universidad Autonoma de
Chihuahua. 33pp
Norgren, M., M. Baga, J. M. Tennent, and S. Normark. (1987) Nucleotide sequence,
regulation and functional analysis of the papC gene required for cell surface localization
of Pap pili of uropathogenic Escherichia coli. Mol. Microbiol. Vol.1: pp169-178.
Oswald E., De Rycke J., Lintermans P., Van Muylem K., Mainil J., Daube G., and Pohl P.,
(1991), Virulence factor associated with cytotoxic necrotizing factor type two in bovine
diarrheic and septicemic strains of Escherichia coli, Journal of Clinical Microbiology, Vol.
24, pp 708-711
Rivera, José. Méndez Cristian.(2005) Biopelículas y salud pública. Analisis médicos, volumen
50, Número 4 Octubre-Diciembre.Vol.56 pag 172 -176
Romero R. Oyarzún E, Mazor M, Hobbins JC, Bracken M: (1989) Meta analysis of the
relationship between asymptomatic bacteriuria and preterm delivery/low brith weight.
Obstet Gynecol; Vol.73: pp576-582
Smith, D. K., Grohskopf, L. A., Black, R. J., Auerbach, J. D., Veronese, F., Struble, K. A.,
Cheever, L., Johnson, M., Paxton, L. A., Onorato, I. A. and Greenberg, A. E. (2005).
"Antiretroviral Postexposure Prophylaxis After Sexual, Injection-Drug Use, or Other
Nonoccupational Exposure to HIV in the United States". MMWR 54 (RR02): pp1-20.
Stepanovic S., Vukovic D., Dakic I., Savic B., Svabic-Vlahovic,(2000) A modified microtiter-
plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation, Journal of
Microbiological Methods, Vol.40, pp 175-179.
Van Bost, Jacquemin E., Oswald E and Mainil J.,(2003) Multiplex PCRs for Identification of
Necrotoxigenic Escherichia coli,Journal of Clinical Microbiology, Vol. 41:No.9, pp 4480-
4482.
Documentos electronicos
Atman R. (2000) Replicación del virus. http://vihsida.blogspot.com/2007/03/replicacin-del-
virus.html (consultada el dia 16 de enero del 2008)
Jannsen-Cilag,(2008) ¿Que es el SIDA?, http://www.infosida.es/bgdisplay.jhtml?
itemname=SIDA_que_es, (Consultado el dia 13 de noviembre del 2007)
Medline plus (2008) Anatomia del riñon.
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/1101.htm
(consultada el 22 de febrero del 2007).
Medtempus (2007) Replicación del VIH http://medtempus.com/archives/animacion-3d-de-la-
replicacion-del-vih/ (consultada el 20 de julio del 2008)
The body (2004). La capacidad de replicación del VIH
http://www.thebody.com/content/esp/art5701.html (consultada el dia 20 de julio del
2008)
INDICE
I.- INTRODUCCIÓN 1
II. ANTECEDENTES 2
2.1 VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) TAXONOMÍA, HISTORIA Y EPIDEMIOLOGÍA 2
2.2 FORMAS DE TRANSMISIÓN DEL VIH 3
2.3 MECANISMO DE INFECCIÓN Y REPLICACIÓN DEL VIH 4
2.4. INFECCIONES OPORTUNISTAS EN PACIENTES CON VIH 6
2.5 ESCHERICHIA COLI COMO AGENTE OPORTUNISTA 9
2.6 INFECCIONES DEL TRACTO URINARIO (ITU) 11
2.7 ANTIBIOTICOS 12
III.- OBJETIVOS 13
3.1. OBJETIVO GENERAL 13
3.2. OBJETIVOS PARTICULARES 13
IV. MATERIALES Y MÉTODOS 14
4.1.MUESTRAS 14
4.2 CEPAS 14
4.3 RECOLECCIÓN DE DATOS DEL EXPEDIENTE DE LOS PACIENTES CON VIH 15
4.4 TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA 15
4.5 MATERIALES Y EQUIPO 15
4.5.1 MATERIALES 15
4.5.2 EQUIPO
16
4.5.3 REACTIVOS 16
4.6. MÉTODOS
17
4.6.1 ANÁLISIS MICROSCÓPICO 17
4.6.2 CULTIVO Y PRUEBAS BIOQUÍMICAS 17
4.6.3 SUCEPTIBILIDAD A DROGAS 18
4.6.4 EXTRACCIÓN DE ADN 18
4.6.5 DETECCIÓN DEL CNF-1 19
4.6.6 DETECCIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ALFA HEMOLISINA 20
4.6.7 CAPACIDAD DE ADHERENCIA 20
4.6.8 DETECCIÓN DE GEN PAP, AFA Y SFA 21
4.6.9 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS 22
4.6.10 POLIMORFISMOS DE FRAGMENTOS AMPLIFICADOS AL AZAR (RAPD) 22
4.6.11 ANÁLISIS DE DATOS. 24
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25
5.1 SUSCEPTIBILIDAD A DROGAS 25
5.2 PRODUCCIÓN DE ALFA HEMOLISINA Y FACTOR DE NECROSIS CELULAR (CNF-1) 28
5.3 CAPACIDAD DE ADHERENCIA 32
5.4 DETERMINACIÓN DE GENES DE ADHERENCIA: PAP, SFA Y AFA. 37
5.5 FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS 40
5.6. ANALISIS DE LOS RAPD´S 43
5.6.1. UTILIZANDO EL INICIADOR OPA 07 43
5.6.2 UTILIZANDO EL INICIADOR P5 45
5.6.3. UTILIZANDO EL INICIADOR OPL-04 45
VI. CONCLUSIONES 45
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45