5. identifikasi fenotip dan genotip … fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti...
TRANSCRIPT
53
5. IDENTIFIKASI FENOTIP DAN GENOTIP BAKTERI ASAM LAKTAT YANG BERPERAN SELAMA FERMENTASI
SPONTAN PISANG VAR AGUNG SEMERU (Musa paradisiaca formatypica)
[Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana (Musa
paradisiaca formatypica)]
ABSTRAK Fermentasi spontan pada suhu kamar selama 24 jam dilakukan dalam
pembuatan tepung pisang kaya pati resisten. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang mendominasi selama fermentasi spontan pisang var agung semeru (Musa paradisiaca formatypica). Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL indigenus pisang. Identifikasi fenotip dilakukan berdasarkan morfologi umum, uji fisiologi dan biokimiawi menggunakan kit API (analytical profile index). Identifikasi genotip dilakukan dengan menggunakan PCR dan analisis sekuen DNA pengkode 16S rRNA. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BAL yang tumbuh memiliki karakteristik sel bentuk batang yang tumbuh optimal pada suhu 35 oC dan memiliki kemampuan memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N-asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D-seliobiosa, D-maltosa, D-sukrosa dan gentiobiosa. Isolat BAL FSnh1 juga mampu menggunakan D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium glukonat, sedangkan isolat FSnhA juga mampu menggunakan gliserol, metil αD-glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa sebagai sumber karbon. Identifikasi genotip menunjukkan bakteri asam laktat FSnh1 dan FSnhA termasuk famili Lactobacillaceae dengan genus Lactobacillus. Hasil analisis pohon filogenetik menunjukkan isolat BAL FSnh 1 memiliki similaritas dengan L. salivarius dan isolat BAL FSnh A memiliki similaritas dengan L. fructivorans.
ABSTRACT Spontaneous fermentation at room temperature for 24 h was conducted in
the resistant starch-rich banana flour production. The investigation showed that lactic acid bacteria (LAB) were the dominating bacteria during spontaneous fermentation of unripe var agung semeru banana (Musa paradisiaca formatypica). The objectives of the research were to identify the LAB phenotypic and genotypic. Phenotypic identification was based on general morphology, physiological test, and biolochemical test using API (Analytical Profile Index) kit. Genotypic identification was conducted by using polymerase chain reaction (PCR) and analyses of 16S rRNA sequence. The result showed that LAB are the predominant species as Gram-positive rod and have ability to ferment D-ribose,
54
D-xilose, D-glucose, D-fructose, D-mannosa, N-acetyl glucosamin, arbutin, esculin fericitrat, salicin, D-celiobiose, D-maltose, D-saccarose and gentiobiose as carbon source. Beside that FSnh1 isolate able to ferment D-galactose, L-sorbose, L-rhamnose, amygdalin and kalium gluconat, while FSnhA isolate used glycerol, metil αD-glucopyranosid, D-lactose, D-meliobiose, D-trehalose and D-turanose as carbon source. The genotypic identification showed that Lactobacillus sp associated with the spontaneous fermentation of var agung semeru banana were identified as L. salivarius and L. fructivorans.
Keywords: Musa paradisiaca formatypica, phenotypic-genotypic identification, Lactobacillus salivarus, Lactobacillus fructivorans
PENDAHULUAN
Salah satu proses modifikasi tepung pisang adalah fermentasi spontan yang
dikombinasi dengan pemanasan bertekanan-pendinginan. Proses ini mampu
meningkatkan kandungan RS3 pada tepung pisang. Selama fermentasi spontan
dilaporkan bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh dominan hingga jam ke-100
(Jenie et al. 2009; Abdillah 2010). Akan tetapi BAL yang tumbuh belum
diidentifikasi fenotip dan genotipnya.
Fermentasi yang terjadi secara spontan tidak dapat digunakan untuk
menjaga mutu produk yang dihasilkan. Penggunaan kultur starter indigenus dari
bahan aslinya akan memudahkan dalam mengendalikan proses fermentasi serta
memberikan hasil fermentasi yang lebih baik dan sesuai dengan karakteristik
produk yang diinginkan. Fermentasi urutan (sosis daging babi sebagai makanan
khas Bali) menggunakan starter L. plantarum dan Pediococcus acidilactici yang
diisolasi dari urutan tradisional (fermentasi spontan) serta mampu menghasilkan
karakteristik sosis yang lebih baik daripada urutan hasil fermentasi spontan
(Antara et al. 2002; Antara 2010). Oleh karena itu isolasi dan identifikasi BAL
dari strain indigenus sangat penting dilakukan untuk mengembangkan produk
pangan lokal.
Identifikasi BAL dapat dilakukan berdasarkan fenotip dan genotip.
Identifikasi fenotip didasarkan pada hasil pengamatan morfologi seperti bentuk sel
dan pewarnaan Gram, uji fisiologis, metabolik (biokimia) atau kemotaksonomi.
Identifikasi genotip dapat dilakukan dengan menggunakan metode molekuler
55
yaitu sekuensing gen pengkode 16S rRNA bakteri dengan metode Polymerase
Chain Reactions (PCR)-sekuensing (Ammor et al. 2005).
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi fenotip dan genotip BAL
yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru (Musa
paradisiaca formatypica). Pisang tersebut merupakan jenis pisang plantain yang
banyak dibudidayakan di Kabupaten Lumajang Propinsi Jawa Timur dengan
tingkat produksi dapat mencapai lebih dari 57 ribu ton per tahun (RPJMD
Lumajang 2009).
BAHAN DAN METODE
Bahan
Pisang var agung semeru (Musa paradisiaca formatypica) diperoleh dari
Desa Burno dan Desa Kandang Tepus Kecamatan Senduro Kabupaten Lumajang
Propinsi Jawa Timur. Pisang yang digunakan berumur 16 minggu dari awal
pembungaan yang memiliki tingkat kematangan tahap 1 yaitu pisang tua dengan
kulit hijau merata. Primer universal 16S rRNA adalah 63F dan 1387R yang
diperoleh dari PT. Genetika Science of Indonesia (order ID: 82804-2028)
Metode
Isolasi Bakteri Asam Laktat
Pisang dikupas dan diiris melintang membentuk lembaran dengan ketebalan
sekitar 5 mm. Sebanyak 750 g irisan pisang dimasukkan ke dalam erlenmeyer
berisi 1000 mL akuades steril dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam.
Selanjutnya 10 mL air rendaman diambil dan dilakukan pengenceran hingga 10-3
kemudian dilakukan pemupukan pada media de Mann Rogosa Sharp (MRS) agar
dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama dua hari. Koloni tunggal dimurnikan
dengan goresan kuadran selanjutnya dikelompokkan berdasarkan bentuk koloni,
sifat Gram positif, katalase negatif, dan bentuk morfologi (kokus atau batang).
56
Isolat diinokulasikan dalam media MRS cair dan diinkubasi pada suhu 37 oC
selama 24 jam. Isolat sebelum digunakan dapat disimpan dalam sediaan gliserol
(30% v/v) pada suhu -20 oC.
Identifikasi Fenotip Menggunakan API 50CHL (API-Biomerieux)
Isolat BAL diinokulasikan pada media MRS agar dengan metode gores dan
diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam. Kultur dipersiapkan dengan
mengambil isolat dan dimasukkan ke dalam 10 mL medium suspensi API
(Analytical Profile Index). Lubang pada tatakan plastik diberi akuades steril (± 1
ml), selanjutnya 1 mL kultur diteteskan pada 50 microtube API 50CHL yang
berisi 49 jenis gula, dan pada bagian atas ditutup dengan 1ml parafin cair steril.
Kit API 50CHL diinkubasi pada suhu 37 oC selama 48 jam. Terjadinya perubahan
warna dari biru menjadi hijau hingga kuning atau hitam dinyatakan sebagai uji
positif. Selanjutnya profil isolat dianalisis dengan menggunakan Program
APIWEBTM untuk mengetahui identitas kedekatannya (genus dan spesies).
Identifikasi Genotip Menggunakan PCR dan Analisis Urutan DNA Pengkode
16S rRNA
Identifikasi genotip dilakukan dengan mengekstrak DNA pengkode 16S
rRNA yang selanjutnya diamplifikasi dan dilakukan sekuensing. Ekstraksi DNA
genomik menggunakan Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB). Sebanyak
1.5 mL kultur dalam tabung eppendorf disentrifus (5000 rpm, 7 menit) dan
supernatan dibuang sedangkan pelet ditambah 1 mL akuabides steril yang
selanjutnya disentrifus lagi. Pelet ditambah 600 µL buffer CTAB (1.5% CTAB,
75 mM Tris HCL, pH 8.0, 15 mM EDTA, 1.05 M NaCl) yang mengandung
polivinilpirolidon 2% dan dicampur hingga merata kemudian diinkubasi pada
suhu 65 oC selama 30 menit. Inkubasi dilanjutkan dalam balok es selama 5 menit
yang kemudian ditambah 600 µL PCI (fenol-klorofom-isoamil) dan dibolak balik
serta disentrifus (10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit). Supernatan ditambah 600 µL
57
PCI (fenol-klorofom-isoamil) dan dibolak balik, selanjutnya disentrifus lagi
(10.000 rpm, suhu ruang, 10 menit). Supernatan diambil dan ditambah 2M Na-
asetat pH 5.2 (0.1 x volume) dan etanol murni (2 x volume) kemudian disimpan
dalam freezer selama 2 jam. Selanjutnya larutan tersebut disentrifus (10.000 rpm,
4 oC, 20 menit). Pelet dibilas dengan etanol 70% (500 µL) dan disentrifus (10.000
rpm, 4 oC, 5 menit). Supernatan dibuang dan pelet dikeringkan dengan pengering
vakum 37 - 40 oC selama 15 menit. Ekstrak DNA ditambah 15 µL akuabides dan
6 µL RNAase (100 µg/mL) serta dipanaskan pada suhu 70 oC selama 10 menit.
Visualisasi DNA dilakukan pada gel agarosa (1.5%) dalam larutan 1mM TAE
(Tris Asetat EDTA) 1 X. Pita-pita DNA diamati di bawah UV transilluminator
GelDoc (Labquip) dan difoto dengan kamera UV Canon 1200 (Thompson et al.
1995; Suharsono dan Widyastuti, 2008).
Amplifikasi DNA Pengkode 16S rRNA dengan PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Reaksi amplifikasi sampel DNA dilakukan dalam 0.2 mL tabung PCR. Pada
setiap tabung reaksi PCR ditambahkan RBC Taq (5 unit/mL) sebanyak 0.25 μL,
10 x buffer Taq (mengandung Mg2+) sebanyak 5 μL, dNTP 2.5mM sebanyak 4
μL, primer universal 63F (5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’) dan primer
universal 1387R (5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’) sebanyak masing-masing
1.25 μL (20 pmol) dan 1.25 μL (20 pmol), ekstrak genom sebanyak 2.5 μL (100
ng) dan ditambah ddH2O sampai volume menjadi 50 μL.
Amplifikasi PCR dilakukan dengan menggunakan alat PCR PTC 100 (MJ
Research, Inc) pada suhu 95 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi
pada suhu 94 oC selama 30 detik kemudian 30 siklus penempelan primer pada
suhu 50 oC selama 1 menit, 72 oC selama 2 menit, dan tahap akhir pasca sintesis
pada suhu 72 oC selama 5 menit dan 15 oC selama 10 menit. Produk PCR diambil
dan disimpan pada suhu 4 oC untuk selanjutnya diperiksa dengan menggunakan
elektroforesis agarosa 1% b/v dalam TAE 1x, 100 V selama 30 menit (Sambrook
dan Russel 2008; Suharsono dan Widyastuti 2008).
58
Analisis Urutan DNA Pengkode 16S rRNA
Sekuensing DNA pengkode 16S rRNA dilakukan oleh 1st Base Singapura
melalui PT. Genetika Science of Indonesia. Analisis hasil sekuensing dilakukan
dengan memBLAST urutan nukleotida dari hasil sekuensing DNA pengkode 16S
rRNA dengan data base yang tersedia pada situs www.ncbi.nlm.hts.nih. Pensejajaran
ganda (multiple alignment) dilakukan dengan menggunakan Program Clustal W.
Selanjutnya visualisasi kekerabatan menggunakan pohon filogenetik Program
TREEVIEW X dengan Neighbor-Joining plot (Thompson et al. 1995).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Fenotip Bakteri Asam Laktat
Bakteri asam laktat (BAL) yang diisolasi memiliki karakteristik morfologi
yaitu bentuk selnya batang dan tumbuh optimal pada suhu 35 oC. Karakteristik
BAL yang tumbuh dapat dilihat pada Tabel 5.1. Dua belas isolat dikelompokkan
menjadi dua kelompok berdasarkan kesamaan morfologi, sifat homofermentatif
atau heterofermentatif dan suhu pertumbuhannya. BAL yang tumbuh lebih
dominan (FSnh1-10) memiliki ciri yaitu koloni bulat sedang, berwarna putih susu
dengan elevasi cembung, tidak membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 45 oC tetapi tidak tumbuh pada suhu 15 oC. BAL yang tumbuh kurang dominan
(FSnhA-B) memiliki ciri yaitu koloni bulat kecil berwarna putih bening dengan
elevasi seperti tetesan, membentuk gas dan dapat tumbuh pada suhu 15 oC dan 45 oC. Identifikasi lanjut seperti uji fermentatif menggunakan kit API 50 CHL dan
identifikasi genotip berdasarkan gen pengkode 16S rRNA dilakukan pada dua
kelompok yang diwakili oleh isolat BAL FSnh1 untuk BAL homofermentatif
yang tumbuh dominan dan isolat BAL FSnhA untuk BAL heterofermentatif yang
tumbuh kurang dominan.
59
Tabel 5.1 Karakteristik bakteri asam laktat yang diisolasi dari fermentasi spontan pisang var agung semeru
No Isolat BAL
Karakteristik
Gram Gas Katalase Bentuk Sel Tipikal koloni Suhu Pertumbuhan
15oC 35oC 45oC
1 FSnh1 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
2 FSnhA + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan
+ +++ ++
3 FSnh2 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
4 FSnh3 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
5 FSnh4 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
6 FSnh5 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
7 FSnh6 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
8 FSnh7 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
9 FSnh8 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung
- +++ ++
10 FSnhB + + - Batang Bulat kecil berwarna putih bening dengan elevasi seperti tetesan
+ +++ ++
11 FSnh9 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung.
- +++ ++
12 FSnh10 + - - Batang Bulat sedang berwarna putih susu dengan elevasi cembung.
- +++ ++
Kedua isolat BAL tersebut (isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA) pada
substrat gula kit API 50CHL menunjukkan pola fermentasi yang berbeda dan
mampu memfermentasi gula tertentu sebagai sumber karbon. Pola fermentasi
yang dihasilkan oleh isolat FSnh1 dan isolat FSnhA dapat dilihat pada Tabel 5.2.
60
Tabel 5.2 Pola fermentasi isolat BAL FSnh 1 dan isolat BAL FSnh A pada Kit API 50CHL
Sumber Karbon Kemampuan Memfermentasi Isolat BAL FSnh1 Isolat BAL FSnhA
Gliserol - + D-ribosa + + D-xilosa + + D-galaktosa + - D-glukosa + + D-fruktosa + + D-manosa + + L-sorbosa + - L-rhamnosa + - Metil αD-glukopiranosida - + N-asetil glukosamin + + Amigdalin + - Arbutin + + Eskulin feri sitrat + + Salisin + + D-seliobiosa + + D-maltosa + + D-laktosa - + D-meliobiosa - + D-sukrosa + + D-trehalosa - + Gentiobiosa + + D-turanosa - + Kalium glukonat + -
Uji fermentasi pada kit API 50CHL menunjukkan bahwa kedua isolat
mampu memfermentasi D-ribosa, D-xilosa, D-glukosa, D-fruktosa, D-manosa, N-
asetil glukosamin, arbutin, eskulin feri sitrat, salisin, D-seliobiosa, D-maltosa, D-
sukrosa dan gentiobiosa. Selain itu isolat BAL FSnh1 juga mampu
memfermentasi D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa, amigdalin dan kalium
glukonat, sedangkan isolat BAL FSnhA juga mampu memfermentasi gliserol,
metil αD-glukopiranosa, D-laktosa, D-meliobiosa, D-trehalosa dan D-turanosa
sebagai sumber karbon. Adanya perbedaan kemampuan memfermentasi sumber
karbon tertentu pada kedua isolat BAL yaitu D-galaktosa, L-sorbosa, L-rhamnosa,
gliserol, metil αD-glukopiranosa, amigdalin, D-laktosa, D-meliobiosa, D-
trehalosa, D-turanosa, dan kalium glukonat menunjukkan fenotip biokimiawi
61
kedua isolat tersebut berbeda. Tamang et al. (2008) melaporkan bahwa
identifikasi dengan menggunakan API 50CHL dan karakteristik biologi perlu
dilanjutkan dengan identifikasi genotip untuk memperjelas di tingkat strain
berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA.
Karakteristik Genotip Bakteri Asam Laktat
Karakterisasi genotip isolat BAL dilakukan berdasarkan DNA pengkode
16S rRNA untuk menentukan genus dan strainnya. DNA pengkode 16S rRNA
dapat digunakan sebagai penanda molekuler untuk definisi spesies karena molekul
ini ada pada setiap bakteri dengan fungsi yang identik pada seluruh bakteri. Oleh
karena itu dapat dirancang suatu primer yang universal untuk seluruh kelompok
bakteri. Data urutan basa gen penyandi 16S rRNA dapat digunakan untuk
mengkonstruksi pohon filogenetik yang menunjukkan nenek moyang dan
hubungan kekerabatan suatu organisme (Ward 1998; Pangastuti 2006).
DNA dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA diamplifikasi dengan
menggunakan primer 63F dan 1387R, sedangkan marker pita DNA yang
digunakan mendekati 1500 pasang basa. Hal ini relevan dengan produk PCR yang
dihasilkan yaitu sekitar 1400 pasang basa (Gambar 5.1).
Gambar 5.1 Hasil elektroforesis agarosa 1% dan amplifikasi DNA pengkode gen 16S rRNA dengan PCR. M = marka DNA 1kb DNAladder. a = BAL FSnh1; b = BAL FSnhA
~ 1400 pb
12000 pb
1650 1000
b M a
62
Hasil pensejajaran sekuen DNA pengkode 16S rRNA menunjukkan isolat
BAL FSnh1 dan BAL FSnhA merupakan famili Lactobacillaceae. Hasil Program
Clustal W menunjukkan skor kedekatan tertinggi dari kedua isolat tersebut adalah
84 terhadap genus Lactobacillus. Komposisi nukleotida penyusun DNA pengkode
16S rRNA setiap isolat BAL berbeda sehingga dilakukan analisis kekerabatan
menggunakan program BLAST-N (Basic Local Alignment Search Tool-
Nucleotide) yang dapat diakses secara online dari website NCBI. Berdasarkan
analisis program BLAST-N maka diketahui homologi spesies dari isolat BAL
FSnh1 dan isolat BAL FSnhA seperti yang disajikan pada Tabel 5.3. Isolat BAL
FSnh1 memiliki kemiripan/similaritas dengan Lactobacillus delbruekci subsp.
bulgaricus NDO2 (81%), L. amylovorus GRL 1112 (80%) dan L. iners (80%)
yang masing-masing memiliki query coverage di atas 80%. Isolat BAL FSnhA
memiliki kemiripan 81% dengan Lactobacillus iners dan L. delbruekci subsp.
bulgaricus, serta 80% dengan Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC
19254.
Tabel 5.3 Hasil analisis sekuen DNA pengkode gen 16SrRNA dari isolat BAL FSnh1 dan FSnhA menggunakan program BLAST-N
Isolat Spesies Bakteri Asam Laktat Homolog
Query Coverage
(%)
Identitas Maksimal
(%)
Kode Akses
FSnh1 Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2
Lactobacillus amylovorus GRL 1112
Lactobacillus iners LEAF
86
86
85
81
80
80
NC 008054.1
ACKV01000113.1
AEKH01000023.1
FSnhA Lactobacillus iners LEAF
Lactobacillus delbruekci subsp. bulgaricus NDO2
Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC 19254
84
85
85
81
81
80
AEKH01000023.1
NC 008054.1
ACKV01000113.1
Hasil analisis kekerabatan dengan program BLAST-N kemudian dilanjutkan
dengan analisis pohon filogenetik secara dua tahap menggunakan program
TREEVIEW X yang dikombinasikan dengan program NJplot. Tahap pertama
63
mensejajarkan sekuen kedua isolat BAL dengan isolat internasional dari genus
yang berbeda dalam satu famili yaitu Lactobacillaceae (Gambar 5.2).
Gambar 5.2 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA
isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu famili Lactobacillaceae
Hasil analisis pohon filogenetik tahap pertama menunjukkan bahwa kedua
isolat BAL memiliki skor kesejajaran tertinggi dengan Lactobacillus sebesar 84
dan skor kesejajaran terendah dengan Weisella sebesar 39. Skor kesejajaran antara
isolat BAL FSnh1 dan isolat BAL FSnhA sebesar 92 yang menunjukkan bahwa
kedua isolat tersebut berada dalam genus yang sama yaitu Lactobacillus.
Tahap kedua adalah mensejajarkan kedua isolat BAL dengan isolat
internasional dari spesies yang berbeda dalam genus Lactobacillus dari hasil tahap
pertama. Hasil analisis pohon filogenetik tahap kedua menggunakan program
NJplot menunjukkan bahwa isolat FSnh1 memiliki skor tertinggi sebesar 87
dengan Lactobacillus salivarius ATCC 11741, sedangkan isolat FSnhA memiliki
skor tertinggi sebesar 86 dengan Lactobacillus fructivorans (Gambar 5.3). L.
salivarius dan L. fructivorans memiliki skor kesejajaran sebesar 98 yang
menunjukkan kekerabatan yang dekat antara kedua isolat yaitu memiliki genus
yang sama (Lactobacillus).
LeuconostocFructobacillus
0.0230.055
Oenococcus
0.028
0.112Abiotrophia
AerococcusEremococcus
0.0620.050
0.060
0.016
StreptococcusLactococcus
0.0500.061
0.030
EnterococcusGranulicatellaCarnobacterium
0.0380.037
0.048
Pediococcus0.080
0.010
Lactobacillus0.077
0.009
0.016
FSnh1FSnhA
0.1450.032
0.068
0.087
Weissella
0.192
0.3550.05
64
Gambar 5.3 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA pengkode 16S rRNA
dari isolat BAL FSnh1 dan BAL FSnhA yang dibandingkan dengan sekuen DNA pengkode 16S rRNA bakteri asam laktat genbank dalam satu genus Lactobacillus
Berdasarkan hasil identifikasi genotip, fermentasi spontan pisang var agung
semeru didominasi oleh BAL genus Lactobacillus sp. Pisang var agung semeru
merupakan salah satu jenis pisang olahan (plantain) yang memiliki kadar pati
lebih dari 70 g /100 g tepung yang dihasilkan. Reddy et al. (2008) menjelaskan
bahwa Lactobacillus sp juga dapat ditemukan pada produk pangan berpati seperti
pada fermentasi singkong, beras, dan gandum.
Fermentasi spontan pisang var agung semeru dilakukan secara terendam
dalam akuades steril dengan menggunakan erlenmeyer dan ditutup secara aseptis.
Kondisi demikian memungkinkan bakteri anaerob fakultatif atau mikroaerofilik
seperti L. salivarius dan L. fructivorans yang tumbuh dalam kondisi oksigen
terbatas. L. salivarius adalah bakteri gram positif dengan G + C 32.9%, batang
pleomorfik, anaerob fakultatif, katalase negatif, nonmotil, homofermentatif
obligat, tumbuh baik pada suhu 37 oC (Stern et al. 2006). Bakteri tersebut hidup di
inang seperti pada mulut dan saluran pencernaan mamalia termasuk manusia
(Mozzi et al. 2010).
L.sobriusL.amylovorusL.helveticus
0.008
0.012L.salivarius
L.paracaseiL.fermentumL.vaginalis
0.0540.060
L.collinoides0.011
0.050L.lindneri
L.fructivorans0.0290.019
0.027
0.0760.053
0.061
0.008
FSnh1FSnhA
0.1420.036
0.094
0.087L.casei
L.rhamnosus0.1140.140
L.curvatus0.177
0.278
0.169
0.044
0.05
65
L. fructivorans merupakan bakteri asam laktat berbentuk batang, dapat
tumbuh pada suhu 45 oC, heterofermentatif obligat, dapat membentuk gas dari
glukosa dan glukonat (Dicks & Endo 2009). Hasil BLAST-N isolat FSnhA
memiliki kemiripan dengan isolat Leuconostoc mesenteroides hal ini diduga
karena L. fructivorans dan L. mesenteroides memiliki sifat yang sama yaitu
bersifat heterofermentatif obligat.
KESIMPULAN
Karakteristik bakteri asam laktat (BAL) yang tumbuh pada fermentasi
spontan pisang 24 jam adalah BAL dengan sel berbentuk batang yang tumbuh
optimal pada suhu 35 oC, dapat tumbuh pada suhu 45 dan atau 15 oC dengan tipe
koloni bulat kecil – sedang, berwarna putih bening – susu dengan elevasi
cembung atau seperti tetesan, homofermentatif atau heterofermentatif.
Pola fermentasi kedua isolat adalah berbeda sehingga dilakukan konfirmasi
genotip dengan menggunakan PCR dan sekuen DNA pengkode 16S rRNA untuk
mengidentifikasi di tingkat strain. Visualisasi genotip pada pohon filogenetik
menunjukkan bahwa kedua isolat BAL indigenus pisang adalah Lactobacillus
salivarius untuk isolat BAL FSnh1 dan L. fructivorans untuk isolat BAL FSnhA.
DAFTAR PUSTAKA
Antara NS. 2010. Peran bakteri asam laktat strain lokal untuk memperbaiki mutu dan keamanan produk pangan lokal. [Orasi Ilmiah]. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana.
Antara NS, Sujaya IN, Yokota A, Asano K, Aryanta WR, Tomita F. 2002. Identification and succession of lactic acid bacteria during fermentation of ‘urutan’, a Balinese indigenous fermented sausage. World J Microbiol & Biotechnol. 18: 255–262, 2002.
Ammor S, Rachman C, Chaillou S, Prevost H, Dousset X, Zagorec M, Dufour E, Chevallier I. 2005. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from a small-scale facility producing traditional dry sausages. J Food Microbiol. 22: 373–382
66
Arief II, Jenie BSL, Asyawan M, Witarto AB. 2010. Efektivitas probiotik Lactobacillus plantarum 2C12 dan Lactobacillus acidophilus 2B4 sebagai pencegah diare pada tikus percobaan. J Media Peternakan. 33 (3): 137-143.
Bjorkroth KJ, Schillinger U, Geisen R, Weiss N, Hoste B, Holzapfel WH, Korkeala HJ, Vandamme P. 2002. Taxonomic study of Weissella confusa and description of Weissella cibaria sp. nov., detected in food and clinical samples. Int J Systematic and Evolutionary Microbiol. 52; 141–148
Dicks LMT, Endo A. 2009. Taxonomic Status of Lactic Acid Bacteria in Wine and Key Characteristics to Differentiate Species. S. Afr. J Enol. Vitic. 30 (1): 72-90
Katina K, Maina NH, Juvonen R, Flander L, Johansson L, Virkki L, Tenkanen M, Laitila A. 2009. In situ production and analysis of Weissella confusa dextran in wheat sourdough. J Food Microbiol. 26: 734–743
Kusumawati N, Jenie BSL, Siswasetyahadi, Hariyadi RD. 2003. Seleksi bakteri asam laktat indigenus sebagai galur probiotik dengan kemampuan menurunkan kolesterol. J Mikrobiologi Indonesia. 8 (2): 39-43
Malik A, Ariestanti DM, Nurfachtiyani A, Yanuar A. 2008. Skrining gen glukosiltransferase (gtf) dari bakteri asam laktat penghasil eksopolisakarida. J Makara Sains. 12 (1): 1-6
Mozzi F, Raya RR, Fignolo GM. 2010. Biotecnology of Lactic Acid Bacteria: novel application. Wiley Blackwell Publishing. State Avenue-Ames-Iowa USA.
Pangastuti A. 2006. Definisi spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen penyandi 16s rRNA dan gen penyandi protein. J Biodiversitas. 7(3) : 292-296.
Plessis HW, Dicks LMT, Pretorius IS, Lambrechts MG, Toit MD. 2004. Identification of lactic acid bacteria isolated from South African brandy base wines. Intern J Food Microbiol. 91: 19– 29
Reddy G, Altaf M, Naveena BJ, Venkateshwar M, Kumar EV. 2008. Amylolytic bacterial lactic acid fermentation — A review. J Elsevier- Biotechnol Adv. 26: 22–34.
[RPJMD] Kabupaten Lumajang. 2009. Rencana Pembangunan Jangka Kabupaten Menengah Daerah Kabupaten Lumajang 2010 - 2014.
Sambrook J, Russel DW. 2008. Molecular Cloning a Laboratory Manual, Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, p.999
Stern NJ, Svetoch EA, Eruslanov BV, Perelygin VV, Mitsevich EV, Mitsevich IP, Pokhilenko VD, Levchuk VP, Svetoch OE, Seal BS. 2006. Isolation of a Lactobacillus salivarius strain and purification of its bacteriocin, which is inhibitory to Campylobacter jejuni in the chicken gastrointestinal system. J Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (9) :3111–3116
67
Suharsono, Widyastuti U. 2008. Penuntun Praktikum; Pengantar Genetika Molekuler. Departemen Biologi-FMIPA. Institut Pertanian Bogor
Sujaya N, Ramona Y, Widarini NP, Suariani NP, Dwipayanti NMU, Nociaanitri KA, Nursini NW. 2008. Isolasi dan karakterisasi bakteri asam laktat dari susu kuda sumbawa. J Veteriner. 9 (2): 52-59
Tamang B, Tamang JP, Schillinger U, Franz CMAP, Gores M, Holzapfel WH. 2008. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of North East India. Int J Food Microbiol. 121: 35–40
Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ. 1995. CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, Position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680
Vela AI, Porrero C, Goyache J, Nieto A, Sánchez B, Briones V, Moreno MA, Domínguez L, Garayzábal JFF. 2003. Weissella confuse Infection in Primate (Cercopithecus mona). J Emerging Infectious Diseases. 9 (10)
Ward DM. 1998. A natural species concepts for procaryotes. Current Opinion in Microbiol. 1: 271-277