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3. ANTECEDENTES
Hedí (1941) define a las vitaminas como un compuesto químico cuya presencia en la dieta
es esencial para mantener el crecimiento y la salud, y cuya ausencia o suministro
inadecuado da como resultado el desarrollo de manifestaciones específicas de
enfermedades en la salud.
Las vitaminas difieren de lo que llamamos nutrientes esenciales en varias cosas. Primero, la
cantidad esencial es más pequeña que las de los nutrientes ordinarios tales como proteínas,
grasas, carbohidratos y minerales. Segundo, ellas pueden cambiar y ser “inactivadas” por
temperatura, oxidación, etc. Tercero, pueden existir en una forma inactiva y requieren de
tratamientos específicos tales como irradiación o acción enzimática, para que se vuelvan
fisiológicamente eficientes.
Las vitaminas que se encuentran en forma inactiva en la naturaleza son las provitaminas. El
caroteno, por ejemplo, es la provitamina A.
Combs (1992) menciona, que para el aspecto nutritivo, una vitamina se puede definir de las
siguientes maneras:
• es un compuesto orgánico distinto de grasas, carbohidratos y proteínas;
• es un componente natural de alimentos en donde está comúnmente presente en
pequeñas cantidades;
• es esencial en pequeñas cantidades, para la función fisiológica normal
(mantenimiento, crecimiento, desarrollo y/o reproducción);
• al estar ausente causa un síndrome de deficiencia específico.
• no es sintetizada por el hospedero en cantidades adecuadas para satisfacer las
necesidades fisiológicas adecuadas.
En el siguiente cuadro se muestran los diferentes tipos de vitaminas, sus grupos, vitámeros
(miembros de la misma familia de vitaminas), pro-vitaminas y sus funciones fisiológicas:
Cuadro No. 1. Las Vitaminas: sus vitámeros, pro-vitaminas y funciones.
Grupo Vitameros Pro-vitaminas Funciones fisiológicas Vitamina A Retinol
Retinal Acido retinóico
β-caroteno Criptoxantina
Pigmentos visuales Diferenciación de célula
epitelial Vitamina D Colecalciferol (D3)
Ergocalciferol (D2) Ca homeostasis
Vitamina E α-tocoferol γ-tocoferol
Antioxidante de membrana
Vitamina K Filoquinonas (k1) Menaquinonas (k2)
Menadiona (k3)
Coagulación de la sangre Ca metabolismo
Vitamina C Acido ascórbico Acido dehidroascórbico
Reductor en hidroxilaciones en la
formación de colágeno y carnitina, y en el
metabolismo de drogas y esteroides.
Vitamina B1 Tiamina
Coenzima para
decarboxilaciones de 2-keto ácidos (piruvato)
Vitamina B2 Riboflavina Coenzimas en reacciones
redox de ácidos grasos Niacina Acido nicotínico
Nicotinamida Coenzimas para muchas
deshidrogenasas
Vitamina B6 Pirridoxol Pirridoxal
Pirridoxamina
Coenzimas en el metabolismo de
aminoácidos Acido fólico Acido fólico
Poliglutamil folacinas Coenzimas en el
metabolismo de carbonos sencillos
Biotina Biotina Coenzima para carboxilaciones
Acido pantotenico Acido pantoténico Coenzimas en el metabolismo de ácidos
grasos Vitamina B12 Cobalamina Coenzimas en el
metabolismo de prpionato, amino ácidos
y carbono sencillo Combs, G. F. (1992)
Sólo unas pocas vitaminas son sustancias individuales; casi todas son familias de sustancias
químicamente relacionadas llamadas vitámeros, que comparten actividades biológicas
cualitativas (y no necesariamente cuantitativas) (Ver cuadro 1). Por otro lado, las familias
de vitaminas son químicamente heterogéneas, por eso conviene considerar sus propiedades
físicas (Combs, 1992).
Las vitaminas se dividen en las que son solubles en grasas (liposolubles) como la A, E, D y
K, y las que son solubles en agua (hidrosolubles) tales como la tiamina, vitamina B6, folato,
riboflavina, biotina, niacina, ácido pantoténico, vitamina B12 y vitamina C (Combs, 1992).
Las cuatro vitaminas liposolubles son compuestos isoprenoides. Están formadas, como los
esteroides, por unidades activadas de cinco carbonos. Como grupo tienen una relación
estructural que no se da en las vitaminas hidrosolubles. En cambio, las vitaminas
hidrosolubles tienen una uniformidad funcional, por cuanto todas ellas están diseñadas para
transportar grupos metabólicos móviles, mientras las vitaminas liposolubles son diversas en
sus funciones (Mathews et al, 2002).
3.1. Carotenoides
La estructura básica de un carotenoide es simétrica, lineal, un tetraterpeno de 40 carbonos
hecho de unidades de ocho isoprenoides de 5 carbonos unidas de tal manera que el orden se
revierte en el centro (Rodríguez et. al., 1997).
Los carotenoides son hidrocarburos conjugados que son clasificados como caroteno (sin la
molécula de oxígeno) y xantofilas (con una o más moléculas de oxígeno) (Rodríguez et. al.,
1997).
Uno de los micronutrientes antioxidantes más prometedores es el caroteno. Los carotenos
fueron primero identificados en la raíz del vegetal que hoy conocemos como zanahoria. Las
zanahorias son originarias de Asia en el área de Afganistán hace unos 3000 años y
lentamente se diseminaron en el área del Mediterráneo. Las primeras zanahorias eran
blancas, púrpuras y amarillas – no naranjas. Las zanahorias naranjas fueron desarrolladas
en 1600 por los holandeses (http://www.kenil.com.uy/menu11-2/2.htm).
La vitamina A se proporciona en la dieta como vitamina A preformada (éster de retinil,
retinol, retinal, 3-dehidroretinol, y ácido retinoico) de alimentos de origen animal como el
hígado, leche y productos lácteos, pescados, y carne; o como carotenoides que pueden ser
transformados biológicamente a vitamina A (provitaminas A), generalmente de plantas. La
provitamina A tiene la ventaja de ser convertida a vitamina A solo cuando el cuerpo lo
necesita; así se evita una toxicidad potencial por una sobredosis de vitamina A (Rodríguez
et. al., 1997).
Los carotenoides (β-caroteno, 13 y 9 -cis-β.caroteno, γ-caroteno, α-caroteno, cis-α-
caroteno, β-zeacaroteno, β-α- criptoxantina, cis-β-criptoxantina) (Rodríguez et. al., 1997)
son formas de provitamina A encontradas en las plantas. Los carotenoides se encuentran
naturalmente en las plantas como el α-caroteno, γ-caroteno, licopeno, luteína, xantofila,
zeaxantina, criptoxantina y β-caroteno, siendo este último el mejor y más ampliamente
conocido (http://www.kenil.com.uy/menu11-2/2.htm).
Los carotenoides van a ser un grupo de pigmentos vegetales liposolubles de color intenso
(rojo, anaranjado y amarillo). Todos los organismos que dependen del sol para obtener
energía, sean bacterias o plantas, contienen carotenoides. Su efecto antioxidante hace que
estos compuestos tengan un papel esencial para proteger a los organismos de daños durante
la fotosíntesis. (http://www.kenil.com.uy/menu11-2/2.htm). Una función principal de
carotenoides tiene que ver claramente con la absorbancia de la luz en el proceso de la
fotosíntesis (De Leenheer, 2000)
En general, mientras mayor sea la intensidad del color, mayor será el contenido de
carotenoides. En las hortalizas de hoja, el β-caroteno es el carotenoide predominante. Las
frutas y hortalizas anaranjadas, como las zanahorias, los chabacanos, los mangos o la
calabaza, tienen concentraciones elevadas de beta caroteno, pero predominan otros
carotenoides precursores de la vitamina A. Las hortalizas amarillas tienen una mayor
concentración de carotenoides amarillos (xantofilas) y por lo tanto, menor actividad como
precursores de la vitamina A; sin embargo, algunos de estos compuestos, como la luteína,
pueden tener beneficios importantes para la salud debido a sus posibles efectos
antioxidantes. Las frutas y hortalizas rojas y moradas, como el tomate rojo, la col morada y
las ciruelas, contienen en su mayoría carotenoides que no están relacionados con la
vitamina A. Las legumbres, los cereales y las semillas son también fuentes importantes de
carotenoides. Los carotenoides se encuentran también en varios alimentos de origen animal,
como el salmón, la yema de huevo, los mariscos, la leche y el pollo. El jugo de zanahoria y
las “bebidas verdes” preparadas con verduras, hojas de cebada deshidratada o pasto de
trigo, contienen también distintos carotenoides (Caliendo, 1984).
En cuanto a la dosis recomendada, algunos médicos recomiendan a la mayoría de las
personas un suplemento máximo de 25,000 UI (unidades internacionales) (15mg
aproximadamente) al día de β-caroteno, y aproximadamente 6 mg al día de α-caroteno,
luteína y licopeno, ya que estudios preliminares indican que estos niveles de ingesta
favorecerán un mejor estado de salud (Combs, 1992).
3.2. Vitamina A
Fisher y Bender (1983) mencionan que la vitamina A son todos los retinoides que muestran
actividad biológica del denominado “todo-transretinol”. Las verduras y hortalizas amarillas
contienen carotenoides provitamínicos que se convierten en retinal en las células mucosas
del intestino delgado, el retinal es reducido a retinil y posteriormente esterificado. La mayor
parte de la vitamina A del organismo se almacena en el hígado en forma de palmitato de
retinil. Se libera a la circulación en forma de retinol, unido a una proteína fijadora del
retinol y a la prealbúmina (transretina).
En 1915 cuando se le dio nombre a esta vitamina, se descubrió que dicha sustancia era
esencial para el crecimiento de los animales jóvenes estimulando de alguna manera el
desarrollo del sistema nervioso. Se sabe que cuando hay deficiencia de vitamina A se
observan varios trastornos, los primeros de los cuales afectan la vista, ya que esta vitamina
interviene de manera importante en el proceso visual en los bastones de la retina, células
que son las responsables principales de la visión con poca luz, con una detección
relativamente escasa de color. (Mathews et al, 2002).
La vitamina puede ingerirse con el alimento o puede biosintetizarse a partir del β-caroteno.
La biosíntesis de la vitamina A se muestra a continuación (Figura1):
Fig. 1. Biosíntesis de vitamina A
En las verduras que contienen caroteno, el verde de la clorofila cubre su color. El caroteno
del pasto es la fuente de vitamina A que se encuentra en los productos lácteos y en el
hígado del ganado (Fisher y Bender 1983).
Entonces los retinoides serán compuestos isoprenoides que se encuentran en productos
animales y los carotenoides serán pigmentos isoprenoides producidos por las plantas
(Combs, 1992).
El reporte de la actividad de la vitamina A requiere de una estandarización. Hay dos
sistemas utilizados para lograr esto: las unidades internacionales (IU) y los equivalentes de
retinol (RE) (Combs, 1992), dicho término se acuño para permitir la comparación entre las
diferentes fuentes de actividad de vitamina A (Mc Laren et. al., 2002).
Aunque la vitamina A ya se puede conseguir en forma cristalina y, por tanto, se puede
pesar, a veces, aún se mide en unidades internacionales. El siguiente cuadro muestra las
relaciones que hay entre diferentes compuestos:
Cuadro2. Unidades Internacionales (UI) y Equivalentes de Retinol (ER)
Compuesto µg/UI UI/ µg ER/µg µg/ER
todo-trans retinol 0.300 3.33 1.000 1.00
todo-trans retinil acetato 0.344 2.91 0.873 1.15
todo-trans retinil palmitato 0.549 1.82 0.546 1.83
todo-trans γ-caroteno 1.800 0.56 0.167 6.00
Carotenoides mixtos* 3.600 0.28 0.083 12.0
*Carotenoides provitamina A sin incluir el γ-caroteno. MacLaren & Frigg, 2002.
3.3. Estructura y Nomenclatura
La vitamina A con actividad biológica de retinol se deriva de un compuesto precursor mono
cíclico que contiene cinco dobles enlaces de carbono-carbono y un grupo funcional al final
de la porción acíclica (Combs, 1992).
Combs también menciona que hay tres formas en que los retinoides activos de la vitamina
A se presentan en la naturaleza; la primera es el alcohol retinol, la segunda es el aldehído
retinal o retinaldehído, y la tercera el ácido retinoico.
La vitamina A en sí (retinol) y su forma ácida estrechamente relacionada (ácido retinoico),
que efectúan la mayoría de las funciones de la vitamina A en el organismo, se almacenan
en el interior de los animales y seres humanos (McLaren & Frigg, 2002).
Sólo una pequeña parte de carotenoides está presente en los alimentos que consumimos, los
cuales son de dos tipos, carotenos y retinoides. En la figura 2 y figura 3, se muestran las
fórmulas del β-caroteno, retinol y algunos de los carotenoides y retinoides relacionados más
importantes (McLaren & Frigg, 2002).
Fig. 2. Estructura química de carotenoides.
Fig. 3. Estructura química de retinoides
La cadena larga del β-caroteno habitualmente es dividida a la mitad por una enzima que
está presente en el intestino produciendo dos moléculas de retinol (McLaren & Frigg,
2002). El otro tipo de carotenoide, incluidos la luteína, el licopeno y otros, no pueden
formar vitamina A.
3.4. Propiedades químicas
En solución, los retinoides y carotenoides se pueden convertir a isómeros geométricos por
la luz, el calor y yodo a través de isomerismo cis-trans de la cadena de dobles enlaces.
Por su largo número de dobles enlaces, los carotenoides tanto en plantas como en animales
se presentan casi exclusivamente en la forma trans. Estos sistemas absorben luz y en el
caso de los carotenoides parece que apagan radicales libres. Para los retinoides, el grupo
funcional en la posición 15 determina la reactividad química específica. Así, el retinol
puede ser oxidado a retinal y ácido retinoico o esterificado con ácidos orgánicos; el retinal
puede ser oxidado a ácido retinoico o reducido a retinol; y el ácido retinoico puede ser
esterificado con alcoholes orgánicos (Combs, 1992).
La mayoría de las formas de la vitamina A son cristalizables pero tienen un punto de fusión
bajo (retinol: 62-64°C, retinal: 65°C). Ambos, retinoides y carotenoides tienen un gran
espectro de absorción. La vitamina A y los carotenoides de pro-vitamina A son muy
sensibles al oxígeno en el aire, especialmente en presencia de luz y calor; por eso, el
aislamiento de estos compuestos requiere de la exclusión de aire y la presencia de un
antioxidante (Combs,1992)
Los diferentes carotenos se almacena también en el tejido graso de la piel (palmas de las
manos y pies principalmente), por lo que se puede subsistir largos períodos sin su aporte
(Marks, 1975)
La función principal de la vitamina A es la protección de la piel y su intervención en el
proceso de visión de la retina. También participa en la elaboración de enzimas en el hígado
y de hormonas sexuales y suprarrenales. El déficit de vitamina A produce ceguera nocturna,
sequedad en los ojos (membrana conjuntiva) y en la piel y afecciones diversas de las
mucosas. En cambio, el exceso de esta vitamina produce trastornos, como alteraciones
óseas, o incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos. El consumo de alimentos
ricos en vitamina A es recomendable en personas propensas a padecer infecciones
respiratorias (gripes, faringitis o bronquitis), problemas oculares (fotofobia, sequedad o
ceguera nocturna) o con la piel seca y escamosa (acné incluido) (Marks, 1975).
Debido a que los carotenoides absorben en forma máxima a diferentes longitudes de onda y
tienen diferentes coeficientes de absorción, los resultados obtenidos de la normalización
(porcentajes de área) sólo se pueden considerar como proporciones relativas aproximadas.
Para la ciencia de los alimentos y para propósitos nutricionales, los resultados son sólo
útiles si se presentan en términos de concentración, es decir, peso de la provitamina por
unidad de peso de la muestra. Esto se puede realizar en HPLC mediante curvas de
calibración interna o externa (Rodríguez-Amaya, 1997).
3.5. Mecanismos de acción
La vitamina A (retinol) y el β-caroteno y otros carotenoides provitamina A, son liberados
en el estómago y al igual que todos los demás lípidos son absorbidos por la pared del
intestino delgado y se transforman en parte de los quilomicrones que ingresan al torrente
sanguíneo. Desde aquí son tomados por el hígado, donde son almacenados en forma de
retinil éster principalmente en células estrelladas. Para ser transportado a otras partes del
organismo, el retinol se une a su propia proteína, la proteína ligante de retinol (RBP por su
sigla en inglés) y a otra proteína llamada transtiretina (TTR por su sigla en inglés) (Figura
4).
Fig. 4. Mecanismo de acción del ácido retinoico.
Recientemente se ha descubierto que en el núcleo de las células hay dos conjuntos de tres
receptores nucleares (conocidos como RAR y RXR por su sigla en inglés) (ver figura 4).
Estos receptores nucleares son activados por una forma acídica de retinol como el ácido
retinoico (RA por sus siglas en inglés). En las células de los órganos y tejidos de todo el
organismo el RA es la forma activa de la vitamina A. Se ha demostrado que los receptores
nucleares RAR y RXR activan numerosos genes. Estos receptores actúan como hormonas,
tales como los esteroides y las hormonas tiroideas, con las cuales están vinculadas
estrechamente. Es a través de este mecanismo que la vitamina A ejerce sus funciones, con
la única excepción de la visión. En las células de la retina (conos y bastoncillos)
responsables de la visión, la forma funcional de la vitamina A no es el ácido retinoico (RA)
sino el 11-cis retinal (McLaren, 2002).
Los bastoncillos de la retina contienen una proteína, la opsina, ligada a una forma de
vitamina A, el 11-cis retinal, que forma un compuesto sensible a la luz, la rodopsina o
púrpura visual. Al ser expuesto a la luz, el 11-cis se convierte en todo-trans retinal y genera
un impulso nervioso. Cuando hay deficiencia de vitamina A, se reduce el suministro de
retinal con el deterioro consiguiente de la función de los bastoncillos (McLaren, 2002).
3.6. Aislamiento
En la naturaleza la vitamina A se encuentra como éster, y por lo tanto es altamente soluble
en solventes orgánicos pero no en soluciones acuosas. El β-caroteno, tiene propiedades en
solventes similares. Uno de los recursos más ricos de vitamina A en particular son los
aceites del hígado de peces y mamíferos marinos. Los ésteres pueden ser aislados
directamente de éstos aceites por destilación molecular a muy baja presión.
Alternativamente, la vitamina A puede ser extraída directamente con cloroformo o con otra
combinación de solventes, tales como hexano junto con etanol, seguido por purificación de
la vitamina A por medio de cromatografía. Para hidrolizar los esteres, no sólo de vitamina
A y carotenoides sino también de triglicéridos y otros lípidos se usa comúnmente la
saponificación con KOH, seguida por la extracción con solventes orgánicos (Machlin,
1991).
3.7. Dificultades en la medición de provitamina A
Rodríguez-Amaya (1997), hace mención en que hay que tomar en cuenta varios aspectos
para la determinación y contenido de provitamina A en alimentos para poder tener una
validez y confiabilidad en los datos que se obtienen, ya que se suelen presentar varias
dificultades en el análisis de carotenoides.
Rodríguez-Amaya (1997) también menciona que para estas dificultades de análisis se
pueden comprender los siguientes factores:
- Existen muchos carotenoides naturales
- La composición de los carotenoides en los alimentos varía tanto cualitativa como
cuantitativamente
- Las concentraciones de carotenoides en un alimento dado cubren un amplio rango
- Sólo unos pocos carotenoides son provitaminas A y aquellos que lo son varían en su
bioactividad
- Los carotenoides tienen una predisposición a la isomerización y oxidación
Por estos factores pueden ocurrir problemas al separar, identificar y cuantificar los
carotenoides junto con su degradación al momento de realizarse el análisis.
Sin importar el método que se escoja, se deben tomar ciertas precauciones para evitar
transformaciones y pérdidas cuantitativas de los carotenoides durante el análisis. Estas
incluyen (Rodríguez-Amaya, 1997):
- Completar el análisis dentro del plazo más breve posible
- Usar solventes de grado reactivo o destilados libres de impurezas nocivas, tales
como éter etílico libre de peróxidos y tetrahidrofurano, o cloroformo libre de ácido.
- Proteger de la luz
- Excluir oxígeno, por ejemplo utilizando una atmósfera al vacío, de nitrógeno o de
argón
- Evitar altas temperaturas
Históricamente muchos de los datos de los carotenoides se han obtenido midiendo la
absorción total a una longitud de onda determinada, o más comúnmente por una
cromatografía de columna abierta seguida por una cuantificación espectrofotométrica como
en el método de la AOAC (Hart et al. 1995).
Tee & Lim (1991), realizaron un trabajo en donde se determinaron los contenidos de β-
caroteno de cuarenta vegetales y catorce frutas utilizando un método cromatográfico de
columna abierta de la AOAC, y se comparó con un método nuevo desarrollado con HPLC
fase reversa, en el cual los carotenoides se separaron isocráticamente en una columna C18
(octadecilsilano) usando una mezcla de acetonitrilo, metanol y etil acetato. Los resultados
obtenidos mostraron que el método de la AOAC dio resultados falsamente elevados para
muestras que contenían α-caroteno, así como aquellos con muy bajas concentraciones de β-
caroteno. Por otro lado, los métodos de HPLC separaron exitosamente y cuantificaron la
mayoría de los carotenoides presentes; luteína, criptoxantina, licopeno, γ- y α- carotenos
además de β-caroteno. Este estudio demostró que el método de HPLC dará una imagen más
completa de la composición de carotenoides así como una cuantificación más precisa del
valor de la vitamina A de vegetales y frutas.
También se puede requerir de antioxidantes y agentes neutralizantes especialmente cuando
el análisis es prolongado. Las muestras después de cortarse se deben extraer
inmediatamente para evitar la oxidación enzimática. De hecho, la desintegración de la
muestra y la extracción con un solvente orgánico se realizan generalmente en forma
simultánea. Una buena medida es comenzar el análisis tan pronto como se recolecten las
muestras debido a que es difícil preservar las muestras sin alterar su composición
(Rodríguez-Amaya, 1997).
Rodríguez-Amaya menciona cuales son los errores comunes al analizar carotenoides los
cuales se mencionan a continuación:
- Muestras que no representan los lotes de alimentos bajo investigación
- Extracción incompleta
- Pérdidas en la partición, saponificación y lavado
- Separación incompleta
- Mala identificación
- Fallas en la cuantificación y cálculo
- Isomerización y oxidación de los carotenoides durante el análisis
La revista food chemistry en su volumen 54 publicado en 1995, publicó un trabajo en el
cual se describe un método para el análisis de carotenoides en vegetales y frutas utilizando
el HPLC. Sus análisis demuestran que los mejores recursos (>1000µg/100g) de β-caroteno
son el brócoli, zanahoria, lechuga, espinaca, perejil y berro. Su estudio demostró la
necesidad de una evaluación cuidadosa de procedimientos analíticos y validación de
respuestas de carotenoides, esto para evitar factores que causen variación y errores en la
determinación cuantitativa de carotenoides.
Por otra parte, con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantáneos
se efectuó la validación de la metodología para la determinación de la vitamina A por
cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisión del sistema se
evaluaron tres parámetros: tiempo de retención, área y altura. Cada técnica que ha sido
propuesta para la medición de vitamina A en alimentos infantiles tiene sus ventajas y
limitaciones, pero, comparado con otros métodos de HPLC, es que en éste método el
tratamiento de la muestra se realiza con menos tiempo, en relación con el método oficial de
la AOAC (Pérez, 2000).
3.8. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Actualmente se dispone de métodos de laboratorio para medir las cantidades de diferentes
formas de retinol, conocidos en conjunto como retinoides, y también los carotenoides
individuales. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC por sus siglas en inglés)
ha reemplazado a la mayoría de los métodos siendo también, más cara y con necesidad de
instalaciones de alta calidad.
Los métodos cromatográficos involucran el paso de una solución (la fase móvil) a través de
un medio (la fase estacionaria) que presenta una adsorción selectiva para los distintos
componentes solutos de la muestra. La rapidez con la que pasa cada componente de la fase
móvil depende de manera inversa de la fuerza con la que interactúe con la fase estacionaria.
Una de las ventajas del HPLC sobre los otros métodos cromatográficos habituales es que en
éstos, sólo se aplica una pequeña presión hidrostática para hacer que los fluidos pasen a
través de la columna y la elusión (paso a través de la columna) requiere varias horas, por lo
que esos procesos son muy lentos y en ocasiones perjudiciales para los productos sensibles;
además, la muestra tiende a esparcirse, debido a la difusión, a medida que baja a lo largo de
la columna. Cuanto más dure el experimento, más grave será la extensión y quedará
afectada la resolución de los componentes. En cambio con la técnica del HPLC se utilizan
presiones de 2000 a 3000 psi para hacer que las soluciones pasen rápidamente a través de la
resina. Este nivel de presión ha requerido el desarrollo de resinas no compresibles y
columnas metálicas fuertes en las que se lleva a cabo el proceso. De esta manera las
separaciones que antes llevaban horas, ahora pueden realizarse en minutos y con una
resolución más elevada (Mathews et al, 2002).
La cromatografía en sus muchas formas es ampliamente utilizada como un separador y una
técnica analítica. Se utiliza para la separación de un gran espectro de productos
farmacéuticos, alimentos y compuestos bioquímicos. Las ventajas del HPLC sobre otras
formas de cromatografía líquida se pueden resumir así: (i) la columna de HPLC puede ser
utilizada varias veces sin regeneración; (ii) la resolución alcanzada en tales columnas
excede por mucho los métodos viejos; (iii) la técnica es menos dependiente de la habilidad
del operador; (iv) la instrumentación del HPLC deja a si mismo la automatización y
cuantificación; (v) los tiempos de análisis son generalmente mucho más cortos. (Hamilton,
et al. 1977).
3.8.1. Equipo básico para HPLC
3.8.1.1. Fase móvil. El intervalo de solventes que se pueden utilizar como fase móvil para
el HPLC es amplio. Son comunes el agua y soluciones amortiguadoras acuosas, así como
también muchos solventes no acuosos de baja viscosidad. Los solventes de alta viscosidad
se evitan ya que requieren de un mayor tiempo para pasar a través de la columna, lo cual
provoca un ensanchamiento del pico, una resolución muy pobre, y una presión más alta
para forzar al solvente a través de la columna (Pomeranz y Meloan, 1994).
Los solventes utilizados deben estar libres de partículas suspendidas así como de impurezas
químicas. Las partículas suspendidas tienden a tapar la columna y las impurezas químicas
producen falsos picos en el detector. Si se quiere tener una buena separación con HPLC, se
deben de usar solventes altamente puros. La muestra también es un problema, se debe estar
seguro de que no hay partículas suspendidas o no disueltas en la muestra antes de ser
inyectada en la columna. Para asegurar que la muestra está libre de partículas se pasa a
través de un filtro, se recomienda un filtro de Teflón de 0.45µm para solventes orgánicos.
(Pomeranz y Meloan, 1994).
3.8.1.2. Bomba. La bomba es una de los principales componentes de una cromatógrafo
líquido de alta resolución. Pomeranz y Meloan (1994), mencionan que una buena bomba
para HPLC debe tener las siguientes características:
1. Alta presión para forzar los líquidos a través de la columna.
2. Capacidad para obtener tasas de flujo reproducibles y estables en el intervalo de 30-
a 200 mL/hr, utilizando una variedad de solventes con una medida de flujo natural,
y tasas de flujo independiente de la presión de la columna.
3. Flujo no palpitante para lograr una sensibilidad completa de los detectores.
4. Capacidad para cambiar incluso solventes inmiscibles fácil y rápido.
5. Permitir una máxima libertad para escoger solventes, incluso aquellos que son
volátiles y corrosivos.
6. Gradiente de elusión hábil y capaz para mezclar solventes en proporciones
deseadas.
7. Alta confiabilidad y mantenimiento mínimo.
3.8.1.3. Gradiente de Elusión. Si la composición del solvente se mantiene constante a
través de toda la separación, el proceso se llama elusión isocrática. Pero, si la composición
del solvente se cambia de cualquier manera (pH, intensidad del buffer, mezclas de
diferentes solventes), entonces el proceso se llama gradiente de elusión. El gradiente de
elusión es particularmente utilizable cuando se separan mezclas que tienen varias
características, por que los empaques de las columnas generalmente funcionan bien solo en
un intervalo reducido de las características de muestra. Sin embargo, si las características
del solvente se van cambiando progresivamente, entonces el comportamiento del
compuesto de la muestra se alterará (Pomeranz y Meloan, 1994)
3.8.1.4. Columnas y Empaquetamiento de columnas. Las columnas para HPLC
normalmente son de 10-30 cm de largo y 3-10 mm de diámetro. Son comúnmente hechas
de acero inoxidable. Las altas presiones utilizadas requieren de un material de
empaquetamiento muy duro. Por estos requerimientos, las partículas de la columna están
comúnmente hechas de silica o alumina y consiste de partículas redondas. Pomeranz y
Meloan (1994), mencionan que normalmente hay tres tipos generales de partículas: las
completamente porosas, las peliculares y las microporosas.
- Completamente porosas: Las partículas completamente porosas las hay de varios
tamaños, pero un tamaño popular para trabajar es de cerca de 50 µm de diámetro.
Tienen un área superficial muy grande de 300-500 m2/g. Esta gran área significa
una gran capacidad de la columna, por lo que estos materiales son utilizados para
separaciones preparativas. El tiempo de retención con partículas completamente
porosas son un poco más largos por que las distancias de difusión (25µm dentro y
25µm fuera) pueden ser más largas. Ejemplos de estas son Porasil, Styragel, y el
Porasil Durapak y Porasil Bondapak .
- Peliculares: Las partículas peliculares consisten de un núcleo sólido con una
cubierta grabada a la superficie de 2 a 3 µm. También miden cerca de 50µm de
diámetro, pero su área superficial (10-30 m2/g) es mucho menos que las de las
partículas completamente porosas. Entonces la capacidad de la columna es mucho
menor, pero por sus pequeñas distancias de difusión (2µm dentro y 2µm fuera) son
altamente eficientes y excelentes para separación analítica. Ejemplos de ellas son
Corasil y Corasil Durapak y Corasil Bondapak.
- Microporosa: Miden aproximadamente 10µm de diámetro son partículas
completamente porosas. Son altamente eficientes y tienen un embalaje de alta
velocidad y se utilizan para las separaciones más eficientes. Su elevada porosidad,
significa que es posible una carga más pesada que la de las partículas peliculares.
Además ya que las distancias de difusión de las partículas microporosas son
pequeñas, tienen muy buena eficiencia. Ejemplos de materiales microporosos con
micro-Porasils, Bondapaks, y Styragels.
Diagramas del los tipos de empaquetamiento de columnas:
Fig. 5. Tipos de empaquetamiento de columnas
3.8.1.5. Detectores. El detector es otro de los componentes críticos de un cromatógrafo
líquido de alta resolución. Hay diferentes tipos de detectores a continuación se mencionarán
los más comunes (Pomeranz y Meloan, 1994):
- Detector de absorción ultravioleta: Este detector utiliza una lámpara de mercurio de
baja presión como recurso. Normalmente, tienen rango de absorbancia de 0.001 a 3
unidades de absorbancia. El detector UV es particularmente útil para muchos
componentes alimenticios, aditivos, pesticidas y medicinas, ya que estos
compuestos contienen grupos funcionales –C=C-, -C=O, -N=O y –N=N- , los cuales
absorben radiación UV.
- Detector de índice de refracción: El detector de índice refractivo (RI) se aplica a
todos los compuestos aunque no es tan sensible como el detector UV. En el detector
RI deben pasar 5 x 10- 7 g/mL a través del detector para una muestra favorable. Los
detectores de índice de refracción son difíciles de utilizar con un sistema de
gradiente de elusión y el control de la temperatura de los solventes es crítico.
- Detector de fluorescencia: Una forma de disminuir los límites de detección de
muchas variedades de compuestos, es midiendo su fluorescencia natural. Los
compuestos que no fluorescen naturalmente pueden reaccionar a veces, después de
la separación, con agentes específicos para formar un producto fluorescente. Los
detectores de fluorescencia generalmente tienen límites de detección que son de 100
a 1000 veces mas bajos que los de los detectores estándar de UV.
Existen varios métodos para la extracción y análisis de vitamina A en muestras de origen
animal, incluso muchas de ellas están registradas en las Normas Oficiales Mexicanas, cada
uno utiliza distintos métodos obteniendo diferentes resultados, pero no hay alguno que en sí
haga una determinación para ver qué método es el más efectivo. Por tal motivo se hará una
comparación de cinco métodos reportados para la extracción de provitamina A para
determinar cuál es su efectividad en muestras de jugo de zanahoria.