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EFEITOS EM MACROMOLÉCULAS
PROTEÍNAS
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Estrutura dos 20 aminoácidos que compõe as proteínas
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IMPORTÂNCIA DAS LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS
1. Ligações covalentes não podem ser as responsáveis pelas interações entre moléculas na célula, pois, por definição, numa ligação covalente os átomos unidos devem pertencer a uma mesma molécula.
2. Ligações fracas ocorrem entre átomos de uma mesma molécula ou moléculas diferentes.
3. Uma ligação química é uma força atrativa que mantém átomos juntos.
4. HbA é mantida por ligações fracas.
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5. Ligações fracas são facilmente quebradas.
6. Dois H mantidos por ligação covalente H2 são separados por 0,74 A
enquanto que por Van der Waals 1,2 A
7. O máximo de ligações covalentes no de valência (oxigênio tem 2 valências)
8. No caso de ligações fracas, o fator limitante é puramente espacial
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9. O ângulo entre duas ligações covalentes é sempre o mesmo. Por exemplo:
para ligações fracas o ângulo é variável
10. Quanto mais forte a ligação, maior a energia liberada por ela.
A + B AB + energia
CH
H
H
H
Todos tem 109o
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11. CALORIACal quantidade de energia necessária para elevar a temperatura de 1 grama de água de 14,5 para 15,5 oC.Em geral, usa-se kcal/mol
1kcal = 26 eV
12. As ligações podem ser quebradas por calor, radiação, etc.AB + energia A + B
13. No equilíbrio temos:conc. AB
conc. A x conc. BKeq =
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14. Energia livre é a energia capaz de realizar o trabalho (G )G (G é negativo) reação espontânea
no equilíbrio G = 0
15. Quanto mais forte a ligação, maior a mudança na “energia livre” que acompanha a sua formação, maior o no de átomos ligados.
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16. G = - R.T.lnKeq R=1,987 cal/o/mol Keq = e - G / RT T = temp. absoluta
Keq = cte equilíbrio
Keq G kcal/mol0,001 4,0890,01 2,7260,1 1,3631,0 010 -1,363100 -2,7261000 -4,089
Temperatura = 25oC (298K)
G para ligações covalentes (H, O, etc) é da ordem de -50 a -110 kcal/mol keq muito alta, portanto a concentração de átomos não ligados será muitopequena.
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17. Ligações fracas têm energias que variam de 1 a 7 kcal/mol e são constantemente feitas e quebradas.
18. Moléculas polares facilitam a formação de ligações fracas.
O2-
H+
H+
0,95 A
Raio de Van der Waals p/ o oxigênio é 1,4 A
Raio de Van der Waals p/ o hidrogênio é 1,2 A
105o
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19. Tipos de LIGAÇÕES QUÍMICAS FRACAS
a) Forças de Van der Waalsb) Pontes de hidrogênioc) Ligações iônicasd) Ligações hidrofóbicas
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20. Van der WaalsForça atrativa que se origina pela aproximação de dois átomos ou moléculas.Energia 1 kcal/mol
Átomo Van der Waalsraio -
H 1,2N 1,5O 1,4P 1,9S 1,85CH3 2,0
A
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21. Pontes de hidrogênioEnergia varia entre 3 a 7 kcal/mol. Aparece um hidrogênio ligado covalentemente com alguma carga positiva e um aceptor ligado covalentemente, porém carregado negativamente.
Átomos Distância AO – H--------O 2,70O – H--------O- 2,63O – H--------N 2,88N – H--------O 3,04N+ - H--------O 2,93NH-----------N 3,10
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10 A
fraca
5 A
forte
4 A
atração e repulsão balanceadas
A soma de vários átomos ou moléculas pode chegar a 10 kcal/mol.
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CR C = O
C = O
H
H
H N
C
R
Entre grupos peptídicos
C = O H O
H
H
C
H
Entre grupos OH
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H O-O C = O
H O-N+
H
C = O
H
Entre COO- e OH da Tyr
Entre NH3+ e COO-
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H O = CO
N
C C
H H
R
H Entre OH da Serina e um grupo peptídico
Ponte de Hidrogênio são mais fortes quando apontam diretamente para o aceptor
H O
OH
mais forte mais fraca
OHH
O
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22. Ligações iônicasTêm energia média de 5 kcal/molOcorrem entre moléculas que têm uma ou mais unidades de carga positiva ou negativa líquida.Ex: COO- e NH3
+
23. Ligações fracas necessitam de superfícies complementares (chave - fechadura).
24. Moléculas de H2O formam pontes de hidrogênio. Moléculas orgânicas que formam pontes de hidrogênio são solúveis em água.
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25. Moléculas não polares como o Benzeno, em água tendem a se unir ligações hidrofóbicas (tendência da água a excluir grupos não polares)
26. Ligações fracas participam das ligações E - S, dão flexibilidade e a forma das moléculas.
27. Algumas moléculas formam hélices e subunidades.Ferritin tem PM 480.000, porém não contém uma única cadeia de 4.000 a.a. , mas 20 polipeptídeos idênticos de cerca de 200 a.a.
28. Subunidades são econômicas e diminuem o erro de síntese
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Formação de estrutura secundária das proteínas
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Formação de estrutura terciária das proteínasExemplo: hemoglobina humana
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Formação de estrutura quaternária das proteínasExemplo: hemoglobina humana
Deoxihemoblobina Oxihemoglobina
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Interação Enzima – SubstratoEstrutura terciária da Hexokinase A
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Formação de agregação de proteínas
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Ação da radiação
DIRETA
INDIRETA
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AÇÃO DIRETA1. Absorção de Energia
Excitação e Ionização
2. Processos de transferência de EnergiaESR (Ressonância Eletro Spin)
R STermoluminescência
Adição de 3H
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3. Formação de moléculas danificadas estáveis
4. Características da ação direta
4.a. Relação dose-efeitoTeoria do alvo A = Ao . c
Beauragard (1985), Kempner (1986)temperatura dependente
Swillens (1986) - considera “target” e a eficiência do “hit”
processo multievento estocástico
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“Teoria do alvo – target size”1. Num organismo vivo temos um ou mais “target(s)”.
2. A interação da radiação com um organismo vivo é ao acaso
3. Um “hit” ou uma interação da radiação com o target mata, inativa ou induz um efeito radiobiológico no organismo
4. A probabilidade de produção de um hit é proporcional ao tamanho do target.
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5. Para radiações de alta energia ocorre o que chamamos de ionizações primárias.
6. Uma ionização primária envolve 66 eV de energia 1500 kcal/molLigação covalente 100 kcal/molPonte de hidrogênio 7 kcal/mol
7. Como as ionizações ocorrem ao acaso, a probabilidade de ocorrer 0, 1, 2, ..., n ionizações é dada pela fórmula de Poisson
P(n) = e-x (X)n
n!Onde x é a função da exposição à radiação.
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8. Como a energia é muito alta cada vez que ocorre 1 HIT INATIVAÇÃO BIOLÓGICA
9. A probabilidade de não ocorrer ionizações é P(0) = e –x A curva de sobrevivência ou atividade biológica medida após várias exposições decrescerá como uma simples exponencial
A= A0.e-KD
A = Atividade após a dose D de irradiaçãoA0 = Atividade inicial
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A exposição é dada em unidades de ionização primárias por cm3
K é a constante característica de cada atividae biológica cuja uniadade é volume (cm3 )
K é chamado RADIATION TARGET ou VOLUME SENSÍVEL
Como as ionizações ocorrem ao acaso e a energia é alta: a sensibilidade é independente da FORMA e da COMPOSIÇÃO QUÍMICA do alvo
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Para radiações não ionizantes, por exemplo UV, a energia absorvida depende de fatores tais como presença de ANÉIS AROMÁTICOS, PTES. DE ENXOFRE, etc.
O target size K é obtido a partir da dose 37% ou D37 que é a dose necessária para reduzir a atividade para 37% da inicial.
A = 0,37 A0
0,37 A0 = A0. e-KD37
ln 0,37 = -1 = -KD37
K = 1 D37
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Cálculo do Peso MolecularConsiderando:1. RAD é a deposição de 100 ERGs de energia por cm3
de material.2. Densidade da proteína.3. O número de Avogadro.4. Uma série de dados obtidos por radiação.
Chegou-se a uma equação empírica
Peso molecular = 6,4 x 1011 D37 D37 em RADs
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1. Se tivermos mais de uma molécula, teremos soma de exponenciais
2. Só é válido para efeito direto da radiação (irradiação a seco)
Exemplos da literaturaEnzima PM x 10-3 Target size Radiação
Malato desidrogenase
74 73 e-
Catalase 232 230 RXLisozima 14 15 e-
ATPase 284 280 e-
Glutamato desidrogenase
320 300 e-
Fosforilase de amido
215 210
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Enzima PM x 10-3
No. de cadeias
PM x 10-3
Target size
Radiação
Álcool Desidrogenase
141 4 35 37
Xantina Oxidase
300 2 150 125
Glucose e Fosfatase
130 2 63 70
Peroxidase 40 14
Amilase 96 2 48 46
Fosfatase Alcalina
140 2 69 70 e-
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Crotoxina1. É a toxina mais potente do veneno de cascavel brasileira2. PM por várias técnicas: 23. 0003. Cristalizável4. Contém duas subunidades
CROTAPOTIN = PM 8 000FOSFOLIPASE A2 = PM 13 000
TOXICIDADECrotoxina: LD50 = 0,05 mg/kg camundongo Fosfolipase A2 : LD50 = 0,55 mg/kg camundongoCrotapotin: LD50 100 mg/kg camundongo
A interação das duas proteínas aumenta a toxicidade 10 vezes (não covalente)
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Importância da fosfolipase A2
C
O = PR
O
OC H2C
OC = O C = O
OHH
H
xxxx
xxxx
1 2 3
1,2 diacilfosfoglicerídeos
R = colina
Fosfolipase A2
POLAR
APOLAR
- CH2 - CH2 - N+ - CH3
CH3
CH3Leticina
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A dor é provocada pelo estímulo do receptor da dor, que é chamado nociceptor.
PEI2 e PGE2 agem na membrana destes receptores alterando a atividade elétrica, produzindo estímulos de dor levados pelos nervos sensitivos ao sistema nervoso central.
Bactérias Pirogênio exógeno Macrófagos Pirogênio endógeno Circulação C.N.C. PGE2 Altera o centro regulador do hipotálamo Temp. 37oC do sangue como fria Ordena vaso constrição periférica Evita perda de calor. Ao mesmo tempo Tremores gera calor.
Isto tudo leva à febre.Aspirina age no mesmo ponto.
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Mecanismo de açãoJ.R. Vane (Nobel, 1982)Sérgio H. Ferreira - Med. Rib. Preto década de 70
COOH
Fosfolipídeos da membrana
Fosfolipase A2
O
O
HO
O
COOH
COOH
Ácido aracdônico
Ciclo oxigenase
Endoperóxidos cíclicos
Prostaglandinas clássicas
OHOH
OO
COOH
ASPIRINA
Prostaciclina
PGE2
PGI2
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RESULTADOS EXPERIMENTAIS
1. Irradiação de Fosfolipase A2 e Crotoxina 1mg/mL - Liofilizada - em placas de Petri, elétrons acelerados com doses de 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 Mrad.
2. Dissolução das amostras em solução fisiológica.
3. Determinação da atividade enzimática usando gema de ovo como substrato e glóbulos vermelhos de rato.
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DoseMrad
% Ativid. DoseMrad
% Ativid.
0 100 0 1005 70 5 56,4
10 23 10 49,315 18 15 4020 17 20 24,225 15 25 24,230 12 30 19,2
FOSFOLIPASE A2 CROTOXINA
D37 = 8 MradPM = 80 000Agregação ?
Em gráfico semi logD37 = 19 MradPM = 33 000
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4.b. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas
b.1 Temperatura
0
100
30 60Dose Mrad
Ativ
. Enz
.
310 K
195 K
77 K
Inativação da Ribonuclease por 60Co () no vácuo
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b.2. Presença de O2
0
3
720Mm Hg
Rad
ioss
.
2
1
Radiosensibilidade da Tripsina seca, irradiada com 60Co
D37 oxigênio
D37 no vácuo
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b.3. Presença da segunda molécula
Radiosensibilidade relativa de enzimas no estado sólido irradiadas na presença de diferentes aditivos
Aditivo Invertase Ribonuclease UreaseNenhum 1,0 1,0 1,0Cisteína 0,5 - 0,5 – 0,7Glutationa 0,5 0,52 0,10 -Extrato de lev. 0,45 0,52 10 0,8Tampão acetato 1,4 – 1,6 4,8 1,4 -Sacarose - 2,6 0,5 -NaCl 1,5 – 3,5 0,98 0,21 -
D37 nenhum / D37 aditivo
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b.4. Conteúdo de água
6
12
14 28% água
Dos
e 37
x 1
0 6
ArilesteraseColinesterase
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b.5. Efeito do pH
2
10
3,5 8,5pH
Dos
e 37
x 1
0 6
6,5
Deoxiribonuclease dissolvida em tampão fosfato pH 3,5 - 8,5, liofilizado e inativado com 60 Co
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AÇÃO INDIRETAReação entre as moléculas do soluto e as espécies reativas do solvente, formadas pela ação direta da radiação
1. Espécies reativas da águaH2O H + OH + e-
aq + H2 + H2O2 + H3O+
Valores de G a pH neutro
Produto Ge-
aq 2,6H 0,6OH 2,6H2 0,45H2O2 0,75
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2. Algumas reações dos produtos da radiólise com o soluto
2.a. Abstração de átomos de HR H + H R H2
2.b. Reações dissociativasR NH3
+ + e-aq R +NH3
2.c. Reação de adição
C=C CCOH
OH
HH H
RR
+ R
R
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2.d. Dimerização e adição
NH2 CH2 COOH
NH2 CH2 COOH
NH2 CH2 COOH
CH2 COOH
H e- aq
Glicina
NH2 CH COOH
CH2 COOHÁcido aspártico
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2.e. Reações de desprotonação
2 CH3 CH2 OH 2 CH3 CH OH
CH3 COH
CH3 CH2 OHálcool
álcool
acetaldeído
2.f. Hidrólise
RCO NH CH R2 RCO NH CH R2
RCOR
RCO NH2 + H2O
OH
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0
1
5 X 10-1
G0,1
0,01
DNA ase
G de inativação
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0
1,0
1,0 100Conc. DNA (%)
0,1 10
G 0,5
G da formação de grupos monofosfatos (quebras simples da cadeia)
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2.h. Transferência de H
2.g. Adição de oxigênio
RO2O2 RO2HR +
CH2OH CH3OHRSH+ RS+
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3. Fatores que afetam a radiosensibilidade das moléculas frente à radiação indireta
3.a. Concentração do soluto (‘efeito da diluição’)Geralmente o efeito da diluição está entre 0,1 e 10%
para macromoléculas e para moléculas pequenas, como a glicina, entre 10-3 a 10-1 M.
0
2
1,0
1Fraç
ão re
lativ
a
Conc. Carboxi Peptidase
conc x concdose
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3.b. Presença do segundo solutoTipo de reação competitiva (Scavengers)
3.c. Efeito do oxigênioEm algumas moléculas o O2 pode aumentar o dano de 2 ou 3 vezes. Embora isto não seja observado em algumas enzimas e no DNA.
3.d. Efeito do pHO pH altera a distribuição de cargas na superfície molecular além da conformação molecular.
3.e. Efeito do tipo de radiação LET é menos efetivo em soluções diluídas
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Mudanças na estrutura primária1. Destruição de aminoácidos entre proteínas
2. Gly e Ala
3. Cys, His, Met, Phe, Tyr, Trp estão entre os mais radiosensíveis
4. Formação de grupos carbonilas a partir de quebras da ligação C - N
5. Formação de fragmentos de PM formação de agregadosPor exemplo: crosslink s poli ala
poli phe
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Mudanças na estrutura secundária1. Desestabilização das pontes de H2. Agregação
Por exemplo:
10
10 50
% a
min
o gr
upos
de
Lys
ñ n
ativ
os
20
30
40 globulina
BSA
Dose x 10-6 radelétrons de Z MeV
1. Estrutura quaternária2. Dissociação de subunidade
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Ocorre, em seguida, uma reação em cadeia que pode ser interrompida de duas maneiras
H + H2O2 OH + H2O
OH + H2 H + H2O
Que termina
OH + H H2O
ouOH + H2O2 HO2 + H2O
HO2 + H H2O2
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Do ponto de vista de rendimento, quando a radiação atinge moléculas de água, temos:
28% de ionização
26% de excitação
47% de superexitação
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H2O H2O H + OH
H2O H2O+ + e-
H+ + OH
+ H2O H2O- H + OH-
e- + H+ H+H2O e-
aq
H2O + H2O H2O- H + OH-
exitação
ionização
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EFEITO DA RADIAÇÃO
ULTRAVIOLETA - UV
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Efeito da radiação UV
A) AbsorçãoUV causa como efeio biológico excitação de parte das macromoléculas. O primeiro passo é a absorção de QUANTA - um processo que ocorre ao acaso
QUANTA: São pulsos de energia que para uma dada frequência de luz que tem a mesma energia definida como
E = hh = cte. de Plank = 6,63 x 10-34 J. seg1 eV = 1,6 x 10-19 Jaule
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A absorção ocorre ao acaso e segue a equação:
I/I0 = e-nsl
I = Intensidade transmitidaI0 = Intensidade incidente
n = número de partículas absorventes/cm3
l = comprimento do trajeto da amostra em cms = cte. que depende da natureza das partículas e
comprimento de onda da radiação
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B) Rendimento quânticoA probabilidade da UV provocar uma alteração mensurável é pequena porque a energia pode ser dissipada como fluorescência ou calor.
Esta probabilidade é chamada rendimento quântico , que é o número de partículas danificadas pelo número QUANTA absorvido.
é da ordem de 10-2 ou menos para macromoléculas biológicas
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C) Radiação MonocromáticaUsando-se prismas que filtram a luz UV, obtém-se bandas da ordem de 20 A com intensidade suficiente para produzir efeitos biológicos.
D) Curva Dose-EfeitoA inativação de enzimas obedece a equação:
N/N0 = e- D
Onde: D = dose em QUANTA/cm2
= é a sensitividade que varia com o comprimento de onda
Se D = 1 N/N0 = 1/2 = 37%
Dose = 37%
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CURVAS DE INATIVAÇÃO
% so
brev
ida
QUANTA / cm2 x 10-21
% so
brev
ida
QUANTA / cm2 x 10-21
% so
brev
ida
QUANTA / cm2 x 10-21
% so
brev
ida
QUANTA / cm2 x 10-21
30 60
10
100
1 1
11
10
10
10
100 100
100
2967 A
2967 A
2650 A
2805 A
0,01 0,02 0,03
2650 A 2537 A
2375 A
4 8
2400 A
2650 A
10 20
3023 A2303 A 2652 A
C) Inativação de DNA de haemophilus influenzae
A) Inativação de gramicidin (11 a a )
B) Inativação de Bacteriófago T2
D) Inativação de Hema glutinina de vírus influenzae
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AÇÃO EM PEOTEÍNAS E SEUS CONSTITUINTESPode ocorrer- Rompimento de ponte C - C- Desaminação- Oxidação para formar carboxil ou ceto grupos- Transferência de amino grupos
Phe, Tyr, Trp e cistina são os mais sensíveis. Deles, cistina é o mais sensível
para produzir cisteína é 0,2; para formar NH3, H2S é 0,04 e 0,02 respectivamente
para produzir NH3 a partir de Phe, Tyr e Trp é 0,002
para destruição de cistina é 0,13; 10 vezes maior que para os aa aromáticos
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INATIVAÇÃO DE ENZIMAS E A.A.Os QUANTA absorvidos pela cistina são os maiores responsáveis pela inativação por causa do rompimento das pontes S - S.
% 1/2 cistina
0,01
0,03
0,02
T
CHT
CHTDD
PAC
L R
I
I - insulinaR - RNAaseL - lisizimaCH - quimiotripsinaP - pepsinaTD - triposfato desidrogenaseA - aldolaseD - DNAaseC - catalaseG - gramicidinCHT - quimiotripsinogênio
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medido em água ou com proteína seca dá resultados semelhantes solvente parece não ser importante.
RNAase dá mesmo para 95% etanol ou 100% H2O.
Comprimento de onda é importante para algumas enzimas.
pH: não parece ser importante - lisozima tem mesmo a pH 3-12.
T menor sensibilidade das proteínasO2 não afeta
Conc. da proteína não afeta