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Procedimientos en Microbiología Clínica

Recomendaciones de la Sociedad Española de EnfermedadesInfecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

Coordinadora: María Antonia Meseguer Peinado

Autores: Juana Begoña Cacho CalvoMaría Antonia Meseguer PeinadoAntonio Oliver PalomoJorge Puig de la Bellacasa

25.Diagnóstico

microbiológico de lasinfecciones bacterianas deltracto respiratorio inferior

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ÍNDICE DEL DOCUMENTO CIENTÍFICO

1. Introducción2. Consideraciones clínicas. Cuadros clínicos y agentes etiológicos Bronquitis

2.1.1. Bronquitis por Bordetella pertussis2.1.2. Bronquitis por Mycoplasma pneumoniae2.1.3. Bronquitis por Chlamydophila pneumoniae

Bronquiolitis Neumonía aguda

2.3.1. Neumonía adquirida en la comunidad2.3.1.1. Neumonía por Streptococcus pneumoniae2.3.1.2. Neumonía por Haemophilus influenzae2.3.1.3. Neumonía por Legionella pneumophila2.3.1.4. Neumonía por Mycoplasma pneumoniae2.3.1.5. Neumonía por Chlamydophila pneumoniae y otras clamidias2.3.1.6. Neumonía por Moraxella catarrhalis2.3.1.7. Neumonía por Enterobacteriaceae2.3.1.8. Neumonía por Pseudomonas y otros bacilos gramnegativos no

fermentadores2.3.1.9. Neumonía por aspiración

2.3.2. Neumonía en el paciente inmunodeprimido2.4. Neumonía nosocomial

2.4.1. Neumonía en el paciente sin ventilación mecánica2.4.2. Neumonía en el paciente con ventilación mecánica

2.5. Colonización-infección respiratoria crónica2.5.1. Neumonía crónica

2.5.1.1. Neumonía por Nocardia spp.2.5.1.2. Neumonía por Rhodococcus equi2.5.1.3. Neumonía por Burkholderia pseudomallei2.5.1.4. Neumonía por Propionibacterium propionicum

2.5.2. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)2.5.3. Bronquiectasias

2.6. Absceso pulmonar2.7. Derrame pleural y empiema

3. Tipos de muestras y recogida de muestras3.1. Muestras obtenidas por procedimientos no invasivos

3.1.1. Frotis del tracto respiratorio superior3.1.2. Esputo. Esputo inducido3.1.3. Broncoaspirado /aspirado traqueal /secreciones respiratorias3.1.4. Hemocultivos3.1.5. Orina3.1.6. Suero

3.2 Muestras obtenidas por procedimientos invasivos3.2.1. Mediante fibrobroncoscopia

3.2.1.1. Lavado bronquial3.2.1.2. Cepillado bronquial3.2.1.3. Lavado broncoalveolar3.2.1.4. Biopsia transbronquial3.2.1.5. Aspiración transbronquial con aguja

3.2.2. Mediante otras técnicas no fibrobroncoscópicas3.2.2.1. Técnicas ciegas3.2.2.2. Aspiración transtraqueal3.2.2.3. Biopsia por punción transtorácica3.2.2.4. Biopsia a pulmón abierto 3.2.2.5. Punción pleural

3.3. Tipos de muestras indicados en relación con el cuadro clínico3.4. Tipos de muestras indicados en relación con los diferentes agentes etiológicos

4. Transporte y conservación de la muestra5. Manejo de la muestra a la recepción en el laboratorio de microbiología

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6. Procesamiento de la muestra. Selección de los medios de cultivo y condiciones de incubación6.1. Criterios microscópicos de validez del esputo para su posterior cultivo6.2. Cultivos cualitativos6.3. Cultivos cuantitativos en muestras obtenidas por fibrobroncoscopia6.4. Cultivos cuantitativos en muestras obtenidas por procedimientos no invasivos6.5. Cultivos en medios especiales

6.5.1 Legionella spp.6.5.2. Bordetella spp.

7. Criterios para la interpretación de los resultados. Información de los resultados7.1. Muestras contaminadas con microbiota del tracto respiratorio superior7.2. Muestras no contaminadas con microbiota del tracto respiratorio superior7.3. Cultivos cuantitativos en muestras obtenidas por fibrobroncoscopia

8. Técnicas de diagnóstico rápido8.1. Determinación de antígenos bacterianos en orina (S. pneumoniae y L. pneumophila)8.2. Métodos moleculares8.3. E-test directo en muestras de pacientes con neumonía asociada a ventilación mecánica

9. Procedimientos no aceptables10. Procedimientos adicionales a realizar en situaciones especiales 10.1. Neumonía por bacterias del orden Rickettsiales (R. prowazekii, C. burnetii) 10.2. Infección neumónica por Francisella tularensis11. Bibliografia

ÍNDICE DE LOS DOCUMENTOS TÉCNICOS

1. PNT-ITRI-01. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS RESPIRATORIAS OBTENIDAS POR PROCEDIMIENTOS NO INVASIVOS

2. PNT-ITRI-02. CULTIVO CUANTITATIVO DEL LAVADO BRONCOALVEOLAR

3. PNT-ITRI-03. CULTIVO CUANTITATIVO DEL CEPILLO BRONQUIAL PROTEGIDO

4. PNT-ITRI-04. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE Bordetella spp

5. PNT-ITRI-05. TÉCNICA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE Stretococcus pneumoniae EN ORINA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS

6. PNT-ITRI-06. ANTIBIOGRAMA POR Etest DIRECTO EN MUESTRAS RESPIRATORIAS DE PACIENTES CON NEUMONÍA ASOCIADA A VENTILACIÓN MECÁNICA

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Procedimientos en Microbiología ClínicaRecomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades

Infecciosas y Microbiología Clínica

Editores: Emilia Cercenado y Rafael Cantón

25. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES BACTERIANAS DEL

TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR. 2007

Coordinadora: María Antonia Meseguer Peinado

Autores: Juana Begoña Cacho CalvoMaría Antonia Meseguer Peinado

Antonio Oliver PalomoJorge Puig de la Bellacasa

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1. INTRODUCCIÓN Las infecciones del tracto respiratorio inferior seencuentran entre las enfermedades infecciosas másfrecuentes y con mayores tasas de morbilidad ymortalidad. El diagnóstico microbiológico resultaesencial para la determinación del agente etiológicoy la instauración de un tratamiento antimicrobianoadecuado. Sin embargo, en la actualidad, el papeldel laboratorio de microbiología en el diagnóstico delas infecciones del tracto respiratorio inferiorpresenta importantes limitaciones y controversias.Así, su rendimiento, muy limitado en el caso deldiagnóstico etiológico de la bronquitis aguda, escontrovertido en la neumonía adquirida en lacomunidad y ofrece mejores perspectivas en eldiagnóstico la neumonía nosocomial. También,existe controversia sobre los diferentes métodosdiagnósticos, cuyo valor depende, a su vez, de undiagnóstico clínico correcto de infección bacteriana yde la probabilidad de la existencia de un tratamientoantibiótico previo.

Las principales limitaciones del diagnósticomicrobiológico de las infecciones del tractorespiratorio inferior estriban en su baja rentabilidad(en el 40-60% no se aísla el agente causal) y en ladificultad en la interpretación del valor de losmicroorganismos aislados en relación con susignificación clínica. Con frecuencia, el cultivo de lasmuestras del tracto respiratorio inferior supone unode los esfuerzos microbiológicos más innecesarios,y, lo que es peor, sus resultados además defrustrantes para el diagnóstico etiológico puedeninducir, a su vez, a un diagnóstico y tratamientoerróneos del paciente.

La baja sensibilidad de los cultivos obedece, poruna parte, a la contaminación de las muestras deltracto respiratorio inferior con secreciones y, portanto, con microbiota colonizadora del tractorespiratorio superior, lo que dificulta el crecimiento yenmascara la presencia de los verdaderospatógenos procedentes de localizacionesanatómicas más bajas y, por otra parte, a la dificultadpara cultivar ciertos patógenos que requieren mediosy procedimientos diagnósticos especiales yespecíficos para su detección. Además, la valoraciónclínica de los aislados resulta problemática. Latrascendencia de una rápida y correcta valoración delos aislados es obvia, ya que permite proporcionarinformación de la máxima utilidad clínica. Sinembargo, con frecuencia, la interpretación delresultado obtenido se ve limitada por la dificultad enatribuir con seguridad una valoración de losverdaderos agentes etiológicos, responsables de lainfección, a los microorganismos aislados de lasmuestras respiratorias o, por el contrario, de meroscolonizantes. En cambio, en otros casos el hallazgode ciertos microorganismos (Mycobacteriumtuberculosis, Legionella spp, Bordetella spp) nopresenta duda alguna en cuanto a su valoración, yaque siempre son considerados como patógenos.

Finalmente, los estudios serológicos, reservadospara los patógenos atípicos, en ocasiones, sólopermiten confirmar, pero no establecer el diagnóstico

con la suficiente rapidez como para ser de utilidaden la práctica clínica. Lógicamente, esto ha llevado ala necesidad de establecer pautas terapéuticasempíricas que se utilizan de forma rutinaria ante lasospecha de infecciones causadas por estosmicroorganismos. Por el contrario, las nuevasherramientas de laboratorio, como son las técnicasde amplificación de ácidos nucleicos y las técnicasde detección de antígenos bacterianos en orinapermiten la detección del agente causal de formamás rápida y sensible, sobre todo en el caso de lospatógenos difíciles de cultivar, y abren futuras ynuevas perspectivas para el diagnóstico de lasinfecciones del tracto respiratorio inferior.

2. CONSIDERACIONES CLÍNICAS. CUADROSCLÍNICOS Y AGENTES ETIOLÓGICOS Los pasos previos a la infección del tractorespiratorio inferior son habitualmente el cambiocualitativo de la microbiota normal de la orofaringe(debido a sustitución por especies bacterianas másinvasivas o resistentes, como en la clásica neumoníapor Streptococcus pneumoniae), o cuantitativo (porincremento de los organismos colonizadores, comoen la enfermedad broncopulmonar crónica, en laneumonía nosocomial y en la intubaciónendotraqueal), o una combinación de ambos. Laimportancia del cambio en la carga bacterianacolonizadora estriba en que su aumento puededeterminar el límite entre colonización e infección dela mucosa respiratoria, incluso en el caso debacterias de reconocido poder patógeno. Tal es elcaso de Mycoplasma pneumoniae, para el que se hase ha demostrado mediante la técnica de PCRcuantitativa, que el límite que diferencia entre estadode portador sano e infección clínica son 104 copiasde ADN genómico. La dinámica de las poblacionesbacterianas de la microbiota aerobia y anaerobia deltracto respiratorio superior (orofaringe, laringe) estáinfluida por la propia patología y por el medioambiente que rodea al paciente, factores principalesque propician los cambios cualitativos y cuantitativosde la microbiota. Así, la colonización bacterianasublaríngea, mínima en las personas sanas,experimenta un importante aumento en los pacientesintubados o con enfermedad pulmonar crónica. Delmismo modo, en los pacientes hospitalizados contratamiento antibiótico se produce una drásticasustitución de los organismos grampositivos,constituyentes de la microbiota orofaríngea normal,por un franco predominio de microorganismosgramnegativos. Igualmente ocurre tras una infecciónvírica o un tratamiento antibiótico. Son tales loscambios que se producen en las poblacionesbacterianas que integran la microbiota orofaríngeaque según en qué diferentes tipos de pacientes seseleccionan diferentes tipos de microorganismos: asíocurre en los pacientes con enfermedadessubyacentes (inmunodepresión, diabetes mellitus,alcoholismo, enfermedad pulmonar crónica, fibrosisquística), en pacientes en tratamiento conantibióticos de amplio espectro, en pacientes conexposición a otros pacientes colonizados con

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microorganismos con multirresistencia a losantibióticos. La mayoría de los patógenosresponsables de las infecciones del tractorespiratorio inferior se encuentran en proporcionesmuy elevadas en las secreciones bronquiales, lo quepermite su crecimiento en una cantidad considerableen los cultivos cuantitativos y semicuantitativos. El pulmón está constantemente expuesto amicroorganismos, gases y partículas de materialvehiculizados en el aire inspirado; sin embargo, lasvías respiratorias inferiores permanecengeneralmente estériles. La infección de los tramosrespiratorios inferiores sólo se produce cuando serompe el equilibrio entre dos fuerzas opuestas: poruna parte, la disminución de las defensas delhuésped (la inmunidad humoral, local, mediada porcélulas, fagocitos y los mecanismos de limpieza delaparato mucociliar bronquial) y por otra, lascaracterísticas de virulencia y tamaño del inóculo dela especie bacteriana aspirada. De los mecanismos por los cuales losmicroorganismos alcanzan el tracto respiratorioinferior, la aspiración de microbiota residente en laorofaringe dentro del alvéolo pulmonar es el másfrecuente, (neumonía por S. pneumoniae yneumonía nosocomial por bacilos gramnegativos). Elsegundo mecanismo en frecuencia es la inhalaciónde microorganismos aerosolizados (como ocurre enlas denominadas neumonías atípicas: Legionellaspp., Chlamydia spp., M. pneumoniae, Coxiellaburnetii, en la neumonía por Aspergillus spp. y porhongos dimórficos). El tercer mecanismo, y menosfrecuente, se produce por diseminación sanguíneadesde un foco infeccioso distante (pacientes enhemodiálisis, usuarios de drogas por vía parenteral)o por translocación bacteriana a partir de lamicrobiota intestinal. Por ello, para obtener el máximo rendimiento enla valoración del resultado microbiológico en relacióncon el diagnóstico etiológico de la infección, resultacrucial clasificar adecuadamente el cuadroclínico/radiológico del paciente (bronquitis aguda,exacerbación de la bronquitis crónica,bronquiectasias, neumonía adquirida en lacomunidad, neumonía nosocomial, asociada o no aventilación mecánica, o fibrosis quística), y tenerpresente que cuanto más comprometido esté elpaciente, más amplio deberá ser el estudiomicrobiológico y en él se deberá incluir la realizaciónde hemocultivos, cultivo de líquido pleural y demuestras obtenidas por fibrobroncoscopia.

La neumonía es la entidad clínica en la que eldiagnóstico microbiológico alcanza el mayorrendimiento, si bien en los casos de neumoníanosocomial y en pacientes inmunocomprometidos serequieren muestras obtenidas por métodosinvasivos.

Por otra parte, la detección de algunos agentescausales requiere el empleo de medios selectivosespeciales, mientras que para la valoración dealgunos aislados se requieren técnicas cuantitativas.En el laboratorio, la elección de los procedimientos aemplear con las muestras respiratorias deberá

basarse en el cuadro clínico del paciente y elpatógeno sospechado. De todo ello se deduce lanecesidad de una adecuada comunicación entre ellaboratorio de microbiología y el clínico, que permitaal microbiólogo disponer de la información apropiadasobre el cuadro clínico del paciente, elmicroorganismo sospechado y el modo de obtenciónde la muestra, siendo esto especialmente necesariocuando se han empleado técnicas invasivas para suobtención o se esperan patógenos poco frecuentes.

A continuación se describen los diferentesprocesos clínicos que se incluyen dentro de lainfección del tracto respiratorio inferior, haciendohincapié en sus principales aspectos clínicos,agentes etiológicos y el papel del diagnósticomicrobiológico en cada uno de ellos.

2.1. BRONQUITISLa bronquitis, uno de los diagnósticos clínicos

más frecuentes, consiste en la inflamación ehiperreactividad del epitelio ciliado que recubre elárbol bronquial, con la consiguiente obstrucción delflujo de aire, que se manifiesta clínicamente pordificultad respiratoria y tos acompañada o no de laproducción de esputo. Con frecuencia se acompañade fiebre y afecta a todos los grupos de edad. Por laduración de los síntomas (principalmente la tos)puede clasificarse en bronquitis aguda (variassemanas) y bronquitis crónica (episodios de tresmeses de duración durante dos años consecutivos).

En la bronquitis aguda, la gran mayoría de loscasos tiene una etiología vírica (influenza,parainfluenza, rinovirus, coronavirus y respiratoriosincitial) formando parte del cortejo sintomático delcatarro común, y sólo una pequeña proporción tienenetiología bacteriana, que puede corresponder a unainfección primaria o, más frecuentemente,secundaria a una infección vírica previa. Entre losagentes bacterianos, M. pneumoniae, Chlamydophilapneumoniae, Bordetella pertussis y Bordetellaparapertussis son los más frecuentementeimplicados, y el cuadro clínico se caracteriza por tospersistente de curso más prolongado que en el casode la infección vírica, que en ocasiones puedeprogresar al inicio de un cuadro asmático. Losagentes respiratorios comunes, tales comoHaemophilus influenzae, S. pneumoniae y Moraxellacatarrhalis no tienen un papel relevante en labronquitis aguda del paciente previamente sano. Porel contrario, en los pacientes con bronquitis crónicaestos tres microorganismos adquieren el principalprotagonismo al ser responsables de la mayoría delas exacerbaciones clínicas. Así, H. influenzae(cepas tipables y no tipables) es el patógeno aisladocon mayor frecuencia (50% de los casos), seguidopor S. pneumoniae (15-25% de los casos) y, enmenor proporción, M. catarrhalis (10-20% de loscasos) y bacterias anaerobias. Estosmicroorganismos son también los principalesagentes etiológicos de las exacerbaciones agudasque se producen en los pacientes con enfermedadpulmonar obstructiva crónica (EPOC), de lasbronquiectasias y en las primeras fases (durante la

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infancia) de la fibrosis quística. La importancia deotros microorganismos en las reagudizaciones de labronquitis es notablemente inferior, aunque puedenpredominar Pseudomonas aeruginosa y lasenterobacterias en las exacerbaciones de labronquitis crónica avanzada.

El papel del laboratorio de microbiología en eldiagnóstico de la bronquitis crónica es muy limitado,ya que ni el examen microscópico ni el cultivo delesputo permiten diferenciar la colonización de lainfección del tracto respiratorio, dado que hasta el25% de los pacientes con EPOC y muchos pacientescon bronquitis crónica presentan colonización deltracto respiratorio superior y de las secrecionesbronquiales por S. pneumoniae y H. influenzae. Noobstante, puede estar indicado el estudiomicrobiológico en las exacerbaciones de la bronquitiscrónica en caso de fracaso del tratamiento empírico.

2.1.1. Bronquitis por Bordetella pertussis. Labronquitis por Bordetella pertussis, diminutococobacilo gramnegativo muy lábil y de crecimientodifícil, se caracteriza por episodios de tos intensa,violenta y paroxística acompañada de jadeoinspiratorio característico, que con frecuenciafinalizan en un vómito. La infección, endémica conciclos regulares epidémicos, es fácilmentetransmisible y de declaración obligatoria. Sepresenta con más frecuencia en niños menores de 6meses, no vacunados o parcialmente vacunados,entre los que se dan los casos más graves, perotambién en pacientes adultos y adolescentes, inclusocon inmunización previa, ya que la inmunidadpostvacunal es limitada (menos de 12 años).

La cepa variante no toxigénica de B. pertussis,produce un cuadro clínico similar al de B. pertussis,no prevenible por la vacunación, y requiere undiagnóstico microbiológico diferencial. Bordetellabronchiseptica, endémica en algunos animales,puede producir infecciones respiratorias crónicas dedifícil tratamiento en humanos, especialmente enpacientes inmunocomprometidos.

El aislamiento de B. pertussis en cultivo esdefinitivo para el diagnóstico, y aunque poco sensible(50%) sigue siendo el método diagnóstico dereferencia, ya que la prueba de la reacción encadena de la polimerasa (PCR), aunque permite undiagnóstico rápido y mejora la sensibilidad delcultivo, no se encuentra al alcance de la mayoría delos laboratorios clínicos. La baja sensibilidad delcultivo depende de factores propios del paciente(tratamiento antibiótico previo, duración de lossíntomas, edad y vacunación), de las condiciones deltransporte de la muestra y del tipo y calidad de losmedios empleados. El microorganismo se aíslapreferentemente durante la fase exudativa de laenfermedad, de modo que la posibilidad delaislamiento disminuye progresivamente. Además,son condiciones necesarias que la recogida de lamuestra, siempre nasofaríngea, se realice utilizandoescobillones de alginato cálcico o dacrón y que susiembra se haga de forma inmediata en mediosespeciales, ricos en nicotinamida, que incluyan

sustancias protectoras como, almidón, carbón osangre para absorber y neutralizar los compuestostóxicos presentes en muchos medios. Lainmunofluorescencia directa con anticuerpos (poli omonoclonales) sobre la muestra presenta unasensibilidad muy variable (30%-71%) endependencia del número de microorganismospresentes en la muestra y la pericia del observador,por lo que no es una técnica aconsejable para eldiagnóstico sin la confirmación por cultivo o por PCR.

Las pruebas serológicas para la detección deanticuerpos (ELISA, aglutinación inmunoblot,hemaglutinación indirecta y determinación deanticuerpos frente a la toxina de B. pertussis) noestán estandarizadas y, aunque útilesepidemiológicamente, tienen una rentabilidad muylimitada para el diagnóstico clínico, por lo que no seutilizan ampliamente. De todas ellas, la másespecífica es la demostración de seroconversión dela IgG frente a la toxina pertúsica.

2.1.2. Bronquitis por Mycoplasma pneumoniae.M. pneumoniae es un patógeno de comportamientoextra e intracelular implicado en infecciones deltracto respiratorio adquiridas en la comunidad tantoen niños como en adultos. La presentación clínicaprimaria es la traqueobronquitis con fiebre y tos noproductiva (en ocasiones con un cierto parecido a lade la tos ferina), acompañada por una variedad demanifestaciones del tracto respiratorio superior. Estainfección puede progresar a bronquiolitis,especialmente en los niños pequeños, y a neumoníaen el 10%-15% de los casos, y en raras ocasionesacompañarse o seguirse de manifestacionesextrapulmonares importantes, principalmenteneurológicas y cardíacas.

El microorganismo, que se caracteriza por laausencia de pared celular, se adhiere selectivamentemediante adhesinas específicas a las células delepitelio ciliado bronquial en las que causa ciliostasisy destrucción celular y, por consiguiente, inflamacióny pérdida del recubrimiento epitelial de la mucosa deltracto respiratorio, así como hiperreactividad de lasvías aéreas que puede persistir durante semanas omeses, y que es característica de esta bacteria.

Aunque clásicamente descrita como la másfrecuente en esta entidad, la verdadera incidencia deM. pneumoniae en la bronquitis no es bien conocida.Estudios recientes prospectivos de grandes series depacientes con bronquitis aguda realizados en Franciamediante la prueba de PCR han demostrado lapresencia de M. pneumoniae en las secrecionesbronquiales en el 2,3% de los pacientes.

M. pneumoniae es un microorganismo decrecimiento lento y difícil que requiere el empleo demedios específicos para su cultivo, por lo que ésteno es recomendable para el diagnóstico clínicodebido a su baja sensibilidad (60%) y largo períodode tiempo necesario para el crecimiento delmicroorganismo (7 a 35 días). Igualmente, eldiagnóstico serológico es poco útil, ya que requierela demostración de una seroconversión en el títulode inmunoglobulinas G entre los sueros de las fases

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aguda y de convalecencia. En cuanto a la detecciónde títulos altos de inmunoglobulina M en el suero dela fase aguda, aunque tienen valor diagnóstico deinfección actual, hay que tener presente laposibilidad de que correspondan a títulos residualespertenecientes a otro proceso infeccioso anterior, yaque esta inmunoglobulina puede persistir elevadadurante largos períodos de tiempo. Las pruebasrápidas actuales de enzimoinmunoensayo directosobre las secreciones presentan todavía unasensibilidad y valor predictivo bajos con respecto a laPCR. Esta última técnica realizada en tiempo realsobre las muestras respiratorias (exudado faríngeo ylíquido de gargarismo, en los casos que cursan contos no productiva, así como en el esputo) ofrece lasmejores perspectivas en sensibilidad para eldiagnóstico microbiológico.

Merece mención especial la asociación de M.pneumoniae con el asma. Estudios controladosapoyan un papel emergente de M. pneumoniae, asícomo también de C. pneumoniae, en el asma crónicoestable y en sus exacerbaciones agudas. Laevidencia de esta asociación se basa en el mayoraislamiento o detección por PCR de M. pneumoniaeen los pacientes con asma estable que en losindividuos controles, así como en la mejor respuestaal tratamiento con macrólidos de los pacientes conasma y detección del M. pneumoniae que en lospacientes asmáticos en los que no se aísla o detectael microorganismo. Por otra parte, hay múltiplesrazones por las que M. pneumoniae puede tener unpapel relevante en la patogenia del asma, más alláde la simple exacerbación. Es conocida sucapacidad para la inducción de secreción demediadores proinflamatorios implicados en lapatogenia del asma y de las exacerbaciones, incluidala respiración sibilante. Así, en niños asmáticos conrespiración sibilante e infección por M. pneumoniaedocumentada se detecta un aumento significativo delas concentraciones séricas de citocina IL-5, cuandose compara con niños sanos o sin infección.Igualmente, en los niños asmáticos infectados conM. pneumoniae se observan concentracionessignificativamente más elevadas de IL-4 que en loscontroles no infectados, o con neumonía por S.pneumoniae, lo que sugiere una respuesta decitocinas del tipo TH-2, característica del asma.También se ha demostrado en estos pacientes unainfiltración tisular por células cebadas y unaconcentración de IgE sérica elevadas, así como laaparición de IgE específica frente a M. pneumoniae.2.1.3. Bronquitis por Chlamydophila pneumoniae.Tres especies de clamidias (Chlamydophilapneumoniae, Chlamydophila psittaci y Chalmydiatrachomatis) pueden causar infección bronquial que,en ocasiones, puede progresar a neumonía, perocada una de ellas se desarrolla en contextos y conimplicaciones epidemiológicas muy diferentes. C.pneumoniae produce un cuadro bronquial parecido ala tos ferina, así como procesos de infecciónbronquial más crónicos. La infección por C. psittaci,de aparición esporádica, se asocia con la exposicióna secreciones de pájaros infectados y C. trachomatis

es causa de infección bronquial y neumonía enlactantes que adquieren la infección durante elnacimiento a partir de la madre infectada. C.pneumoniae y C. psittaci, recientemente incluidas enel género Chlamydophyla, además de un cuadrorespiratorio grave pueden causar manifestacionesextrapulmonares y secuelas neurológicas.

C. pneumoniae es un patógeno muy ubicuo, demodo que más del 50% de la población adultapresenta datos serológicos (IgG) de infección previapor esta bacteria. Aunque su incidencia es menor enlos niños pequeños, aumenta significativamentedurante la edad escolar. Causa bronquitis aguda enniños y adultos, además de síntomas del tractorespiratorio superior, como faringitis, laringitis ysinusitis, aunque su mayor interés corresponde a uncuadro grave parecido a la tos ferina. Otraimplicación importante de C. pneumoniae se debe asu asociación con la exacerbación aguda en labronquitis crónica, asma y EPOC. En estos últimospacientes, es característica la producción de tospersistente, acompañada o no de fiebre.

2.2. BRONQUIOLITISLa bronquiolitis es un síndrome agudo que afecta

a los niños durante los dos primeros años de vida(mayor tasa de ataque entre 1 y 6 meses de edad)que se caracteriza por la inflamación del epitelio quereviste los pequeños bronquios y los bronquiolos. Amedida que la inflamación progresa, la infiltraciónperibronquiolar y el edema de la submucosa y laadventicia conducen a la necrosis y pérdida delepitelio bronquiolar y, en consecuencia, alestrechamiento y obstrucción de la luz de las víasaéreas. La progresión del proceso conduce a laneumonitis intersticial.

La etiología de la bronquiolitis es principalmentevírica (más frecuentemente por virus respiratoriosincitial, seguido por virus parainfluenza ymetapneumovirus) como resultado de la progresiónde una infección originada en las vías altas, pero enocasiones puede producirse como resultado de unainfección bronquial descendente, en particular por M.pneumoniae. M. pneumoniae es el causante dehasta el 5% de las bronquiolitis en los niñospequeños. La presentación es estacional, conpredominio invernal y al inicio de la primavera. Lasmanifestaciones clínicas incluyen unos pródromoscon síntomas de vías altas y un comienzo agudo conrespiración sibilante, distensión torácica, tos, disnea,apnea y síndrome de dificultad respiratoria aguda.La mayoría de los niños requieren hospitalización.

El diagnóstico se basa principalmente en losparámetros clínicos y para el diagnósticomicrobiológico de M. pneumoniae se aplican lasmismas directrices que para el diagnóstico de labronquitis.

2.3. NEUMONÍA AGUDALa neumonía es un proceso caracterizado por la

inflamación y consolidación de los pulmones,causado por infección o por irritantes. La neumonía

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aguda puede estar causada por una amplia gama deagentes microbianos.

La diferenciación de los distintos síndromesneumónicos en relación con los parámetros clínicosy epidemiológicos, así como con losmicroorganismos bacterianos más frecuentementeasociados a cada uno de ellos, no sólo facilita laelección del tratamiento empírico más adecuado,sino que también resulta de gran ayuda en laaplicación de los criterios de selección y recogida delas muestras apropiadas para el estudio, los métodosde procesamiento y siembra, así como a lainterpretación de los aislados bacterianos.2.3.1. Neumonía adquirida en la comunidad. Laneumonía aguda adquirida en la comunidad (NAC)es una entidad clínica muy frecuente (en nuestropaís 2-10 casos/1000 habitantes adultos/año) queconlleva una morbilidad (aproximadamente un 35%requieren hospitalización) y mortalidad importantes(menos del 5% a más del 30%). Las característicasdel síndrome de neumonía aguda adquirida en lacomunidad han cambiado con el curso de los años,presentando una mayor diversidad de la poblaciónafectada, con aumento de la edad de los afectados ydel número de pacientes con enfermedades de base(diabetes, EPOC, bronquiectasias) oinmunodepresión (infección por el VIH,trasplantados). Además, ha cambiado también elespectro de los microorganismos potencialmenteimplicados. A continuación se detallan los principalessíndromes clínicos y los agentes etiológicosbacterianos más frecuentes. Sin embargo, se ha detener presente que aproximadamente en el 10% delos casos la etiología de la NAC puede ser mixta yque casi en el 40% de los pacientes se desconoce elagente causal.2.3.1.1. Neumonía por Streptococcus pneumoniae.S. pneumoniae es el agente causal más frecuente dela NAC, con una prevalencia del 20%-65% yresponsable de hasta el 35% de los casos de NACque requieren hospitalización. Afecta a todos losgrupos de edad, pero con mayor frecuencia a niñospequeños y ancianos. Es la primera causa deneumonía bacteriana en el paciente infectado por elVIH y su incidencia es mayor en los adultos conenfermedad broncopulmonar o inmunodeficienciasubyacentes.

La colonización de la orofaringe y tractorespiratorio superior por S. pneumoniae es frecuenteen los adultos y muy frecuente en los niños, sobretodo durante los dos primeros años de vida. Sutransmisión se realiza de persona a persona y lainfección pulmonar se adquiere por microaspiracióndesde la orofaringe. Cuando a la colonización porneumococo se suman ciertos factores de riesgocomo la alteración de los mecanismos defensivos deltracto respiratorio (alcoholismo, tabaquismo,infecciones víricas), ciertas inmunodeficiencias(linfoma, mieloma, infección por el VIH) y unaenfermedad crónica subyacente (pulmonar, hepática,renal o diabetes) se favorece el desarrollo de laneumonía. Merece mencionarse la especialgravedad que adquiere la neumonía neumocócica en

los pacientes esplenectomizados, con aspleniafuncional o con respuesta anormal deinmunoglobulinas (mieloma, linfoma, infección por elVIH).

El cuadro clínico-radiológico de la neumonía porS. pneumoniae (se observa en 50% de los casos)representa el síndrome clásico de neumoníabacteriana: fiebre, tos productiva con esputospurulentos o herrumbrosos, dolor pleural,leucocitosis y a la exploración presencia deestertores crepitantes y, a veces, soplo tubárico. Enla radiografía se observa la presencia de imágenestípicas de condensación lobar o segmentaria conbroncograma aéreo.

En este contexto clínico, y en ausencia de untratamiento antibiótico previo, el diagnósticomicrobiológico puede ser de gran ayuda. Lapresencia de diplococos grampositivos comomorfotipo predominante en la tinción de Gram de unesputo de buena calidad, que cumpla los criterios devalidez de la muestra (presencia de leucocitos yausencia o escasez de células epiteliales), es muysugestiva de neumonía neumocócica (57%sensibilidad y 82% especificidad). Así mismo, ladetección por inmunocromatografía de membrana dela presencia del antígeno polisacárido Cneumocócico en orina (80%-90% de sensibilidad y70%-90% especificidad) orienta de forma rápida eldiagnóstico etiológico inicial. Por otra parte, serecomienda la obtención de hemocultivos, queaunque son positivos para S. pneumoniae en sólo el20% de los pacientes, permiten la identificacióndefinitiva del agente etiológico.2.3.1.2. Neumonía por Haemophilus influenzae. H.influenzae coloniza con frecuencia la orofaringe delas personas sanas, que adquieren y eliminanespontáneamente nuevas cepas y las transmiten aotras personas por las secreciones. La infecciónafecta preferentemente a pacientes adultos yancianos con EPOC, así como a pacientes conSIDA, por lo que se incluye en las series de NACcategorizadas como graves, con una prevalencia del3%-10%. Sin embargo, se desconoce su verdaderaincidencia en los pacientes no hospitalizados, debidoa que en la mayoría de éstos no se obtienenmuestras de esputo, y a la dificultad de establecer ladistinción entre colonización e infección. En losniños, la neumonía por H. influenzae se acompañacon frecuencia de otitis, epiglotitis y, en ocasiones,meningitis. El cuadro clínico es similar al de laneumonía neumocócica. El diagnósticomicrobiológico se basa en el aislamiento por cultivodel microorganismo y en la tinción de Gram de unesputo de calidad, que muestra una elevadaespecificidad (>90%) cuando se observa la presenciapredominante de bacilos gramnegativos pequeñosextra e intraleucocitarios.2.3.1.3. Neumonía por Legionella pneumophila. Laneumonía por L. pneumophila se incluye dentro delas denominadas neumonías por patógenosbacteriano atípicos, junto con M. pneumoniae y C.pneumoniae. La relativa contribución de estospatógenos a la NAC varía dependiendo de la

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población estudiada así como de los métodosdiagnósticos empleados, y su diagnóstico esproblemático. La presentación clínica puedeconfundirse con la causada por otros agentesinfecciosos y el cultivo, cuando es posible, es pocosensible o lento y requiere técnicas de cultivoespecíficas.

De las más de 40 especies de Legionella, L.pneumophila (principalmente los serogrupos 1, 4 y 6)es responsable de más del 90% de las infeccionescausadas por este grupo de organismos. L.pneumophila, de amplia distribución en la naturaleza,tiene su hábitat natural en las aguas ambientales,industriales y domésticas (grifos, duchas,acondicionadores de aire), en las que, normalmente,se encuentra en número reducido. Resistente a laacción de la cloración puede sobrevivir ymultiplicarse hasta números elevados. Latransmisión al hombre se produce por inhalacióndirecta, aspiración o instilación en el tractorespiratorio de líquidos contaminados. La neumoníapuede aparecer en casos esporádicos o en brotesepidémicos y su prevalencia varía mucho según lasáreas geográficas (en general del 2%-10%). Afecta alos principalmente a adultos varones y, comopatógeno intracelular, son factores predisponentestodas las situaciones de déficit de la inmunidadcelular (tabaquismo, alcoholismo, bronquitis crónica,tratamiento con corticosteroides), así como lainmunodepresión del transplantado.

Las manifestaciones clínicas de la neumonía porL. pneumophila son indistinguibles de las de lasneumonías de otra etiología. Con frecuencia, sepresenta de forma parecida a la neumoníaneumocócica grave, requiriendo hospitalización. Enotras ocasiones, la presentación corresponde a uncuadro más leve que recuerda a la neumonía“atípica”.

El diagnóstico diferencial puede presentardificultades. Aparte de la existencia de un broteconocido, pueden ser de utilidad la presencia dedatos tales como cefalea intensa, anomalíasgastrointestinales y neurológicas, necesidad deatención en unidad de cuidados intensivos, elevaciónde la creatinina y de las enzimas hepáticas,hiponatremia y falta de respuesta al tratamiento conantibióticos betalactámicos.

El diagnóstico microbiológico de certeza se basaen el cultivo de las secreciones y su aislamiento enel medio específico agar BCYEα, considerado comoel patrón de referencia. También, la detección delantígeno de Legionella en orina permite undiagnóstico rápido sensible y específico de laneumonía causada por L. pneumophila, aunque sólodel serogrupo 1 (sensibilidad del 70-90% yespecificidad mayor del 99%). En cuanto al estudioserológico, se considera diagnóstica laseroconversión (títulos de 1:128 o mayores) porinmunofluorescencia indirecta.

Para mayor información consultar elProcedimiento de la SEIMC Nº 20 y los PNT-LP-01,PNT-LP-04 y PNT-LP-05.

2.3.1.4. Neumonía por Mycoplasma pneumoniae. M.pneumoniae es un agente etiológico importante de laNAC. Su incidencia (globalmente más del 20% de lospacientes con NAC y el segundo agente etiológicodespués de S. pneumoniae) presenta ampliasvariaciones según las áreas geográficas, losperíodos en que se producen brotes epidémicos ylas poblaciones que residen en institucionescerradas. De forma clásica, se ha descrito una mayorpreferencia de presentación en los niños en edadescolar (5-15 años) y en los adultos jóvenes, siendomuy infrecuente en niños menores de 5 años. Sinembargo, estudios de los últimos años han puesto demanifiesto que la neumonía por M. pneumoniae tieneuna presentación endémica y epidémica significativaen los niños menores de 5 años y en los ancianos,aunque el síndrome más típico en los niñospequeños siga siendo la traqueobronquitis.

Generalmente, el curso clínico de la neumoníapor M. pneumoniae suele ser benigno (“neumoníaambulatoria”) e incluso asintomático. No obstante,cerca de un 3-4% de los pacientes requierenhospitalización, especialmente los ancianos, y enraras ocasiones se presenta como NAC de caráctergrave, dándose casos, aunque muy infrecuentes, enlos que cursa con síndrome de insuficienciarespiratoria aguda.

El cuadro clínico corresponde al “síndrome deneumonía atípica” en el que además de M.pneumoniae se incluyen las neumonías causadaspor C. pneumoniae, en ocasiones L. pneumophila, ylas relacionadas con zoonosis producidas por C.psittaci y C. burnetii, así como algunos virusrespiratorios y caracterizado por inicio subagudo, tosseca, predominio de manifestacionesextrapulmonares (artromialgias) sobre lasrespiratorias, imágenes radiológicas de infiltradosnodulares con distribución peribronquial y típicadisociación clínico-radiológica. De especialrelevancia son las manifestaciones extrapulmonaresque se producen en la infección por M. pneumoniae,tanto por su variedad (neurológicas, cardíacas,cutáneas, hematológicas), como por su gravedad,que en ocasiones sobrepasan en importancia alcuadro respiratorio.

Al igual que en el resto de las neumoníasatípicas, el diagnóstico microbiológico esfundamentalmente serológico (título elevado deanticuerpos IgM en el suero de la fase aguda y/oseroconversión del título de anticuerpos IgG en elsuero de la fase de convalecencia y/o títulos deanticuerpos IgG altos y estacionarios en ambossueros agudo y de la fase convaleciente). Por sumayor especificidad, se prefieren las técnicas deELISA que emplean como antígeno un purificado deproteínas (adhesinas) del microorganismo. Serecomienda realizar la determinación de los títulos deambos tipos, IgM e IgG, de inmunoglobulinasespecíficas, especialmente en los adultos mayoresde 35 años, que pueden no presentar elevación deIgM después de reinfecciones repetidas. La técnicade Western blot para determinación de IgG e IgA esotra buena alternativa. Por el contrario, no se

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considera adecuado el empleo de la técnica defijación de complemento, ya que además de nodistinguir la clase de anticuerpos, presentareacciones cruzadas con otros microorganismos.Tampoco se considera de utilidad clínica ladeterminación de la presencia de crioaglutininas, porsu baja sensibilidad y especificidad.

El cultivo y el aislamiento del M. pneumoniae enmedios específicos es difícil y lento (sensibilidadinferior al 60% respecto a la PCR o la serología), porlo que no se utiliza con frecuencia para eldiagnóstico de rutina.

Las pruebas rápidas para la detección antigénicadirecta del M. pneumoniae en las muestrasrespiratorias (inmunofluorescencia, ELISA decaptura) muestran una sensibilidad baja y no sonrecomendables. Por el contrario, las técnicas deamplificación de ácidos nucleicos como las sondasde ADN y sobre todo la PCR (combinada conhibridación o con reamplificación posterior delproducto de la PCR) poseen una importantesuperioridad diagnóstica frente al cultivo o laserología y se encuentran comercializadas.2.3.1.5. Neumonía por Chlamydophila pneumoniae yotras clamidias. Las dos especies del nuevo géneroChlamydophila compuesto por C. pneumoniae y C.psittaci, así como la especie Chlamydia trachomatis,son agentes etiológicos de la NAC, aunque, como haquedado expuesto en el apartado correspondiente ala bronquitis, dentro de contextos epidemiológicosdistintos: C. trachomatis, en lactantes que adquierenla infección durante el nacimiento y C. psittaci, porexposición a secreciones de pájaros infectados.

Las especies de la familia Chlamydiaceae sonmicroorganismos intracelulares obligados, con totaldependencia de la energía producida por el huéspedpara su replicación dentro del citoplasma de la célulahuésped, donde el microorganismo forma lascaracterísticas inclusiones intracelulares. Presentanpreferencia por las células epiteliales, losmacrófagos y las células mononucleares. Su efectocitopático consiste en disfunción ciliar y daño en elepitelio bronquial.El diagnóstico microbiológico de la infección por C.pneumoniae no está exento de problemas ylimitaciones, requiriendo técnicas específicas ypersonal adiestrado. El cultivo es una técnicadiagnóstica muy insensible, debido al crecimientodifícil del patógeno. El aislamiento delmicroorganismo se realiza por cultivo de lasmuestras del tracto respiratorio (se debe evitar elesputo) en líneas celulares y posterior confirmaciónde su presencia en los cuerpos de inclusiónmediante anticuerpos fluorescentes, o bien por ladetección de las formas extracelulares en lasmuestras mediante tinción directa con antisuerosespecíficos de género o especie. Comoconsecuencia de la escasa sensibilidad ycomplicación técnica del cultivo, las pruebasserológicas se han utilizado mucho másampliamente. De todas ellas, la técnica demicroinmunofluorescencia (MIF) es la únicarecomendada en la actualidad para el diagnóstico de

rutina de la infección por C. pneumoniae. Estatécnica, la más utilizada, permite establecer loscriterios de evidencia serológica de la infecciónaguda (título de anticuerpos IgM mayor o igual a 16 oanticuerpos IgG mayor a 512 en el suero de la faseaguda o seroconversión del título de anticuerposIgG) y de la exposición ya pasada al microorganismo(indicada por un título de IgG entre 8 y 256; IgMmenor de 16). No obstante, hay que señalar que laMIF presenta también inconvenientes, como lavariabilidad en la calidad de los reactivoscomerciales disponibles y la subjetividad de lainterpretación de los resultados. En la literatura sehan descrito otras técnicas serológicas alternativaspara la detección de C. pneumoniae (ELISA,Western blot), pero en la actualidad no serecomienda su empleo debido a su falta decomercialización o a la falta de evaluación de suespecificidad.

Con todo, el diagnóstico serológico presentaserias limitaciones, como son la alta prevalencia deanticuerpos frente a C. pneumoniae en la poblacióngeneral, las frecuentes infecciones crónicas yreinfecciones en el adulto, y los frecuentesportadores asintomáticos. Todo ello haceextremadamente difícil diferenciar la infección agudade la infección previa, la infección crónica de lacolonización o la reactivación de una infeccióncrónica.

En la actualidad, los métodos molecularesofrecen mayor sensibilidad que el cultivo. Laaplicación de la PCR (dirigida frente al gen 16SARNr, el gen MOMP o la proteína 60-kDa rica encisteína) sobre la secreción faríngea, lavadobroncoalveolar (LBA) y esputo permite la deteccióndel microorganismo en las muestras. Aunque existencuatro técnicas de PCR para la detección de C.pneumoniae validadas por los CDC, no seencuentran disponibles en el comercio. Merecen mención aparte las dos especies delgrupo “nuevas clamidias”, Parachlamydiaacanthamoebae y Simkania negevensis,recientemente reconocidas como patógenosrespiratorios emergentes. Ambas especies,asignadas a nuevas familias (familiaParachlamydiaceae y familia Simkaniaceae,respectivamente) pertenecen al orden Chlamydiales,pero fuera de la familia Chlamydiaceae y seengloban bajo el término “clamidias resistentes aamebas” por su capacidad de infectar y sobrevivirdentro de las amebas, que utilizan como reservorioambiental.

P. acanthamoebae coloniza las mucosas nasal yfaríngea de los individuos sanos y ha sido implicadacomo agente causal de casos de bronquitis,neumonía adquirida en la comunidad y neumonía poraspiración en pacientes inmunocomprometidos, porlo que se comporta como un patógeno oportunista.El microorganismo ha sido detectado por aislamientoy PCR en el LBA y en el esputo, y los estudiosserológicos han demostrado la presencia de

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anticuerpos, así como de seroconversión en lospacientes con neumonía.

S. negevensis, se encuentra ampliamentedistribuida, como lo demuestra la elevadaseroprevalencia y su detección por PCR, peroademás se ha asociado con bronquiolitis enlactantes, infección crónica del tracto respiratorioinferior en adultos, exacerbaciones del EPOC yneumonía, además de haberse detectado por PCRen biopsias arteriales.

Estudios futuros permitirán conocer la verdaderaincidencia de la infección respiratoria por estos dosnuevos patógenos emergentes.2.3.1.6. Neumonía por Moraxella catarrhalis. M.catarrhalis es un colonizador frecuente del tractorespiratorio superior de niños y adultos sanos y deforma especial en los adultos con EPOC. Se leasocia con cuadros de sinusitis y otitis media en losniños. Como agente etiológico de la NAC, M.catarrhalis da cuenta del 10% de los casos en laspersonas ancianas, sobre todo en las que sufrenenfermedades subyacentes, en especial la EPOC,insuficiencia cardiaca congestiva, diabetes mellitus yotras enfermedades crónicas. 2.3.1.7. Neumonía por Enterobacteriaceae. Lasenterobacterias forman parte de la microbiota normalgastrointestinal. Cuando en las células del huéspedocurre una alteración de los puntos de unión para losbacilos gramnegativos, se produce un aumento en lacolonización orofaríngea por estas bacterias que,fundamentalmente, por aspiración alcanzan elparénquima pulmonar y dan lugar a la neumonía.Aunque el aumento de la colonización por bacilosgramnegativos es más frecuente en los pacienteshospitalizados y la neumonía por enterobacterias es,en general, nosocomial, las enterobacterias tambiénson causa de NAC en un grupo restringido depacientes no hospitalizados, si bien en unaproporción mucho más reducida (<5%). Lospacientes con inmunodepresión, enfermedadesdebilitantes crónicas, como la diabetes, y EPOC,hospitalización previa o tratamiento antimicrobianotienen un riesgo mayor de padecer neumonía porenterobacterias.

Las neumonías causadas por Escherichia coli yK. pneumoniae tienden a la formación de empiema,abscesos y adherencias pleurales y se acompañande una elevada tasa de mortalidad. Otras especiesde enterobacterias asociadas a neumonía en estospacientes incluyen Enterobacter spp., Hafnia spp., yCitrobacter spp.2.3.1.8. Neumonía por Pseudomonas y otros bacilosgramnegativos no fermentadores. P. aeruginosa, esuna bacteria muy ubicua y forma parte de lamicrobiota normal de las personas sanas. Lospacientes con inmunodepresión, alteración de losmecanismos respiratorios (enfermedad pulmonarcrónica, insuficiencia cardíaca congestiva,bronquiectasias, fibrosis quística) y hospitalizaciónprevia son especialmente susceptibles a laneumonía por P. aeruginosa. La vía de adquisiciónse produce por la aspiración del microorganismo quecoloniza en altas tasas la faringe y el tracto

respiratorio superior. P. aeruginosa, tiene resistenciaintrínseca a muchos agentes antimicrobianos y es elprincipal agente etiológico bacteriano multirresistentede la neumonía nosocomial.

Acinetobacter spp., se encuentra distribuido deforma ubicua en multitud de fuentes ambientales ytambién coloniza heces, piel y esputos de laspersonas sanas fuera del medio hospitalario. Sinembargo, Acinetobacter spp. es causa de neumoníacomunitaria en pacientes con inmunosupresión.2.3.1.9. Neumonía por aspiración. Se denominaneumonía aspirativa a la producida por la aspiraciónde secreciones orofaríngeas o de materialcontaminado procedente del tracto digestivo. Laaspiración de secreciones contaminadas esfrecuente durante el sueño, pero en condicionesnormales estas secreciones son eficazmenteeliminadas por los mecanismos defensivos delhuésped (tos, la acción del epitelio ciliar y losmacrófagos alveolares). Cuando estos mecanismosestán alterados (alteración de la consciencia, de ladeglución y boca séptica), la aspiración es de granvolumen o contiene un alto inóculo bacteriano, sedesarrolla la infección pulmonar.

La neumonía por aspiración puede representarhasta el 10-15% de los casos de NAC. Presentadificultades para el diagnóstico clínico, cuyas únicasclaves son la presencia de infiltrado pulmonar en unazona declive en un paciente con factores de riesgode aspiración o boca séptica, y rara vez se confirmabacteriológicamente. En ocasiones, evoluciona deforma grave hacia la necrosis y el absceso pulmonar.

La etiología suele ser polimicrobiana. Cuando enun paciente no hospitalizado se produce unaaspiración, las bacterias anaerobias (Fusobacteriumspp., Bacteroides spp., Prevotella spp.,Peptostreptococcus spp., etc) y los estreptococosmicroaerofílicos de la orofaringe son losmicroorganismos predominantes. En los pacienteshospitalizados, además de los microorganismosanteriores se incluyen también patógenosnosocomiales, como S. aureus (2-33%) y bacilosgramnegativos. Una higiene oral deficiente es unfactor de riesgo, en el que la placa dental actúacomo un reservorio.

Para el diagnóstico microbiológico, el esputo noes de utilidad, por lo que es necesario realizartécnicas invasivas que eviten la contaminación con lamicrobiota orofaríngea, aunque en la mayoría de loscasos su práctica no se lleva a cabo, ya que losagentes causales y su sensibilidad son predecibles.2.3.2. Neumonía en el paciente inmunodeprimido.En los pacientes inmunodeprimidos la infecciónpulmonar tiene, además de una elevada frecuencia,una morbilidad y mortalidad importantes, por lo queel diagnóstico microbiológico adquiere una granrelevancia en estos síndromes por la necesidad dela instauración precoz del tratamiento antimicrobianoadecuado.

Las diferentes alteraciones de los mecanismos dedefensa inmunitaria permiten clasificar a lospacientes inmunodeprimidos en tres grandes grupos,cada uno de los cuales tiene una etiología bacteriana

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más probable: 1) pacientes en los que predomina undeterioro en el número y función de los granulocitos(pacientes en tratamiento con citotóxicos, pacientesen las 3-4 semanas postrasplante de médula ósea)expuestos con mayor probabilidad a infeccionesbacterianas piógenas como P. aeruginosa, Klebsiellapneumoniae, enterobacterias, Acinetobacter spp.,Stenotrophomonas maltophilia, S. pneumoniae, S.aureus, así como también Candida spp. y hongosfilamentosos, 2) pacientes con deterioroinmunocelular (trasplante de órganos sólidos ymédula ósea, infección por el VIH, tratamiento concorticoides y fármacos inmunosupresores,enfermedades hematológicas, radioterapia,enfermedad injerto contra huésped), sujetos ainfecciones por bacterias como Legionella spp.,Nocardia spp., Listeria monocytogenes, Salmonellaspp., Rhodococcus equi y micobacterias y, 3)pacientes con deterioro de la inmunidad humoral(pacientes con mieloma, asplenia,hipogammaglobulinemia, corticoides, quimioterapia,trasplante de médula ósea, leucemia linfática,linfoma no Hodgkin) especialmente predispuestos ainfecciones por bacterias encapsuladas, como S.pneumoniae, H. influenzae y Neisseria meningitidis.

S. maltophilia coloniza frecuentemente el tractorespiratorio de estos pacientes y su transmisiónpuede realizarse desde fuentes ambientales,soluciones farmacológicas, agua de las instalacioneshospitalarias o a través de las manos del personalsanitario. La neumonía por S. maltophilia se asociacon una elevada tasa de mortalidad.

La incidencia de la neumonía, adquirida tanto enel medio hospitalario como en la comunidad,depende del déficit inmunológico subyacente. Así, enel paciente trasplantado, en el que se producen lostres tipos de déficit de inmunidad de forma sucesivay según el tiempo transcurrido desde el trasplante, laincidencia es máxima, con cifras que dependen delórgano trasplantado (inferior al 10% en el renal, entreel 5-38% en el hepático y en el cardíaco, y superioral 50% en el de pulmón). En el pacienteneutropénico la incidencia de neumonía es menor(0,5-10%). En el paciente con infección por el VIH laincidencia de neumonías bacterianas es 6 vecessuperior a la de la población general. Igualmente, lamortalidad por neumonía en los pacientesinmunodeprimidos es muy elevada (superior al 50%)y de forma especial en los pacientes infectados porel VIH (85%).

2.4. NEUMONÍA NOSOCOMIALLa neumonía nosocomial es una de las

principales causas de infección hospitalaria. Sudiagnóstico rápido y correcto es esencial para lainstaurar tratamiento antibiótico apropiado. Untratamiento incorrecto en las primeras horas conllevaun peor pronóstico y el uso excesivo de antibióticosse acompaña de mayor morbilidad y mortalidad.

Se define como neumonía nosocomial a aquellaque se presenta después de las 48 horas del ingresohospitalario. Es la segunda causa más frecuente deinfección adquirida en el hospital y la principal causa

de mortalidad por infección nosocomial. Suincidencia depende de varios factores, peroglobalmente se estiman tasas del 10-20% (5 a 10casos/1000 hospitalizaciones) en los pacientes sinventilación mecánica y tasas 20 veces más altas enlos pacientes con tubo endotraqueal.

La neumonía nosocomial se producegeneralmente por microaspiración de las secrecionesorofaríngeas o gástricas contaminadas conmicrobiota colonizante (generalmente modificada porsobrecrecimiento o tratamiento antibiótico previoprolongado), por aspiración de un gran inóculo demicroorganismos y por alteración o abolición de losmecanismos de defensa del tracto respiratorio detipo mecánico (epitelio ciliado y moco), humoral(anticuerpos) y celular (polimorfonucleares,macrófagos y linfocitos y sus respectivas citocinas).Dentro de la neumonía nosocomial, la neumoníaasociada a ventilación mecánica (NAV) presentaciertas características especiales que la hacendiferente de la neumonía nosocomial no asociada aventilación mecánica.2.4.1. Neumonía en el paciente sin ventilaciónmecánica. Las vías de acceso de losmicroorganismos al parénquima pulmonar incluyen lamicroaspiración de la microbiota orofaríngeacolonizadora (la causa más frecuente), la inhalaciónde aerosoles acuosos (duchas, grifos) y aéreos(saliva, bacterias en suspensión), el reflujo delcontenido gástrico contaminado con microbiotagramnegativa y, por último y con menor frecuencia,la diseminación por vía hemática desde otro focoinfeccioso.

El paso previo a la infección es la colonización dela orofaringe (por vía exógena o por vía retrógradagástrica) por una gran concentración de bacilosgramnegativos. Este proceso se produce durante lahospitalización prolongada y afecta hasta un 60% delos pacientes.

La orofaringe está normalmente recubierta defibronectina, que proporciona a las bacteriasgrampositivas una superficie de adhesión a lamucosa. Los enfermos críticos presentan unaumento de los valores de proteasa que, a su vez,produce una disminución de la inmunoglobulina A dela mucosa y de la fibronectina. Se impide así, laadherencia de las bacterias grampositivas a lamucosa y se favorece la adherencia de bacteriasgramnegativas, a lo que se añade el efecto deselección bacteriana producido por el tratamientoantibiótico. Así, P. aeruginosa, que coloniza en tasasbajas la piel y las mucosas nasal y faríngea de laspersonas sanas, en los pacientes hospitalizadosadquiere una tasa de colonización superior al 50%,especialmente tras la administración de tratamientoantimicrobiano prolongado. Otro tanto ocurre conAcinetobacter spp., que además también colonizacon frecuencia y persistencia al personalhospitalario.

En el desarrollo de la neumonía nosocomial,además del papel crítico que supone la modificacióniatrogénica de la microbiota orofaríngea por elempleo prolongado de antibióticos, se produce una

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inmunosupresión temporal o parálisis inmunitaria demecanismo no bien conocido, que se manifiesta poruna disminución de la expresión de los marcadoresde superficie celular, como el HLA-DR en losmonocitos y macrófagos alveolares, así como por lamodificación en la concentración de mediadorescomo la IL-10. También se sugiere la intervención deuna cierta predisposición genética que llevaría a laadquisición de infecciones múltiples y secuenciales.

Son factores de riesgo para la adquisición deneumonía nosocomial la inmunosupresión,enfermedades subyacentes, enfermedadcardiopulmonar, diabetes, EPOC, cirugía previa,tratamiento antibiótico previo, pérdida deconsciencia, sedación y empleo de todos los agentesque conlleven una disminución de la eficacia de latos, como sedantes, analgésicos y anticolinérgicos.El curso puede ser fulminante o indolente y tiene unamortalidad aproximada del 18%.

Entre los agentes etiológicos, los bacilosgramnegativos son causa del 20-60% de lasneumonías nosocomiales, incluyendo P. aeruginosa,Enterobacter spp., K. pneumoniae, E. coli, Serratiamarcescens, Hafnia spp. y Acinetobacter spp. S.aureus tiene un papel destacado por su frecuencia(mayor en los pacientes sometidos a cirugía),gravedad y aumento de su resistencia a la meticilina.Por el contrario, la implicación de microorganismosanaerobios es infrecuente, aunque con frecuencia laetiología es polimicrobiana. En ocasiones, latransmisión de los microorganismos se realiza pormedio del personal hospitalario.

En relación con el momento de presentación, enla neumonía nosocomial de aparición precoz (menosde 5 días), el espectro de los microorganismoscorresponde a patógenos prevalentes en lacomunidad e integrantes de la propia microbiota delpaciente, como S. pneumoniae, H. influenzae, E. coliy otros bacilos gramnegativos entéricos sensibles opoco resistentes a los antibióticos y S. aureussensible a meticilina. La neumonía nosocomial deaparición tardía tienen más probabilidad de estarcausadas por microorganismos multirresistentes (P.aeruginosa, Acinetobacter spp., enterobacteriasresistentes y S. aureus resistente a la meticilina). Noobstante, la resistencia a los antibióticos guardamayor asociación con la hospitalización y eltratamiento antibiótico previo que con el tiempo decomienzo de la neumonía. Los factores clínicos deriesgo y la patología de base del paciente puedenayudar a predecir la probabilidad del agentecausante. Así, los pacientes con coma, traumatismo,diabetes e insuficiencia renal están predispuestos apadecer neumonía nosocomial por S. aureus (2-33%de los casos) que tiende a progresar a cavitación y ala formación de abscesos pulmonares y empiemapleural. Los pacientes con larga estancia en UCI,tratamiento antimicrobiano prolongado o enfermedadpulmonar de base presentan mayor riesgo depadecer neumonía por Pseudomonas . Los pacientesinmunodeprimidos tienen predisposición a padecerneumonía por Candida spp. y L. pneumophila. Este

último agente puede aparecer en brotes hospitalariosa partir de instalaciones de agua contaminadas.

El diagnóstico clínico es difícil. Diferentesestudios indican que los criterios diagnósticos deinfiltrado radiográfico nuevo o progresivo y al menosdos de tres características clínicas (fiebre,leucocitosis o secreciones purulentas) tienen unasensibilidad elevada, pero una baja especificidad. Eldiagnóstico microbiológico se basa en la tinción deGram y en el cultivo del esputo o de las secrecionestraqueales. La presencia predominante de bacilosgramnegativos en la tinción de un esputo ysecreciones que cumplan los criterios de calidad enla valoración microscópica es muy sugestiva deinfección por gramnegativos. El procesamiento delas muestras debe realizarse a la mayor brevedad,ya que el retraso en el inicio del tratamientoantibiótico apropiado se asocia con una mayormortalidad. También deben realizarse hemocultivos(aunque la sensibilidad es inferior al 25%) ydeterminación de antigenuria de S. pneumoniae y L.pneumophila. Entre los medios de cultivo debeincluirse el medio específico para Legionella para elaislamiento de las cepas con serogrupos distintos alserogrupo 1. La punción pulmonar transtorácica esuna alternativa válida. Sin embargo, la realización detécnicas invasivas debe reservarse para lospacientes con neumonía grave, inmunosupresión ofalta de respuesta al tratamiento.2.4.2. Neumonía en el paciente con ventilaciónmecánica. La neumonía constituye la primera causade infección en el paciente con ventilación mecánicay lleva asociada unas tasas de morbilidad ymortalidad muy elevadas, por lo que la informaciónmicrobiológica es esencial para instaurar a la mayorbrevedad un tratamiento antibiótico apropiado. Untratamiento inicial inadecuado conlleva un aumentode la mortalidad y el tratamiento antibiótico excesivoaumenta las complicaciones, el coste y lasresistencias.

En los pacientes intubados el riesgo dedesarrollar neumonía es entre 6 y 21 veces mayorque en los no intubados y aumenta en 1-3% porcada día de ventilación mecánica. Según los datosrecogidos en nuestro país por el Estudio Nacional deVigilancia de la Infección Nosocomial en UCI(ENVIN-UCI) durante el año 2005, la neumoníaasociada a ventilación mecánica (NAV) representó el42% de las infecciones adquiridas en la UCI. Lastasas de incidencia de la NAV varían según lascaracterísticas de la población estudiada (del 5,8%en niños, hasta el 24,1% en quemados). Los datosrecogidos por el ENVIN-UCI durante el año 2005arrojan una tasa de densidad de incidencia de 17,2episodios de NAV por 1.000 días de ventilaciónmecánica y de 15,5 episodios por cada 100pacientes con ventilación mecánica.

Los criterios clínicos de sospecha de NAV sebasan en la presencia (48-72 horas después deiniciar la ventilación mecánica) de infiltradospulmonares asociados con fiebre o hipotermia,leucocitosis o leucopenia y secrecionestraqueobronquiales purulentas. Otros signos que se

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incluyen son hipoxemia, aumento de leucocitosinmaduros (más de 10% de cayados), persistenciay/o extensión del infiltrado pulmonar y/o evoluciónrápida del infiltrado hacia la cavitación. Estoscriterios suelen ser suficientes para instaurar untratamiento empírico. Sin embargo, con frecuencia,el diagnóstico clínico presenta dificultades, ya que enestos pacientes la fiebre y los infiltrados pulmonarespueden deberse a procesos no infecciosos.

En los pacientes intubados la infección pulmonarse produce por las mismas vías descritas en laneumonía nosocomial sin ventilación mecánica, queen estos pacientes está ampliamente facilitada por laintubación endotraqueal. El tubo endotraquealfavorece la abolición de las barreras mecánicas delas vías aéreas del tracto respiratorio superior (laglotis, el reflejo de la tos y el lavado mucociliar),mantiene abierta la glotis facilitando el paso directode las secreciones orofaríngeas hacia la vía aéreadistal y, además, debido al biofilm que le recubre, secomporta como un reservorio bacteriano. La principal vía de infección se produce a partirde la superficie externa del tubo endotraqueal que,por una presión inadecuada del balón de aislamientode la vía aérea, permite que se produzcanaspiraciones repetidas de las secrecionesorofaríngeas, con su correspondiente microbiotabacteriana endógena. La segunda vía es lainhalatoria o exógena, en la que la infecciónpulmonar se produce por inhalación directa por la luzdel tubo endotraqueal a partir de reservoriosexternos (respiradores, aerosoles, humidificadores),por manipulaciones (aspiración de secreciones) y portécnicas invasivas (la propia intubación,fibrobroncoscopia). Otra posible vía de infección,más rara (en pacientes inmunológicos, oncológicos ygrandes quemados), se realizaría por translocaciónbacteriana mediante el paso de los microorganismosa través de la mucosa intestinal (facilitado por laisquemia, malnutrición y los traumatismos) y laformación de bacteriemias que dan lugar a lacolonización bacteriana del pulmón.

En ocasiones, la contaminación bacteriana delaire y agua de las instalaciones hospitalarias puedellevar a originar casos esporádicos o brotesepidémicos de neumonía por Aspergillus y Legionellaspp., respectivamente. Curiosamente la NAV porLegionella spp. es muy infrecuente, quizás debido aque los pacientes con ventilación mecánica estánprotegidos a la exposición al agua contaminada.

Entre los factores de riesgo para adquirir la NAV,además de todas las situaciones que disminuyan lasdefensas del tracto respiratorio y favorezcan laaspiración de secreciones, destacan la duraciónprolongada de la ventilación, la edad, enfermedadpulmonar crónica, situación de gravedad,traumatismo craneal, profilaxis con antiácidos o anti-H2, sondaje nasogástrico y la reintubación.

La mortalidad en la NAV (33-72%), se relacionacon los factores de riesgo, la gravedad al ingreso, elagente etiológico y la administración inadecuada otardía del tratamiento antibiótico. En cuanto a losagentes etiológicos, también caben ciertas

diferencias en relación con el momento de lapresentación de la neumonía. En las NAV depresentación precoz (primeros 5-7 días de estanciahospitalaria) que se producen en pacientes sintratamiento antibiótico previo ni enfermedad crónicade base (pacientes con traumatismos, neurológicos,cirugía programada) los agentes etiológicospertenecen a bacterias de la microbiota endógenaprimaria, del propio paciente, con predominio de S.aureus (meticilina sensible), S. pneumoniae, H.influenzae y enterobacterias. En cambio, en las NAVtardías (después de 5-7 días de ventilación) y en lospacientes con ingreso anterior, enfermedadescrónicas, tratamiento antibiótico previo, los agentescausantes forman parte de la microbiota endógenasecundaria del paciente, en este caso, las bacteriasadquiridas en el medio hospitalario y prevalentes enla unidad donde esté ingresado, con predominio deP. aeruginosa, Acinetobacter baumannii, S.maltophilia, enterobacterias con frecuenciamultirresistentes y S. aureus (frecuentementeresistente a meticilina). En las unidades de cuidadosintensivos la transmisión de Acinetobacter spp.puede estar particularmente asociada al equipo deventilación, a los guantes y al personal de enfermeríacolonizado. No se consideran patógenas para elpulmón la mayoría de las especies del géneroCorynebacterium, Streptococcus del grupo viridans,Enterococcus, Bacillus y los Staphylococcuscoagulasa negativos. Las bacterias anaerobias noson agentes etiológicos importantes de la NAV ycuando se encuentran suelen formar parte de unainfección polimicrobiana. Los aislados del géneroCandida se asocian, en general, a colonización. Lomismo sucede con los aislamientos de hongosfilamentosos, como Aspergillus, que sólo son causade NAV en los pacientes con formas graves deinmunodeficiencia. En aproximadamente el 25% delos casos la etiología puede ser polimicrobiana.Además, el 15-30% de las NAV son recurrentes,como en el caso concreto de la NAV por P.aeruginosa cuya recurrencia puede ser hasta del50%. M. pneumoniae y C. pneumoniae también hansido implicados como causa de NAV pero, al no serestudiados sistemáticamente, su papel esdesconocido.

La necesidad de instaurar de forma inicial eltratamiento antimicrobiano apropiado en el pacientecon NAV, hace crucial la identificación rápida delagente etiológico. Sin embargo, el diagnóstico clínicoy el microbiológico son todavía controvertidos,presentan limitaciones y carecen de “patrón oro”. Eldiagnóstico clínico es poco específico y puedeconducir a un tratamiento antibiótico innecesario.

El diagnóstico microbiológico de la NAV se basaen la realización de cultivos cuantitativos de lassecreciones del tracto respiratorio inferior obtenidaso no mediante broncoscopia. El empleo de métodosinvasivos (fibrobroncoscopia) tiene por objeto laobtención de muestras representativas del tractorespiratorio inferior (cepillado bronquial mediantecatéter telescopado protegido (CTP) y LBA sincontaminación con microbiota de la orofaringe o, al

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menos, con la menor contaminación posible. Larealización de cultivos cuantitativos permiteestablecer puntos de corte en el crecimientobacteriano que faciliten la diferenciación entrecolonización e infección. Para el diagnóstico de laNAV se requiere un crecimiento del agente oagentes etiológicos por encima de los puntos decorte establecidos para cada muestra. El crecimientopor debajo de este punto se asume comocolonización o contaminación.

El interés de las técnicas invasivas combinadascon cultivos cuantitativos reside, en gran medida, nosólo en la detección del agente etiológico, que facilitael tratamiento antibiótico apropiado, sino en laposibilidad de cambiar, reducir o suprimir untratamiento innecesario, ya que los cultivos estérilesdel tracto respiratorio inferior, en ausencia de uncambio reciente en el tratamiento antibiótico,permiten excluir prácticamente la infecciónbacteriana. El inconveniente de estos procedimientoses que no están exentos de complicaciones para elpaciente y precisan personal especializado.

De los procedimientos no invasivos, el aspiradotraqueal (AT) es el de obtención más asequible detodos. El cultivo cualitativo del AT tiene muy buenasensibilidad (90-100%) respecto al CTP y el LBA, yaque en él crecen todos los organismos encontradosen el CTP o LBA, pero tiene una especificidad muybaja (14-47%), por lo que no es recomendable parael diagnóstico etiológico. Sin embargo, el cultivocuantitativo del AT proporciona resultados muysimilares a los obtenidos con el CTP o el LBA, conmárgenes de sensibilidad y especificidad muyamplios (38-100%, y 14-100%, respectivamente,dependiendo del punto de corte aplicado 105 ufc/ml ó106 ufc/ml). Otra alternativa a los métodos invasivos, demás fácil realización y menor riesgo, la constituyenlas técnicas ciegas. Estas técnicas nobroncoscópicas realizadas mediante la inserción aciegas de un catéter (telescopado o no) en unbronquio distal, junto con la realización de cultivoscuantitativos de las secreciones obtenidas en el CTPciego (sensibilidad, 58-86%; especificidad, 71-100%)o en la aspiración bronquial ciega (sensibilidad, 74-97%; especificidad, 74-100%) o en el mini-LBA ciego(sensibilidad, 63-100%; especificidad, 66-96%)obtenidos, poseen un valor diagnóstico de la NAVcomparable al de las técnicas broncoscópicas(concordancia entre 73% y 100%).

La fibrobroncoscopia parece estarparticularmente indicada en grupos determinados depacientes, como ante la sospecha de NAV decomienzo tardío, falta de respuesta al tratamientoantibiótico empírico, pacientes inmunodeprimidos ocon sospecha de un diagnóstico alternativo.

En cuanto al valor diagnóstico de las diferentesmuestras, el LBA y el AT representan la infecciónmultifocal pulmonar y están indicados en losinfiltrados difusos y en la sospecha de patógenosoportunistas, mientras que el CTP (que es másespecífico que sensible) sólo representa unsegmento bronquial, por lo que está indicado en los

infiltrados localizados. Los estudios comparativossobre el valor de las técnicas invasivas frente a lastécnicas no invasivas para el diagnóstico de la NAV,no han proporcionado datos convincentes quepermitan establecer una superioridad manifiesta delas técnicas broncoscópicas frente a las nobroncoscópicas. En cambio, es evidente que esesencial que los procedimientos aporten resultadoscon cuantificación bacteriana.

Tampoco existe unanimidad ni recomendaciónsobre el tipo de muestras a obtener para eldiagnóstico de la NAV. Lo que parece estar claro esque la toma de muestras precoz y el inicio rápido deltratamiento son más importantes que el tipo detécnica cuantitativa utilizada y que la elección delmétodo depende de la experiencia, disponibilidad ycoste en cada institución. En cualquier caso, seacual sea la técnica diagnóstica empleada, laobtención de las muestras debe hacerse antes delinicio del tratamiento antibiótico y de cualquiercambio de éste y su procesamiento debeconsiderarse como una urgencia microbiológica porla repercusión que sus resultados tienen sobre lamorbilidad y mortalidad del paciente con NAV. Hayque tener presente que pueden obtenerse cultivoscuantitativos falsamente negativos si se ha iniciado ocambiado el tratamiento antibiótico en las 24-48horas precedentes o si el paciente se encuentra enel inicio de la infección.

Las normas de la American Thoracic Society andthe Infectious Diseases Society of America para elmanejo de los pacientes con NAV, recomiendan laobtención de muestras del tracto respiratorio inferior(antes de iniciar o cambiar el tratamiento antibiótico)y la realización de cultivos cuantitativos tanto del AT,como en las muestras tomadas con el broncoscopioo a ciegas, teniendo en cuenta que cada muestratiene su propio punto de corte.

La tinción de Gram aplicada a las secreciones deltracto respiratorio inferior puede ser de enormeutilidad, ya que proporciona información inmediatapara orientar el diagnóstico etiológico de la NAV y eltratamiento antibiótico inicial. Los diferentes estudiosarrojan datos muy variables sobre su sensibilidad(57-95%) y especificidad (48-87%) en las distintasmuestras, por lo que su valor diagnóstico en la NAVtambién es controvertido. Sin embargo, la tinción deGram de las secreciones del AT presenta una altasensibilidad (91%) y un alto valor predictivo negativo(94%) para el diagnóstico de la NAV en los pacientessin cambios en el tratamiento antibiótico. En el casodel CTP, la tinción de Gram muestra una sensibilidadmuy baja, pero una especificidad alta (95%) quepermite iniciar la antibioterapia de forma inmediata.El examen para la detección de organismosintracelulares en la tinción de Gram del LBA esobligado por su elevado valor predictivo deneumonía (especificidad = 90%).

En todos los pacientes con NAV se deben realizarhemocultivos, teniendo presente que un resultadopositivo puede indicar tanto la presencia deneumonía, como de una infección extrapulmonar.

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La determinación en el LBA de los marcadoresbiológicos de infección y de los receptores solublesexpresados en las células (receptor desencadenantesoluble sTREM-1), parece tener un valor prometedoren la predicción de la NAV, pero todavía se requiereuna mayor experiencia para su aplicación en eldiagnóstico de rutina y para su comercialización.

2.5. COLONIZACIÓN-INFECCIÓN RESPIRATORIACRÓNICA En el contexto fisiopatológico determinado porciertas enfermedades respiratorias crónicas de base,entre ellas el EPOC, las bronquiectasias crónicas y,particularmente, la fibrosis quística, surge unaentidad infecciosa con características clínicas ymicrobiológicas claramente distintivas definida comocolonización-infección respiratoria crónica. En el concepto colonización-infección, eltérmino infección no implica la invasión bacterianatisular, ni necesariamente un mecanismo virulentoactivo, sino un efecto patogénico pasivo derivado dela propia presencia del microorganismo que colonizala superficie mucosa bronquial y sus secreciones conuna elevada densidad de células bacterianas porunidad de superficie. Es decir, es una colonizacióncon efectos patogénicos. Estos efectos patogénicosse deben originar, por una parte por la reducciónfísica que la enorme masa bacteriana (más de 1010

células por gramo de tejido) produce en el accesodel oxígeno a los alvéolos pulmonares; por otraparte, por la reducción a nivel de la mucosabronquial del agua, oxígeno y nutrientes orgánicos einorgánicos que se requieren competitivamente porlos procesos metabólicos y de crecimientobacteriano; y, por último, por la liberación durante losprocesos catabólicos y de autolisis de la masabacteriana, de moléculas con potenciales efectosbioactivos sobre el huésped e inductoras deprocesos proinflamatorios locales. Sin olvidar, porotra parte, que las altas densidades de colonizaciónbacteriana facilitan la aparición de variantesbacterianas con alta resistencia a los antimicrobianosy quizás, también, de variantes con hiperexpresiónde mecanismos de virulencia capaces de producirefectos patogénicos activos. Independientemente del mecanismo patogénicodesencadenante, estas enfermedades respiratoriascrónicas se caracterizan por la producción de unadisminución de la capacidad de eliminación demicroorganismos de las vías respiratorias inferiores,facilitando su presencia persistente en estalocalización habitualmente estéril. Sin duda, elcomponente infeccioso tiene una importanterepercusión sobre la elevada morbimortalidad deestas patologías crónicas. En términos generales, eldeterioro progresivo de la función pulmonar y, portanto, de la calidad de vida de los pacientesafectados es frecuentemente consecuencia de unacolonización broncopulmonar persistente basalacompañada de frecuentes exacerbaciones agudasprovocadas, generalmente, por el sobrecrecimientopor encima de un cierto umbral del propiomicroorganismo colonizante. La erradicación del

microorganismo una vez establecida la colonización-infección crónica es muchas veces inalcanzable ypor tanto los objetivos terapéuticos están destinadosa mantener una carga microbiana basal lo más bajaposible y a reducir rápidamente el inóculo bacterianoen las exacerbaciones. Por ello, desde el punto devista del seguimiento microbiológico de estospacientes adquieren especial relevancia losparámetros cuantitativos (carga bacteriana) ademásde los puramente cualitativos (diagnósticoetiológico). Los aspectos clínicos y microbiológicosde la colonización-infección respiratoria crónica enlos pacientes con fibrosis quística seránespecíficamente abordados en un Procedimientoposterior.2.5.1. Neumonía crónica. La neumonía crónica esun proceso inflamatorio del parénquima pulmonarque persiste durante semanas o meses acompañadode imágenes radiográficas anormales y síntomaspulmonares crónicos o progresivos. La causa puedeser infecciosa o no infecciosa. La neumonía crónicaafecta a personas débiles de edad avanzada y deforma especial a personas con inmunodepresión,SIDA, pacientes hospitalizados y personas conenfermedades debilitantes (alcoholismo, diabetes,EPOC). La neumonía crónica puede deberse apatógenos que típicamente causan neumonía agudapero que puede persistir más allá del cuadro agudo(microorganismos anaerobios, S. aureus, H.influenzae, enterobacterias y P. aeruginosa) y aagentes infecciosos que típicamente causanneumonía crónica entre los que se incluyen bacteriasoportunistas, como Nocardia spp., Rhodococcusequi, Burkholderia pseudomallei, Actinomyces spp.,P. aeruginosa, Enterobacteriaceae, así como otrasbacterias aerobias y anaerobias. Dado que elaislamiento de algunos de estos microorganismospuede ser lento o con dificultad, el laboratorio demicrobiología debe ser alertado acerca de susospecha para facilitar el aislamiento.2.5.1.1. Neumonía por Nocardia spp. Las bacteriasdel género Nocardia, perteneciente a losactinomicetos aerobios, se encuentran ubicuamentedistribuidas en la naturaleza, suelo y materiaorgánica y en el hombre causan una amplia variedadde enfermedades conocidas como nocardiosis, queafectan tanto a individuos inmunocompetentes comoinmunocoprometidos. En la última década, laaplicación de técnicas moleculares, como lasecuenciación del gen 16S ARNr y el análisis derestricción enzimática después de PCR del genhsp65 y del gen 16S ARNr ha revolucionado laidentificación de las especies de Nocardia alproporcionar una identificación rápida y específica deespecies patógenas conocidas y, al mismo tiemporevelar nuevas especies. En la actualidad, hay másde 30 especies de Nocardia con significación clínica,correspondiendo la mayoría de los aisladospatógenos a las especies N. asteroides tipo VI, N.farcinica, N. brasiliensis, N. otitidiscaviarum complex,N. nova complex y N. transvalensis complex. Lamitad de las nuevas especies descritas tienen

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significación clínica a nivel pulmonar (N. abscessus ,N. africana, N. asiatica, N. beijingensis, N.cyriacigeorgica, N. higoensis, N. paucivorans y N.veterana) y una distribución geográfica prevalente endeterminadas localizaciones.

Dada su ubicuidad, Nocardia puede colonizar deforma saprofita la piel y el tracto respiratorio superior,por lo que su aislamiento en esputo no siempreindica infección. Los pacientes con enfermedadespulmonares crónicas subyacentes y, en particular,con obstrucción bronquial o alteración de losmecanismos de depuración broncociliar (neoplasias,tuberculosis, fibrosis quística, asma, bronquitiscrónica, bronquiectasias y aspergilosis), así como lospacientes con inmunosupresión importante, tienenuna mayor predisposición a la colonización porNocardia en el tracto respiratorio, sin que estoimplique necesariamente una infección invasiva, amenos que se instaure un tratamiento esteroideo.

Estudios experimentales han demostrado que losaislados clínicos de N. asteroides son máspatógenos que los aislados ambientales. Estadiferencia se ha atribuido a la mayor presencia deácidos micólicos de cadena larga en la pared celularde las cepas clínicas. El principal determinante depatogenicidad de Nocardia spp. es su resistencia a lafagocitosis por inhibición de la inducción fagosoma-lisosoma y por la inhibición de la acidificación delfagosoma.

La infección pulmonar es la forma clínica másfrecuente de la nocardiosis y se produce porinhalación de las esporas o micelios. Afecta de formapredominante a los pacientes con inmunosupresiónsistémica (linfoma, receptores de transplantesrenales, cardíacos y de hígado), enfermedadpulmonar crónica (EPOC, enfisema, bronquitiscrónica, bronquiectasias), lupus eritematoso y a losindividuos con SIDA. Son factores de riesgoimportantes para el desarrollo de la infección lostratamientos previos prolongados concorticosteroides o citotóxicos. No obstante, laneumonía por Nocardia spp. puede presentarsetambién en pacientes sin enfermedad concurrente nitratamiento inmunosupresor. N. asteroides complex es la especie que se aíslacon más frecuencia (80%) e incluye 6 tiposdiferentes de patrones de sensibilidad a losantibióticos. Las manifestaciones clínicas sonindistinguibles de las que presentan neumonías deotras etiologías. En cambio, los hallazgosradiográficos pueden ser muy variables e incluyeninfiltrados reticulonodulares, nódulos simples omúltiples, consolidación lobar, masas pulmonarescon o sin cavitación y derrame pleural, lo que enocasiones conduce a un diagnóstico erróneo deabsceso pulmonar, tuberculosis, infección fúngica oneoplasia. El curso de la infección, crónico eindolente en los pacientes inmunocompetentes, escon frecuencia progresivo, rápido, diseminado ygrave en los inmunodepremidos. El procesopatológico de la infección por Nocardia secaracteriza por su tendencia a la formación deabscesos pulmonares necrosantes poco localizados

y cavitados, así como por su tendencia a ladiseminación por tejidos adyacentes (pleura,mediastino) o a distancia (piel, cerebro). También escaracterística la formación de granulomas. Lascomplicaciones, que incluyen empiema, pleuritis,mediastinitis, pericarditis y síndrome de la vena cavasuperior, requieren a veces la intervención quirúrgicapara su resolución.

El examen microscópico de las muestras clínicases esencial en el diagnóstico de laboratorio de lanocardiosis. La tinción de Gram es el método mássensible para visualizar y reconocer elmicroorganismo en las muestras respiratorias(esputo, secreciones bronquiales, LBA) que semuestra como cocobacilos grampositivos e hifasramificadas y fragmentadas en formas bacilares finaso cocoides sobre un fondo de leucocitospolimorfonucleares.

El crecimiento lento del microorganismo requiereuna incubación prolongada (al menos dos semanas)de los medios de cultivo para su aislamiento.Nocardia spp. crece en la mayoría de los mediosconvencionales para bacterias aerobias, así como enlos medios de cultivo para micobaterias (Löwenstein-Jensen o Middlebrook), pero se recomienda lainclusión de placas con medio Thayer-Martinmodificado o medio BCYE∝ (para Legionella) paraminimizar el crecimiento de microorganismoscontaminantes. Nocardia spp. resiste ladescontaminación y concentración empleada para elaislamiento de Mycobacterium spp. La tinción deKinyoun modificada (1% de ácido sulfúrico) sobrepreparaciones del microorganismo crecido en cultivopermite demostrar la ácido-alcohol resistencia.

La presencia de hifas aéreas en las colonias y laresistencia a la lisozima permiten diferenciar elgénero Nocardia de otros géneros relacionadosincluidos en los actinomicetos aerobios.Clásicamente, para la identificación en el laboratorioclínico-asistencial de las especies de Nocardia seemplean baterías de pruebas bioquímicas, como lahidrólisis de sustratos (caseína, xantina, hipoxantina,tirosina), la producción de arilsulfatasa y los patronesde sensibilidad antibiótica. Recientemente, algunosautores han evaluado la utilización de las pruebasbioquímicas de sistemas de identificacióncomerciales diseñados para otros microorganismos(galería de identificación API20C AUX (bioMérieux) ybioMérieux ID32 C yeast identification system,MicrosScan Rapid Anaerobe and Haemophilus-Neisseria Identification pannels (Dade Microscan),con la obtención de grados de concordanciavariables en la identificación de especiescomparativamente con los métodos fenotípicosconvencionales.

En la actualidad, como muchas de las nuevasespecies son genéticamente distintas de lasespecies establecidas aunque no existan diferenciasen el fenotipo, no es posible la identificación precisade Nocardia a nivel de especie sin el empleo detécnicas moleculares. Los métodos fenotípicosconvencionales (la hidrólisis, morfología de las

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colonias y los patrones de sensibilidad), sólo puedenidentificar fiablemente un reducido número deespecies patógenas, mientras que las técnicasmoleculares permiten la identificación rápida yprecisa de más del 90% de las especies clínicasreconocidas de Nocardia. Por lo tanto, para loslaboratorios que no pueden tener acceso a losmétodos de secuenciación, es suficiente laidentificación, mediante las pruebas clásicas, a nivelcomplex de algunas especies clínicamentesignificativas (N. asteroides complex, N. novacomplex, N. otitidiscaviarum complex y N.transvalensis complex), dejando la identificación deespecie para laboratorios de referencia.

Las pruebas inmunodiagnósticas carecen desensibilidad y especificidad, debido a las reaccionescruzadas con M. tuberculosis y otros actinomicetos,así como a la gran heterogeneidad antigénica de lascepas de Nocardia, por lo que no son adecuadaspara su empleo en el laboratorio clínico. No obstante,la purificación de un antígeno extracelular específicode género combinado con una prueba de ELISA oinmunoblot, parece tener sensibilidad y especificidadadecuadas para la detección de anticuerpos séricosfrente a este antígeno en los pacientes con infecciónpor Nocardia, sin que se produzca una reaccióncruzada con M. tuberculosis. No obstante, estosmétodos no han sido evaluados suficientemente.2.5.1.2. Neumonía por Rhodococcus equi. Lasespecies del género Rhodococcus se encuentranampliamente distribuidas en el medio ambiente(principalmente estiércol de las caballerizas). Dentrodel género Rhodococcus , R. equi es un patógenoimportante para el ganado y es la especie con mayorsignificación clínica en el hombre. Las infeccionespor R. equi se producen predominantemente enpacientes con inmunosupresión importante(hematológicos, neoplasias, transplantados) entratamiento con quimioterapia o corticosteroides y,en particular, en los pacientes infectados por el VIH.También se han descrito casos en pacientesinmunocompetentes.

La infección pulmonar primaria por R. equi tienecarácter invasivo y corresponde a cuadros deneumonía, absceso pulmonar con tendencia a lacavitación (más del 50% de los casos) y derramepleural (20%). La neumonía es la forma clínica másfrecuente (más del 70%). La adquisición se producepor inhalación del microorganismo. El cuadro clínicoes poco específico, por lo que el diagnóstico de lainfección puede llevar tiempo y necesitar deprocedimientos invasivos como la broncoscopia o labiopsia pulmonar, y tiende a ser crónico y progresivo.En algunos casos se acompaña de bacteriemia, porlo que se aconseja tomar hemocultivos.

El diagnóstico microbiológico de la infecciónpulmonar por R. equi se puede establecer en lamayoría de los casos por el examen microscópicodirecto y el cultivo del esputo o secreciones delpaciente. No obstante, también puede tener ciertasdificultades. R. equi presenta una gran variación deformas (de bacilos grampositivos a formas cocoidesgrampositivas) en la observación microscópica de las

muestras clínicas, lo que puede llevar a su confusióncon corinebacterias. En las muestras de esputo, LBAy sangre predominan las formas bacilares, mientrasque en las muestras de material purulento y tejidosobtenidos por biopsia, predominan las formascocoides. En las tinciones de colonias, elmicroorganismo también presenta variacionesmorfológicas (bacilar, cocoide, filamentos conrudimentos de ramificaciones) dependiendo deltiempo de incubación y de las condiciones decrecimiento. El aspecto de las colonias de R. equi,que no producen hifas aéreas, en mediosconvencionales con 5% de sangre e incubaciónaerobia también es variable. Pueden presentar tresmorfologías principales: colonias mucosas de colorrosa pálido, colonias no mucosas de color coral y, lamenos frecuente, colonias no mucosas de coloramarillo pálido. Para evitar el sobrecrecimiento demicroorganismos contaminantes durante la largaincubación, se recomienda incluir medios de cultivocon antibióticos (colistina, ácido nalidixico).

En la identificación bioquímica, R. equi semuestra bastante inerte, ya que no fermenta ni oxidalos carbohidratos. Una alternativa válida para laidentificación (70% de rentabilidad) es la utilizacióndel sistema API-CORYNE (bioMérieux). Además, R.equi posee una característica que puede ser deayuda para la identificación: la producción del “factorequi”. Consiste en áreas de hemólisis completa enplaca de agar sangre de carnero cuando interactúacon la hemolisina de L. monocytogenes , Listeriaseeligeri V o S. aureus.

En las tinciones de Kinyoun modificada y Ziehl-Neelsen, R. equi muestra una débil ácido-alcoholresistencia, por lo que debe diferenciarse deMycobacterium spp. mediante la demostración de laausencia de actividad arilsulfatasa en R. equi.

Las pruebas serológicas tienen un limitado éxito yno se utilizan rutinariamente para el diagnóstico.2.5.1.3. Neumonía por Burkholderia pseudomallei. B.pseudomallei es una de las tres especies del géneroBurkholderia patógenas para el hombre. Es un bacilogramnegativo pequeño, intracelular, oxidasa positivoy móvil, presente en el suelo y en aguas superficialesde las regiones donde es endémico. Las regionesendémicas se localizan en el sureste asiático(Tailandia, Malasia, China, Taiwan y Vietnam), Indiay norte de Australia. Infecta a animales y humanosprincipalmente mediante inoculación por víapercutánea, aunque también por inhalación oingestión.

B. pseudomallei es el agente causal de ladenominada melioidosis, enfermedad de grandiversidad clínica que abarca un espectro de cuadrosclínicos que va desde la infección asintomática (lamayoría de los casos) hasta el shock sépticofulminante e incluye formas clínicas tan diversascomo úlceras cutáneas, abscesos con tendencia a lacavitación, de localización pulmonar o en otrosórganos. La melioidosis puede permanecer comoinfección latente durante décadas desde la infeccióninicial y después reactivarse a enfermedad

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sintomática. La neumonía, que es la presentaciónclínica más frecuente (50% de los casos), puedepresentar un cuadro agudo fulminante o un cuadrocrónico (más de dos años) de fiebre, tos productiva,hemoptisis, pérdida de peso, consolidación pulmonardiscreta pero progresiva, infiltrados con o sincavitación y escasa mortalidad, que se parece a latuberculosis incluso en la tendencia a la reactivación.El interés por la neumonía crónica por B.pseudomallei en nuestro medio radica en laposibilidad de adquisición de la enfermedad en losviajes a zonas endémicas de melioidosis. Losfactores de riesgo más importantes para adquirir lamelioidosis son la diabetes, alcoholismo yenfermedad renal crónica. Otros factores incluyenenfermedad pulmonar crónica, fibrosis quística,neoplasias, tratamiento con corticosteroides ytuberculosis.

El diagnóstico microbiológico se basa en elaislamiento de B. pseudomallei que no presentaproblemas, dado que crece en los medios habitualescon agar sangre. En los países no endémicos puedeser identificado erróneamente como Pseudomonasspp. La identificación puede llevarse a cabo por latinción de Gram, reacción de la oxidasa, los sistemasde identificación API 20NE ó 20E y el patrón deresistencia a los antibióticos. En las áreas endémicasse utilizan técnicas de detección antigénica o deADN y PCR en muestras del paciente que no estándisponibles en nuestro medio. Por el contrario, síestán disponibles las técnicas serológicas(hemaglutinación indirecta, ELISA), que son de granutilidad para descartar la posibilidad de melioidosisen pacientes febriles que regresan de un viaje apaíses donde la enfermedad es endémica.2.5.1.4. Neumonía por Propionibacteriumpropionicum. P. propionicum es un bacilogrampositivo anaerobio o microaerófilo muypleomórfico y con ramificaciones, que forma parte dela microbiota endógena de la boca.Morfológicamente es indistinguible de Actinomycesisraelii. El microorganismo alcanza el pulmón pormedio de la aspiración de secreciones orofaríngeas yproduce un proceso infeccioso de curso indolenteque afecta al parénquima pulmonar y al espaciopleural. P. propionicum se ha asociado con casos deactinomicosis con formación de abscesospulmonares con o sin empiema torácico.2.5.2. Enfermedad pulmonar obstructiva crónica(EPOC). La EPOC es sin duda una de lasenfermedades más prevalentes en los paísesdesarrollados, mostrando además una claratendencia ascendente que la situará como la terceracausa de muerte en el mundo en 2020. En España laprevalencia de esta enfermedad se sitúa en torno al9% en adultos con edades comprendidas entre los40 y los 70 años. Esta patología se define por lapresencia de una limitación del flujo aéreoirreversible que es frecuentemente progresiva y estáasociada con una respuesta inflamatoria anormal delos pulmones a partículas y gases nocivos.

Los pacientes con EPOC frecuentementepresentan colonización bacteriana en las vías

respiratorias bajas, hecho que se asocia con unaelevación significativa de los marcadoresinflamatorios. El curso de esta enfermedad secaracteriza por presentar exacerbaciones agudasintermitentes de los síntomas, responsables de granparte de la morbilidad y mortalidad asociada a estapatología. Aproximadamente la mitad de estasexacerbaciones se producen por infecciónbacteriana, siendo H. influenzae el principalpatógeno implicado, seguido de lejos por M.catarrhalis y S. pneumoniae. No obstante, en losúltimos años la infección por P. aeruginosa empiezaa ocupar un papel relevante como marcador degravedad, asociándose con una intensa inflamaciónde las vías respiratorias. Aproximadamente el 4% delas exacerbaciones son producidas por estemicroorganismo, llegando hasta el 8-13% enpacientes con EPOC avanzada. Todavíadisponemos de pocos datos acerca de laidiosincrasia de la infección por P. aeruginosa enpacientes con EPOC, aunque en una importanteproporción de los casos parece ajustarse al modelode colonización-infección crónica con exacerbaciónaguda extensamente estudiado en los pacientes confibrosis quística.

La infección por H. influenzae es, sin duda, lamás estudiada en el paciente con EPOC. Variostrabajos han demostrado el papel de estemicroorganismo como una de las principales causasde inflamación de la vía aérea en estos pacientes.Cabe destacar en este sentido el papel de laproteína de membrana externa P6. Esta lipoproteínaconservada presenta propiedades inmunorreactivaspor medio de la activación de los receptores tipo Toll(TLR). Estudios in vitro demuestran el papel de P6en la estimulación de los macrófagos para laproducción de marcadores inflamatorios,especialmente IL-8 y TNF-α.

Varios estudios también han demostrado lacolonización persistente por H. influenzae enpacientes con EPOC, encontrando que las cepasaisladas de episodios de exacerbación secuencialesson idénticas y que en los períodos asintomáticos,aun en casos de cultivos negativos, es posibledetectar por técnicas moleculares ADN cromosómicode la misma cepa colonizadora. No obstante, éste esun punto todavía controvertido, ya que otrasinvestigaciones apuntan a que las cepas queproducen exacerbaciones agudas presentanpropiedades distintas a las cepas colonizadoras, conuna mayor capacidad para inducir inflamación.2.5.3. Bronquiectasias . Las bronquiectasias sedefinen como una dilatación anormal e irreversiblede uno o más bronquios. La causa desencadenantees frecuentemente desconocida aunque muchasveces se puede atribuir a infecciones respiratoriasgraves en la infancia, a la inhalación de sustanciastóxicas, deficiencia humoral de anticuerpos,disfunción mucociliar, fibrosis quística o enfermedadbroncopulmonar alérgica. Al contrario que en laEPOC, esta patología respiratoria crónica no estágeneralmente ligada al consumo de tabaco y ocurre

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más frecuentemente en mujeres. Como ocurre en lospacientes con fibrosis quística, las alteracionesanatómicas y fisiológicas de las vías respiratoriaspredisponen a los pacientes con bronquiectasias a lacolonización-infección crónica por diversosmicroorganismos, y es ésta una de las principalescausas de morbilidad y mortalidad de estospacientes.

La producción crónica de secrecionesrespiratorias purulentas, fiebre recurrente yhemoptisis son manifestaciones típicas de lacolonización-infección crónica en los pacientes conbronquiectasias. P. aeruginosa es uno de losmicroorganismos más frecuentemente implicados,asociándose además con una mayor gravedad y undeterioro más rápido de la función pulmonar. H.influenzae y S. pneumoniae se aíslan también conrelativa frecuencia de las secreciones respiratoriasde los pacientes con bronquiectasias, mientras quela colonización-infección por S. aureus es rara salvoen las bronquiectasias ligadas a la fibrosis quística.

Si bien la colonización-infección crónica por P.aeruginosa está estrechamente ligada a lasbronquiectasias, y parece clara su implicación en lamorbilidad y el deterioro pulmonar, existe todavíauna cierta controversia sobre si la infección crónicapor este microorganismo es causa o consecuenciade esta patología. Los resultados de modelosanimales sugieren de hecho que la infección crónicapor P. aeruginosa puede inducir el desarrollo debronquiectasias como consecuencia deldesencadenamiento de reaccionesinmunopatológicas y algunos estudios clínicossustentan esta teoría, encontrando que la infecciónpor P. aeruginosa tiene un papel central en eldesarrollo de las bronquiectasias.

Los estudios de seguimiento microbiológico de lainfección respiratoria crónica por P. aeruginosa enlos pacientes con bronquiectasias muestran unpatrón muy similar al documentado en los pacientescon fibrosis quística. Este patrón se caracterizageneralmente por la persistencia durante años deuna única línea clonal de P. aeruginosa que sufreuna importante diversificación fenotípica, comoconsecuencia de un complejo proceso adaptativo alnuevo nicho ecológico, siendo muy frecuentes losmorfotipos mucoides (hiperproducción de alginato) ylas variantes de lento crecimiento (small colonyvariants, SCV).

Una característica común a todas las infeccionesrespiratorias crónicas por P. aeruginosa, al contrariode lo que ocurre en las infecciones agudas, es la altaprevalencia de cepas hipermutadoras. Estas cepaspresentan una frecuencia de mutación espontánea(para cualquier gen incluyendo todos aquellosimplicados en la resistencia a antibióticos u otrasmutaciones adaptativas, como las que producen losfenotipos mucoides o SCV) hasta 1000 veces másde lo normal. Las cepas hipermutadoras fueronoriginalmente descritas en el contexto de la fibrosisquística, detectándose en el 30-60% de los pacientessegún varios estudios, mientras que sonextremadamente infrecuentes (<1%) en pacientes

con infecciones agudas. La base molecular delfenotipo hipermutador es en la mayoría de los casosla deficiencia de alguno de los genes que formanparte del sistema de reparación de emparejamientoserróneos de ADN; mutS, mutL, o uvrD (mutU). Unestudio reciente demuestra también una altaprevalencia (57%) de cepas hipermutadoras enpacientes con EPOC o bronquiectasias e infeccióncrónica por P. aeruginosa. Asimismo, se documentauna firme asociación entre la presencia de estascepas y la resistencia a múltiples antibióticos. El 42%de las cepas hipermutadoras (que representaron el53% del total de los aislamientos) fueron resistente amúltiples antibióticos, contrastando enormementecon el 0% de de las cepas no hipermutadoras. Enotras palabras, todas las cepas resistentes amúltiples antibióticos (23% del total) fueronhipermutadoras.

Debido a sus características similares, para eldiagnóstico y seguimiento microbiológico de lacolonización-infección respiratoria crónica por P.aeruginosa en pacientes con EPOC obronquiectasias, deberían seguirse lasrecomendaciones establecidas para los pacientescon fibrosis quística, abordadas en un Procedimientoespecífico.

2.6. ABSCESO PULMONAREl absceso pulmonar se produce como

consecuencia de la necrosis del parénquimapulmonar causada por una infección microbiana. Lanecrosis pulmonar, a su vez, evoluciona a una o máscavidades que con frecuencia se comunican con elbronquio, produciendo imágenes características connivel hidroaéreo, así como tos y expectoraciónpurulenta. Cuando el proceso cursa con múltiplescavidades de pequeño tamaño en áreas contiguasdel pulmón se denomina neumonía necrosante.

La mayoría de los abscesos pulmonares seproducen como complicación de una neumonía poraspiración y son infecciones polimicrobianascausadas por bacterias anaerobias de la boca. Sonfactores predisponentes para la producción delabsceso pulmonar los estados de alteración de laconsciencia, disfagia neurológica, sondasnasogástricas e intubación endotraqueal yenfermedad periodontal.

Los microorganismos más frecuentes (90%) sonlas bacterias anaerobias de la orofaringePeptostreptococcus spp., Fusobacterium spp.,Bacteroides spp. y Prevotella spp.), acompañadaspor estreptococos del grupo viridans microaerófilos.Cuando la infección es mixta, generalmente incluyebacterias aerobias patógenas, como S. aureus, K.pneumoniae, bacilos gramnegativos entéricos oStreptococcus pyogenes. En ocasiones, la infecciónes monomicrobiana por bacterias tales como, S.aureus, Klebsiella spp., P. aeruginosa, B.pseudomallei, Legionella spp., Actinomyces spp. y S.pneumoniae. En los pacientes con alteración de lainmunidad celular, patógenos oportunistas comoNocardia spp., Aspergillus spp. y R. equi son causaimportante de lesiones pulmonares cavitadas.

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El diagnóstico microbiológico recae en el examendel esputo, de olor pútrido patognomónico, que en latinción de Gram muestra abundantes neutrófilos ymicrobiota mixta con múltiples morfotipos. En elcultivo del esputo se obtiene la microbiota habitualen dicha muestra, por lo que es necesario el empleode métodos invasivos para la obtención de muestrasdel tracto respiratorio inferior (aspiracióntranstorácica, LBA, CTP y líquido del empiemaobtenido por toracocentesis).

2.7. DERRAME PLEURAL Y EMPIEMAEl empiema es una entidad que se acompaña de

una morbimortalidad importante. La primera causade infección del espacio pleural es una neumoníaprevia (40-60% de los empiemas), seguida por latoracostomía (20%) y los traumatismos (4-10%).

Los microorganismos causantes del empiema sonbacterias anerobias (35%), aerobias (24%) y, confrecuencia, ambas de modo simultáneo (41%). Lasbacterias anaerobias (Bacteroides fragilis, Prevotellaspp., Fusobacterium spp. y Peptotresptococcus spp.)se encuentran frecuentemente en el empiema, yacomo organismos únicos o en combinación conbacterias aerobias. En los pacientes con NAC elempiema suele deberse a S. pneumoniae, S.pyogenes y H. influenzae, mientras que L.pneumophila y M. pneumoniae sólo causanpequeños derrames pleurales que, en general, noprogresan a empiema. En los últimos años, se haconstatado un aumento en la incidencia de derramepleural paraneumónico en los niños con NAC, siendoS. pneumoniae (generalmente sensible a lapenicilina) el microorganismo más frecuentementeaislado.

En los pacientes hospitalizados, los agentes quese encuentran con más frecuencia en el empiemason S. aureus y las bacterias anaerobias, sobre todoen los pacientes con aspiración de secreciones. Enaquellos con empiema después de un traumatismo ocirugía, la infección se debe con frecuencia a S.aureus y bacilos gramnegativos aerobios. Elempiema por Candida spp. se produce comocomplicación de la cirugía, en los enfermos conrotura esofágica y en la infección subdiafragmática.Muchas de estas infecciones son polimicrobianas.Los pacientes inmunocomprometidos y los pacientescon SIDA tienen empiemas causados por bacilosgramnegativos, hongos y Nocardia spp.

En caso de practicarse la toracocentesis esobligada la realización de una tinción de Gram y elcultivo del líquido obtenido para bacterias aerobias yanaerobias. Sin embargo, en sólo el 60% de lospacientes con empiema es positiva la tinción deGram. Los estudios de microorganismos especialesdeben requerirse de forma explícita.

3.TIPOS DE MUESTRAS Y RECOGIDA DEMUESTRAS

Existe una gran variedad de tipos de muestrasprocedentes de diferentes zonas del tractorespiratorio inferior que se pueden someter a estudiomicrobiológico. Estas muestras se obtienen por

procedimientos no invasivos o invasivos. Otros tiposdemuestras que se emplean para el diagnóstico delas infecciones del tracto respiratorio inferior incluyenexudados faríngeos y nasofaríngeos para ladetección de patógenos respiratorios específicos,orina para la detección de antígenos de algunosagentes infecciosos, sangre para cultivo y, endeterminadas situaciones, suero para ladeterminación de anticuerpos específicos.

3.1. MUESTRAS OBTENIDAS PORPROCEDIMIENTOS NO INVASIVOS3.1.1. Frotis del tracto respiratorio superior. Encaso de infección bronquial, bronquiolar o alveolar sepueden recoger torundas faríngeas para la detecciónde M. pneumoniae o C. pneumoniae. Para ladetección de B. pertussis en pacientes pediátricos,se deben recoger torundas nasofaríngeas oaspirados nasofaríngeos.

Se dispone de medios de transporte específicospara micoplasma y clamidia, como por ejemplo elmedio M4. Para B. pertussis el medio de transporterecomendado es una solución al 1% de hidrolizadode caseína (ácidos Casaminoo, Difco) o medio deAmies o Stuart con charcoal. Para las pruebasmoleculares deben utilizarse medios de transporteespecíficos para mantener intactos los ácidosnucleicos.3.1.2. Esputo. Esputo inducido. El esputo, ademásde microorganismos, contiene una mezcla decomponentes entre los que se encuentran células delepitelio respiratorio del huésped, proteínas y otrosmateriales de secreción producidos en los pulmonescomo resultado de la respuesta inflamatoria. Paradisminuir la contaminación superficial de la muestracon la microbiota que coloniza el tracto respiratoriosuperior y la cavidad oral, se han recomendadoalgunas medidas a tomar, como la extracción de ladentadura postiza, si se utiliza, y el enjuague de laboca con agua o solución salina estériles, antes de larecogida de la muestra.

El esputo obtenido por expectoración espontáneadebe ser el resultado de un golpe de tos profunda ycontener secreciones purulentas representativas deltracto respiratorio inferior. Deben desecharse losesputos compuestos por saliva o secrecionespostnasales.

El esputo inducido, obtenido por la inhalación deNaCl al 3% mediante un nebulizador ultrasónico,tiene su principal indicación para la detección dePneumocystis jiroveci y M. tuberculosis. Para el restode los microorganismos su utilidad es dudosa.3.1.3. Broncoaspirado / aspirado traqueal /secreciones respiratorias. La aspiración traqueal oendotraqueal es el método más sencillo de obtenersecreciones respiratorias en los pacientes intubadosy con ventilación mecánica para la detección de losagentes causales de la infección del tractorespiratorio inferior. La recogida de la muestra serealiza por aspiración a través del tubo endotraqueal.En ocasiones puede ser necesario diluir con suerosalino las secreciones viscosas y facilitar de estemodo la recogida.

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Con frecuencia, las secreciones así obtenidasson erróneamente denominadas “BAS” cuando enrealidad se corresponden con el aspirado traqueal.Por lo que es conveniente no confundir esta muestracon el BAS (broncoaspirado selectivo), secrecionesbronquiales obtenidas mediante fibrobroncosopia omediante técnicas ciegas no broncoscópicas poraspiración tras enclavamiento de un catéter,telescopado o no, en un bronquio distal.

El aspirado traqueal puede considerarse como unesputo a los efectos de tinción y cultivo y deberánaplicársele los mismos requerimientos para eltransporte y el procesamiento.

No deben cultivarse las secreciones de latraqueostomía, ya que la traqueostomía en las 24primeras horas de su inserción se coloniza conmúltiples bacterias que no corresponden a lascausantes de la infección pulmonar.3.1.4. Hemocultivos. Se recomienda la realizaciónde hemocultivos en las neumonías graves del tractorespiratorio inferior que requieren hospitalización. Larecogida de la muestra debe realizarse de acuerdocon el Procedimiento de Microbiología Clínica de laSEIMC, Hemocultivos 3a.3.1.5. Orina. Las pruebas de antigenuria detectan laexcreción renal de antígenos microbianos. En laactualidad, están disponibles comercialmente laspruebas para detección de antígenos de S.pneumoniae y L. pneumophila. La muestra de orinadebe ser recogida según el Procedimiento deMicrobiología Clínica de la SEIMC, Recogida,transporte y procesamiento general de las muestrasen el laboratorio de microbiología 1a.3.1.6. Suero. Debe recogerse para confirmar undiagnóstico específico o cuando el patógeno seadifícil de detectar por métodos directos. Si es posible,deberá recogerse una muestra de suero en la faseaguda de la enfermedad para determinar anticuerposIgM, IgA y otra en la fase de convalecencia (21 a 30días después) para determinar la seroconversión delos anticuerpos IgG. Las pruebas serológicas sonparticularmente útiles para los agentes causantes dela neumonía atípica, M. pneumoniae, C. pneumoniaey Legionella spp. Además, la serología puede ser útilen combinación con otros métodos en el diagnósticode la infección por microorganismos que puedencausar bioterrorismo, como Francisella tularensis yYersinia pestis.

3.2 MUESTRAS OBTENIDAS PORPROCEDIMIENTOS INVASIVOS3.2.1. Mediante fibrobroncoscopia. Lafibrobroncoscopia tiene por objeto la obtención demuestras representativas del tracto respiratorioinferior correspondientes a la vía aérea o alsegmento pulmonar radiológicamente afectos, sincontaminación con microbiota de la orofaringe o, almenos, con la menor contaminación posible. Lasmuestras más empleadas son el broncoaspiradoselectivo (BAS), el cepillado bronquial mediantecatéter telescopado protegido (CTP) y el LBA, perotambién se emplean el lavado bronquial y la biopsiatransbronquial. La indicación de la fibrobroncoscopia

es el diagnóstico de la neumonía nososcomial y demodo particular de la NAV, así como de la neumoníadel paciente inmunocomprometido.

El desarrollo de las técnicas broncoscópicas parael diagnóstico de la afectación pulmonar nace de lanecesidad de obtener muestras más representativasdel foco infeccioso y, de este modo, poder distinguirsi se trata de una neumonía o de un proceso noinfeccioso, obtener el agente etiológico en el caso deinfección pulmonar, conocer el motivo del fracasoterapéutico, etc. La utilización de lafibrobroncoscopia alcanza mayor sentido cuandoestos datos no se pueden conseguir con lasmuestras no broncoscópicas, más fáciles de obtenery más baratas.

En 1979, Wimberly introdujo la primera técnicabroncoscópica, el cepillado bronquial protegido, quepermitió obtener muestras del foco de la infección sincontaminación orofaríngea. Posteriormente, seintrodujo el empleo del LBA.

El mayor empleo de técnicas fibrobroncoscópicas,sobre todo del LBA, se explica, en primer lugar, porel incremento de la población de enfermosinmunodeprimidos, en especial los trasplantados deórganos y los pacientes con SIDA, que presentabaninfecciones pulmonares causadas por gran variedadde microorganismos oportunistas. Y también, por ladificultad para obtener diagnósticos etiológicos en lasneumonías bacterianas, sobre todo en los pacientesde las unidades de cuidados intensivos y, enespecial, en el enfermo sometido a ventilaciónmecánica, en el que se produce una alta incidenciade neumonía nosocomial y en el que lacomunicación directa con el árbol traqueobronquialpermitía utilizar el broncoscopio más fácilmente.

Sin embargo, la aplicación de los procedimientosinvasivos para la obtención de muestras del tractorespiratorio inferior obtuvo su mayor rentabilidadcuando el procesamiento microbiológico se mejorócon la realización de cultivos cuantitativos mediantediluciones de las secreciones obtenidas. Laconcentración de organismos necesaria para que seproduzca una neumonía depende de la virulencia delmicroorganismo y de las defensas del huésped. Sinembargo, se ha establecido que en la neumoníaclínicamente manifiesta se produce unaconcentración de bacterias de al menos 104 ufc/g detejido o 105 ufc/ml de exudado respiratorio.

El cultivo cuantitativo tiene como objetivodiferenciar las bacterias colonizadoras de laorofaringe que contaminan la muestra y que estánpresentes en pequeña cantidad (concentracionesinferiores a 104 ufc/ml), de las bacteriaspotencialmente patógenas, presentes en altasconcentraciones (entre 105 y 106 ó más ufc/ml).

El empleo de la broncoscopia como método paraobtener muestras respiratorias adecuadas junto conel cultivo cuantitativo bacteriano, ha permitido unaserie de mejoras en el manejo de las infeccionespulmonares, ya que permite la iniciación deltratamiento antimicrobiano y el diagnósticoetiológico, ya sea bacteriano, vírico, fúngico. Elaislamiento de la bacteria permite realizar las

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pruebas de sensibilidad, imprescindibles paraescoger el antibiótico óptimo, que en un porcentajeimportante de casos será distinto al inicial. Además,en base a los datos obtenidos se puede reducir eluso excesivo de antibióticos, con los beneficios queesto comporta. Por otra parte un resultado negativo,descarta la infección pulmonar e induce a labúsqueda de otros focos o etiologías posibles. Todosestos estudios, que son de organización y realizacióncompleja, requieren una relación estrecha entremicrobiólogos, infectólogos, facultativos de equiposde trasplante, intensivistas, etc.

El tipo de muestra más adecuado (cepilladobronquial, LBA, etc.) para el diagnóstico, varía segúnla sospecha diagnóstica, la etiología, nivel pulmonarde la lesión, etc. Así, si la patología se encuentra enlos espacios aéreos distales es necesario obteneruna muestra del fluido alveolar, mediante el lavadobroncoalveolar o la biopsia transbronquial, mientrasque el cepillado bronquial está más indicado cuandola patología se localiza en un segmento bronquial. Sise van a obtener varias muestras, el orden derecogida indicado es obtener en primer lugar ellavado bronquial y el LBA antes que el cepilladobronquial o la biopsia transbronquial, con el fin deevitar el exceso de sangre en los líquidos de lavado,que puede alterar la concentración de loscomponentes celulares.

Además, la indicación de la fibrobroncoscopiaestá en relación con el tipo de enfermo. Así ocurreen los pacientes inmunodeprimidos, en los que no esinfrecuente la infección mixta y en las situacionesclínicas en las que los enfermos no responden altratamiento empírico o en el caso de sospecha deotro diagnóstico.

En cuanto a la etiología de la neumonía, elempleo combinado de las muestras obtenidas porfibrobroncoscopia y el procesamiento de la muestrapor recuento cuantitativo permite no sólo diferenciarlos microorganismos que no forman parte de lamicrobiota normal y cuyo aislamiento o deteccióntiene valor diagnóstico sino, además, disminuir elriesgo de valorar microorganismos sin interésetiológico, que pueden formar parte de la microbiotaorofaríngea.3.2.1.1 Lavado bronquial. Consiste en la instilaciónde suero fisiológico estéril en un bronquio principal,seguida de una aspiración inmediata para recoger lamuestra. La muestra recogida no representa materialbronquiolar ni alveolar y es equivalente a un aspiradoendotraqueal. Su uso es escaso ya que proporcionainformación confusa al aislarse con frecuenciamicrobiota orofaríngea, sobre todo en enfermos nointubados, por lo que no se considera apropiado parael cultivo bacteriano, excepto en casos en los que sesospechen infecciones por M. tuberculosis,Legionella u hongos. En enfermos intubados nopresenta ninguna ventaja sobre el aspirado traqueal.3.2.1.2 Cepillado bronquial. Su única indicación es eldiagnostico de la neumonía bacteriana y su finobtener muestras del foco de infección evitando lacontaminación orofaríngea. Para ello se emplea undoble catéter telescópico (catéter telescopado

protegido). El catéter interno contiene un cepillo connumerosas cerdas flexibles y el externo está ocluidoen su porción distal por un tapón de materialreabsorbible. Al llegar con el fibroscopio hasta elbronquio que conduce al foco infeccioso se empujael cepillo para desalojar el tapón y obtener lamuestra, girándolo suavemente para conseguir quese adhieran las secreciones de los bronquíolosdistales. Es un procedimiento rápido y las únicascomplicaciones son las propias de lafibrobroncoscopia. Extraído el fibroscopio, se corta elcepillo en condiciones estériles y se introduce en untubo que contiene 1 ml de suero fisiológico estéril.Combinando este sistema de obtención de lamuestra con el cultivo cuantitativo de la misma seconsigue aumentar la sensibilidad y especificidad.

Después de su descripción alcanzó gran difusióndebido a que se obtenía una elevada eficaciadiagnóstica pues, a pesar de las diferencias en losdiseños de los estudios, las muestras obtenidaspermiten diferenciar la infección de la colonización eidentificar la etiología en unos porcentajes cercanosal 90%.

El umbral diagnóstico propuesto para losrecuentos bacterianos se basa en el concepto deque la concentración de bacterias contaminantes enlas secreciones de las vías inferiores es inferior a 104

ufc/ml. Como el cepillo recoge entre 0,01 y 0,001 mlde secreciones, el aislamiento de más de 103 ufc/mlen la muestra depositada en 1 ml de suero fisiológicorepresenta entre 105 y 106 ufc/ml en la muestraoriginal. Este punto de corte de 103 ufc/ml,establecido por comparación con los resultados decultivos cuantitativos de biopsias de pulmón, indicauna alta probabilidad de que exista una neumonía.Para el diagnóstico microbiológico de la NAV elprocedimiento tiene una sensibilidad del 33-100%,media del 66% y una especificidad del 50-100%,media del 90%.

Para mejorar la eficacia se ha propuesto controlarla calidad de la muestra mediante la tinción de Gramde una extensión realizada en una citocentrífuga yconsiderar las muestras que tienen menos de 10células inflamatorias por campo de 1.000 aumentoscomo muestras de mala calidad.3.2.1.3 Lavado broncoalveolar. Para obtener lamuestra se enclava el broncoscopio en el bronquiodel segmento pulmonar radiográficamente afecto yse instilan volúmenes variables de suero fisiológicoestéril en cantidades que oscilan entre 20 y 100 ml.Después de cada instilación se hace una aspiraciónpara recuperar el máximo volumen de líquidoposible, formado por una mezcla del suero fisiológicoy secreción broncoalveolar. El procedimiento no estáestandarizado, en el sentido de que no estáestablecida la cantidad de suero fisiológico a instilarni el número de alícuotas necesario. El volumen demuestra obtenido depende del volumen instilado ypuede variar entre 10 y 100 ml. Se considera quepara tener una buena eficacia diagnóstica el volumende líquido recuperado bebe ser superior al 30% delintroducido e idealmente no inferior a 60 ml. Seconsidera que el suero instilado lava y obtiene

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material de alrededor de un millón de alvéolos (el 1%de la superficie pulmonar). La primera porción delíquido aspirado debe descartarse para el estudiomicrobiológico ya que suele contener un exceso decélulas escamosas y ciliadas. El último líquidoaspirado es el que mejor representa el contenidoalveolar.

El LBA es una muestra representativa del fluidoalveolar, por lo que está indicada en infecciones queafectan a enfermos inmunodeprimidos sobre todopor microorganismos oportunistas como P. jiroveci,CMV, etc, que producen una afectación bronquialmínima. Por estos motivos es la muestra másimportante en estos enfermos para el diagnostico dela infección pulmonar. Además, el LBA por suvolumen permite un estudio microbiológico completopara bacterias, virus, hongos y parásitos, mediantetécnicas que permiten obtener resultados pocashoras después de obtenerla. Su rendimiento suelevariar en relación con el tipo de enfermo, el tipo deafectación pulmonar, la etiología, y el procedimientoempleado, ya que hay variaciones en el volumen desuero fisiológico instilado y recuperado, etc., y debeser calculado para cada institución en función de lapoblación que atiende y las etiologías dominantes yde la metodología broncoscópica y microbiológicaque emplee. Por otra parte, el volumen suficiente dela muestra permite realizar un gran número deextensiones para estudios microscópicos. El métodopreferido es centrifugando con una citocentrífuga abaja velocidad lo que permite obtener una capamonocelular de 6 milímetros de diámetro, con lascélulas habitualmente bien conservadas. Estasextensiones permiten el estudio citológico que puedeorientar la etiología de la afectación pulmonar, sea ono infecciosa. En las infecciones por P. jiroveci y enlas infecciones víricas suelen observarse recuentoscelulares inferiores al 25% de células inflamatorias.Por el contrario en las infecciones bacterianas esteporcentaje es superior, aunque se trate de enfermosinmunodeprimidos.

El empleo del LBA para el diagnóstico de lasneumonías bacterianas, sobre todo en enfermossometidos a ventilación mecánica, fue posterior aldel cepillado bronquial. Para el diagnóstico se hacencultivos cuantitativos mediante diluciones seriadas,siendo significativos crecimientos superiores a 104

ufc/ml, ya que se considera que éste número decolonias obtenidas del mililitro de secrecionesalveolares diluido en los 10 a 100 mililitros de suerofisiológico recogido representa entre 105 y 106 ufc/mlen la muestra original. Sin embargo este criterio esdiscutible pues no se conoce el grado de dilución delmaterial alveolar en el suero instilado. No obstante,para el diagnóstico de la NAV se considera comopunto de corte recuentos bacterianos en el LBAiguales o superiores a 104 ufc/ml con unasensibilidad del 42-93%, media de 73% y unaespecificidad del 45-100%, media del 82%. Losresultados varían según la población estudiada, eluso previo de antibióticos, el estadío inicial de laenfermedad, etc

Debe realizarse un control de calidad de laidoneidad de la muestra, que consiste en que alhacer el recuento diferencial celular mediante latinción de Giemsa o de Gram de las extensioneshechas tras citocentrifugación no deben observarsecélulas escamosas en proporción igual o superior al1% de las células contadas, que deberían ser 300. Sise sobrepasa este punto de corte se considera queha habido contaminación por microorganismos de lasvías altas y debe cuestionarse el resultado delcultivo. Para mejorar la eficacia se puede utilizar uncatéter protegido que pasa a través del canal internodel fibrobroncoscopio y así evitar la contaminaciónorofaríngea.

El diagnóstico se ve favorecido por la observaciónde bacterias intracelulares en la tinción de Gram deuna extensión hecha tras citocentrifugación,considerándose diagnóstica si se observanmicroorganismos en el 5% o más de las células(sensibilidad cercana al 70% y especificidad superioral 90%).3.2.1.4. Biopsia transbronquial. Se utiliza elbroncoscopio para obtener una pequeña muestra detejido peribronquial o alveolar. Es una técnica útil quepuede evitar la biopsia pulmonar quirúrgica en casosseleccionados de lesiones localizadas o cuando sesospecha alguna etiología no infecciosasobreañadida (sarcoidosis, neoplasia) y no se hanobtenido resultados con las pruebas broncoscópicasmás comunes. En las etiologías infecciosas su papeles muy limitado. En enfermos con SIDA se handescrito casos de única muestra diagnóstica para P.jiroveci o M. tuberculosis. El riesgo de ésta técnicaen enfermos con ventilación mecánica es alto.3.2.1.5. Aspiración transbronquial con aguja. No sesuele usar en afectaciones infecciosas pero se handescrito buenos resultados en infiltrados pulmonareslocalizados de fácil acceso.3.2.2. Mediante otras técnicas nofibrobroncoscópicas3.2.2.1.Técnicas ciegas. Las técnicas ciegas sonmenos invasivas, más económicas y de menorriesgo que las broncoscópicas, y no precisan depersonal especializado. Además, pueden emplearseen los pacientes intubados con tubos de pequeñocalibre. Están indicadas en los casos en los que noes posible realizar la broncoscopia (técnica nodisponible o contraindicación). Su principal limitaciónestriba en la imposibilidad de seleccionar elsegmento pulmonar afecto radiológicamente, lo cuales importante cuando los infiltrados se localizan enlos lóbulos superiores o en el pulmón izquierdo.Pero, en general estas técnicas ciegas proporcionanresultados similares a las técnicas broncoscópicascon un elevado nivel de concordancia (73-100%).Existen tres métodos ciegos:

A) Aspirado bronquial ciego: consiste en enclavarel catéter en un bronquio distal y aspirar 1-2 mlde secreciones bronquiales sin instilar suero.Su sensibilidad varía del 74-97% (media 85%)y su especificidad entre 74-100% (media 91%)

B) Minilavado broncoalveolar: Consiste en instilara través de un catéter (telescopado protegido

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o no) una cantidad no estandarizada (20-150ml). La sensibilidad de la técnica para eldiagnóstico de la NAV oscila entre el 63% y el100% (media 79%). La especificidad varíaentre el 66% y el 96% (media 82%).

C) Catéter telescopado no broncoscópico:presenta un balón en su extremo distal paraevitar la contaminación. Sensibilidad entre 58-86% (media 72%) y especificidad 71-100%(media 86%).

3.2.2.2. Aspiración transtraqueal. Procedimientoempleado, sobre todo, en el enfermo no ventiladocon neumonía nosocomial en el que es complicadohacer una broncoscopia y el acceso al foco por lapunción transtraqueal resulta más fácil. Técnica conbuena sensibilidad, su especificidad está afectadapor la colonización traqueal del paciente,especialmente en aquellos con patología bronquialcrónica. Es útil en la infección pulmonar poranaerobios.3.2.2.3. Biopsia por punción transtorácica. La biopsiapulmonar realizada mediante la punción y aspiracióncon aguja fina se realiza de forma percutánea, espoco agresiva y no requiere anestesia general. Sehace guiada por ecografía o por tomografía axialcomputarizada (TAC), que es el mejor método deguía. Su principal indicación es la lesión periférica,como el nódulo pulmonar, no accesible a otrastécnicas diagnósticas como la broncoscopia, por loque es poco utilizada en el diagnóstico deinfecciones. Su sensibilidad en neumonías graves yen pacientes inmunodeprimidos es de alrededor del50%, con una especificidad alta.3.2.2.4. Biopsia a pulmón abierto. Su objetivo es laobtención de tejido del parénquima pulmonar para elestudio histológico como indicación principal. Suindicación microbiológica es la persistencia de una

mala evolución clínica y la necesidad de obtener undiagnóstico etiológico. La muestra suele obtenersepor minitoracotomía.3.2.2.5. Punción pleural. Es una técnica habitual enel estudio del derrame pleural ya que puede obtenerhasta el 75% de los diagnósticos etiológicos,infecciosos o no. Consiste en la extracción de líquidopleural con una aguja introducida transparietalmente. El derrame pleural es el resultado de lapresencia de líquido en el espacio pleural. En lasetiologías infecciosas el mecanismo que causa elaumento de líquido es el aumento de lapermeabilidad de la microcirculación y es frecuenteen las neumonías (hasta un 40%), sobre todo en lasde etiología neumocócica. El líquido contiene célulasinflamatorias y suele ser estéril a menos que no setrate o fracase el tratamiento antibiótico,circunstancias que favorecerían la aparición deempiema o derrame purulento. El derrame pleural deetiología vírica también es frecuente y suele ser depequeño volumen. La ventilación mecánica no esuna contraindicación para su realización.

3.3. TIPOS DE MUESTRAS INDICADOS ENRELACIÓN CON EL CUADRO CLÍNICO.

En la tabla 1 se resumen los distintos tipos demuestras adecuadas para las infecciones másfrecuentes del tracto respiratorio inferior.

3.4.TIPOS DE MUESTRAS INDICADOS ENRELACIÓN CON LOS DIFERENTES AGENTESETIOLÓGICOS

En la tabla 2 se resumen los tipos de muestrasrecomendados para la detección de patógenosespecíficos y las técnicas que deben realizarse.

Tabla 1. Muestras clínicas recomendadas para el diagnóstico microbiológico de las infecciones del tractorespiratorio inferior.

Tipo de infección Tipo de muestra ComentariosBronquitis Exudados faríngeos; aspirados nasofaríngeos

Bronquiolitis Exudados faríngeos; aspirados nasofaríngeos Detección de virus

Neumonía Esputo; muestras obtenidas por fibroscopia;punción transtorácica aspirativa; puncióntranstraqueal; broncoaspiradoHemocultivoOrina

Empiema y abscesospulmonares

Líquido pleural; aspirados de abscesos

Derrame pleural Líquido pleural

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Tabla 2. Muestras clínicas recomendadas en relación con los diferentes agentes etiológicos de las infecciones deltracto respiratorio inferior.

Agente etiológico Tipo de muestraa Técnicas disponiblesBordetella pertussis Torunda NF (con medio de transporte

Stuart con charcoal); aspiradosnasofaríngeos

Cultivo selectivo; pruebasmoleculares

Mycoplasma pneumoniae Torunda NF (con medio de transporte demicoplasma como M4); esputo, muestracon broncoscopioSuero

Cultivo selectivo; pruebasmoleculares

SerologíaChlamydophila pneumoniae Torunda NF (con medio de transporte

como M4); muestra con broncoscopioSuero

Cultivo selectivo; pruebasmolecularesSerología

Anaerobios ATT; líquido pleural; CPT; LBA Tinción de Gram y cultivo

Legionella spp. CTP; LBA

SueroOrina

Cultivo selectivo; IFDb; pruebasmoleculares

SerologíaAntigenuria

Nocardia y microorganismosrelacionados

Esputo; LBA; BTB; PAAFTB; PAAFTT;BPA;

Tinción de Gram y ácido alcoholresistencia; cultivo

Burkholderia spp. Esputo; LBA Tinción de Gram y cultivoFrancisella tularensis Esputo; muestra con broncoscopio

Suero

Tinción de Gram y cultivo

SerologíaYersinia pestis Esputo; muestra con broncoscopio

Suero

Tinción de Gram y cultivo

SerologíaStreptococcus pneumoniae Esputo; muestra con broncoscopio

Orina

Tinción de Gram y cultivo

AntigenuriaHaemophilus influenzae Esputo; muestra con broncoscopio Tinción de Gram y cultivo

aNF: nasofaríngea; ATT: aspirado transtorácico; CTP: cepillado por catéter telescopado protejido; LBA: lavadobroncoalveolar; BTB: biopsia transbronquial; PAAFTB: punción transbronquial con aguja ultrafina; PAAFTT:punción transtorácica con aguja ultrafina; BPA: biopsia a pulmón abierto. bIFD: inmunofluorescencia directa.

4. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRA

El transporte al laboratorio de microbiología deberealizarse de forma rápida, y no debe demorarse lallegada de la muestra en más de 1 hora. En loscasos en que no sea posible deben guardarse lasmuestras a temperatura entre 2-8ºC.

Para las muestras de esputo, aspirado traqueal yLBA se utilizarán contenedores estériles de bocaancha y tapón de rosca. Para las muestras obtenidaspor catéter telescopado o biopsia pulmonar seutilizarán tubos estériles con 1 ml de suerofisiológico.

En la tabla 3 se muestran las diferentescondiciones de transporte y conservación de lamuestra dependiendo de la determinación solicitada.

5. MANEJO DE LA MUESTRA A LA RECEPCIÓNEN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Implica la determinación del cumplimiento porparte de la muestra de los requisitos de calidad

necesarios para ser procesada, como se indica en elProcedimiento de Microbiología Clínica de la SEIMCRecogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de microbiología 1a. Sedeben comprobar los siguientes requisitos:

a) La correcta identificación de la muestra en losrecipientes y medios de transporte, así como enlos impresos del laboratorio en los que seespecificará el método que se ha seguido parasu obtención.

b) Valoración de la cantidad adecuada de lamuestra para el estudio solicitado.

c) Comprobación de que el tiempo y lascondiciones de transporte y conservación sonadecuadas.

d) Cultivos y determinaciones solicitadas.

Cada laboratorio debe elaborar y distribuir loscriterios de aceptación y rechazo de las muestras.Las muestras que incumplan los requisitos decalidad establecidos, deben ser rechazadas para su

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procesamiento y se debe emitir un informe escrito enque se detallen los motivos del rechazo.

6. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.SELECCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO YCONDICIONES DE INCUBACIÓN

Las muestras se deben procesar en una cabinade bioseguridad ya que los aerosoles puedenproducir infecciones respiratorias adquiridas en el

laboratorio. Se deberán tener en cuenta lassiguientes recomendaciones:§ Procesar todas las muestras lo más rápidamente

posible para mantener la viabilidad de lospatógenos y evitar al paciente repetir losprocedimientos de la recogida de la muestra§ Seleccionar la porción más purulenta o más

sanguinolenta de la muestra.

Tabla 3. Transporte y conservación de muestras para el diagnóstico microbiológico de las infecciones del tractorespiratorio inferior

Tipo demuestra

Determinación Envases TransporteTiempo ytemperatura

ConservaciónTiempo y temperatura

Nasofaríngea Bordetellapertussis

Torunda conmedio detransporte Stuart oAmies concharcoal

Inmediato TAa

2 horas, 2-8ºC

Aspiradosnasofaríngeos

Bordetellapertussis

Estéril InmediatoTAa

2 horas, 2-8ºC

Nasofaríngea

Esputo

Mycoplasmapneumoniae

Torunda en mediode transporte demicoplasma

Estéril

InmediatoTAa

24 horas, 2-8ºC

>24 horas, -60ºC- 80ºC

Muestra conbroncoscopio

Mycoplasmapneumoniae

EstérilInmediato TAa

24 horas, 2-8ºC>24 horas, -60ºC- 80ºC

Nasofaríngea Chlamydophilapneumoniae

Torunda conmedio detransporte comoM4

Inmediato TAa24 horas, 2-8ºC>24 horas, -60ºC- 80ºC

Muestra conbroncoscopio

Chlamydophilapneumoniae

EstérilInmediato TAa

24 horas, 2-8ºC>24 horas, -60ºC- 80ºC

Muestra deltractorespiratorioinferior b

Bacterias yhongos

Estéril < 2h, TAa < 24h, 2-8º C

aTA: temperatura ambiente; b Muestra del tracto respiratorio inferior: esputo, aspirado traqueal, lavadobroncoalveolar, cepillado por telescopado, punción transbronquial con aguja ultrafina, punción transtorácica conaguja ultrafina, aspirado broncoalveolar telescopado, biopsia transbronquial, biopsia a pulmón abierto

§ Preparar extensiones de la muestra sobre variosportaobjetos para las tinciones (Gram, Giemsa,Ziehl, etc). Utilizar una citocentrífuga para lasextensiones del LBA. En las biopsias pulmonaresse prepararán improntas de las muestras paratinciones directas.§ Utilizar torunda, pipeta o asa estériles para

inocular las muestras en los medios de cultivo.§ En los cultivos cualitativos de esputo, AT y

secreciones bronquiales se realizará la siembraen placa reaislando con asa estéril en, al menos,tres áreas de reaislamiento.§ Para la realización de los cultivos cuantitativos,

las muestras (LBA y CTP) deben agitarse envórtex y no se centrifugarán.

§ La porción inicial de las muestras del LBA debedesecharse.§ Las piezas de tejido recogidas por biopsia

transbronquial deben introducirse en uncontenedor estéril con una pequeña cantidad desuero salino no bacteriostático. A continuaciónse homogeneizará la muestra con salino nobacteriostático para inocular en los medios decultivo.§ El resto de las muestras deben centrifugarse

entre 1.500 a 1.800 x g durante 15 a 20 minutospara utilizarlas para otros cultivos selectivos.

6.1. CRITERIOS MICROSCÓPICOS DE VALIDEZDEL ESPUTO PARA SU POSTERIOR CULTIVO

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La rentabilidad del cultivo del esputo para eldiagnóstico de la neumonía adquirida en lacomunidad ha constituído durante años una de lasmayores controversias y ha sido objeto denumerosos estudios con resultados pococoncluyentes. No obstante, existe unanimidad enque el cultivo de muestras respiratorias de malacalidad constituye un gasto de los recursos dellaboratorio y puede conducir a informes ytratamientos antibióticos erróneos. El cultivo deesputo presenta una sensibilidad baja (40-60%)debido a la pérdida de bacterias por retraso en elprocesamiento, presencia de agentes etiológicosdifíciles de cultivar y, sobre todo, por sucontaminación con la microbiota orofaríngea.

La aplicación al examen de la tinción de Gram delesputo de unos criterios estandarizados de cribadopermite determinar el grado de contaminación y lacalidad de la muestra antes de la realización delcultivo y establecer, de este modo, unos criterios derechazo. No obstante, la tinción de Gram presentatambién problemas, por su gran variabilidad en laespecificidad, sensibilidad y reproducibilidad,dependiendo de factores como la muestra y laexperiencia del observador.

La evaluación adecuada de la tinción de Gram dela muestra es crítica para asegurar que sólo seprocesan muestras de calidad. Los criterios deaceptabilidad del esputo y de las secrecionestraqueales se basan en la presencia de numerosascélulas inflamatorias y la ausencia o escasez decélulas epiteliales, que se consideran indicadoras decontaminación orofaríngea superficial.

Para la aceptación de la muestra, varios autoreshan descrito criterios celulares cuantitativos decribado que difieren en el número límite de leucocitosy células epiteliales aceptables, pero todos coincidenen considerar que un número elevado de célulasepiteliales indica contaminación orofaríngea. Engeneral, los criterios de Murray y Washington (1975)establecen como esputo de calidad aceptable para elcultivo la muestra que contiene: > 25leucocitos/campo de 100X y < 10 células epitelialesescamosas/campo de 100X

En el caso de la presencia concomitante denumerosos leucocitos y células epitelialesescamosas, Heineman y Radano (1979) establecencomo criterio de aceptación el índice de > 10leucocitos/1 célula epitelial.

Por otra parte, la detección en un esputo,aceptable por los criterios citológicos anteriores, deun morfotipo bacteriano claramente predominantesobre el resto de la microbiota que habitualmentecontamina estas muestras, permite sugerir, consensibilidad variable (57% para S. pneumoniae; 82%para H. influenzae), el agente etiológico de laneumonía y ayuda en la valoración de losmicroorganismos crecidos en los cultivos. Así,algunos morfotipos de microorganismos, comoHaemophilus, Bacteroides y los bacilos entéricospueden ser fácilmente identificados en la tinción deGram. Por otra parte, en algunos microorganismoscomo, S. aureus y M. catarrhalis, se ha establecido

una correlación del 69-93% y del 90%,respectivamente, entre la presencia en gran cantidad(>50 microorganismos/campo de 1.000X) de suscorrespondientes morfotipos en la tinción de Gram yla evidencia clínica de neumonía causada por estosagentes. Igualmente, un aumento significativo de lamicrobiota mixta (>50 microorganismos/campo de1.000X) y la detección de microorganismosintracelulares grampositivos y gramnegativos, esclaramente sugerente (valor predictivo del 79%) deneumonía por aspiración.

Los laboratorios que reciben esputos ysecreciones traqueales para tinción y cultivo, debenseguir las siguientes recomendaciones:§ Examinar con bajo aumento (100X) de 20 a 40

campos de la extensión del esputo o secreciónendotraqueal teñidos con tinción de Gram.Realizar una media del número de células en loscampos representativos que contengan células.Se aceptarán para cultivo:

- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de100X y < 10 células epitelialesescamosas/campo de 100X.

- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de100X y >10 células epiteliales/campo de100X, cuando el cociente leucocito/célulaepitelial sea >10 y exista un predominiofranco (3 ó 4 +) de un único morfotipobacteriano.Cuando en una muestra con numerososleucocitos (4+) y detritos celulares no seobservan microorganismos, puede ser útilinundar la extensión con naranja de acridinay observarla con microscopio defluorescencia para confirmar la ausencia demicroorganismos en los detritos.Pseudomonas y Haemophilus pueden noobservarse en estas tinciones por ladificultad de diferenciación entre los detritoscelulares. Legionella se puede observar conla tinción de naranja de acridina, aunque enesta infección hay a menudo ausencia deleucocitos en el esputo.

§ Se rechazarán e informarán como “muestrainaceptable” o “no compatible con procesosinfecciosos bacterianos”, según corresponda, lassiguientes muestras:

- Esputos con >10 células epiteliales/ campo de 100X.

- Aspirados traqueales de adultos con >10 células epiteliales/campo de 100X, o los

aspirados en los que no se observan microorganismos.

- Aspirados traqueales de pacientes pediátricos en los que no se observen microorganismos, independientemente del número de células epiteliales.§ No se rechazarán los esputos y aspirados

endotraqueales con petición de cultivo paraLegionella, Mycobacterium, Nocardia yRhodococcus, ni las muestras de pacientes con

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fibrosis quística o neutropenia aunque nocumplan los criterios citológicos de calidad.

6.2. CULTIVOS CUALITATIVOSSe realizarán cultivos cualitativos de bacterias en

todas las muestras respiratorias excepto en losaspirados endotraqueales (AT), muestras obtenidaspor fibrobroncoscopia (CTP y LBA) y muestrasobtenidas por técnicas ciegas. Los AT no debencultivarse cualitativamente por su falta deespecificidad para el diagnóstico de la NAV.

La mayoría de los patógenos bacterianos quecausan infecciones del tracto respiratorio inferiorpueden detectarse en medios de cultivo comunes.Medios de cultivo. Los medios de cultivoconvencionales para el aislamiento de bacteriasrespiratorias comunes incluyen agar sangre decarnero 5% (o agar sangre de caballo), una placa deagar chocolate y una placa de agar MacConkey oagar EMB. En caso de sospecha de infección porLegionella spp. se incluirán placas de agar BCYEα .En caso de sospecha de infección por M.pneumoniae o C. pneumoniae se inocularán lasmuestras en los medios de cultivo específicos paraestos microorganismos.

En las placas de agar sangre y chocolate seinoculará la muestra reaislando en, al menos, tresáreas de reaislamiento, con el fin de valorar lacantidad de crecimiento de los posibles patógenos.

Opcionalmente, se puede realizar uno o más delo siguientes procedimientos:§ Añadir un disco de bacitracina de 10 UI a laplaca de agar chocolate o agar sangre parainhibir la microbiota respiratoria superior ymejorar la detección de H. Influenzae.§ Inocular una estría de S. aureus (ATCC25923) en la placa de agar sangre parademostrar el satelitismo de Haemophilusdirectamente en la placa.§ Añadir un disco de optoquina en el segundocuadrante de la placa de agar sangre paraobservar la inhibición de S. penumoniae, y asírealizar la detección directa en las placasprimarias.

Como todas estas muestras pueden estar muycontaminadas con microbiota normal respiratoria, noson apropiadas la utilización de caldos deenriquecimiento, ni de medios para anaerobios. Loscultivos para anaerobios se podrían realizar enmuestras obtenidas por aspiración percutánea(raramente se realiza) o en las muestras de CTP conuna solicitud específica.Condiciones de incubación. Se incubarán las placasa 35-37ºC en 5% de CO2 durante 48 a 72 horas. Loscultivos de muestras pulmonares obtenidas porprocedimientos invasivos se incubarán durante 4días. Las placas de medio de Legionella seincubarán 7 días. Las placas para cultivo deNocardia y Rhodococcus se incubarán hasta 2semanas antes de descartarlas como negativas.

6.3. CULTIVOS CUANTITATIVOS EN MUESTRASOBTENIDAS POR FIBROBRONCOSCOPIAProcesamiento de la muestra. Existen dos métodospara la realización de los cultivos cuantitativos: elmétodo de las diluciones en el que se realizandiluciones decimales seriadas de las muestras ensuero salino fisiológico y posterior siembra dealícuotas de las diferentes diluciones en los mediosde cultivo y el método de la siembra con asacalibrada (Ver PNTs correspondientes alprocesamiento del cepillo bronquial y del lavadobroncoalveolar). Después de la incubación secuentan las colonias y se multiplican por el factor dedilución apropiado para determinar el número debacterias presentes en 1 ml de líquido.Medios de cultivo. Como medios primarios de cultivopara el aislamiento y recuento de bacterias seutilizan placas de agar sangre, agar chocolate y agarMacConkey o EMB como medio selectivo parabacilos Gram negativos. Además se incluirá agarBCYEα para el cultivo de Legionella spp., y agarSabouraud para el cultivo de hongos,preferiblemente en tubo inclinado. Opcionalmentepuede utilizarse agar para anaerobios (en muestrasde cepillado bronquial y biopsias).Incubación. Para el aislamiento bacteriano seincuban las placas a 35-37ºC en atmósfera de CO2al 5% durante 48 horas como mínimo, siendopreferible mantener la incubación hasta las 72 horas.La placa para anaerobios se incubará en atmósferade anaerobiosis durante el mismo tiempo ytemperatura. Las placas para Legionella spp. debenincubarse en la misma atmósfera de CO2 durante 10días. El medio de Sabouraud se debe incubardurante 3 semanas en estufa de 30ºC.

6.4. CULTIVOS CUANTITATIVOS EN MUESTRASOBTENIDAS POR PROCEDIMIENTOS NOINVASIVOS

El cultivo del aspirado traqueal (AT) y lasmuestras obtenidas por técnicas ciegas (aspiradobronquial ciego, minilavado broncoalveolar) debenprocesarse cuantitativamente por el método de lasdiluciones seriadas o de forma más práctica ysencilla mediante el método del asa calibrada(0,0025 ml). El resto del procesamiento, los mediosde cultivo y las atmósferas de incubación son losmismos que los empleados para los cultivoscuantitativos de las muestras obtenidas porfibrobroncoscopia.

6.5. CULTIVOS EN MEDIOS ESPECIALESLos organismos que presentan condiciones

especiales de crecimiento, como Legionella spp. y B.pertussis requieren medios selectivos para suaislamiento.6.5.1. Legionella spp. Para el cultivo de Legionellano se aplicarán los criterios de rechazo de muestrasde la tinción de Gram. Los pacientes con legionelosistípica producen un esputo fino y acuoso que puedecontener pocos leucocitos y en el que sólo puedenverse morfotipos de bacterias orales normales, ya

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que la Legionella no se tiñe con los reactivos de latinción de Gram en las muestras clínicas.

Las muestras de LBA que estén muy diluidasdeben concentrarse por centrifugación antes derealizar el cultivo. No se realizarán “cultivoscuantitativos de LBA” para Legionella; suconcentración en este tipo de muestra es siemprebaja.

Las muestras de líquido pleural de menos de 5 mlpueden cultivarse sólo después de advertir al clínicode que esta muestra tiene muy poco rendimientopara el cultivo de Legionella.

Se rechazará “la prueba de curación” porque nose puede utilizar para monitorizar la respuestaterapéutica.Todas las muestras deben inocularse en placas de:

− BCYE-a no selectivo.− BCYE-a con polimixina, anisomicina,cefamandol y a-cetoglutarato (BMPA-a). Es útilpara el cultivo de muestras que contienen otrosmicroorganismos, pero podría inhibir elcrecimiento de Legionella spp. (por ejemploLegionella micdadei) que son sensibles acefamandol, por lo que no debe utilizarse solo.

Los medios deben almacenarse a 4ºC en bolsasselladas, para conservar la humedad. No almacenarfuera de la bolsa.

Los medios deben incubarse a 35-37ºC, enatmósfera aeróbica (sin 5% CO2), durante10 díascon humedad adecuada (50-70% de humedadrelativa) para prevenir el secado durante laincubación, ya que los medios secos impiden elcrecimiento de Legionella. Si fuera difícil mantener elgrado de humedad óptimo, colocar unas gasasestériles humedecidas con agua estéril en el fondode la jarra e introducir las placas encima de lasgasas dentro de la jarra. Se examinará el cultivodiariamente. Para mayor información consultar elProcedimiento de Microbiología de la SEIMC nº 20 yel PNT-LP-01.6.5.2. Bordetella spp. Se sembrará la muestra enmedio de agar Regan-Lowe, que contiene agarcharcoal CM119 (51 g/l), 10% de sangre de caballodesfibrinada y 0,04 g de cefalexina por litro. Algunasfórmulas utilizan ciclodextrina en lugar de charcoal.Almacenar las placas preparadas comercialmente a4ºC durante 4 a 8 semanas en un contenedorsellado. El agar Bordet-Gengou ha sido sustituidopor el agar Regan-Lowe, que tiene una vida mediamás larga y mayor capacidad para aislar elmicroorganismo y es más fácil de preparar. Algunasespecies de Bordetella spp. se inhiben por lacefalexina y algunos investigadores recomiendanutilizar medio con y sin antibióticos.Desafortunadamente, los medios sin antibióticossuelen tener sobrecrecimiento por contaminantes decrecimiento rápido y esta práctica no pareceaumentar los porcentajes de aislamiento. Enconsecuencia, la mayoría de los laboratorios nosiguen esta recomendación.

Para la incubación se colocarán las placas enbolsas de plástico o en una cámara húmeda con

papel de filtro humedecido para evitar el secado. B.pertussis es muy sensible a la desecación. Seincubarán las placas a 35ºC en atmósfera aeróbica(sin 5% CO2) durante 12 días. Es crítico mantenerlasa 35ºC. Muchas cepas de B. pertussis no soportanuna incubación a la temperatura de 37ºC. Debenobservarse las placas de Regan-Lowe a las 48h ydespués diariamente. Para una información másdetallada consultar el PNT- ITRI- 04 de esteprocedimiento.

7. CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DELOS RESULTADOS. INFORMACIÓN DE LOSRESULTADOS7.1. MUESTRAS CONTAMINADAS CONMICROBIOTA DEL TRACTO RESPIRATORIOSUPERIOR

Para la interpretación de los cultivos de esputo seutilizará como guía la información del morfotipobacteriano predominante observado en la tinción deGram de la muestra, una vez comprobado quecumple los criterios de calidad.

Se valorarán, identificarán e informarán losmicroorganismos no pertenecientes a la microbiotanormal, como los aislados de S. pyogenes,estreptococos del grupo B en neonatos, Bordetella(especialmente B. bronquiseptica), M. pneumoniae,C. pneumoniae, Legionella, Nocardia, F. tularensis,B. anthracis, Cryptococcus neoformans y hongosfilamentosos (no considerados contaminantes).

También, se identificarán e informarán losmicroorganismos pertenecientes a la microbiota decolonización cuyo morfotipo esté presente de formapredominante en el Gram de la muestra y quecrezcan en cantidades significativas en la segunda oen la tercera área de reaislamiento de la placa,aunque no sean predominantes en el cultivo. En estegrupo se incluyen los aislados de S. pneumoniae, H.influenzae, M. catarrhalis, P. aeruginosa, S.maltophilia, Acinetobacter spp. y Burkholderia spp.,éstos últimos de particular interés en pacienteshospitalizados y en pacientes no hospitalizados conbronquiectasias.

Igualmente, se identificarán e informarán losmicroorganismos con crecimiento en cantidadsignificativa y predominante en el cultivo, enparticular si se ha observado su morfotipo en latinción de Gram de la muestra. En este grupo seincluyen S. aureus, estreptococos del grupo B enadultos, estreptococos ß-hemolíticos de los grupos Co G, bacilos gramnegativos cuando crezca un solomorfotipo (en especial K. pneumoniae), especies deCorynebacterium (urea positiva o aisladas enpacientes intubados) y R. equi (en pacientesinmunodeprimidos). Además, se considerará elcrecimiento de pequeñas cantidades de especiesbacterianas, siempre que coincidan con el morfotipobacteriano observado en la tinción de Gram delesputo, así como también el crecimiento de coloniasen el primer cuadrante de la placa en cultivo puro oprácticamente puro.

Por el contrario, no se debe valorar el crecimientode más de un morfotipo de bacilos gramnegativos en

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el medio de MacConkey (E. coli, Proteus spp., etc) yse debe informar como “crecimiento de bacilosgramnegativos entéricos”. Tampoco se valorará niinformará el aislamiento de Enterococcus spp., amenos que se aísle en cultivo puro. Las especies deCandida no son causa de neumonía (colonizanhabitualmente la boca), excepto posiblemente en lospacientes oncológicos (leucemia), transplantadospulmonares y en los neonatos.

Cuando la muestra de esputo se rechace paracultivo siguiendo los criterios de la tinción de Gram,es apropiado comunicar uno de los siguientesresultados:§ “Se observan > 10 células epiteliales escamosas

por campo de bajo aumento, lo cual sugiere malacalidad de la muestra; el cultivo no se realiza.Por favor, recoger nueva muestra si existeindicación clínica.”§ “No se observan bacterias tras el examen con

objetivo de 1.000X; el cultivo no se realiza.Contactar con el laboratorio si están indicadosclínicamente otros estudios”§ Si no se aísla ningún patógeno en el cultivo se

informará como “crecimiento de microbiotahabitual”.§ Si se aíslan microorganismos patógenos se

informará la especie identificada y las pruebasde sensibilidad.

7.2. MUESTRAS NO CONTAMINADAS CONMICROBIOTA DEL TRACTO RESPIRATORIOSUPERIOREn las biopsias pulmonares por puncióntranstorácica, biopsias a pulmón abierto y en ellíquido pleural todos los patógenos se debenidentificar e informar junto con las pruebas desensibilidad a antibióticos.

7.3. CULTIVOS CUANTITATIVOS EN MUESTRASOBTENIDAS POR FIBROBRONCOSCOPIA

Según los trabajos de Bartlett y Finegold,Baselski, Wimberley y otros autores, las bacteriasorofaríngeas que contaminan las secrecionespurulentas de las vías aéreas inferiores estánpresentes en pequeña cantidad, en concentracionesinferiores a 10.000 ufc/ml de muestra, mientras quelas bacterias patógenas se encuentran en altasconcentraciones, entre 100.000 y 1.000.000 ó másufc/ml. El cultivo cuantitativo tiene como objetivodiferenciar los dos tipos de bacterias basándose ensu concentración.

En las muestras obtenidas por fibrobroncoscópialos puntos de corte están fijados en 1.000 ufc/ml (103

ufc/ml) para el cultivo del cepillado bronquial y10.000 ufc/ml (104 ufc/ml) para el cultivo bacterianodel LBA y se consideran un buen indicador deneumonía bacteriana, en especial en los enfermosventilados mecánicamente con sospecha deneumonía nosocomial. Recuentos inferiores a 103

ufc/ml suelen indicar contaminación por microbiotaorofaríngea. Sin embargo, en determinadasocasiones, tanto en el cepillado como en el lavadobrocoalveolar estos puntos de corte no deben ser

tomados de forma rígida y recuentos de más o demenos de un logaritmo para el cepillado bronquial(102-104) y de 1-2 para el lavado broncoalveolar (102-106) deben interpretarse con precaución ya que hayvarios factores relacionados con la técnica de labroncoscopia y el procesamiento microbiológico,pero sobre todo con el tratamiento antibiótico querecibe el enfermo, que pueden alterarlos.Excepciones a estos puntos de corte seríanpatógenos primarios o raramente aislados comoparte de la microbiota, como Legionella, Nocardia, yotros, en los que debe valorarse cualquier recuento.

La tinción de Giemsa permite observar ladistribución porcentual de células y orientar laetiología, ya que la infección bacteriana suele cursarcon una proporción de células inflamatorias superiora la de las etiologías víricas o fúngicas. Laobservación de células epiteliales escamosas indicacontaminación orofaríngea.

Por otra parte, en el caso del lavado, laobservación en la tinción de Gram de bacteriasintracelulares en un porcentaje superior al 5% indicala existencia de neumonía con sensibilidadescercanas al 70% y especificidades superiores al90%.

En la información de los resultados debenconsiderarse los siguientes aspectos:

- Se debe informar el recuento de cada tipo decolonias bacterianas expresado en unidadesformadoras de colonias por mililitro (ufc/ml).- Recuentos superiores o inferiores demicroorganismos no potencialmente patógenos sepueden informar como microbiota respiratoriahabitual.- Considerar como muestra pobre o de malacalidad, e informarlo así, a aquellas en las que seobserven menos de 10 neutrófilos por campo de1.000 aumentos en la tinción de Gram o deGiemsa.- Si en la tinción de Gram o de Giemsa seobservan células epiteliales en una proporciónsuperior al 1% se ha de informar que el resultadodel cultivo bacteriano puede corresponder amicrobiota orofaríngea.- Se informará del morfotipo o morfotiposbacterianos observados en la tinción de Gram.- En el LBA se debe informar si se observanbacterias intracelulares en la tinción de Gram.- Del resto de pruebas para virus, hongos,parásitos y bacterias se informará del resultado,añadiendo la interpretación del microbiólogo si seconsidera conveniente.

8.TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO8.1.DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOSBACTERIANOS EN ORINA (S. pneumoniae y L.pneumophila)

En la actualidad, existen técnicas rápidas para ladetección de antígenos bacterianos que representanuna ayuda complementaria de gran valor en eldiagnóstico de la NAC y permiten sustituir a otrastécnicas de realización mucho más compleja

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(enzimoinmunoensayo y radioinmunoensayo). Estaspruebas comerciales (Binax-now), soninmunocromatografías sobre membrana quedetectan los antígenos de S. pneumoniae y L.pneumophila del serogrupo 1, respectivamente, en laorina de los pacientes con neumonía causada porestos microorganismos.

En el caso de la neumonía por neumococo, latécnica detecta el antígeno polisacárido C de lapared del neumococo, antígeno común a todos losserotipos del microorganismo, que es soluble enorina y en líquido cefalorraquídeo, por lo que tambiénes aplicable para el diagnóstico de la meningitisneumocócica. En el caso de la inmunocromatografíapara L. pneumophila la técnica está diseñadaúnicamente para la detección del lipopolisacárido delserogrupo 1. La técnica, similar en ambos casos, essencilla y rápida (15 minutos) y permite detectar elantígeno desde el primer día de la infección en elcaso del neumococo y después de los 3 primerosdías en el de L. pneumophila.

La técnica para detección de antígeno de S.pneumoniae muestra una muy buena sensibilidad(90%) y una especificidad que varía según las series,pero por encima del 70%. Sin embargo, lasensibilidad de la técnica se ve afectada por lavacunación frente a S. pneumoniae, que puedeproducir falsos positivos. También, en pacientes coninfección o colonización bronquial como ocurre en laEPOC y en niños, pueden producirse falsospositivos. No se conoce con precisión el efecto quepueda tener el tratamiento antibiótico previo.

En el caso de L. pneumophila, la técnica tieneuna sensibilidad muy buena (97%) en la orinaconcentrada y una especificidad del 100%, por loque resulta de gran utilidad para el cribado de casosen los brotes epidémicos. Para mayor informaciónsobre la técnica consultar el PNT-LP-05 delProcedimiento de Microbiología de la SEIMC nº 20.8.2. MÉTODOS MOLECULARES

Las técnicas moleculares son un instrumentovalioso para el diagnóstico etiológico de laneumonía, porque pueden detectar en poco tiempolos ácidos nucleicos de todos los patógenospotenciales, no dependiendo de la viabilidad delmicroorganismo. Esta técnica se ve menos afectadapor los tratamientos antibióticos previos que loscultivos y la obtención de los resultados es másrápida. Con el desarrollo de la tecnología de la PCR atiempo real se consiguen resultados en menos deuna hora. Todas estas ventajas hacen que la PCR sepresente como la prueba ideal para el diagnóstico dela neumonía, aunque existen algunas desventajas,como son la limitación en realizar pruebas desensibilidad y la imposibilidad de coleccionar losaislados para futuras pruebas. Quedan porestablecer algunos parámetros antes de incorporarestas pruebas a los protocolos de diagnóstico clínico,como por ejemplo el tipo de muestra óptima, controlinterno de inhibición, sensibilidad y especificidadclínica, y reproducibilidad de la técnica.

Inicialmente las técnicas de hibridación de ácidosnucleicos se utilizaron para detectar virus del herpessimplex, citomegalovirus, M. pneumoniae, Legionellaspp. y micobacterias. Recientemente, laamplificación de ácidos nucleicos por PCR haproducido un gran interés. Estas técnicasrepresentan un método rápido y relativamente simplede identificación de micoorganismos con unasensibilidad y especificidad alta y se han aplicadosobre todo a microorganismos que son difíciles deidentificar utilizando técnicas microbiológicashabituales, como L. pneumophila, M. pneumoniae, C.pneumoniae, citomegalovirus y Pneumocystisjiroveci, y también a otros patógenos bacterianosmás frecuentes como S. pneumoniae. Aunque lamayoría de los estudios se han realizado conmuestras de esputo, la técnica de PCR en exudadofaríngeo ha demostrado ser un método rápido dediagnóstico en infecciones por L. pneumophila y M.pneumoniae. En la tabla 4 se muestran las pruebasde PCR evaluadas para el estudio de neumonías.

La PCR ofrece la ventaja de tener una sensibilidadalta, incluso en fases tempranas de la infección. Laslimitaciones de esta técnica son que no diferenciaentre infección y colonización y entre infecciónactiva, latente o pasada y que pueden producirseresultados falsos negativos por la presencia deinhibidores naturales.

8.3. Etest DIRECTO EN MUESTRAS DEPACIENTES CON NEUMONÍA ASOCIADA AVENTILACIÓN MECÁNICA

Es bien conocido que, frente a la terapiaempírica, la instauración de tratamientosantimicrobianos dirigidos por el antibiograma, tiene laventaja de permitir evitar tanto el fracaso terapéuticoderivado del uso de antibióticos inactivos frente alagente etiológico como el uso innecesario deantibióticos de amplio espectro. Esto esparticularmente importante en el tratamiento de lasinfecciones nosocomiales graves, entre ellas laneumonía asociada a ventilación mecánica con tasasde mortalidad entre el 24 y el 50%. Es también bienconocido que el mayor problema asociado a laterapia dirigida por antibiograma es que losresultados del mismo no están disponibles hasta 2 ó3 días después de la toma de la muestra en el mejorde los casos, limitando enormemente el impactopositivo de la terapia dirigida, particularmente en lasinfecciones graves de rápida evolución. Es por tantodeseable disponer en estos casos de técnicas quepermitan conocer el perfil de sensibilidad a losantibióticos en las primeras 24h.

En este sentido, según estudios recientes, larealización de un antibiograma por E-testdirectamente de las muestras respiratorias de lospacientes con neumonía asociada a ventilaciónmecánica ofrece resultados en 18-24 horasprácticamente concordantes en su totalidad con elantibiograma convencional.

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Tabla 4. Pruebas de PCR evaluadas para el estudio de la neumonía adquirida en la comunidad.

Agente etiológico Tipo de muestraa ComentarioS. pneumoniae Esputo, exudado faríngeo,

suero, plasma, leucocitos,orina, PAAFTT

En muestras respiratorias problemas endiferenciar colonización de infección; ensangre la sensibilidad varía según losestudios

Mycoplasmapneumoniae

Esputo, exudado faríngeo onasofaríngeo, LBA, PAAFTT

Más sensible que el cultivo; exudadofaríngeo es la muestra de elección

Legionella spp. Esputo, LBA, AT, exudadofaríngeo, suero, leucocitos,orina

Al menos tan sensible como el cultivocuando se realiza en muestras del tractorespiratorio inferior; necesidad deevaluar en muestras no respiratorias

Chlamydophilapneumoniae

Esputo, exudado faríngeo onasofaríngeo, LBA, lavadooral

Más sensible que el cultivo

Chlamydia psittaci Esputo, exudado faríngeo,sangre, tejido pulmonar

No evaluado totalmente

Virus Exudado faríngeo onasofaríngeo, esputo, LBA

No evaluado totalmente paraneumonías; mayor utilidad en pacientesinmunodeprimidos

a PAAFTT: punción transtorácica con aguja ultrafina; LBA: lavado broncoalveolar; AT: aspirado endotraqueal.

Desde el punto de vista metodológico, elprocedimiento consiste en realizar una tinción deGram de las secreciones respiratorias y sembrar enagar Mueller-Hinton a modo de antibiogramaconvencional aquellas en las que se observenmicroorganismos. Posteriormente, se depositan enlas placas tiras de E-test seleccionadas en funciónde que el microorganismo sea Gram positivo onegativo y tras incubación a 35ºC durante 18-24horas se leen los resultados.

A pesar de que el E-test es una técnicarelativamente cara, la reducción del coste económicoasociado con el uso inapropiado de losantimicrobianos parece compensar con creces estaaparente desventaja. Una limitación potencial deesta aproximación es la difícil interpretación de losresultados en infecciones polimicrobianas y su noaplicabilidad a los patógenos respiratorios clásicosque no crecen en Mueller-Hinton como S.pneumoniae o H. influenzae, aunque ciertamente suincidencia en la neumonía nosocomial asociada aventilación mecánica es baja. En cualquier caso, sonquizá todavía deseables más trabajos de evaluaciónde las ventajas e inconvenientes del estudio desensibilidad directo en muestras respiratorias.

9. PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLES - No se deben aceptar cultivos repetidos enintervalos inferiores a 48 horas.- Se rechazarán las siguientes muestras para eldiagnóstico de la infección del tracto respiratorioinferior:

- Esputos recogidos durante 24 horas.

- Esputos y muestras endotraquealescontaminadas sin criterios de aceptabilidadpor la tinción de Gram.

- Saliva.- Exudados faríngeos. No indican infecciónde la vía respiratoria inferior, excepto paracultivo de M. pneumoniae y C. pneumoniae.- Muestras para cultivo de anaerobios,excepto el aspirado transtraqueal, CTP,muestras de biopsias, líquido pleural u otrasmuestras no contaminadas.- El cultivo del cepillado bronquial si no serecoge con catéter telescopado. Se aceptarásólo en el caso de CTP no disponible.- Secreciones obtenidas por lavadobronquial. Esta muestra corresponde a lassecreciones aspiradas de las vías aereas demayor tamaño, por lo que son de peorcalidad para el cultivo de bacterias que lasmuestras de LBA, que recogen secrecionesde los espacios bronquiolares y alveolares.Si se reciben ambos, sólo debe cultivarsecuantitativamente la muestra de LBA.- Las muestras cuya demora en el transportesupere a las 2 horas sin refrigerar, ya quepuede alterar los resultados de los cultivos,especialmente en las muestras obtenidas porfibrobroncoscopia.- No se deben realizar cultivos cuantitativosen el cepillado bronquial si el volumen desuero fisiológico que contiene el cepillo esinferior a 1 ml, ya que la información queproporciona no refleja la carga bacteriana dela muestra original.

- En el LBA no debe procesarse la primera alícuotarecuperada, ya que contiene células escamosas y

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ciliadas en elevada proporción, y por lo tanto debedesecharse.- En el cultivo cuantitativo del lavado broncoalveolar,deben tomarse con precaución los aislamientosbacterianos cuando se observa un 1% ó más decélulas epiteliales en la tinción de Gram o Giemsa,porque indica que la muestra puede habersecontaminado con microbiota orofaríngea.- Se deben tomar con precaución los resultados delprocesamiento del lavado broncoalveolar cuando elvolumen recuperado es inferior a 10 ml, ya que seconsidera que no son representativos de la afecciónpulmonar.

10. PROCEDIMIENTOS ADICIONALES AREALIZAR EN SITUACIONES ESPECIALES

Se incluye el diagnóstico microbiológico de lasinfecciones del tracto respiratorio inferior que seproducen en el contexto de otros cuadros infecciososde presentación infrecuente en nuestro medio.

10.1. NEUMONÍA POR BACTERIAS DEL ORDENRICKETTSIALES (R. PROWAZEKII, C. BURNETII) En el curso de los cuadros clínicos causadospor Rickettsia prowazekii (tifus epidémico) y C.burnetii (fiebre Q) en ocasiones se produce infecciónpulmonar. Los microorganismos del ordenRickettsiales presentan una especial peligrosidad ensu manejo y son responsables de numerosasinfecciones adquiridas en el laboratorio. A diferenciade R. prowazekii, que puede ser inactivada por losdesinfectantes habituales, C. burnetii, resiste ladesecación y la inactivación química. Por ello, elprocesamiento de las muestras sospechosas(pulmón, bazo, ganglios linfáticos), en las que hayuna concentración de organismos mayor a la de lasangre, requiere medidas de bioseguridad del nivel 3y personal preparado. En los laboratorios clínicos serecomienda realizar pruebas serológicas en suerospareados. Es necesario tener un especial cuidadopara evitar la producción de aerosoles durante lamanipulación para la separación del suero a partir dela sangre. Dada la peligrosidad que implica el trabajocon microorganismos vivos, el intento de aislamientoo la detección por inmunofluorescencia directa debenlimitarse y las muestras post-mortem de los casosfatales deben enviarse a un laboratorio de referencia.

10.2. INFECCIÓN NEUMÓNICA PORFRANCISELLA TULARENSIS

La infección pulmonar por F. tularensis es laforma clínica más aguda de la tularemia. Se producepor inhalación de un aerosol infeccioso (lo másfrecuente) o por diseminación del microorganismodesde las formas ulceroganglionar, glandular uorofaríngea de la enfermedad. La inhalación de F.tularensis se produce principalmente durante lasactividades en granjas en las que residen roedoresinfectados. Aunque la tularemia tiene unadistribución preferente en el hemisferio norte(Escandinavia, América del Norte, Japón y Rusia),también se han descrito casos en Suiza, Turquía,Yugoslavia y España.

F. tularensis es un agente extremadamenteinfeccioso y el tercer agente causal más frecuente delas infecciones adquiridas en el laboratorio, por loque se recomiendan medidas de bioseguridad denivel 2 para la manipulación de las muestrassospechosas y de nivel 3 para los cultivos.

El cultivo del microorganismo, de crecimientodifícil, es poco sensible y requiere mediosenriquecidos con cisteína y sangre, aunque F.tularensis puede crecer en medios habituales, comoagar chocolate con IsoVitalex, agar Thayer-Martin yagar-carbón-extracto de levadura. Sin embargo, elaislamiento y la identificación bioquímica delmicroorganismo no justifican el riesgo que supone lamanipulación del cultivo. Por ello, el diagnósticomicrobiológico de la tularemia es fundamentalmenteserológico (aglutinación o ELISA). Las técnicas dePCR, aunque en proceso de perfeccionamiento,permiten una detección rápida y más segura que elcultivo.

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DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-ITRI-01PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS RESPIRATORIAS OBTENIDAS POR

PROCEDIMIENTOS NO INVASIVOS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

PNT- ITRI-01Servicio de MicrobiologíaHospital ....................................

Procesamiento de las muestrasrespiratorias obtenidas por

procedimientos no invasivos Edición Nº 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl objetivo de este documento es definir la

metodología del procesamiento, así como lavaloración de las muestras respiratorias obtenidaspor procedimientos no invasivos, para el diagnósticoetiológico de la infección respiratoria bacteriana deltracto respiratorio inferior.

2. FUNDAMENTOLos cultivos de las secreciones del tracto

respiratorio inferior pueden ser de ayuda para eldiagnóstico de la infección del tracto respiratorioinferior, aunque hay que tener presente que, engeneral, tienen un valor limitado debido a la bajasensibilidad de las técnicas microbiológicasconvencionales según el cuadro clínico:

A) En el diagnóstico microbiológico de laneumonía adquirida en la comunidad (NAC), en el40-60% de los cultivos no se detecta el agenteetiológico. Esta baja sensibilidad se debe a laescasa sensibilidad del cultivo del esputo para elaislamiento de los patógenos; así Streptococcuspneumoniae sólo se aísla en el 50% de los casos,especialmente si las muestras no se hanprocesado inmediatamente. También algunosagentes etiológicos de la NAC son de difícilcrecimiento o no se investigan de forma rutinaria(Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasmapneumoniae, Legionella pneumophila). En laactualidad varias guías recomiendan el cultivo enlimitadas ocasiones, aunque cada sociedadcientífica tiene diferentes criterios para indicarlo.En general, se estima que el cultivo de muestrasrespiratorias y la tinción de Gram pueden serútiles cuando el paciente cumple criterios deingreso hospitalario.B) En el caso de la neumonía nosocomial(pacientes con ventilación mecánica o sin ella) eldiagnóstico microbiológico es poco sensible yespecífico debido a la contaminación del cultivo delesputo o del aspirado traqueal con microbiotaorofaríngea y por la colonización con bacilosgramnegativos que se produce en gran parte delos pacientes hospitalizados y tratados conantibióticos. En consecuencia, en la mayoría de loscasos, el problema de la diferenciación entreinfección neumónica o simple colonización deltracto respiratorio superior con microbiotapotencialmente patógena sólo permite realizar undiagnóstico de probabilidad. Únicamente seobtendrá un diagnóstico de certeza cuando seaísle un patógeno primario que no forme parte dela microbiota comensal (Legionella, M.pneumoniae, etc)

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA− Murray P.R., E.J. Baron, J.H. Joergensen, M.A.

Pfaller, and. R.H. Yolken, ed. Manual ofClinical Microbiology. 8th ed. 2003. AmericanSociety for Microbiology. Washington, DC.

− Isenberg H.D., ed. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. 2nd ed. 2004. American Society forMicrobiology, Washington, DC.

− Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general demuestras en el laboratorio de microbiología. 2003.

− Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica.2000.

4. MUESTRASLas muestras del tracto respiratorio inferiorrecogidas por procedimientos no invasivosincluyen los esputos, los aspiradosendotraqueales (pacientes intubados) y lassecreciones bronquiales.En el procedimiento SEIMC 1a., Recogida, transporte yprocesamiento general de muestras en el laboratoriode microbiología (2003) se indican las directricesprincipales de la recogida y conservación de lasmuestras (PNT-RTP-01).

5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS− Colorantes para la realización de la tinción de Gram− Placas de medios de cultivo:! agar sangre de carnero! agar chocolate o agar de sangre de caballo

(HBA), o con 20.000 UI de bacitracina por litro(HBAB)

! agar MacConkey (MAC) o agar EMB! agar extracto de levaduras charcoal buffered

(BCYE-α)! BCYE-α con polimixina, anisomicina, cefamandol

y α-quetoglutarato (BMPA-α)6. APARATOS Y MATERIALES− Cabina de bioseguridad− Torunda estéril o pipeta tipo Pasteur− Asas de cultivo estériles− Portaobjetos− Cámara húmeda− Estufa de 35ºC con 5% de CO2 o sistema generador

de CO2

− Estufa de 35-37ºC7. PROCEDIMIENTO Las muestras deben procesarse en una cabina debioseguridad, ya que los aerosoles producidosdurante la siembra pueden ser causa de infeccionesrespiratorias adquiridas en el laboratorio.Cultivo sistemático de bacterias− Procesar las muestras lo más rápidamente posible− Seleccionar la parte de la muestra más purulenta o

con sangre− Realizar la tinción de Gram sobre una extensión

uniforme de la muestra, según el protocolo dellaboratorio.1) Proceder a la evaluación de la aptitud de la

muestra para su posterior cultivoPermite asegurar que sólo se procesan muestras decalidad.

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Procesamiento de las muestrasrespiratorias obtenidas por

procedimientos no invasivos Edición Nº 01 Página 3 de 5

• Examinar la tinción de Gram con aumentos100X en un mínimo de 20 a 40 campos. Aplicarlos criterios de Murray y Washington (1975) (>25 leucocitos/campo 100X; < 10 célulasepiteliales/campo 100X) para el rechazo oaceptación de la muestra:

• Las muestras de esputo en las que seobserve la presencia de >10 células /campo100X y <25 leucocitos/campo 100X serechazarán para cultivo.

• Las muestras de aspirados traqueales deadultos con >10 células epiteliales/campo100X y en las que no se observenmicroorganismos, serán rechazadas paracultivo.

• Los aspirados traqueales de niños en losque no se observen microorganismos,serán rechazados para cultivo.

! Estos criterios de selección de calidad de lamuestra no son aplicables a los esputos paracultivo de bacterias como Legionella,Nocardia, Rhodococcus, M. pneumoniae y C.pneumoniae. Tampoco se aplicarán estoscriterios a los esputos para estudio de fibrosisquística, ni en los pacientes congranulocitopenia.

2) Proceder al exámen de los morfotipospresentes en la muestra que cumpla loscriterios de aptitud- En las muestras que cumplan los criterios deaceptación (<10 células epiteliales/campo 100X y>25 leucocitos/campo 100X) se proseguirá elexámen microscópico.- Igualmente, se aceptarán para cultivo lasmuestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y>10 células epiteliales/campo de 100X, cuandose observen >10 leucocitos/1 célula epitelial yen el examen con objetivo de inmersiónpresenten un predominio franco (3 ó 4 +) de unúnico morfotipo bacteriano.

• Examinar con aumento de 1000X, paraobservar la presencia de microorganismos.

• Describir el tipo de microbiota presente como:• “Microbiota mixta” (cocos grampositivos

en parejas, cadenas o racimos; cocosgramnegativos; levaduras; bacilosgrampositivos (morfotipoCorynebacterium o anaerobios) etc.,pero sin predominio franco de ningúnmorfotipo.

• Predominio franco de algún morfotipoconcreto (aproximadamente 50 o másorganismos/campo 1000X), tal comococos grampositivos en diplos (morfotipocompatible con S. pneumoniae); bacilosgramnegativos (morfotipos compatiblescon Haemophilus, enterobacterias,Pseudomonas); cocos grampositivos(morfotipo Staphylococcus); cocosgramnegativos en diplos (morfotipo

Moraxella) y la presencia de bacilosgrampositivos cortos, en cadenas y conformas ramificadas (morfotipo compatiblecon Nocardia).

• Aumento en la microbiota mixtacompuesta por organismos grampositivosy gramnegativos (bacilos con morfotipocompatible con anaerobios) acompañadapor la presencia de organismosintracelulares, lo que es sugerente deneumonía por aspiración.

− Etiquetar o rotular las placas correctamente− Utilizar una torunda estéril, asa o pipeta tipo Pasteur

para inocular la muestra en placas de- Agar sangre- Agar chocolate o HBA o HBAB- MacConkey o EMB

− Sembrar la muestra con asa de cultivo reaislando entres áreas

− Incubar las placas a 35-37ºC en CO2

− Examinar las placas a las 24 h− Incubarlas durante un tiempo adicional de 24 a 48 h

aunque exista crecimiento.− Para cultivo de Legionella consultar el PNT-LP-01

8. CONTROL DE CALIDAD− Verificar la fecha de caducidad de los medios a

utilizar, el color y el estado de deshidratación.− El control de esterilidad se realizará incubando a

35-37ºC durante 5 días una placa del medio decada nuevo lote que se inicie. En este control nose deberá observar crecimiento en el medio.

− El control del rendimiento o eficiencia del medio sedeberá realizar en cada nuevo lote fabricado en ellaboratorio. Para ello se pueden realizarsuspensiones en suero fisiológico o agua destiladade una turbidez 0,5 McFarland de la cepa dereferencia correspondiente. Los resultadosdeberán registrarse, y si no son correctos sedeberán llevar a cabo nuevos controles.

− Es recomendable la participación en controles decalidad externos para asegurar la calidad de losresultados.

9. INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOS

A) INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:- Para la interpretación de los cultivos de esputose utilizará como guía la información del morfotipobacteriano predominante observado en la tinciónde Gram, con el fin de seleccionar los aisladospotencialmente patógenos para posterioridentificación (según el protocolo del laboratorio) yrealización de las pruebas de sensibilidad.Interpretar con cautela el cultivo del esputo,incluso cuando sea de buena calidad.

- Tener presente que en ausencia de correlacióncon los resultados de la tinción de Gram de lamuestra, la mitad de la información que proporcionael cultivo del esputo conduce a una malainterpretación clínica.

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Procesamiento de las muestrasrespiratorias obtenidas por

procedimientos no invasivos Edición Nº 01 Página 4 de 5

- Se valorarán, identificarán e informarán losmicroorganismos no pertenecientes a lamicrobiota normal, como los aislados deStreptococcus pyogenes, estreptococos del grupo Ben neonatos, Bordetella (especialmente B.bronchiseptica), M. pneumoniae, C. pneumoniae,Legionella, Nocardia, Francisella tularensis, Bacillusanthracis, Cryptococcus neoformans y hongosfilamentosos (no considerados contaminantes).- Se identificarán e informarán losmicroorganismos pertenecientes a la microbiotade colonización cuyo morfotipo esté presente deforma predominante en la tinción de Gram de lamuestra y que crezcan en cantidades significativasen la segunda o en la tercera área de reaislamientode la placa, aunque no sean predominantes en elcultivo. En este grupo se incluyen los aislados de S.pneumoniae, aemophilus influenzae, Moraxellacatarrhalis, Pseudomonas aeruginosa,Stenotrophomonas maltophilia, Acinetobacter spp yBurkholderia, éstos últimos de particular interés enpacientes hospitalizados y en pacientes externoscon bronquiectasias.

- Igualmente, se identificarán e informarán losmicroorganismos con crecimiento en cantidadsignificativa y predominante en el cultivo,principalmente si se ha observado su morfotipo enla tinción de Gram de la muestra. En este grupo seincluyen S. aureus, estreptococos del grupo B enadultos, estreptococos beta-hemolíticos de losgrupos C o G, bacilos gramnegativos cuando crezcaun solo morfotipo (en especial Klebsiellapneumoniae), especies de Corynebacterium (ureapositiva o aisladas en pacientes intubados) yRhodococcus equi (en inmunodeprimidos).

- Además, se considerará el crecimiento de especiesbacterianas en pequeñas cantidades, siempre quecoincidan con el morfotipo bacterianopredominante observado en la tinción de Gram delesputo, así como también el crecimiento de coloniasen el primer cuadrante de la placa en cultivo puro oprácticamente puro.- Por el contrario, no se debe valorar ni informar:

• El crecimiento de más de un morfotipo de bacilosgramnegativos en el medio de MacConkey(Escherichia coli, Proteus spp, etc) y se debeinformar como “crecimiento de bacilosgramnegativos entéricos”.

• Tampoco se valorará ni informará el aislamientode Enterococcus spp, a menos que se aísle encultivo puro y con predominio del morfotipo en elGram).

• Las especies de levaduras no son causa deneumonía (colonizan habitualmente la cavidadbucal). No se valorarán, excepto cultivos puros omasivos en pacientes oncológicos,hematológicos, trasplantados de pulmón yneonatos, así como aislados de la especieCryptococcus neoformans.

• Aislados de especies de Haemophilusparainfluenzae.

• Aislados de Streptococcus beta-hemolíticos delgrupo F.

B) EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS:- Los resultados obtenidos se registrarán en losimpresos para tal efecto, así como en la base dedatos del programa de gestión del laboratorio.- Cuando la muestra de esputo se rechace paracultivo siguiendo los criterios de la tinción de Gram, esapropiado comunicar uno de los siguientesresultados:! “Muestra no apta para cultivo (se observan > 10

células epiteliales escamosas/campo de bajoaumento y <25 leucocitos/campo de bajoaumento. Muestra no procesada. Por favor,recoger nueva muestra si existe indicaciónclínica.”

! “No se observan bacterias después del exámencon objetivo de 1000X; el cultivo no se realiza.Contactar con el laboratorio si están indicadosclínicamente otros estudios.”

- En las muestras procesadas se informará elresultado de la tinción de Gram, indicando elmorfotipo predominante.! Si no se aísla ningún patógeno en el cultivo se

informará como “crecimiento de microbiotahabitual”.

! Si se aíslan microorganismos patógenos seinformará la especie identificada y los resultadosde las pruebas de sensibilidad.

10. RESPONSABILIDADESLas responsabilidades están descritas en el

manual general de organización del laboratorio yen los documentos de descripción de los puestos detrabajo.

El procedimiento deberá llevarse a cabo porpersonal técnico cualificado con un entrenamientoespecífico. La supervisión de la técnica y de losresultados emitidos deberá realizarla el facultativoespecialista responsable de la sección.

11. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO YLIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La tinción de Gram del esputo presenta unaescasa reproducibilidad, así como una granvariabilidad en la sensibilidad y especificidad condependencia de la calidad de la muestra y delentrenamiento del observador.

En la NAC, algunos agentes no crecen en elcultivo sistemático, aunque pueden ser causa deenfermedad.

Pueden obtenerse cultivos falsos negativosdebido a la contaminación con microbiota normalde la orofaringe o a tratamientos previos conantibióticos.

Pueden obtenerse cultivos falsos positivos porla valoración excesiva de los crecimientos en lasplacas.

En la neumonía nosocomial, la purulencia delesputo no es indicación específica de neumonía.

PNT- ITRI-01Servicio de MicrobiologíaHospital ....................................

Procesamiento de las muestrasrespiratorias obtenidas por

procedimientos no invasivos Edición Nº 01 Página 5 de 5

En situaciones de intubación o ventilaciónmecánica prolongada se produce una proliferaciónde leucocitos o la entidad clínica denominadatraqueobronquitis nosocomial, sin que existainfiltrado pulmonar.

El esputo no es una muestra adecuada para eldiagnóstico de la neumonía asociada a ventilaciónmecánica.

Para el diagnóstico de la neumonía nosocomial,los cultivos no cuantitativos del aspiradoendotraqueal tienen muy baja especificidad, con unaconcordancia de sólo el 40% respecto a los cultivosde biopsias pulmonares, por lo que con frecuenciaconducen a un error diagnóstico porsobrevaloración.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A, Bartlett JG,Campbell GD, Dean NC, Dowell SF, File TM Jr, MusherDM, Niederman MS, Torres A, Whitney CG. InfectiousDiseases Society of America/American Thoracic Societyconsensus guidelines on the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin Infect Dis 2007; 44(Suppl 2): S27-72.2. Mandell LA, TJ Marie, RF Grossman, AW Chow, RHHyland, and the Canadian Community-Acquired PneumoniaWorking Group. Canadian guidelines for the initialmanagement of community-adquired pneumonia: anevidence-based update by the Canadian InfectiousDiseases Society and the Canadian Thoracic Society. ClinInfect Dis 2000; 31: 383-421.3. Niederman MS, Mandell LA, Anzueto A, Bass JB,Broughton WA, Campbell GD, Dean N, File T, Fine MJ, GrossPA, Martínez F, Marie TJ, Plouffe JF, Ramírez J, Sarosi GA,Torres A, Wilson R, Yu L. Guidelines for management ofadults with community-acquired pneumonia. Diagnosis,assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention.Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:1730-1754.

PNT- ITRI-02CULTIVO CUANTITATIVO DEL LAVADO BRONCOALVEOLAR

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de ServicioNombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT- ITRI-02Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del lavado

broncoalveolar Edición Nº 01 Página 2 de 5

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del

cultivo cuantitativo de la muestra obtenida medianteel lavado broncoalveolar para el diagnóstico de lainfección pulmonar bacteriana. Describir otrosestudios microbiológicos para el diagnóstico de virus,hongos y parásitos.

2. FUNDAMENTOEl cultivo cuantitativo del lavado broncoalveolar

permite establecer el diagnóstico microbiológico de laneumonía.

El lavado broncoalveolar (LBA) es unprocedimiento invasivo que permite recoger materialalveolar mediante la instilación y aspiraciónsecuencial de suero salino estéril a través de unfibrobroncoscopio enclavado en la vía aérea. Elcultivo cuantitativo de la muestra obtenida aumentala eficacia diagnóstica en la neumonía asociada aventilación mecánica, en la que está particularmenteindicada su realización.

La aplicación de puntos de corte establecidos alos recuentos de los diferentes morfotipos decolonias obtenidos en los cultivos, permite ladiferenciación entre las bacterias de contaminaciónorofaríngea y las bacterias patógenas opotencialmente patógenas aisladas de la muestra.Recuentos de 10.000 (104) ufc/ml o superiores en losmedios de cultivo empleados se consideranindicadores de neumonía bacteriana. Teniendo encuenta el factor de dilución de la muestra, estenúmero de colonias significa que en la secreciónpulmonar estudiada hay entre 105 y 106 ufc/ml.Recuentos inferiores a 104 ufc/ml suelen indicarcontaminación por microbiota orofaríngea. El método habitual de cultivo es el de dilucionesseriadas de la muestra. Después de la incubación secuentan las colonias y su número se multiplica por elfactor de dilución empleado para determinar elnúmero de bacterias por mililitro de secreción.

Por la procedencia y el mayor volumen demuestra que se obtiene con la realización del LBA, elanálisis de esta muestra permite el diagnóstico demuchos microorganismos víricos, bacterianos,fúngicos y parasitarios a través de técnicas demicroscopía, cultivo, biología molecular, etc.

En los pacientes en los que no es posible realizarla broncoscopia (técnica no disponible,contraindicación) existe la posibilidad de realizar elmini-LBA ciego, procedimiento no broncoscópico,que permite la obtención de material alveolarmediante la introducción de diferentes catéteres(telescopados protegidos, Swan-Ganz). En esteprocedimiento se consideran significativos recuentosbacterianos entre 103 y 104 ufc/ml.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica.2000.

- Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de microbiología. 2003.

4. MUESTRALavado broncoalveolar obtenido porfibrobroncoscopia o mini-lavado por técnicaciega Se estima que el volumen de secrecionesrespiratorias obtenido es aproximadamente 1 mililitrodiluido en el líquido que se aspira (que es muyvariable, entre 10-100 mililitros), lo que viene asuponer un factor de dilución 1/10-1/100 de lassecreciones respiratorias originales. Se debe utilizarpara el transporte un contenedor de boca ancha ycon tapón de rosca. El primer líquido aspirado se descarta para elprocesamiento microbiológico, por su alto contenidoen células escamosas y ciliadas. Se pueden mezclarlas alícuotas obtenidas de la misma localizaciónpulmonar. El volumen mínimo aceptable para poderrealizar las pruebas más relevantes es de 10 ml. Sedebe repartir la muestra adecuadamente si ademásse requieren estudios citológicos, químicos, etc.previo consenso con el personal responsable de surealización. Conservar la muestra entre 2 y 8ºC hastasu procesamiento. Un retraso en el procesamientosuperior a 2 horas puede suponer pérdidas desensibilidad en el cultivo de determinadosmicroorganismos como Streptococcus pneumoniae yel sobrecrecimiento de microbiota orofaríngea.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS- Suero fisiológico estéril- Reactivos para tinciones bacterianas: Gram,Giemsa, Ziehl-Neelsen, auramina.- Reactivos para tinciones para hongos: metenaminade plata, calcofluor.- Reactivos de inmunofluorescencia y/o dehibridación in situ y/o anticuerpos monoclonales parala detección de diversos virus.- Reactivos para pruebas de biología molecular,como la PCR, para detectar bacterias, virus, etc.- Placas de cultivo de agar sangre, agar chocolate,agar de Sabouraud y agar BCYEα. Medios de cultivocelular (MDCR, MRC5, Hep2, LLCMK2) paraaislamiento de virus.

6. APARATOS Y MATERIALES- Incubador de 35ºC (+/-2ºC)- Incubador de CO2 5%- Incubador de 30ºC (+/-2ºC)- Microscopio óptico- Microscopio de fluorescencia- Microscopio invertido- Termociclador, aparatos y materiales para PCR- Citocentrífuga- Cámaras de muestra para la citocentrífuga- Filtros para la citocentrífuga- Portaobjetos- Pipetas calibradas de 0,1 ml y de 0,2 a 1 ml

PNT- ITRI-02Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del lavado

broncoalveolar Edición Nº 01 Página 3 de 5

- Puntas de pipeta estériles- Pipetas Pasteur estériles- Tubos estériles de 3 ml- Asas de cultivo estériles

7. PROCESAMIENTOLa muestra se debe procesar en una cabina deseguridad biológica.1. Agitar la muestra con suavidad parahomogeneizarla durante 30-60 segundos.2. Sembrar la muestra para cultivo bacterianocuantitativo mediante:

A) Método de las diluciones seriadas:1. Sembrar 100 microlitros de la muestra en

placas de agar sangre, agar chocolate, agarMacConkey, agar para Legionella y en agarSabouraud si se considera oportuno. Marcarlas placas “x10”. Cada colonia que se aísleequivale a 10 ufc/ml.

2. Pasar 100 microlitros de la muestra a un tuboque contenga 9,9 ml de suero fisiológicoestéril. Agitar en el vortex o agitador similar ysembrar 100 microlitros en placas de agarsangre y agar chocolate. Marcar las placas“x1000” Cada colonia que se aísle equivale a1000 ufc/ml.

3. Pasar 100 microlitros de la dilución anterior aun tubo que contenga 9,9 ml de suerofisiológico estéril. Agitar en el vortex y sembrar100 microlitros en placas de agar sangre ychocolate. Marcar las placas “x100.000”. Cadacolonia que se aísle equivale a 100.000 ufc/ml.

4. Las gotas inoculadas en las placas seextenderán por toda la superficie de la placacon una pipeta Pasteur doblada en ángulorecto o un asa de plástico.

5. Incubar las placas para el aislamientobacteriano a 35-37ºC en atmósfera de CO2 al5% durante 48 horas como mínimo,preferiblemente 72 horas. Las placas paraLegionella spp. deben incubarse en la mismaatmósfera de CO2 durante 10 días. El mediode Sabouraud se puede incubar durante 3semanas en estufa de 30ºC.

Alternativamente, se puede sembrar la muestramediante:

B) Método del asa calibrada:En este método se emplean asas con diferentescalibres con las que se siembran volúmenes demuestra que permiten obtener en las placas decultivo recuentos de colonias bacterianas que secorresponden con el número de colonias incluidoen los puntos de corte propuestos para este tipode muestras (104 ufc/ml para el lavadobroncoalveolar y 103 ufc/ml para el mini-lavadobroncoalveolar ciego). Para ello:1. Tomar la muestra con una asa calibrada de

10 microlitros y sembrar directamente enplacas de agar sangre, agar chocolate, agarMacConkey, (dilución 1/100). Marcar las

placas “x100”. Cada colonia que se aísleequivale a 100 ufc/ml.

2. Tomar la muestra con asa calibrada de 1microlitro y sembrar directamente en placas deagar sangre, chocolate y MacConkey, (dilución1/1000). Marcar las placas “x1000”. Cadacolonia que se aísle equivale a 1000 ufc/ml.

3. Opcionalmente, si se considera oportunosembrar 100 microlitros de la muestra enplacas de agar para Legionella y agarSabouraud. Cada colonia que se aísle equivalea 10 ufc/ml.

4. Las gotas inoculadas en las placas seextenderán por toda la superficie de la placacon una pipeta Pasteur doblada en ángulorecto o un asa de plástico.

5. Incubar las placas para el aislamientobacteriano a 35-37ºC en atmósfera de CO2 al5% durante 48 horas como mínimo,preferiblemente 72 horas. Las placas paraLegionella spp. deben incubarse en la mismaatmósfera de CO2 durante 10 días. El mediode Sabouraud se puede incubar durante 3semanas en estufa de 30ºC.

Preparación de las extensiones en unacitocentrífuga:

1. Calcular las preparaciones necesarias. Colocarlos portaobjetos con el filtro en la cámara demuestra y sujetar el conjunto con los clips de lacentrífuga. Colocar en la centrífuga.

2. Si la muestra no es hemática se pueden colocarde 300 a 500 microlitros en cada cámara. Si lamuestra contiene abundantes hematíes poner100 microlitros.

Con 10 x 104 células por mililitro, sin contarhematíes, se obtienen preparaciones de buenacalidad. Si se cuentan las células del lavado enun hemocitómetro como la cámara de Neubauerse puede calcular el volumen a centrifugar.

3. Centrifugar 15 minutos a 1.500 rpm.4. Terminada la centrifugación separar los

portaobjetos de las cámaras sin quitar el filtro ydejar secar a temperatura ambiente.

5. Proceder a las tinciones necesarias, entre ellasconsiderar:

• Gram• Giemsa• Auramina o Ziehl-Neelsen• Metenamina de plata• Calcofluor• Inmunofluorescencia para virus gripe A y B,

virus respiratorio sincitial (VRS), adenovirus,otros virus

• Inmunofluorescencia con anticuerposmonoclonales para CMV

Otros estudios:1. Cultivo de virus en líneas celulares MDCKJ,

MRC5, Hep2, LLCMK2 para aislamiento deCMV, herpes simple 1 y 2, enterovirus, virus de

PNT- ITRI-02Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del lavado

broncoalveolar Edición Nº 01 Página 4 de 5

la gripe A y B, adenovirus, VRS, y virusparainfluenza 1-3.

2. PCR para micobacterias, virus de la gripe A, By C, VRS A y B, adenovirus.

3. Ocasionalmente PCR para virus parainfluenza1-4, rinovirus, enterovirus, coronavirus.

8. INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOSCultivo cuantitativo:

Contar las colonias de la dilución en la que hayaun mayor número de colonias sin que confluyan.Multiplicar el número obtenido por el factor dedilución empleado en esa placa: por ejemplo, si secuentan 50 colonias en una placa marcada “x100”, elresultado será 5 x 103 ufc/ml. Contar cada morfotipode colonias diferentes de forma individual.

Los recuentos de 10.000 ó más ufc/ml de muestrade microorganismos potencialmente patógenos seconsideran indicadores de neumonía bacteriana.Recuentos inferiores a 10.000 ufc/ml suelencorresponder a contaminación orofaríngea.Recuentos superiores o inferiores pero demicroorganismos no potencialmente patógenos, sepueden informar como microbiota respiratoriahabitual sin comunicar el número de ufc/ml.

En la tinción de Giemsa se puede observar ladistribución porcentual de células de acuerdo a:macrófagos alveolares, leucocitos, linfocitos, célulasepiteliales escamosas y células epiteliales ciliadas.La fórmula celular normal es aproximadamente de80% de macrófagos, 15% de linfocitos, 4% deneutrófilos, y menos de 1% de eosinófilos ybasófilos, por lo que este recuento diferencial puedeorientar en la etiología, ya que en las infeccionesbacterianas el porcentaje de neutrófilos suele sersuperior al 50%, mientras que en las infeccionesvíricas o por Pneumocystis jiroveci suele ser inferioral 25%. También se debe valorar la presencia ycantidad de los hematíes, ya que si es abundanteenmascara la fórmula celular.

En cuanto a las células escamosas, se ha deinformar si se observan en proporción igual osuperior al 1% en las tinciones de Gram o Giemsa,como indicador de contaminación pormicroorganismos de colonizadores de vías altas.

Igualmente, se informará del porcentaje debacterias intracelulares si se observasen. Lapresencia de un 5% o más de organismosintracelulares es altamente sugestiva de neumonía.

La identificación bacteriana y las pruebas desensibilidad se harán por procedimientos habituales.En las bacterias cuyo recuento es inferior al punto decorte, no está indicada la realización de las pruebasde sensibilidad.

Se informará del resultado del resto de pruebas,tinciones y cultivos en medios específicos,añadiendo, si fuese necesario, la interpretación delmicrobiólogo.

9. RESPONSABILIDADESEl personal técnico será el responsable del

procesamiento de las muestras, de la realización delas técnicas y de la validación de los resultados enfunción de los controles. El facultativo especialistaserá responsable de la supervisión de las tareasmencionadas, de mantener al día los procedimientosde validación final de los resultados, de suinterpretación y de realizar el informe de los mismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene para la recogida y el procesamiento de lasmuestras. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOA pesar de establecer los puntos de corte para el

diagnóstico de neumonía bacteriana, en ocasioneses difícil interpretar el resultado cuando los recuentosestán cerca del punto de corte. Es necesario teneren cuenta la existencia de factores que pueden influiren la concentración de microorganismos en lasmuestras tales como:- La distribución irregular de los microorganismos enla secreción y errores en los volúmenes inoculados.- Retrasos en el transporte o procesamiento.- El factor de dilución. Se desconoce el efecto delvolumen del suero fisiológico instilado y delporcentaje recuperado sobre el recuento bacteriano.Cuando se obtienen volúmenes inferiores al 10% delsuero instilado (pacientes con EPOC) los resultadosno son representativos.- El tratamiento antibiótico. Sobre todo el instauradoo modificado en las 24 a 48 horas previas a la tomade la muestra, puede disminuir o negativizar elcrecimiento.- El tiempo de evolución de la neumonía. En losestadíos iniciales de la enfermedad puedenobtenerse recuentos inferiores al punto de corte.- En otras ocasiones, se obtienen recuentosbacterianos altos pero sin acompañarse de loscambios inflamatorios, como ocurre e los pacientescon EPOC.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Álvarez-Lerma F. Torres A, Rodríguez de Castro F.

Comisión de Expertos del Grupo de Trabajo deEnfermedades Infecciosas de la Sociedad Española deMedicina Intensiva, Crítica y Unidades Coronarias(GTEI-SEMICYUC). Área de Trabajo de Tuberculosis eInfecciones Respiratorias de la Sociedad Española dePatología del Aparato Respiratorio (SEPAR), Grupo deEstudio de Infección Hospitalaria de la SociedadEspañola de Enfermedades Infecciosas y MicrobiologíaClínica (GEIH-SEIMC). Recomendaciones para eldiagnóstico de la neumonía asociada a la ventilaciónmecánica. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2001;19:479-487.

PNT- ITRI-02Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del lavado

broncoalveolar Edición Nº 01 Página 5 de 5

2. Baselski VS, Wunderink RG. Bronchoscopic diagnosisof pneumonia. Clin Microbiol Rev 1994; 7: 533-558.

3. Isenberg HD. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. Second Edition. American Society forMicrobiolgy 2004. Washington DC.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-ITRI-03CULTIVO CUANTITATIVO DEL CEPILLO BRONQUIAL PROTEGIDO

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

Nombre/Firma Fecha Nombre/Firma Fecha

EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

COPIA REGISTRADA Nº..........ASIGNADA A.....................................................................................

Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

PNT- ITRI-03Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del cepillo bronquial

protegidoEdición Nº 01 Página 2 de 4

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología para la realización del

cultivo cuantitativo de la muestra obtenida medianteel cepillo bronquial protegido para el diagnóstico dela infección pulmonar bacteriana.

2. FUNDAMENTOEl cultivo cuantitativo de la muestra obtenida

mediante el cepillo bronquial protegido se utiliza enel diagnóstico de la neumonía bacteriana. El cultivocuantitativo aumenta la eficacia diagnóstica.Recuentos de 103 ufc/ml o superiores en los mediosde cultivo empleados se consideran indicadores deneumonía bacteriana. Teniendo en cuenta el factorde dilución este número de colonias representa queen la secreción pulmonar estudiada hay entre 105 a106 ufc/ml. Recuentos inferiores a 103 ufc/ml suelenindicar microbiota orofaríngea contaminante.

El método habitual de cultivo es el de dilucionesseriadas de la muestra. Tras la incubación del cultivose realiza un recuento de las colonias y su númerose multiplica por el factor de dilución empleado paradeterminar el número de bacterias por mililitro desecreción.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica.2000.- Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de microbiología. 2003.

4. MUESTRACepillado bronquial protegido obtenido porfibrobroncoscopia.

Una vez obtenida la muestra el cepillo se corta encondiciones estériles y se introduce en un recipienteestéril que contiene un mililitro de suero fisiológicoestéril.Conservar la muestra entre 2 y 8ºC hasta suprocesamiento. Un retraso en el procesamientosuperior a 2 horas puede suponer pérdidas desensibilidad en el cultivo de determinadosmicroorganismos como Streptococcus pneumoniae ysobrecrecimiento de microbiota orofaríngea.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS- Suero fisiológico estéril- Reactivos para la tinción de Gram, Giemsa y Ziehl-Neelsen, auramina, etc- Placas de cultivo de agar sangre, agar chocolate,agar para anaerobios, agar de Sabouraud y agarBCYEα.

6. APARATOS Y MATERIALES- Portaobjetos- Pipetas calibradas de 0,1 ml y de 0,2 a 1 ml- Puntas de pipeta estériles- Pipetas Pasteur estériles- Tubos estériles de 3 ml

- Sistema de incubación en anaerobiosis- Incubador de 35ºC (+/-2ºC)- Incubador de CO2 5%- Incubador de 30ºC (+/-2ºC)- Asas de cultivo estériles

7. PROCESAMIENTOLa muestra se debe procesar en una cabina deseguridad biológica.1. Agitar el tubo que contiene la muestra durante 1minuto, aproximadamente, en un agitador vortex osimilar hasta desprender el material adherido alcepillo.2. Sembrar la muestra para cultivo bacterianocuantitativo mediante:A) Método de las diluciones seriadas:

1. Sembrar 100 microlitros de la muestra en placasde agar sangre, agar chocolate, agar paraanaerobios. Sembrar en agar BCYEα y en agarSabouraud si se considera oportuno. Marcar lasplacas “x10”. Cada colonia que se aísle equivalea 10 ufc/ml.

2. Pasar 100 microlitros de la muestra a un tuboque contenga 9,9 ml de suero fisiológico estéril.Agitar en el vortex o agitador similar y sembrar100 microlitros en placas de agar sangre y agarchocolate. Marcar las placas “x1000”. Cadacolonia que se aísle equivale a 1000 ufc/ml.

3. Pasar 100 microlitros de la dilución anterior a untubo que contenga 9,9 ml de suero fisiológicoestéril. Agitar en el vortex y sembrar 100microlitros en placas de agar sangre y agarchocolate. Marcar las placas “x100.000”. Cadacolonia que se aísle equivale a 100.000 ufc/ml.

4. Las gotas inoculadas en las placas seextenderán por toda la superficie de la placa conuna pipeta Pasteur doblada en ángulo recto ocon un asa de plástico.

5. Incubar las placas para el aislamiento bacterianoa 35º- 37ºC en atmósfera de CO2 al 5% durante48 horas como mínimo, preferiblemente 72horas. Las placas para Legionella spp. debenincubarse en la misma atmósfera de CO2 durante10 días. El medio de Sabouraud se puedeincubar durante 3 semanas en estufa de 30ºC.

Alternativamente, se puede sembrar la muestramediante:B) Método del asa calibrada:En este método se emplean asas con diferentescalibres con las que se siembran volúmenes demuestra que permiten obtener en las placas decultivo recuentos de colonias bacterianas que secorresponden con el número de colonias incluidos enlos puntos de corte propuestos para este tipo demuestras (103 ufc/ml para el cepillo bronquialprotegido). Se procederá como se indica acontinuación:

1. Tomar la muestra con una asa calibrada de 100microlitros y sembrar directamente en placas deagar sangre, agar chocolate y agar MacConkey.

PNT- ITRI-03Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del cepillo bronquial

protegidoEdición Nº 01 Página 3 de 4

Sembrar en agar BCYEα y en agar Sabouraud sise considera oportuno. Marcar las placas “x10”.Cada colonia que se aísle equivale a 10 ufc/ml.

2. Tomar la muestra con una asa calibrada de 10microlitros y sembrar directamente en placas deagar sangre, agar chocolate y agar MacConkey.Marcar las placas “x100”. Cada colonia que seaísle equivale a 100 ufc/ml.

3. Las gotas inoculadas en las placas seextenderán por toda la superficie de la placa conuna pipeta Pasteur doblada en ángulo recto ocon un asa de plástico.

4. Incubar las placas para el aislamiento bacterianoa 35º-37ºC en atmósfera de CO2 al 5% durante48 horas como mínimo, preferiblemente 72horas. Las placas para Legionella spp. debenincubarse en la misma atmósfera de CO2 durante10 días. El medio de Sabouraud se puedeincubar durante 3 semanas en estufa de 30ºC.

5. De la muestra restante se deposita una gota enun portaobjetos para hacer una tinción de Gram.Utilizar otros portaobjetos para la tinción deZiehl-Neelsen u otras si se consideraconveniente. Las extensiones también puedenprepararse utilizando 100 microlitros en unacitocentrífuga y centrifugando a 1.500 rpmdurante 15 minutos.

6. Incubar las placas para el aislamiento bacterianoa 35-37ºC en atmósfera de CO2 al 5% durante48 horas como mínimo, preferiblemente 72horas. La placa para cultivo de anaerobios seincubará en atmósfera de anaerobiosis duranteel mismo tiempo. Las placas de BCYEα paracultivo de Legionella spp. deben incubarse en lamisma atmósfera de CO2 durante 10 días.

7. El medio de Sabouraud se puede incubardurante 3 semanas en estufa de 30ºC.

8. INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOS

Realizar un recuento de las colonias de la diluciónen la que haya un mayor número de colonias sin queconfluyan. Multiplicar su número por el factor dedilución empleado en esa placa: por ejemplo sicontamos 50 colonias en una placa marcada “x100”el resultado será 5 x 103 ufc/ml.

Realizar un recuento de cada tipo de coloniasdiferentes de forma individual.

Recuentos de 1.000 ufc/ml o superiores demicroorganismos potencialmente patógenos en losmedios de cultivo empleados se consideranindicadores de neumonía bacteriana. Recuentosinferiores a 1.000 ufc/ml suelen corresponder acontaminación orofaríngea. Recuentos superiorespero de microorganismos no potencialmentepatógenos se pueden considerar como microbiotarespiratoria habitual.

En los resultados de la prueba se comunicará elnúmero de colonias de cada bacteria en ufc pormililitro. Recuentos superiores o inferiores demicroorganismos no potencialmente patógenos se

pueden informar como microbiota respiratoriahabitual sin comunicar el número de ufc/ml.

Si se controla la calidad de la muestra medianteuna tinción de Gram de una extensión realizadamediante previa citocentrifugación y se observanmenos de 10 neutrófilos por campo de 1.000aumentos conviene comunicar a través de uncomentario que es una muestra de mala calidad.

La identificación de los microorganismos aisladosy la determinación de su sensibilidad aantimicrobianos se realizarán siguiendo losprocedimientos habituales. Si el resultado es inferioral punto de corte la identificación y el antibiogramano suelen estar indicados.

9. RESPONSABILIDADESEl personal técnico será el responsable del

procesamiento de las muestras, de la realización delas técnicas y de la validación de los resultados enfunción de los controles. El facultativo especialistaserá responsable de la supervisión de las tareasmencionadas, de mantener al día los procedimientosde validación final de los resultados, de suinterpretación y del realizar el informe de los mismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOTodo el personal del laboratorio de microbiología

deberá conocer las normas generales de seguridad ehigiene. Estas recomendaciones deberán estarrecogidas en un documento establecido por ellaboratorio de Microbiología.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOEl cultivo del cepillo bronquial protegido como

método para el diagnóstico microbiológico de laneumonía asociada a ventilación mecánica es másespecífico que sensible. Cuando el resultado espositivo aumenta la probabilidad del diagnóstico deneumonía.

En ocasiones es difícil interpretar el resultadocuando los recuentos están cerca del punto de cortepues hay factores que influyen, como la distribuciónirregular de los microorganismos en la secreción yque la agitación en el vortex no consiguehomogeneizar, errores en los volúmenes sembrados,escasa cantidad de muestra obtenida, retrasos en eltransporte o procesamiento, etc.

Puede ocurrir que no todos los microorganismospatógenos implicados crezcan en los mediosempleados. Un ejemplo son algunas bacteriasanaerobias, cuyo crecimiento puede verse afectadopor la aireación en los procesos de dilución de lamuestra, por lo que pueden obtenerse resultadosfalsamente negativos.

Es sabido que el tratamiento antibiótico, sobretodo el instaurado o modificado en las 24 a 48 horasprevias a la toma de la muestra, puede disminuir onegativizar el crecimiento. También se ha observadoque pueden obtenerse recuentos inferiores al puntode corte en estadíos iniciales de la neumonía.

PNT- ITRI-03Servicio de MicrobiologíaHospital .................................... Cultivo cuantitativo del cepillo bronquial

protegidoEdición Nº 01 Página 4 de 4

12. BIBLIOGRAFÍA1. Álvarez-Lerma F. Torres A, Rodríguez de Castro F.Comisión de Expertos del Grupo de Trabajo deEnfermedades Infecciosas de la Sociedad Española deMedicina Intensiva, Crítica y Unidades Coronarias (GTEI-SEMICYUC). Área de Trabajo de Tuberculosis eInfecciones Respiratorias de la Sociedad Española dePatología del Aparato Respiratorio (SEPAR), Grupo deEstudio de Infección Hospitalaria de la Sociedad Españolade Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica(GEIH-SEIMC). Recomendaciones para el diagnóstico dela neumonía asociada a la ventilación mecánica. EnfermInfecc Microbiol Clin. 2001;19:479-487.2. Baselski VS, Wunderink RG. Bronchoscopic diagnosis ofpneumonia. Clin Microbiol Rev 1994; 7: 533-558.3. Isenberg HD. Clinical Microbiology ProceduresHandbook. Second Edition. American Society forMicrobiolgy 2004. Washington DC.

PNT- ITRI-04PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PARA CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE

Bordetella spp.

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

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EDICIÓN FECHA ALCANCE DE LAS MODIFICACIONES

01 Edición inicial

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Este documento es propiedad del Servicio de Microbiología Clínica del Hospital…………….. La información en élcontenida no podrá reproducirse total ni parcialmente sin autorización escrita del Responsable. Las copias noregistradas no se mantienen actualizadas a sus destinatarios.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT- ITRI-04Servicio de MicrobiologíaHospital ....................................

Procesamiento de muestras para cultivoe identificación de

Bordetella spp.Edición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEDefinir la metodología del procesamiento de

muestras para el cultivo de Bordetella spp. y suidentificación.

2. FUNDAMENTOBordetella pertussis y Bordetella parapertussis

son bacilos gramnegativos que se aíslan de víasrespiratorias superiores. B. pertussis es la especiecausante de la tos ferina y B. parapertussis, menosfrecuente, es causante de un cuadro similar a la tosferina y que se aisla únicamente de forma ocasional.B. bronchiseptica, especie rara en humanos, produceun cuadro respiratorio crónico que afecta de formaespecial a pacientes inmunodepremidos.

B. pertussis requiere medios específicos para sucultivo, en los que crece con lentitud. El medio decultivo selectivo que actualmente se utiliza es el deRegan-Lowe, modificación del de Bordet-Gengou alque ha sustituido. B. parapertussis y B.bronchiseptica crecen en agar sangre.

El diagnóstico clínico puede ser difícil, pues la toscaracterística suele aparecer a partir de las 3semanas de enfermedad y el resto de lasintomatología es inespecífica. En lactantes ydurante los primeros años de vida la enfermedadpuede ser grave.

El tratamiento precoz disminuye las posibilidadesde evolución a formas graves y reduce la transmisióny contagio a otros pacientes. Por tanto es importanterealizar el diagnóstico microbiológico lo másrápidamente posible.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica.2000.- Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de microbiología. 2003.

4. MUESTRAObtener la muestra lo antes posible desde la

aparición de los síntomas. Se consiguenaislamientos hasta 4 semanas después del inicio dela sintomatología, siempre que los pacientes nohayan recibido tratamiento antibiótico, aunque elporcentaje de positividad disminuye con el tiempo.Se debe obtener la muestra mediante:

a) Frotis de la nasofaringe posterior realizado conescobillón de alambre flexible y curvado que seintroduce a través de ambas fosas nasales.

b) Lavado nasofaríngeo con instilación mediantejeringa de 3-5 ml de solución salina y posterioraspiración, advirtiendo al paciente que no traguedurante la toma. Los lavados pernasales debenrecogerse en un recipiente estéril.

El aspirado nasofaríngeo es la técnica con la quese obtiene el mayor rendimiento (debido alrecubrimiento de la nasofaringe por células de

epitelio ciliado a las que B. pertussis se adhiereespecíficamente).

No son aceptables como muestra los frotis nasales,los frotis faríngeos, los esputos o la antigua “placa detos”. Los escobillones de algodón pueden inhibir elcrecimiento del microorganismo, por lo que sedesaconseja su uso. Es necesaria la utilización deescobillones de otros materiales adecuados, comoalginato cálcico o de fibras de dacrón.

Dada la labilidad de B. pertussis, es importanteproceder sin demora a la siembra inmediata de lamuestra después de su obtención (lo ideal, al ladodel enfermo) en los medios de cultivo. Si esto nofuera posible, los escobillones nasofaríngeos debeninocularse inmediatamente en medio de transporteAmies con carbón para su traslado al laboratorio(hasta 24 horas). Al recipiente con el lavadonasofaríngeo se le debe añadir una solución dehidrolizado de caseína al 1% (Casamino acids).

Si el transporte se demora o la siembra no sepuede realizar con rapidez las muestras deberánmantenerse refrigeradas.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS- Medio de cultivo Regan-Lowe (agar carbón),cefalexina 0,04 g/L y 10% de sangre de carnerodesfibrinada).- Medio de cultivo de agar sangre- Medio de cultivo de MacConkey- Reactivo de catalasa- Reactivo de oxidasa- Reactivo de urea- Antisuero para aglutinación de B. pertussis- Anticuerpos para fluorescencia directa

6. APARATOS Y MATERIALES- Incubador de 35ºC- Asas estériles de siembra- Cámara húmeda

7. PROCESAMIENTOCultivo:

1. Inocular la muestra en un tercio de la placa deRegan-Lowe

2. Sembrar con reaislamiento en 4 cuadrantes portoda la placa con un asa de cultivo para obtenercolonias aisladas.

3. Sembrar una placa de agar sangre paracomparar el crecimiento con el medio de Regan-Lowe.

Incubación:1. Colocar las placas en una cámara húmeda o en

una bolsa de plástico que contengan agua opapel de filtro humedecido, pues B. pertussis esmuy sensible a la desecación. No requiereatmósfera de CO2.

2. Incubar las placas a 35ºC en atmósferaaeróbica. El control de la temperatura esimportante pues algunas cepas de B. pertussisno crecen a temperaturas más altas.

PNT- ITRI-04Servicio de MicrobiologíaHospital ....................................

Procesamiento de muestras para cultivoe identificación de

Bordetella spp.Edición Nº 01 Página 3 de 3

Incubar las placas un mínimo de 5 días. Esteperiodo de tiempo permite detectar la granmayoría de los aislamientos. Mantener laincubación un máximo de 12 días. La mayoríade las colonias se detectan macroscópicamentea los 3-4 días.

Control de crecimiento:1. Examinar las placas de Regan-Lowe a las 72

horas y diariamente hasta su descarte. En casode examinar las placas durante los primeros 2-3días puede ser necesaria la utilización de unalupa para detectar las colonias.

2. A partir de las 72 horas se pueden observancolonias pequeñas, abovedadas, de superficielisa y brillante, de color grisáceo y aspectoperlado que no crecen en la placa de agarsangre.

3. En la tinción de Gram se observan cocobaciloso bacilos finos y cortos gramnegativos.

4. Realizar las pruebas de catalasa y oxidasa: B.pertussis es catalasa y oxidasa positivas, B.parapertussis es catalasa positiva, oxidasanegativa y urea positiva.

5. Confirmar la identificación mediante la pruebade aglutinación en portaobjetos con antisuerosde B. pertussis, o mediante una reacción defluorescencia directa.

6. B. bronchiseptica crece en 2 ó 3 días en agarsangre donde muestra hemólisis, y en agarMacConkey. Muestra reacciones positivas a ladeterminación de catalasa, oxidasa y urea y,además, es móvil.

Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos:No son necesarias y no están estandarizadas.

Aunque B. pertussis es siempre sensible a laeritromocina (tratamiento de elección), se hacomunicado la existencia de algunas cepasresistentes, por lo que estarían indicadas las pruebasde sensibilidad a antimicrobianos en caso de fracasoterapéutico.

8. INTERPRETACIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOS

El aislamiento de B. pertussis y B. parapertussises siempre significativo y por lo tanto se debeinformar con prontitud.

Los enfermos sintomáticos en los que se aísle B.pertussis tienen tosferina por definición y deben seraislados.

Si se aísla en personas sin síntomas se consideraque son portadores y también deben ser tratados.

9. RESPONSABILIDADESEl personal técnico será el responsable del

procesamiento de las muestras, de la realización delas técnicas y de la validación de los resultados enfunción de los controles. El facultativo especialistaserá responsable de la supervisión de las tareasmencionadas, de mantener al día los procedimientosde validación final de los resultados, de suinterpretación y del informe de los mismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO Todo el personal del laboratorio demicrobiología deberá conocer las normas generalesde seguridad e higiene. Estas recomendacionesdeberán estar recogidas en un documentoestablecido por el laboratorio de Microbiología.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOSe han descrito reacciones cruzadas de

Legionella spp., que puede crecer en el medio deRegan-Lowe, con el antisuero de B. pertussis.

El tratamiento antibiótico puede inhibir elcrecimiento en el cultivo y dar como resultado unfalso negativo.

Las muestras recogidas con escobillones dealgodón o rayón pueden dar resultados falsosnegativos por inhibición del crecimiento debido a losácidos grasos que contienen.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Isenberg HD. Clinical Microbiology Procedures

Handbook. Second Edition. American Society forMicrobiolgy 2004. Washington DC.

2. Murray PR, E. Baron EJ, Joergensen JH, Pfaller MA,and Yolken RH, ed. Manual of Clinical Microbiology. 8th

ed. 2003. American Society for Microbiology.Washington, DC.

PNT-ITRI-05TÉCNICA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE Streptococcus pneumoniae EN ORINA

PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES RESPIRATORIAS

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

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DOCUMENTO TÉCNICO

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Técnica rápida para la detección deantígeno de S. pneumoniae en orina para eldiagnóstico de las infecciones respiratorias Edición 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este procedimiento es describir una

técnica rápida de inmunocromatografía (ICT) para ladetección del antígeno de Streptococcus pneumoniaeen la orina de pacientes con neumonía.

2. FUNDAMENTODurante el transcurso de la infección respiratoria

por S. pneumoniae se pueden detectar losantígenos neumocócicos en el suero y en la orina.La utilización de la orina tiene algunas ventajas, yaque su recogida es más fácil y constituye un mejorreservorio de antígenos bacterianos.

Igualmente, en el curso de la meningitis por S.pneumoniae también pueden detectarse losantígenos neumocócicos en el líquidocefalorraquídeo (LCR).

La técnica consiste en una ICT que se realizasobre una membrana de nitrocelulosa conanticuerpos de conejo anti-S. pneumoniaeadsorbidos y conjugados. La unión de losanticuerpos con los antígenos neumocócicossolubles en la orina y LCR forma complejosantigeno-conjugado que son capturados por losanticuerpos anti-S. pneumoniae inmovilizadosformando partículas visibles sobre un soportefibroso inerte, que se manifiestan como una bandade color rosa-púrpura. Actualmente se dispone deuna técnica de ICT comercializada (Binax NOWpara S. pneumoniae) que detecta en muestras deorina y LCR el polisacárido C (PnC) soluble, quees común para todos los serotipos de S.pneumoniae.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.

Seguridad en el laboratorio de microbiologíaclínica. 2000.

- Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general delas muestras en el laboratorio de microbiología.2003.

- Procedimiento en Microbiología nº 19 de la SEIMC.Técnicas rápidas de detección de antígeno. 2005.

- Manual de instrucciones para la realización de latécnica incluido en equipo comercial.

4. TIPOS DE MUESTRASPara el diagnóstico de neumonía por S. pneumoniae la

orina es la muestra requerida para la detección delantígeno de S. pneumoniae. No obstante, también sepuede utilizar el líquido pleural cuando se disponga deesta muestra. En los casos de sospecha de meningitispor S. pneumoniae se utilizará el líquidocefalorraquídeo.

4.1.RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE LAMUESTRAEn el procedimiento SEIMC 1a. Recogida, transportey procesamiento general de muestras en ellaboratorio de microbiología (2003) se indican lasdirectrices principales de la recogida y conservaciónde las muestras (PNT-RTP-01).

4.2. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA DE ORINAPara la detección del antígeno de S. pneumoniae enorina con la técnica de ICT no se recomienda utilizartécnicas de concentración, debido a que puedenaumentar los resultados positivos de difícilinterpretación. Se aconseja realizar la técnica con orinadirecta sin concentrar y recién emitida. En caso de norealizarse la prueba dentro de las 24 horas de larecolección de la muestra, ésta debe conservarse ennevera (2-8ºC).

5. REACTIVOSLos reactivos específicos incluidos y descritos enlos equipos comercializados consisten en:- Dispositivos para la prueba en forma de libro, queincluyen una membrana recubierta con anticuerposde conejo específicos para el antígeno de S.pneumoniae contenido en la muestra y un anticuerpocontrol que se combina con el antígeno de conejoanti-S. pneumoniae, así como los conjugados anti-especies.- Reactivo A. Mezcla tamponada con detergente yconservante.- Torundas diseñadas para la toma de las muestras.- Torunda de control positivo. Impregnada con orinacon antígeno de S. pneumoniae.- Torunda de control negativo. Impregnada con orinasin antígeno de S. pneumoniae.

6. APARATOS Y MATERIALNo es necesario equipamiento especial para estatécnica, excepto cronómetro o reloj con segundero.

7. PROCEDIMIENTOEl procedimiento concreto de esta técnica seencuentra debidamente descrito en la documentaciónde cada equipo comercial. Brevemente consiste en:

1. Llevar la muestra de orina y los reactivos decontrol a temperatura ambiente.

2. Agitar la muestra con suavidad parahomogeneizar.

3. Retirar el dispositivo en forma de libro quecontiene la membrana fuera de la bolsa ydepositarlo sobre una superficie plana.

4. Mojar la torunda incluida en el equipo en lamuestra.

5. Insertar la torunda en el orificio inferior del panelderecho del dispositivo y empujar hacia arribahasta que la punta de la torunda se vea en elorificio superior.

6. Añadir tres gotas del reactivo A sobre el orificioinferior manteniendo el envase vertical y a unadistancia entre 1,50 y 2,50 cm.

7. Quitar la cobertura adhesiva del borde derechodel dispositivo y cerrar el dispositivo.

Leer el resultado en la ventana a los 15 minutos.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOSA) Resultado Negativo: aparición de una únicabanda de color rosa-púrpura en la parte superior dela membrana que corresponde al control.

PNT ITRI-05Servicio de MicrobiologíaHospital.......................

Técnica rápida para la detección deantígeno de S. pneumoniae en orina para eldiagnóstico de las infecciones respiratorias Edición 01 Página 3 de 3

B) Resultado Positivo: aparición de una segundabanda de color rosa púrpura (que corresponde a lamuestra) en las ventanas. Toda banda visible espositiva. Las muestras con bajo contenido deantígeno pueden dar un color más tenue.

Un ensayo no tiene validez si no se observa ningunabanda o si sólo se observa la de la línea de muestra.Control de calidad:Esta prueba comercializada contiene controles deprocedimiento positivos y negativos incorporados.- La línea rosa a violeta en la posición “Control” seconsidera control interno de procedimiento positivo.La línea aparecerá en todos los casos.- La desaparición del color del fondo en la ventanade resultados se considera control interno deprocedimiento negativo.

El equipo contiene torundas de control positivo ynegativo para realizar controles externos de laprueba. Se recomienda realizarlos una vez con cadaequipo que se abra y según los procedimientosestándar de control de calidad del laboratorio.La participación en controles de calidad externos esrecomendable para asegurar la calidad de losresultados.

9. RESPONSABILIDADESEl personal técnico de la sección será el

responsable de revisar las solicitudes estudiando laidoneidad de la muestra remitida con la determinaciónsolicitada, del tratamiento de las muestras, de larealización de las técnicas y de la validación de losresultados en función de los resultados de loscontroles. El facultativo especialista responsable dela sección, además de la supervisión de las tareascitadas, será responsable de mantener al día losprocedimientos, de la validación final de losresultados, de su interpretación y de realizar elinforme de los mismos.

El personal de la sección de detección deantígenos debe conocer las ventajas y limitacionesde las técnicas rápidas, así como el fundamento detodas las técnicas y del funcionamiento de los aparatos.Además, debe trabajar en condiciones de máximaseguridad personal y ambiental, realizando unaadecuada segregación de los residuos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOLa técnica de inmunocromatografía sobre

membrana ofrece ventajas frente a otras técnicas dedetección de antígenos solubles en orina, como lacontrainmunoelectroforesis (CIE), como son:- Mayor rapidez al obtener resultados en 15 minutos.- Menor complejidad.- Menor equipamiento- Detectar todos los serotipos, incluidos los serotipos7 y 14, que no son detectables por CIE .

La técnica de ICT se utiliza con mayorfrecuencia en los laboratorios clínicos que la CIE.

La sensibilidad y especificidad de la técnicainmunocromatográfica para detectar el antígeno deS. pneumoniae en la orina de los adultos varía

dependiendo de los estudios. En la mayoría deellos se obtienen sensibilidades aproximadas del70% y especificidades del 90%. Aunque es unatécnica útil para orientar el diagnóstico etiológicode la neumonía adquirida en la comunidad, lainterpretación debe realizarse con cautela. En losniños, la sensibilidad y especificidad disminuye,al ser, con frecuencia, portadores de estemicroorganismo, por lo que algunos autores noaconsejan su utilización sistemática. Losresultados negativos podrían interpretarse comoausencia de neumonía neumocócica, pero lospositivos son difíciles de interpretar.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLas limitaciones que se deben conocer para

realizar una buena interpretación de los resultadosson las siguientes:- La antigenuria se puede detectar al inicio de lossíntomas y hasta un mes más tarde. Incluso enalgunos casos la duración de excreción delantígeno es mayor.- En adultos la sensibilidad es de aproximadamente70%.- En pacientes con EPOC sin exacerbaciones puededetectarse antígeno neumocócico en orina.- En niños la especificidad disminuye, posiblementepor la eliminación del antígeno en orina de niñosportadores de S. pneumoniae en orofaringe,especialmente en niños menores de 2 años.- La vacuna frente a S. pneumoniae puede producirresultados falsos positivos dentro de los 5 díassiguientes a la vacunación.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Andreu F, Domínguez J, Ruiz J, et al. Impact of rapid

urine antigen tests to determine the etiology ofcommunity-acquired pneumonia in adults. Respir Med2006; 100: 884-891.

2. Charkaluk ML, Kalach N, Mvogo H, et al. A.Assesment of a rapid urinary antigen detection by animmunochromatographic test for diagnosis ofpneumococcal infection in children. Diagn MicrobiolInfect Dis 2006; 55: 89-94.

3. Coonrod JD. Urine as an antigen reservoir for diagnosisof infectious diseases. Am J Med 1983; 75: 85-92.

4. Ishida T, Hashimoto T, Arita M, Tojo Y, Tachibana H,Jinnai M. a 3-year prospective study of a urinaryantigen-detection test for Streptococcus pneumoniae incommunity-acquired pneumonia: utility and clinicalimpact on the reported etiology. J Infect Chemother2004; 10: 359-363.

5. Lasocki S, Scanvic A, Le Turdu F, et al. Evaluation ofBinax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigenassay in intensive car patients hospitalized forpneumonia. Intensive Care Med 2006; 32:1766-1772.

6. Navarro D, García-Maset L, Gimeno C, Escribano A,García-de-Lomas J, Spanish pneumococcal infectionstudy network. Performance of the Binax NOWStreptococcus pneumoniae urinary antigen assay fordiagnosis of pneumonia in children with underlyingpulmonary diseases in the absence of acutepneumococcal inection. J Clin Microbiol 2004 42: 4853-4855.

PNT-ITRI-06ANTIBIOGRAMA POR Etest DIRECTO EN MUESTRAS RESPIRATORIAS DE PACIENTES

CON NEUMONÍA ASOCIADA A VENTILACIÓN MECÁNICA

ELABORADO REVISADO Y APROBADO

Jefe de Servicio

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Antibiograma por Etest directo en muestrasrespiratorias de pacientes con neumonía

asociada a ventilación mecánicaEdición Nº 01 Página 2 de 3

1. PROPÓSITO Y ALCANCEEl propósito de este PNT es la descripción del

procedimiento para la realización de un antibiogramadirecto mediante el método de Etest en muestrasrespiratorias [aspirado traqueal, broncoaspirado,secreciones bronquiales, lavado broncoalveolar (LBA),cepillo telescopado] de pacientes con neumoníaasociada a ventilación mecánica.

2. FUNDAMENTO El diagnóstico precoz de neumonía en el pacientesometido a ventilación mecánica, así como ladeterminación rápida de la sensibilidad aantimicrobianos de los microorganismos aislados enmuestras respiratorias es esencial para iniciar untratamiento antimicrobiano adecuado de un modoprecoz, acortando el tiempo de hospitalización yreduciendo el consumo de antimicrobianos. Si bien elaislamiento del microorganismo patógeno seguido de larealización del antibiograma correspondiente es elprocedimiento de referencia y permite obtener unosresultados precisos y altamente reproducibles, éstos noestán disponibles hasta 2 ó 3 días después de la tomade muestra, en el mejor de los casos, limitandoenormemente el impacto positivo de la terapia dirigida,particularmente en las infecciones graves de rápidaevolución. Es por tanto deseable disponer en estoscasos de técnicas que permitan conocer el perfil desensibilidad a antibióticos en las primeras 24 h. En estesentido, según estudios recientes, la realización de unantibiograma por Etest directamente de las muestrasrespiratorias de los pacientes con neumonía asociada aventilación mecánica ofrece resultados en 18-24 hprácticamente concordantes en su totalidad con elantibiograma convencional.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA- Procedimiento en Microbiología nº 10 de la SEIMC.Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica.2000.- Procedimiento en Microbiología nº 1a de la SEIMC.Recogida, transporte y procesamiento general de lasmuestras en el laboratorio de microbiología. 2003.- PNT-ITRI-01 de procesamiento de muestrasrespiratorias incluido en este procedimiento.- Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007.Performance Standards for Antimicrobial SusceptibilityTesting; 17th Informational Supplement. DocumentoM100-S17. Vol 26 No. 6. CLSI Wayne, Pennsylvania.

4. MUESTRAS4.1. TIPO DE MUESTRA.Broncoaspirado, aspirado traqueal, secrecionesbronquiales, cepillo telescopado y LBA obtenidos depacientes sometidos a ventilación mecánica.

4.2. RECOGIDA DE LA MUESTRA, RECIPIENTES,CONSERVACIÓN, CRITERIOS DE ACEPTACIÓN YRECHAZO.Seguir PNT-ITRI-01 de muestras respiratorias (incluidoen este procedimiento)

4.3. TINCIÓN DE GRAM PARA VALORACIÓN DELAS MUESTRAS.Como paso previo a este procedimiento, debehacerse un cribado mediante tinción de Gram de lasmuestras correspondientes, de tal forma que sólo seprocederá a la realización del antibiograma por Etestdirecto en aquellas muestras en las que se observenmicroorganismos.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS YPRODUCTOS Además de los indicados en el PNT-ITRI-01 deprocesamiento de muestras respiratorias incluido eneste procedimiento, se sembrará una placa de 15 cmde diámetro con medio Mueller-Hinton siguiendo el“Procedimiento de antibiograma directo de muestra conEtest” descrito a continuación en el apartado 7.

6. APARATOS Y MATERIAL- Centrífuga- Agitador tipo vórtex- Torundas de algodón estériles- Pinzas- Pipetas Pasteur estériles- Solución salina estéril- Tiras de E-test de antibióticos (AB Biodisk)- Placas de agar Mueller-Hinton de 15 cm de diámetro- Portaobjetos- Reactivos tinción de Gram

7. PROCEDIMIENTO Después de comprobar la presencia demicroorganismos mediante la tinción de Gram, serealizará una siembra de la muestra por elprocedimiento que se describe a continuación.Además se realizará la siembra por el procedimientocuantitativo en los medios de cultivo indicados en losdiferentes PNTs de este procedimiento referentes alos diferentes tipos de muestras respiratorias.

a) Siembra. Se sembrará una placa de 15 cm dediámetro con medio Mueller-Hinton. La superficiedel agar deberá estar seca y atemperada antesde inocularse la muestra y para ello se sacará dela nevera al menos 30 minutos antes de suutilización. Con la ayuda de una pipeta Pasteurde plástico estéril se dispensaráaproximadamente 0,1 ml de la muestra sobre laplaca y se extenderá uniformemente con unatorunda por toda la superficie de la placa envarias direcciones. Si la muestra es muy espesaconviene fluidificarla previamente con soluciónsalina a partes iguales y homogeneizarla con unagitador tipo vortex antes de sembrarla.

b) Dispensación de las tiras de Etest.Previamente a su utilización las tiras de Etestdeben atemperarse y para ello deben sacarsedel congelador, o nevera en su caso, 15-30minutos antes de su utilización. Utilizando unaspinzas se dispensarán 6 tiras de Etest por placasiguiendo una disposición radial, situando losextremos de las tiras con las concentracionesmás bajas de antibióticos hacia el centro (ver

PNT- ITRI-06Servicio de MicrobiologíaHospital....................................

Antibiograma por Etest directo en muestrasrespiratorias de pacientes con neumonía

asociada a ventilación mecánicaEdición Nº 01 Página 3 de 3

figura 1 como ejemplo). Se utilizarán tiras deEtest con los siguientes antimicrobianos, salvoen los casos en que por motivos específicos elmicrobiólogo responsable considere lanecesidad de incluir otros antibióticosadicionales:

- Oxacilina- Tobramicina ó Amikacina- Ciprofloxacino- Ceftazidima ó Cefepima- Imipenem- Piperacilina/Tazobactam

c) Incubación. Se incubarán las placas a 35ºCdurante 18-24 h.

d) Lectura e interpretación de los resultados.Después de la incubación se procederá a lalectura de la concentración mínima inhibitoria(CMI) de cada antimicrobiano frente a cada unode los microorganismos observados y a lainterpretación de la misma aplicando los puntosde corte establecidos por el CLSI. Es importanteutilizar luz transmitida para realizar la lectura,principalmente en cultivos polimicrobianos.

Figura 1. Antibiograma directo de una muestrarespiratoria mediante E-test

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE LOSRESULTADOS Los resultados de este antibiograma directo seconsiderarán como “preliminares” y se informaráncomo tales y personalmente (por teléfono odirectamente) al facultativo responsable deltratamiento del paciente. Asimismo, se archivará uninforme escrito con estos resultados preliminares enel laboratorio de microbiología.

9. RESPONSABILIDADES Los técnicos del laboratorio de microbiología seránlos responsables de la realización de la técnica y elfacultativo responsable del laboratorio de antibióticos, oel facultativo de guardia cuando proceda, serán losresponsables de la interpretación de los resultados y dela información de los mismos al clínico responsable deltratamiento del paciente.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTOEste sistema permite exclusivamente la

determinación presuntiva de la sensibilidad aantimicrobianos, por tanto, es importante que seinforme personalmente al médico que la solicita y no securse un informe escrito.

Este método solamente se ha evaluado paradeterminar la sensibilidad a antimicrobianos enpacientes con neumonía asociada a ventilaciónmecánica y en pacientes con fibrosis quística, por loque no se debe aplicar en otras situaciones.

La presencia de varios tipos diferentes de coloniasen este antibiograma dificulta la lectura, por tanto,siempre se deberá utilizar luz transmitida para realizarla lectura.

Siempre se deben interpretar los resultados delantibiograma directo mediante Etest conjuntamente conla lectura de los medios sembrados cuantitativamentecon la muestra.

Además de la determinación de la sensibilidad aantibióticos por esta técnica debe realizarse unantibiograma convencional a partir de las coloniasaisladas en el cultivo de las muestras respiratorias paraobtener el informe definitivo de los resultados desensibilidad a antibióticos de los microorganismospresentes en dicha muestra.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO- Este procedimiento no es válido paramicroorganismos que no crecen adecuadamente enmedio Mueller-Hinton.- La presencia de múltiples microorganismos en lasmuestras como consecuencia de infeccionespolimicrobianas dificulta la interpretación de losresultados, pudiendo en ocasiones llegar a invalidar elprocedimiento.- En algunas ocasiones el sobrecrecimiento de algunosmicroorganismos en recuentos elevados puedeenmascarar a otros en recuentos inferiores (aunquesignificativos) y por tanto, hacer imposible la lectura delantibiograma.- Los resultados obtenidos deben considerarse comouna información preliminar y presuntiva que debeconfirmarse por las técnicas convencionales de estudiode sensibilidad a antibióticos.

12. BIBLIOGRAFÍA1. Bouza E, Torres MV, Radice C, Cercenado E, de Diego

R, Sánchez-Carrillo C, Muñoz P. Direct Etest (AB Biodisk)of respiratory samples improves antimicrobial use inventilator-associated pneumonia. Clin Infect Dis 2007; 44:382-387.

2. Cercenado E, Cercenado S, Marín M, Rico MV, VicenteT, Bouza E. Evaluation of direct E-test on lowerrespiratory tract samples: a rapid and accurate procedurefor antimicrobial susceptibility testing. Diagn MicrobiolInfect Dis 2007; 58:211-216.