04/11/23

Químicas e AplicaçõesQuímicas e AplicaçõesOPTICONOPTICON

Continuous Fluorescence Continuous Fluorescence Detection SystemDetection System

Carlos Martins04/11/23

Principais QuímicasPrincipais Químicas

SYBR Green 1SYBR Green 1

Molecular BeaconsMolecular Beacons

TaqManTaqMan

Carlos Martins04/11/23

RevisãoRevisão

Como funcionam essas químicasEm que etapa da reação o sinal é visto:

Denaturação, Anelamento, ExtençãoAplicações para cada química

Carlos Martins04/11/23

SYBR Green 1SYBR Green 1

Como funciona?Como funciona? Liga-se ao dsDNA

SYBR Green 1 fluoresce quando na presença de dsDNA

G

TT TG G

C

C CCCC

CA AA

GGG

ACT

T

G

ATAG

C

AT

CG

TA

A

G

T

T

TT

TT

G

G GG

C

CC

CC

C

C

CA AA

AA

T

A

CCG G

G

G

TT

AC

GA

A

C

G G

T

AA

T

DNA denaturado

SYBR Green 1 não ligado

Desnaturação: Não emite Desnaturação: Não emite SinalSinal

G

TT

TTG

G

C

CC

CC

CC

CA AA

AA

A

TG

C

A C

T G

Annelamento dos Primers: Annelamento dos Primers: FluorescênciaFluorescência

SYBR Green 1 ligado ao dsDNAG

TT TG G

C

C CC CC

CA AA

GG

G

AC

T

T

G

A

TAG

C

A

T

C

G

T

A

A

Extenção: FluorescênciaExtenção: FluorescênciaPonto de leitura

AnáliseAnáliseQuantificação da concentração inicial do

Template:• SIM

Análise de Curvas de Melting:• SIM; verificação de produtos únicos, variantes,

produtos múltiplos e/ou complexos primer dimer

Análise de End Point• SIM; Leitura realizada após terminada a amplificação

Quantificação de concentração inicial de Quantificação de concentração inicial de TemplateTemplate

Maior concentração inicial de DNA, menor número de ciclos necessário para detecção.

Usa-se comparação de Controles de DNA contra amostras desconhecidas e obten-se um gráfico.

Intensidade de Intensidade de FluorescênciaFluorescência

Número de Número de CiclosCiclos

Número de CiclosNúmero de Ciclos

105

C(T)

Controle

Controle

Desconhecido

Análise de Curva de MeltingAnálise de Curva de Melting

Identificação do produto por Tm

Intensidade de Fluorescência

Temperatura

Tm

Identificação do Produto por perfil térmico, tm

- Tm de cada amostra difere pela concentração de GC e pelo comprimento

Análise de Curva de MeltingAnálise de Curva de MeltingProduto de interesse

Produto não específico

-dI/dT

Temperatura

Intensidade deFluorescência

Carlos Martins04/11/23

Fácil de usar

- Não utiliza probes de difícil desenhoNão é sequência-específico

- Pode ser usado para diferentes templatesBaixo custoSensível

Vantagens do Vantagens do SYBR Green 1SYBR Green 1

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DesvantagensDesvantagens SYBR Green 1SYBR Green 1

Ligação a produtos não-específicos

Pode inibir a reação à altas concentrações– Solução: sistema mais sensível

Carlos Martins04/11/23

Molecular BeaconsMolecular Beacons

Como funciona?Como funciona?

Stem é composto de sequências complementares

O loop é complementar a sequência alvo

• Probe em forma de alça (hairpin) • Fluoróforo absorvido por um quencher

Denaturação: Fluorescência Denaturação: Fluorescência Não-específicaNão-específica

T

A

C CGG GG

G

T T

A CGA

AC

G GT

A AT

T

A

C CGG GG

G

T T

A CGA

AC

G GT

A AT

Anelamento: FluorescênciaAnelamento: Fluorescência

T

A

C CGG GG

G

T T

A CGA

AC

G GT

A AT

T T

T TG

C C C CC

A A AA

Q

Fluoróforo

Sequência alvo

Loop

Stem

Quencher

Ponto de Leitura

Probe hibridizado

Extenção: Sem FluorescênciaExtenção: Sem Fluorescência

Probes não ligados

AplicaçõesAplicações

Quantificação de Detecção de sequências específicas.

Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms

- Sistemas de detecção simples requerem corrida em duplicata

VantagensVantagensAlta epecificidade de detecção

- Melhor técnica para detecção de SNP

Pode ter custo reduzido quando utilizado para screening do mesmo Target

Permite escolha do Fluoróforo

DesvantagensDesvantagensDesign complicado

Específico para um Target

Custo elevado

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TaqManTaqMan

Como funciona?Como funciona?

Probe Target-específico5’ Reporter and 3’ Quencher

5’ Reporter Quencher

Complementar a sequência alvo

Denaturação: Sem FluorescênciaDenaturação: Sem Fluorescência

3’

5’

5’

3’

Sem Hibiridização

Anelamento: Sem FluorescênciaAnelamento: Sem Fluorescência

3’

3’5’

5’

Hibridização do Probe

Extenção: PolimerizaçãoExtenção: Polimerização

Não ocorre extensão do probe 3’

5’

5’3’

3’

Extensão: Strand DisplacementExtensão: Strand Displacement

ForwardPrimer

ReversePrimer

ProbeR

Q

Probe desligado no 5’ Reporter pela Taq Polymerase

3’

3’5’

5’

Extenção: Clivagem e Extenção: Clivagem e FluorescênciaFluorescência

ForwardPrimer

ReversePrimer

QR

Probe clivado via atividade exonuclease 5’-3’ Taq polymerase.

3’

3’5’

5’

AnáliseAnálise

Curva de Melting: NÃO

Não é possível análise de Curva de Melting devido as propriedades do probe

Quantificação de concentração inicial de Quantify Template: SIM

Análise de End point: SIM

AplicaçõesAplicações

Deteção e Quantificação de amostras específicas.

Deteção de Single Nucleotide Polymorphisms

- Sistemas de detecção simples requerem corrida dupla

VantagensVantagensAlta específicidade

- Bom para detecção de SNPDesign menos complicado que Molecular

Beacons Custo reduzido quando utilizado para o mesmo

TargetLivre escolha do Fluoróforo 5’

DesvantagensDesvantagensDesenhado especificamente para um

target

Não permite análise de Curvas de melting

ResumoResumo

QuímicaComo Funciona

Quencher

Detecção do Sinal

Principal aplicação

SYBR Green I

Liga-se a menor curva do dsDNA Não

Qualquer etapa

Quantificação e Detecção.Análise de Curvas de Melting

Molecular Beacons

Probe Hibridização (Hairpin) Sim

Anelamento

Detecção de SNPQuantificação e Detecção

TaqMan

Probe Hibridização (5’-3’ Exo) Sim Extenção

Detecção de SNPQuantificação e Detecção

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DNA Engine OPTICOMDNA Engine OPTICOM

Real Time PCRReal Time PCR

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Especificações:

• Exitação e detecção Solid state • Capacidade de 96 amostras• Single color• Dynamic range: 7 Ordens de magnitude• Upgradeable• Baseado na plataforma PTC-200• Windows NT

DNA Engine OpticonDNA Engine Opticon

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DNA Engine OpticonDNA Engine Opticon

Melhor:

•Extremamente sensível <5nM Fluorescein•Grande dynamic range•Baseado em tecnologia já existente•Não utiliza partes móveis•Pequeno tamanho•Upgradeable•Gradiente•Baixo custo: $35,000

Carlos Martins04/11/23

Carlos Martins04/11/23

TechnologiaTechnologia•96 LEDs focados em cada poço/amostra •Cada Poço é exitado individualmente(450-495nm)•Detectado por PMT (515-545nm)•Exelente para SYBR Green e FAM

Carlos Martins

OpticonOpticon™™

Plataforma DNA Engine™ Unidade Alpha™ 96V Torre Opticon

OpticonOpticon™™

Carlos Martins

Plataforma PTC 200 DNA Plataforma PTC 200 DNA Engine™Engine™

• Tecnologia de PontaTecnologia de Ponta• Referência em termocicladoresReferência em termocicladores

Carlos Martins

Unidade Alpha™96VUnidade Alpha™96V

• Placas ou Tubos Placas ou Tubos • Tampas chatas ou filmeTampas chatas ou filme

Carlos Martins

Torre Torre Opticon™Opticon™

• Light Emitting Diode (LED) ArrayLight Emitting Diode (LED) Array

• Uso de Fotomultiplicador (PMT)Uso de Fotomultiplicador (PMT)

• Lentes FresnelLentes Fresnel

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LED ArrayLED Array

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Fotomultiplicador PMTFotomultiplicador PMT

Lentes FresnelLentes Fresnel

VVVVVVVVVVVV

Carlos Martins04/11/23

OpticonOpticon™™

• Baseado em Tecnologia de ponta – PTC 200• Plataforma completa – acompanha computador• Design simples – ocupa pequeno espaço• Alta sensibilidade – capta < 5nM Fluorescein• Manutenção com menor custo• Menor preço• Assistência técnica já presente no Brasil