Analytical Characterization of Antibody‐Drug Conjugates via Mass 

Spectrometry

The Mass Spectrometry Society of Japan, 63rd Annual Conference, June 17, 2015

Brian Wiggins, Lily Liu‐Shin, Hideto Yamaguchi, Adam Fung, Gayathri Ratnaswamy

Analytical and Formulation DevelopmentAgensys, Inc. – an affiliate of Astellas Pharma, Inc.

Santa Monica, CA

Outline 

2

• Structure and properties of ADCs conjugated at cysteines involved in interchain disulfides and ADCs conjugated site‐specifically

• Critical quality attributes of ADCs and which can be monitored by mass spectrometry

• Physiochemical characterization of IgG1 vs IgG2 ADCs conjugated at cysteinesinvolved in interchain disulfides compared to an IgG1 ADC conjugated site‐specifically

• Characterization of ADC conjugation site and conjugate distribution profile

• Characterization of disulfide linkages in the mAb intermediate

Antibody‐Drug Conjugates 

3

Antibody Linker Toxin

• IgG1• IgG2

• Cleavable• Non‐cleavable

• Charged• Non‐charged

Conventional Conjugation

• Lysines• Cysteines involved in 

interchain disulfides(after partial reduction)

Site Specific Conjugation

• Engineered cysteines• Non‐natural amino acids• Selenocysteines• Enzymatic conjugation• Glyco‐conjugates

• Panowski et al., Site‐specific antibody drug conjugates for cancer therapy, mAbs, 2014, 6(1), 34‐45

Impact of conjugation

4

• Shen, B., et al., Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of  antibody drug conjugates. Nature Biotechnology, 2012. 30(2): p184‐89• Jackson, D., et al., In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated Herceptin antibody drug conjugates. PloS One, 2014, 9(1): p 1‐14• Axup, J.Y., et al., Synthesis of site‐specific antibody‐drug conjugates using unnatural amino acids .  PNAS , 2012, 109, p 16101‐16106

Jackson, D., et al., In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated Herceptin antibody drug conjugates. PloS One, 2014. 9(1): p. 1‐14.

Conjugation at cysteines involved in interchain disulfide bonds

Site‐specific (nnAA)

Conjugate Distribution

• Heterogeneous• D0 to D12 species• Target DAR of 4

• More Homogeneous• D0 to D2 species• Target DAR of 2

Stability • In‐vivo de‐conjugation through exchange with albumin or glutathione (DL dependent)

• Off‐target toxicity

• Stable in‐vivo

• Monitor conjugate distribution and heterogeneity via mass spectrometry• Site‐specific conjugates could improve the therapeutic index (disease dependent)

Potential conjugation sites for cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCs

Maximum DAR: 8 Maximum DAR: 12

5

IgG2S

SS

S

SS

SS

S SS SS SS S

IgG1

SS

SS

SS

SS

S SS S

Maximum DAR: 2

IgG1 Site‐specific

SS

SS

SS

SS

S SS S

Possible species in IgG1 and IgG2 ADCs conjugated at cysteines involved in interchain disulfides

6

IgG2 only IgG2 only IgG2 only

IgG2 only

DAR = 0  DAR = 2  DAR = 4 

DAR = 6 DAR = 8 DAR = 10

DAR = 12

Image modified from Le, L.N., et al., Profiling antibody drug conjugate positional isomers: a system‐of‐equations approach.Analytical Chem, 2012, 84(17), 7479‐86

7

DAR = 0  DAR = 1 

DAR = 2 

Possible species on mAbs utilizing site‐specific conjugation

Characteristic Critical Attribute Method

IdentityPrimary sequence Peptide Map

Main peak pI and charge variant distribution icIEF

Strength Protein concentration UV‐VIS

Purity

Size homogeneity SEC, CE‐SDS, SDS‐PAGE

% Unconjugated mAb Hydrophobic InteractionChromatography (HIC)

Non‐proteinaceous impurities (NPI) RP‐UPLC for NPI, MS confirmation

Disulfide linkages in mAb intermediate Non‐Reduced Peptide Map

Potency

Binding ELISA

Drug‐to‐Antibody Ratio (DAR) RP‐UPLC, MS confirmation, HIC, UV‐VIS

Cytotoxicity Bioassay

Methods to evaluate critical quality attributes

8

Conjugate distribution of ADCs conjugated at cysteinesinvolved in interchain disulfides and site‐specifically by HIC

9

D0

D2

D4

D6

D8

1.4 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.4

min

D0D2

D4

D6D8 D10+D12

IgG1 ADC, DAR ~4

IgG2 ADC, DAR ~4

IgG Isotype and conjugation technology influences conjugate distribution

% Unconjugated = 7%

% Unconjugated = 11%

WVL:214 nm

D2 IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

D1

D0

% Unconjugated = 1%

10

3.8 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.2-50

100

250 mAU

min

1

L0H0 L1

H1

H2H3

WVL:214 nm

2.4 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 14.9-50

100

200

300 2mAU

min

2

L0

L1

H0H1

H2

H3

H4 H5

WVL:214 nm

IgG1 ADC, DAR ~4

IgG2 ADC, DAR ~4

Conjugate distribution of an IgG1 and IgG2 ADC by RP‐UPLC under reducing conditions

Predominant conjugation to light‐heavy interchain cysteines for IgG1 (DAR = 4)Predominant conjugation to hinge disulfide cysteines for IgG2 (DAR = 4)

Reduction necessary for DAR determination where HIC peaks are not baseline resolved

Reduced LC‐MS (ESI‐TOF) – Confirmation of Light Chain conjugation differences between an IgG1 and IgG2 ADC

11

mass22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

%

0

100

mass22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

%

0

100

mass22500 22600 22700 22800 22900 23000 23100 23200 23300 23400 23500 23600 23700 23800 23900 24000 24100 24200 24300 24400 24500 24600 24700 24800 24900 25000

%

0

100L0

L0 L1

L1

L0

IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

IgG1 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

IgG2 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

g

Reduced LC‐MS (ESI‐TOF) – Confirmation of Heavy Chain conjugation differences between an IgG1 and IgG2 ADC

12

mass48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

%

0

100

mass48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

%

0

100

mass48000 48200 48400 48600 48800 49000 49200 49400 49600 49800 50000 50200 50400 50600 50800 51000 51200 51400 51600 51800 52000 52200 52400 52600 52800 53000 53200 53400 53600 53800 54000 54200 54400 54600 54800 55000 55200 55400

%

0

100 H1

H0

H1H2

H3

H0

H1

H2

H3

H4 H5

IgG1 site‐specific ADC, DAR ~2

IgG1 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

IgG2 cysteine‐conjugated ADC, DAR ~4

Predominant conjugation sites for cysteine conjugated and site‐specific conjugated ADCs

Maximum DAR: 8 Maximum DAR: 12

13

IgG2S

SS

S

SS

SS

S SS SS SS S

IgG1

SS

SS

SS

SS

S SS S

Maximum DAR: 2

IgG1 Site‐specific

SS

SS

SS

SS

S SS S

14

Conjugation site identification using Peptide Mapping with MSE ionization (ESI‐QTOF)

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 95.00 100.00 105.00 110.00

AU

0.0

5.0e-2

1.0e-1

1.5e-1

2.0e-1

2.5e-1

3.0e-1

3.5e-1

4.0e-1

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 95.00 100.00 105.00 110.00

AU

0.0

2.5e-2

5.0e-2

7.5e-2

1.0e-1

1.25e-1

1.5e-1

1.75e-1

2.0e-1

2.25e-1

2.5e-1

2.75e-1

3.0e-1

3.25e-1

3.5e-1

3.75e-1

4.0e-1

Conjugated peptides

mAb

ADC

15

IgG1 conjugation site identification using Peptide Mapping XIC of the drug‐linker fragment mass

Sample Peak Subunit Disulfide Utilized Peptide SequencevcMMAE molecules

IgG1

1, 2 Heavy Chain LC‐HC Interchain 219SCDK222 13, 4, 6 Light Chain LC‐HC Interchain 208SFNRGEC214 1

5 Heavy Chain HC‐HC Interchain223THTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPK2481

5 Heavy Chain HC‐HC Interchain223THTCPPCPAPELLGGPSVFLF

PPKPK2482

7 Unidentified8 Drug + Linker N/A Drug + Linker 1

16

IgG2 conjugation site identification using Peptide Mapping XIC of the drug‐linker fragment mass

Heterogeneity associated with multiple combinations of Hinge conjugations in IgG2

Sample Peak Subunit Disulfide Utilized Peptide SequencevcMMAE Molecules

IgG2

1, 4 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLF

PPKPK2421

1, 4, 6 Heavy Chain HC‐HC Interchain216KCCVECPPCPAPPVAGPSVFL

FPPKPK2422

1, 4 Heavy Chain HC‐HC Interchain216KCCVECPPCPAPPVAGPSVFL

FPPKPK2423

2 Light Chain LC‐HC Interchain 210GEC212 12, 3 Heavy Chain LC‐HC Interchain 120GPSVFPLAPCSR131 15, 9 Unidentified

7, 8 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLF

PPKPK2422

10 Heavy Chain HC‐HC Interchain217CCVECPPCPAPPVAGPSVFLF

PPK2404

IgG1 site‐specific conjugation site identification using Peptide Mapping (ESI‐QTOF)

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 95.00 100.00 105.00 110.00 115.00 120.00

AU

0.0

2.0e-2

4.0e-2

6.0e-2

8.0e-2

1.0e-1

1.2e-1

1.4e-1

1.6e-1

1.8e-1

2.0e-1

2.2e-1

2.4e-1

2.6e-1

2.8e-1

3.0e-1

3.2e-1

3.4e-1

3.6e-1

3.8e-1

4.0e-1

4.2e-1

4.4e-1

HC Peptide + Drug‐linker

Modification from reduction creates additional peak

LC‐MS (SEC with ESI‐TOF) of deglycosylated ADCs

D2

D4

D6D8

D0

18

IgG1, Cysteine‐linked conjugation

IgG1, Site‐specific conjugation

D1

D2

• Valliere‐Douglass, J., et al., Native Intact Mass Determination of Antibodies Conjugated with Monomethyl Auristatin E and F at Interchain Cysteine Residues. Analytical Chemistry, 2012, 84, 2843‐49

Disulfide analysis of mAb intermediate via non‐reduced peptide mapping when conjugated at cysteines involved in interchain disulfides

GEC

GPSVFPLAPCSR

GEC

GPSVFPLAPCSR

• Cumnock, K., et al., Trisulfide modification impacts the reduction step in Antibody‐Drug conjugation process. Bioconjugate Chem, 2013, 24(7), 1154‐60

S

SS

SS

IgG2 mAb

SS

SS

SS

SS

S SS SS SS S

Trisulfide

Disulfide

• LC‐HC or HC‐HC sulfur insertion into the disulfide bond• LC‐HC inter‐disulfide bond sulfur insertion more prevalent in mAbs• High levels of trisulfide may impact reduction step in ADC conjugation and lead to variations in conjugate distribution and DAR

Disulfide analysis via non‐reduced peptide mapping and quantitation by XIC (mAb intermediate only)

Time5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 95.00 100.00

AU

0.0

5.0e-2

1.0e-1

1.5e-1

2.0e-1

2.5e-1

3.0e-1

3.5e-1

4.0e-1

4.5e-1

5.0e-1

5.5e-1

5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00 70.00 75.00 80.00 85.00 90.00 95.00 100.00

AU

0.0

5.0e-2

1.0e-1

1.5e-1

2.0e-1

2.5e-1

3.0e-1

3.5e-1

4.0e-1

4.5e-1

Decrease of LC‐HC disulfide linked peptide

LC‐HC trisulfide linked peptide  (minor species)

Forced trisulfide induction with H2S

Native mAb

GEC

GPSVFPLAPCSR

GEC

GPSVFPLAPCSR

S

SS

SS

Conclusions

• Conjugate distribution and conjugation sites are dependent on IgG isotype for ADCs conjugated at cysteines involved in interchain disulfides

• When conjugated at cysteines involved in interchain disulfides, mass spectrometry has confirmed that IgG1 ADCs are conjugated at cysteines involved in the LC‐HC disulfide (average DAR ~4) while IgG2 ADCs are predominately conjugated in the hinge region

• Mass spectrometry can be used to identify the conjugation sites and conjugate distribution, which may have an impact on pharmacokinetics 

• Mass spectrometry can be employed in analysis of trisulfides for the mAb intermediate, which will have an impact upon the reduction step in cysteine conjugation and DAR

21

Acknowledgements

22

Hideto Yamaguchi, Biotechnology Labs, Astellas Pharma 

AgensysWolf Noe, VP, Technical Operations

Analytical Development Seattle GeneticsChris Adams

Formulation DevelopmentJihea Park Aileen LaAnanda Seneviratne

Process SciencesIan SchwartzJocelyn MaterieFerd TomasZhala TawfiqJonathan RheubenTae Lee WongChris O’BrienMarie Zhu

Ambrx Inc.