2006 届硕士学位论文答辩会

20062006 届硕士学届硕士学位论文答辩会位论文答辩会

姜黄素对人鼻咽癌放射残存细胞株姜黄素对人鼻咽癌放射残存细胞株CNE-2Z-Tr12 CNE-2Z-Tr12 增殖、侵袭、迁移及增殖、侵袭、迁移及

凋亡的影响凋亡的影响

研究生：范德生研究生：范德生导师：孙宁教授导师：孙宁教授

广东医学院病理教研室广东医学院病理教研室

2006.6.162006.6.16

硕士学位论文答辩

硕士学位论文答辩第一部分第一部分

研究背景研究背景

鼻咽癌的特点鼻咽癌的特点

1. 1. 地域分布地域分布 (( 两广、湖南）两广、湖南） 2. 2. 病变及治疗特点（位置、放疗）病变及治疗特点（位置、放疗） 3. 3. 鼻咽癌患者主要死亡原因（复发、转移）鼻咽癌患者主要死亡原因（复发、转移）

因此，在华南地区研究放射后存活鼻咽癌因此，在华南地区研究放射后存活鼻咽癌细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡问题具有细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡问题具有重要的意义重要的意义

研究背景

放射后存活鼻咽癌细胞放射后存活鼻咽癌细胞

研究表明研究表明 ::

1. 1. 辐射可以导致肿瘤细胞线粒体辐射可以导致肿瘤细胞线粒体 DNDNA4977bpA4977bp 特异性缺失特异性缺失

2. 2. 具有辐射抗性的肿瘤细胞多具有具有辐射抗性的肿瘤细胞多具有 EEGFRGFR 过表达的特性过表达的特性

研究背景

细胞侵袭、运动与细胞侵袭、运动与细胞微绒毛、细胞骨架细胞微绒毛、细胞骨架

1.1. 微绒毛在癌细胞侵袭早期起重要作用，具微绒毛在癌细胞侵袭早期起重要作用，具有黏附、运动、吸收、吞噬、支持等多种有黏附、运动、吸收、吞噬、支持等多种作用作用

2.2. 细胞的侵袭、运动与细胞骨架成分、微丝细胞的侵袭、运动与细胞骨架成分、微丝微管分布及相关信号传导通路有关微管分布及相关信号传导通路有关

研究背景

EGFREGFR 与肿瘤与肿瘤

1. EGFR1. EGFR 与肿瘤细胞的增殖、血管生成、与肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、转移及凋亡密切相关侵袭、转移及凋亡密切相关

2. 2. 研究表明研究表明 EGFREGFR 与细胞骨架微丝成分与细胞骨架微丝成分(F-actin)(F-actin) 直接结合直接结合

研究背景

EGFREGFR 与细胞骨架与细胞骨架

EGF EGF 和和 EGFREGFR 结合后通过相关信号传结合后通过相关信号传导通路激活细胞骨架，产生对细胞骨架导通路激活细胞骨架，产生对细胞骨架重构、移动、成分变化等多种影响作用，重构、移动、成分变化等多种影响作用，改变肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力改变肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力等生物学特性等生物学特性

研究背景

姜黄素抗肿瘤研究现状姜黄素抗肿瘤研究现状研究发现姜黄素可以：研究发现姜黄素可以：11 调控癌基因、抑癌基因调控癌基因、抑癌基因22 引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡 33 抑制肿瘤血管生成，降低转移率抑制肿瘤血管生成，降低转移率4 4 抑制抑制 EGFR-PI3K-PKC EGFR-PI3K-PKC 通路通路5 5 本室对其抗鼻咽癌机理已有一定研究本室对其抗鼻咽癌机理已有一定研究

研究背景

第二部分第二部分硕士学位论文答辩

研究目的研究目的

姜黄素抗鼻咽癌研究姜黄素抗鼻咽癌研究

1. 1. 本室证实姜黄素能够抑制本室证实姜黄素能够抑制 H5H5 细胞的增殖细胞的增殖 , , 但但其能否抑制其能否抑制 Tr12Tr12 细胞的增殖细胞的增殖 ? ? 通过什么机制通过什么机制2. 2. 能否抑制能否抑制 Tr12Tr12 细胞的侵袭、迁移细胞的侵袭、迁移 , , 可能机制可能机制3. 3. 能否诱导能否诱导 Tr12Tr12 细胞的凋亡，可能机制细胞的凋亡，可能机制4.4. 是否能通过细胞骨架的破坏对鼻咽癌细胞起是否能通过细胞骨架的破坏对鼻咽癌细胞起到杀伤作用到杀伤作用

研究目的

姜黄素与放射增敏姜黄素与放射增敏

1. 1. 本室对其放射增敏作用已有一定研究本室对其放射增敏作用已有一定研究

2. EGFR2. EGFR 的表达程度与肿瘤的放射抵抗的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈正相关，如果姜黄素能够抑制性呈正相关，如果姜黄素能够抑制 EGEGFRFR 的表达，则可能影响相关传导通路，的表达，则可能影响相关传导通路，从而起到放射增敏作用从而起到放射增敏作用

研究目的

第三部分第三部分

技术路线技术路线


CNE-2Z 细胞 Tr12 细胞

PCR RT-PCR

mtDNA4977bp EGFR mRNA

技术路线

FCM 光镜RT-PCR

BCL-2侵袭、运动

实验细胞形态骨架形态

EGFR

Tr12 细胞

对照组

FCM

姜黄素组

10μ

姜黄素组

20μ

姜黄素组

40μ

SEM Western-Blot

绒毛、凋亡凋亡率周期

技术路线MTT

第四部分第四部分

结果与讨论结果与讨论


结果讨论

一、 Tr12 细胞生物学特性

CNE-2ZCNE-2Z 、、 Tr12Tr12 细细胞胞 mtDNA mtDNA 的的 PCPC

RR 结果结果

M Tr12 Tr12 2Z 2Z

676bp

结果讨论mtDNA4977bpmtDNA4977bp 缺失的检测：缺失的检测：

CNE-2ZCNE-2Z 、、 Tr12Tr12细胞细胞 EGFR mRNEGFR mRNA A 的的 RT-PCRRT-PCR 结结

果果

2Z Tr12 M

676bp

377bp

结果讨论

EGFR mRNAEGFR mRNA 的检测：的检测：

CNE-2ZCNE-2Z 、、 Tr12Tr12细胞细胞 EGFR mRNEGFR mRNA A 的的 RT-PCRRT-PCR 结结

果果

结果讨论

00. 20. 40. 60. 8

11. 2

Tr12 2ZGroup

Rela

tive

lev

er o

fEG

FR m

RNA

(Independent Samples t-Test) ：t=4.972, P ＜ 0.05

EGFR mRNAEGFR mRNA 的检测：的检测：

讨论讨论

• 放射可以特异性诱导放射可以特异性诱导 mtDNA 4977bpmtDNA 4977bp 缺失；缺失；而某些类型的肿瘤也存在而某些类型的肿瘤也存在 mtDNA4977bpmtDNA4977bp 缺缺失；吸烟、老龄化也有诱发此缺失的倾向失；吸烟、老龄化也有诱发此缺失的倾向

• Tr12Tr12 细胞不存在细胞不存在 mtDNA4977bpmtDNA4977bp 缺失原因缺失原因

结果讨论

讨论讨论

• EGFREGFR 的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈的表达程度与肿瘤的放射抵抗性呈正相关正相关 , EGFR, EGFR 高表达的肿瘤放、化疗预高表达的肿瘤放、化疗预

后不良后不良

• 以以 EGFREGFR 为靶点的抗肿瘤治疗在临床试验为靶点的抗肿瘤治疗在临床试验中取得了令人振奋的结果，这种方法主要中取得了令人振奋的结果，这种方法主要针对针对 EGFREGFR 高表达的肿瘤高表达的肿瘤

结果讨论

讨论讨论

• CNE-2ZCNE-2Z 、、 Tr12Tr12 细胞细胞 EGFR mRNAEGFR mRNA 均高均高表达，表达， Tr12Tr12 细胞表达强于细胞表达强于 CNE-2Z CNE-2Z

• 推测推测 CNE-2ZCNE-2Z 细胞由于辐射引起一系列反细胞由于辐射引起一系列反应，造成应，造成 Tr12Tr12 细胞细胞 EGFREGFR 表达更高，也表达更高，也由此导致其辐射抗性、侵袭、运动能力增由此导致其辐射抗性、侵袭、运动能力增强等生物学特性的改变强等生物学特性的改变

结果讨论

二、二、姜黄素对姜黄素对 Tr12Tr12 细胞细胞增殖、侵袭、迁移的影响增殖、侵袭、迁移的影响

结果讨论

MTTMTT 实验结果实验结果

MTTMTT 结果结果

020406080

100

0 10 20 40 80浓度 (μmol/L)

抑制

率（

％）

24h48h

结果讨论

在同一时间范围内，各组间差异有显著意义（ P ＜ 0.001 ） , F 值分别为 71.970 ， 302.015 。

姜黄素对姜黄素对 Tr12Tr12 细胞周期的影细胞周期的影响响

姜黄素对姜黄素对 Tr12Tr12 细胞周期的影响细胞周期的影响

姜黄素对 Tr12 细胞周期的影响（％） Group G0/G1 S G2/M

0 µmol/L 66.10±0.90 15.80±0.19 18.10±1.10

10µmol/L 65.20±1.45* 31.40±1.75* 3.20±0.30*

20µmol/L 39.70±0.35* 22.30±0.95* 37.60±1.29*

40µmol/L 57.20±2.00* 19.60±1.39* 23.50±1.39*

One-Way ANOVA analysis, Compare with0 concentration* : P ＜ 0.01

Tr12Tr12 细胞侵袭实验结果细胞侵袭实验结果

0 µmol/L 10 µmol/L

结果讨论

20 µmol/L 40 µmol/L

Tr12Tr12 细胞侵袭实验结果细胞侵袭实验结果

侵侵袭袭实实验验结结果果

结果讨论

01020304050607080

0 10 20 40

Concentration (μmol/L)

Cell

num

ber

One-Way ANOVA analysis One-Way ANOVA analysis FF=22.443,=22.443, P P ＜＜ 0.0010.001

Tr12Tr12 细胞运动实验结果细胞运动实验结果

结果讨论

00 µmol/L 10 µmol/L µmol/L 10 µmol/L


Tr12Tr12 细胞运动实验结果细胞运动实验结果

运运动动实实验验结结果果

结果讨论

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 40

Concentration(μmol/L)

Cell

num

ber

One-Way ANOVA analysis One-Way ANOVA analysis FF=39.214,=39.214, P P ＜＜ 0.010.01

Tr12Tr12 细胞微绒毛细胞微绒毛 (SEM)(SEM)


结果讨论


Tr12Tr12 细胞微绒毛细胞微绒毛 (SEM)(SEM)结果讨论


T12T12 细胞骨架实验结果细胞骨架实验结果结果讨论

对对 Tr12Tr12 细胞细胞 EGFR mRNAEGFR mRNA 表达的影表达的影响响

RT-PCRRT-PCR 结果结果377bp

500bp

858bp

结果讨论

40 20 10 40 20 10 0 M0 M

对对 Tr12Tr12 细胞细胞 EGFR mRNAEGFR mRNA 表达的影表达的影响响

RT-PCRRT-PCR 结果结果

结果讨论

0

0. 2

0. 4

0. 6

0. 8

0 10 20 40Concerntrati on (μmol/L)

Rela

tive

lev

er o

fEG

FR m

RNA

One-Way ANOVA analysisP ＜ 0.001

讨论讨论

• MTTMTT 结果显示姜黄素可以呈剂量依赖性地结果显示姜黄素可以呈剂量依赖性地抑制抑制 Tr12Tr12 细胞的增殖细胞的增殖

• FCMFCM 结果显示：姜黄素处理后，结果显示：姜黄素处理后， Tr12Tr12 细细胞阻滞于胞阻滞于 SS 期和期和 //或或 G2/M G2/M 期期 , , 两者都可两者都可使整个细胞周期延缓或中断而影响其增殖使整个细胞周期延缓或中断而影响其增殖

• FCMFCM 结果未显示明显的凋亡峰结果未显示明显的凋亡峰

结果讨论

讨论讨论

• TranswellTranswell 小室实验结果分析：比较直观小室实验结果分析：比较直观的显示了姜黄素对的显示了姜黄素对 Tr12Tr12 细胞的抗侵袭活细胞的抗侵袭活性，并能抑制其运动能力性，并能抑制其运动能力

• SEMSEM 结果分析：微绒毛是细胞质骨架在结果分析：微绒毛是细胞质骨架在细胞表面的特化结构（细胞表面的特化结构（ F-actin) F-actin) ，姜黄，姜黄素可能通过对微绒毛的作用抑制素可能通过对微绒毛的作用抑制 Tr12Tr12 细细胞侵袭、迁移胞侵袭、迁移

结果讨论

讨论

• 微丝微管信号传导分布改变生化成分微丝微管信号传导分布改变生化成分• RT-PCRRT-PCR 结果分析：结果分析： EGFREGFR 表达降低通过表达降低通过

相关信号传导通路引起细胞骨架的改变，使相关信号传导通路引起细胞骨架的改变，使细胞的侵袭、运动能力减弱而降低肿瘤的转细胞的侵袭、运动能力减弱而降低肿瘤的转移能力，这可能是姜黄素抑制肿瘤细胞侵袭、移能力，这可能是姜黄素抑制肿瘤细胞侵袭、迁移的具体机制之一迁移的具体机制之一

• 放疗与起到放疗与起到 EGFREGFR 抑制作用的药物（例如抑制作用的药物（例如姜黄素）联用姜黄素）联用

结果讨论

三、姜黄素对 Tr12 细胞凋亡的影响

结果讨论

SEMSEM 实验结果实验结果


结果讨论

Annexin V FITC/PIAnnexin V FITC/PI 双染结果双染结果结果讨论

0 µ 10 µ

20 µ 40 µ

Tr12Tr12 细胞凋亡率细胞凋亡率

Annexin V Annexin V FITC/PI FITC/PI 双染结果双染结果

结果讨论

0

5

10

15

20

25

30

0 10 20 40浓度(μmol/L)

凋亡

率（

％）

Tr12Tr12 细胞细胞 BCL-2BCL-2 的表达的表达

Western-BlotWestern-Blot

结果结果

42kD42kD

28kD28kD

结果讨论

0 10 20 400 10 20 40

BCL-2BCL-2

β-actinβ-actin

Tr12Tr12 细胞细胞 BCL-2BCL-2 的表达的表达

Western-BlotWestern-Blot 结果结果

00. 20. 40. 60. 8

11. 2

0 10 20 40Group

Rela

tive

Lev

er o

fBc

l-2

Prot

ein

结果讨论

讨论讨论

• 凋亡本身是形态学的概念。电镜下大量外膜凋亡本身是形态学的概念。电镜下大量外膜完整、大小不一的凋亡小体证实：凋亡存在完整、大小不一的凋亡小体证实：凋亡存在

• 双染双染 FCM FCM 结果分析：各组结果分析：各组 Tr12Tr12 细胞存在细胞存在不同程度的凋亡，与剂量相关，可能与姜黄不同程度的凋亡，与剂量相关，可能与姜黄素抑制素抑制 BCL-2BCL-2 表达有关；高浓度时细胞直表达有关；高浓度时细胞直接坏死，可能与细胞骨架破坏有关接坏死，可能与细胞骨架破坏有关

• 抑制抑制 BCL-2BCL-2 的表达可增强肿瘤细胞对化疗的表达可增强肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性及放疗的敏感性

结果讨论

讨论讨论

PIPI染色染色 FCMFCM 检测凋亡的局限性检测凋亡的局限性1.1. PIPI染色检测的是细胞染色检测的是细胞 DNADNA 的含量，凋亡早的含量，凋亡早

期胞膜通透性增加并不明显，可能没有期胞膜通透性增加并不明显，可能没有 DNADNA的丢失的丢失

2.2. 凋亡和细胞周期：亚二倍体峰的主要来自处凋亡和细胞周期：亚二倍体峰的主要来自处于于 G0/G1G0/G1 期的凋亡细胞，但一旦凋亡途径被期的凋亡细胞，但一旦凋亡途径被激活，各个阶段的细胞都有可能被诱导凋亡激活，各个阶段的细胞都有可能被诱导凋亡

3.3. 如果药物是针对如果药物是针对 G0/G1G0/G1 的，那么可能会有较的，那么可能会有较明显的亚二倍体峰。如果是明显的亚二倍体峰。如果是 G2/MG2/M 期和期和 //或或 SS期阻滞的药物，如紫杉醇、姜黄素等，那么期阻滞的药物，如紫杉醇、姜黄素等，那么凋亡峰则可能不明显凋亡峰则可能不明显

结果讨论

小结小结

1.1. 本结果为已进入临床实验的以本结果为已进入临床实验的以 EGFREGFR 为靶为靶点的治疗方法在鼻咽癌的临床应用提供了点的治疗方法在鼻咽癌的临床应用提供了实验依据；实验依据； Tr12Tr12 细胞细胞 EGFR mRNAEGFR mRNA 表达表达更高，这可能与肿瘤细胞的辐射抗性和演更高，这可能与肿瘤细胞的辐射抗性和演进有关进有关

2. 2. 姜黄素可以抑制姜黄素可以抑制 Tr12Tr12 细胞的增殖、侵袭、细胞的增殖、侵袭、运动，这可能与姜黄素对细胞周期、微绒运动，这可能与姜黄素对细胞周期、微绒毛、毛、 EGFREGFR 的表达及细胞骨架的影响相关的表达及细胞骨架的影响相关

小结小结

3.3. 姜黄素可以诱导姜黄素可以诱导 Tr12Tr12 细胞的凋亡，从蛋白水细胞的凋亡，从蛋白水平抑制平抑制 bcl-2bcl-2 的表达可能是其作用机制之一，的表达可能是其作用机制之一，超过一定浓度的姜黄素可以直接引起超过一定浓度的姜黄素可以直接引起 Tr12Tr12 细细胞坏死胞坏死

4. 4. 姜黄素对放射后存活鼻咽癌细胞显示了良好姜黄素对放射后存活鼻咽癌细胞显示了良好的抑制、诱导凋亡及体外杀伤作用，丰富了放的抑制、诱导凋亡及体外杀伤作用，丰富了放疗后复发鼻咽癌化疗及放疗增敏的研究内容。疗后复发鼻咽癌化疗及放疗增敏的研究内容。

致谢致谢

• 感谢导师孙宁教授• 感谢唐慰萍教授、陈小毅教授、胡新荣教授、姚

运红副教授、姜汉国副教授、曹军主任医师、赵颖海副教授、熊晖、林琼燕师姐

• 感谢邓惠华高级实验师、蔡琼珍、李飞虹、罗伯涛、揭伟、唐加步、唐泽立、包刚等各位老师

• 感谢附院黄应桂主任和病理科全体老师• 感谢师兄、师姐、同窗好友和师弟、师妹，友谊

地久天长• 最后，深深感谢我的家人给予我的最无私的爱

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