Microbiologia / Microbiologia AmbientalLEGA / MIEA Olga Nunes 2007

Crescimento populacional microbianoMtodos de enumerao / quanticaoContagem do n total de clulas Contagem de clulas viveis Determinao da biomassa Turbidimetria

Olga Nunes

CRESCIMENTO MICROBIANO POPULACIONAL (ASSEXUADO)

Crescimento PopulacionalAumento do nmero de clulas da populao ao longo do tempo;

Como podemos medir o crescimento de uma populao microbiana?Qualquer constituinte da biomassa pode ser utilizado para quanticar o crescimento e determinar a taxa de crescimento:

Clulas

Biomassa

ProtenasOlga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.1 Contagem directa ao microscpio

1 Uma diluio da cultura introduzida numa cmara de contagem:(Lmina de vidro com quadrculos de rea e profundidade conhecidos)

2 Contam-se as clulas ao microscpio

3 Calcula-se o n de clulas por mililitro da amostra inicial.Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.1 Contagem directa ao microscpio

Desvantagens: No distingue clulas mortas de clulas vivas; Clulas pequenas so pouco visveis Baixa preciso;

Suspenses com < 106 clulas /ml no so quanticveis;

Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.2 Contagem com citmetro de uxo, ou contador Coulter1 Um volume conhecido de amostra da cultura passa entre dois elctrodos; 2 Cada clula faz diminuir a condutividade elctrica entre os elctrodos; 3 Regista-se a variao da condutividade de cada clula;+

-

Desvantagens: No distingue clulas mortas de clulas vivas;Olga Nunes

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.3 Contagem do no total de clulas com corantes uorescentes1 Uma amostra da cultura filtrada e incubada com corantes fluorescentes 2 Contam-se as clulas ao microscpio de fluorescncia / confocal 3 Calcula-se o n de clulas por mililitro da amostra inicial.

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.3 Contagem do no total de clulas com corantes uorescentes que intercalam o DNA

Estafilococos (acridina laranja)

Escherichia coli (DAPI)

Desvantagens: No distingue clulas mortas de clulas vivas;

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.3 Contagem do no total de clulas com mistura de corantes uorescentesKit Live/dead (Bac light) :

Corantes de DNA: SYTO 9 - verde - entra livremente nas clulas Iodeto de propdio - vermelho - s penetra nas clulas com membrana danificada

Vantagens: Distingue clulas viveis de clulas no viveis;

Crescimento Populacional 1. Contagem do n de clulas1.4 Fluorescent in situ hibridization (FISH)1. Utilizam-se sondas de DNA que: hibridam especificamente com um gene que esto ligadas a um fluorocromo 2. Quando a sonda adicionada a uma amostra com diferentes tipos de clulas, apenas as clulas que possuem aquele gene ficam coradas com o fluorocromo. 3. A uma mesma amostra podem ser adicionadas vrias sondas, com fluorocromos diferentes. Vantagens: Distingue diferentes tipos de clulas cultura mista

1.4 Fluorescent in situ hibridization (FISH)

Amostra: lamas activadas M. Confocal M. ptico Sondas:1. Bactrias que oxidam amnia (vermelho) (NH3 (NO2NO2-) NO3-) 2. Bactrias que oxidam nitrito (verde)

Crescimento Populacional

2. Contagem de clulas viveisUma clula vivel aquela que ainda tem capacidade para se dividir e originar novas clulas, formando uma colnia em meio slido;

Assim, podemos observar vista desarmada a colnia originada pela clula vivel, designada por unidade formadora de colnia (U.F.C.)

Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis2.1 Espalhamento em placa1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml meio de cultura Cultura 0,1 ml IncubaoOlga Nunes

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

U.F.C.

Crescimento Populacional2.1 Espalhamento em placa10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

APS PERODO DE INCUBAO N DE U.F.C. DEMASIADO ELEVADO PARA CONTAR

171

16

2

0

N U.F.C. / ml CULTURA = 171 X 104Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis2.2 Incorporao em agar1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml meio de cultura Cultura10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

1 ml

Meio agarizado lquido

U.F.C.

IncubaoOlga Nunes

Crescimento Populacional2.2 Incorporao em agar10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

APS PERODO DE INCUBAO N DE U.F.C. DEMASIADO ELEVADO PARA CONTAR

171

16

2

0

N U.F.C. / ML CULTURA = 171 X 103Olga Nunes

Crescimento Populacional 2. Contagem de clulas viveis Nota:OS MEIOS DE CULTURA E AS CONDIES DE INCUBAO DEVEM SER ADEQUADOS AOS ORGANISMOS A ENUMERAR

Desvantagens: No mtodo de incorporao em agar: organismos aerbios podem ter diculdade em se desenvolver; o choque trmico provocado pela adio de meio de cultura pode inibir os microrganismos;Olga Nunes

Crescimento Populacional 3. Determinao de Biomassa3.1 Peso hmidoFunil

1 Pesa-se uma membrana filtrante; 2 Filtra-se um volume conhecido de suspenso celular; 3 Lavam-se as clulas; 4 Pesa-se a membrana filtrante com a biomassa; 5 Calcula-se o peso da biomassa por litro de cultura;Sistema de vcuo Membrana filtrante Suporte Vedante

Olga Nunes

Crescimento Populacional 3. Determinao de Biomassa3.2 Peso secoSemelhante ao mtodo 3.1, mas a membrana filtrante com a biomassa colocada numa estufa a 105C at peso constante;

Peso seco de uma clula procariota: 10-15 a 10-11 g. Peso seco de uma clula eucariota: 10-11 a 10-7 g. Peso seco : ~ 20 a 30% do peso hmido.

Olga Nunes

Crescimento Populacional 4. TurbidimetriaPrisma Amostra de cultura (selecciona ) (ou sua diluio) Clula fotoelctrica Registador

Feixes de luz atravessam a suspenso

Densidade ptica (Log l0/l)

(l0)

Feixes de luz no dispersados pelas clulas

(l)Olga Nunes

Crescimento Populacional 4. TurbidimetriaComo cada clula dispersa a luz incidente, quanto maior o n de clulas, maior a disperso de luz;

A relao absorvncia / densidade celular aproximadamente linear (numa certa gama de concentraes celulares)

um mtodo muito utilizado pois RPIDO e NO DESTRI a amostra. Biomassa Pode construir-se uma curva que relacione a absorvncia com: N de clulas ProtenaOlga Nunes

Crescimento populacional microbianoCrescimento em descontnuo Fases de crescimento Cintica

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo

3 - 10%COLNIA

VASO CULTURA EM MEIO SLIDO CULTURA DE INCULO

CULTURA ONDE SE SEGUE O CRESCIMENTO (VOLUME CONSTANTE)

Olga Nunes

Curva de crescimento em descontnuoEscala linear2 10 ADAPTAO EXPONENCIAL

Escala semi-logartmica

Biomassa (g/l)

Biomassa (g/l)

1.5

1

0.1

0.5

0

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0.01

0

1

2

3

4

5

6

MORTE 7 8Olga Nunes

1

Tempo (horas)

Tempo (horas)

ESTACIONRIA

Crescimento em descontnuo1. Fase de adaptaoPerodo de tempo necessrio para as clulas sintetizarem todos os componentes necessrios para crescerem naquelas condies.

Depende: Fase crescimento do inculo; Composio do meio de cultura; Condies de incubao; Estado das clulas;

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo2. Fase exponencial consequncia do facto de cada clula originar duas clulas filhas.

Depende: Caractersticas genticas do organismo; Composio do meio de cultura; Condies de incubao;

Olga Nunes

Crescimento em descontnuo3. Fase estacionriaNum sistema fechado, o crescimento no pode continuar indefinidamente devido: falta de um nutriente essencial; acumulao de produtos txicos; Normalmente a fisiologia das clulas diferente, pois tm que se adaptar a condies adversas.

4. Fase morteAs clulas da populao morrem porque as suas reservas energticas se esgotaram;Olga Nunes

Cintica do crescimento em descontnuoTaxa de crescimento: variao do n de clulas por unidade de tempoA taxa de aumento da populao no tempo (t) proporcional densidade populacional (N), nesse instante, ento:

(1)

dN/dt = N

N = nmero clulas t = tempo = taxa especca de crescimento instantneo (t-1)

Integrando entre N0, no tempo t0 e N, no tempo t, para constante:

(2) ln N = ln N0 + (t-t0)

N0 = nmero clulas inicial N = nmero clulas nal

ou(3) = (ln N - ln N0) / (t-t0)

= taxa especca decrescimento instantneo (t-1)

Olga Nunes

Cintica do crescimento em descontnuo

Durante fase de adaptao Durante fase exponencial Durante fase estacionria Durante fase de morte

~0 = max. ~0 D

dN/dt > 0

N

S

Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuoNum quimiostato:

[S]

funo directa de S

No estado de equilbrio (estado estacionrio), o quimiostato auto-regula-se:

1.

momentneo

Mais clulas a consumir S

S

2. momentneo

Falta nutrientes

Menos clulas a consumir S Mais clulas Mais nutrientes

S

Olga Nunes

Cintica do crescimento em contnuoNum quimiostato: Se D for mantido constante, em estado estacionrio:

dN/dt = 0Nclulas que permanecem - Nclulas que saem do vaso = 0

N - DN = 0Em estado estacionrio:

=D

D = max. S / (ks + S) e S = ks D / max. - DOlga Nunes

Quimiostato no estado estacionrioSada de biomassa (g/l/h)

Conc. substrato (g/l)

Conc. biomassa (g/l)

8 6 4 2 0

4 3 2 1 0 0,0 0,5Taxa de diluio (h-1)

8Tempo de gerao (h)Olga Nunes

6 4

2

0 1,0

washout

Cintica do crescimento dX/dt = - Y dS/dt Y = - dX/dSX = biomassa produzida t = tempo S = substrato limitante

Taxa de produo de biomassa funo da taxa de consumo de substrato

Y = rendimento em biomassa relativamente ao substrato S Y = massa biomassa produzida/massa substrato consumidoMedida da ecincia das clulas na converso do substrato em biomassa

Olga Nunes

Cintica do crescimento Produtividade da fermentao P = concentrao do produto /tempo de fermentao (unidades/h-1)Tempo de limpeza Tempo preparao do fermentador Tempo fase de adaptao

}

Afectam produtividade

Olga Nunes