15. propiedades de las proteínas
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15. Propiedades de las proteínas
Base añadida (uu.arbitrarias)
0 20 40 60 80 100
pH
0
2
4
6
8
10
12
14
Titulación ácido-base de una proteína
pI
Carga positiva neta
Carga negativa neta
Grupos disociables de una proteína
Ácidos(aniónicos, - )
Asp 3.86Cys 10.78Glu 4.25Tyr 10.07
Básicos(catiónicos, + )
Arg 12.48His 6.00Lys 10.53
Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa
Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa
(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso)
Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentancarga negativa neta.
Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.
En el medio biológico, son, porlo general, más abundantes lasproteínas ácidas.
Electroforesis
1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para mini-mizar efectos de difusión
Muestra
+- 2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica
3. Terminada la carrera electro-forética, las proteínas se tiñencon un colorante adecuado(p.e., Azul de Coomassie)
Fundamento de la cromatografíaMuestra:
tres componentesmezclados
Fase móvil
Faseestacionaria
Se hace fluir una fasemóvil sobre la estacionaria
Dependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla
primitiva se separan
Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria
1. Intercambio iónico- Separa según carga eléctrica- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH
2. Partición- Separa según solubilidad en solventes- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido- Fase móvil: El otro solvente fluyendo
Tipos de cromatografía
3. Afinidad- Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre
4. Hidrofóbica- Separa según hidrofobicidad- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente inverso de sal
5. Exclusión molecular- Separa según tamaño molecular- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada
+
+++
+++++
---
-
----
--
-
+
+++
+++++
-
--
--
--
---
- -- -
-
-
--
-
+
+++
+++++
-
-
--
--
---
-
-
---
-
- -
--
-
Proteínas adsorbidasal intercambiador
iónico
A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos
electronegativas
A mayor concentraciónde sal se desprenden
las proteínas máselectronegativas
Intercambio iónico
O
OH
HOCH2
OHH
H
HOO
O
OH
HOCH2
OHO
H
H
H
H
nCelulosa
O
O
H
H
OH
CH2
O
H
O
O
OH
OH
HOCH2
HO
H
H
n
AgarosaO
OH
CH2
OH
H
HOH
O
OH
OH
H
H
CH2
O
H
O
H
H
OH
H
O
n
Dextrano
Soportescromatográficos
CH2 CH2 NH+CH2
CH2 CH3
CH3
Dietilaminoetil (DEAE)
CH2 CH2 N+ CH2 CH3
CH2
CH3
CH2
CH3
Trietilaminoetil (TEAE)
CH2 CH2 N+ CH2
CH2
CH3
CH2
CH3
CHOH CH3
Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)
CH2 COO-
Carboximetil (CM)
CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfoetil (SE)
CH2 CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfopropil (SP)
O P
O
O-
O-
Fosfo (P)
Bo m b a p e ristá ltic a
G e ne ra d o rd e g ra d ie nte
C o lum na
C o le c to r d efra c c io ne s
Re sina d einte rc a m b ioió nic o
Cromatografía deintercambio iónico
O
O HN NH
SO3-
NN
N
NH
SO3-
O CH2
Cibacron Blue F3GA
Matriz de agarosa
Cromatografía de adsorción a colorantes
1 2 3
Cromatografía de afinidad
Solubilidad
pHpI
Punto isoeléctrico
Solubilidad
Fuerzaiónica, (M)
Salting in
Salting out
Solubilidad,g/L
Temperatura, ºC
00 100
100
Peso molecular de las proteínas
1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc.
2. Cromatografía de exclusión molecular
3. Electroforesis SDS-PAGE
4. Cálculo directo a partir de estructura primaria
Cromatografía de exclusión molecular
Glucagon
Citocromo c
Ribonucleasa
Seroalbúm ina
IgGTiroglobulina
Volumen
Peso m olecular
280
240
200
160
120
80
40
103
104
105
106
BSDS
M ovilidad (cm)
Pesom olecular
Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)
+
-
+
-
+
-
Método de Kjeldahl
Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno
a NH3, que se valora por titulación.
Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis
elemental (p.e., alimentos)
Proteína total= N x 100/16
Absorción a 280 nm
Se fundamenta en la absorción a 280 nm producidapor los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp
- Sensible y fácil de practicar- Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas- Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos
H2N C
O
NC
O
NH2
H OC
NHC
O
HN
HN
-OC
HNC
-O
NH
NH
Cu++
OHH
OHH
BiuretComplejo cúprico coloreado
Reacción del biuret
Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestoscon grupos -CO-NH- dan una coloración violeta.Muy específica; relativamente poco sensible
Método de Lowry
Reacción en dos fases:
1. Reacción del biuret2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu
- Muy sensible (muestras de 10 g) y sencillo- Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos
400 500 600
0.2
0.3
0.4
400 500 600
0.2
0.3
0.4
700
Colorante Colorante + proteína
Método de Bradford
La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteínamodifica las características de absorción visible de aquél.
Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes