1470-4460-1

7/26/2019 1470-4460-1

1/5

76

Revista Interdisciplinar de Estudos Experimentais, v. 2, n. 3, p. 76 - 80, 2010

PROGRAMANDO O SOFWARE IMAGEJ PARA A SELEOAUOMICA DE REAS MARCADAS POR IMUNOHISOQUMICA E CORADAS COM O CROMGENO DAB E

CONRACORADAS PELA HEMAOXILINA.PROGRAMMING IMAGEJ SOFTWARE FOR AUTOMATIC SELECTION OFIMMUNOHISTOCHEMISTRY MARKED AREAS STAINED BY DAB CHROMOGEN ANDCOUNTERSTAINED BY HEMATOXYLIN.

Roberto Sotto-Maior Fortes de Oliveira*, Fabiana Aparecida Mayrink de Oliveira**, Hlady Sanders Pinheiro***

RESUMO

Introduo: A quantificao dos parmetros de imunomarcao na anlise de imagens de imuno-histoqumicadepende da adequada delimitao das regies marcadas, sendo a seleo destas regies realizada manualmente ouatravs de mtodos computacionais automticos ou semi-automticos. Objetivos: Viabilizar um mtodo de seleoautomtica de reas marcadas por imuno-histoqumica por meio do software ImageJ, apresentando a programaoenvolvida e analisando quantitativamente as imagens.Mtodos: Para a aplicao e avaliao da programao proposta neste trabalho foram utilizadas imagens deimuno-histoqumica para localizao de alfa-actina de msculo liso (-SMA) provenientes de estudo de modeloanimal experimental de fibrose renal em ratos Wistar machos. Foram capturadas imagens de reas distintas daregio do crtex renal contendo regies positivas coradas pelo 3,3-Diaminobenzidina (DAB) em uma lminacom imunomarcao extensa (n=10) e em outra lmina com Imunomarcao focal (n=10), provenientes de doisanimais. A contra-colorao foi feita com hematoxilina. Resultados: A diferena da extenso da imunomarcao foiqualitativamente evidente entre os dois grupos de imagens. As reas reveladas pelo DAB nas lminas dos animaisI e II foram selecionadas automaticamente pelo programa, ajustadas pelo operador, e quantificadas, apresentandofrao de rea ocupada de 23,48 6,52% e de 0,10 0,04% respectivamente, valores expressos em mdia desviopadro com diferena estatstica significativa (p < 0,0001).Concluses: O software ImageJ mostrou-se adequado paraa aplicao da seleo automtica de reas marcadas por imuno-histoqumica, embora a interveno do operadortenha sido necessria para a correta identificao dos pontos de corte do threshold, supervisionando a corretadelimitao das reas.

PALAVRAS-CHAVE

Imuno-histoqumica. 3,3-Diaminobenzidina. Hematoxilina. Modelos Animais. Ratos Wistar.ABSTRACT

Introduction: Te immunostaining quantitative parameters of immunohistochemistry image analysis depend onthe proper delimitation of marked regions. Te selection of those marked regions is carried out manually, or bycomputed semi-automatic or automatic methods.Objectives: to carry out a feasible automatic method on selectionof immunohistochemistry stained areas applying the Image J software (NIH), presenting the computed programand the quantitative analysis of some images.Methods: For application and evaluation of the proposed program ofthe study, we used immunehistochemistry images of alpha-smooth muscle actin (-SMA), a marker of epithelialdedifferentiation, coming from an experimental study of renal fibrosis in Wistar male rats. Te images have beencaptured from non-overlapping regions of the renal cortex, comprising positive 3,3-Diaminobenzidine (DAB)-stainedfields of a strong immunostained slide (N=10, animal I) and another slide with focal immune pattern (N=10, animalII), obtained from two different animals. Te slides were counter-stained by Hematoxylin.Results: Te difference byimmunostaning between the two specimens was qualitatively evident. Te areas revealed as DAB-positive in animalsI and II slides were automatically selected by the proposed program, visually adjusted by the operator, and finally,quantified, resulting in an occupied area fraction of 23.48 6.52% and 0.10 0.04%, respectively, p

7/26/2019 1470-4460-1

2/5

77


1 INRODUO

A quantificao dos parmetros de imunomarcao na anlise de

imagens de imuno-histoqumica depende da delimitao das regies

marcadas em relao s regies no marcadas (DI CAALDO et al.,

2010). Uma vez selecionadas as regies com marcao positiva, pode-

se quantificar a porcentagem de rea imunomarcada por meio de

software de processamento de imagens (BREY et al., 2003).

A seleo das regies identificadas como marcadas positivamente

para o cromgeno pode ser feita manualmente atravs da demarcao

direta sobre cada imagem, embora desta forma esta seleo fique sujeita

s variaes do observador ou a dificuldades de seleo quando baixos

nveis de antgenos so corados sobre uma contra-colorao escura,

alm de ser demorado, sobretudo para grandes quantidades de imagens

e/ou extensas reas marcadas (BREY et al., 2003).

Vrios mtodos computacionais foram desenvolvidos para

realizar a rpida separao das reas imunomarcadas das imagens

de fundo, de maneira automtica ou semiautomtica, diminuindo

consideravelmente a interveno do operador e desta forma o vis

(GOO et al., 1992; KING et al., 2002; KOHLBERGER et al.,

1999; LEHR et al., 1997; MA, 1999; MONIRONI et al., 1996;

RUIFROK; JOHNSON, 2001; RUIFROK, 1997; SMEJKAL;

SHAINOFF, 1997; UNDERWOOD et al., 2001; VILAPLANA;

LAVIALLE, 1999).

O DAB (3,3-Diaminobenzidina) comumente utilizado em

imuno-histoqumica na identificao de tecidos marcados pelo

mtodo da imunoperoxidase. O DAB atua como cromgeno, que na

presena da enzima peroxidase produz um precipitado de cor marrom,

revelando desta forma os tecidos imunomarcados. A contracolorao,

quando realizada com a hematoxilina, deixa os tecidos no marcados

com a cor azul de fundo.

Um mtodo de anlise de imagens que permite a seleo

automtica de reas imunomarcadas reveladas pelo DAB utiliza a

converso das imagens RGB (24-bit), obtidas das lminas coradas

pelo DAB e contra-coradas pela hematoxilina, em imagens de 8-bit

normalizadas pelo canal azul (BN), permitindo o delineamento

preciso das reas coradas em relao aquelas contracoradas de fundo.

O mtodo foi implementado em um programa comercial de anlise de

imagem (IPLab 3.5, Scanalytics, Fairfax, USA), podendo tambm ser

empregado usando outros programas de processamento de imagem,

inclusive o NIH Image, embora a programao seja mais complexa

com este software (BREY et al., 2003).

O ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, USA),

substituto do NIH Image, um programa de processamento digital

de imagens de domnio pblico, gratuito, de uso consolidado pela

comunidade cientfica, principalmente na rea de microscopia. Para

viabilizar a aplicao do mtodo das imagens BN por meio do ImageJ,

desenvolvemos o presente trabalho, apresentando a programao

envolvida e aplicando o programa na seleo automtica e anlise

quantitativa de reas marcadas por imuno-histoqumica utilizando

o cromgeno DAB e contracorados pela hematoxilina (BURGER;

BURGE, 2008; Collins, 2007).

2 MAERIAIS E MODOS

Para a aplicao e avaliao da programao proposta neste trabalho

foram utilizadas imagens de imuno-histoqumica para localizao

de -SMA, provenientes de estudo de modelo animal experimental

de fibrose renal realizado no Centro de Biologia da Reproduo-

CBR/UFJF, cujo protocolo (n 005/2008CEEA) foi aprovado

pela Comisso de tica na Experimentao Animal da Universidade

Federal de Juiz de Fora.

2.1 IMUNOHISOQUMICA

A imuno-histoqumica foi realizada em cortes histolgicos

parafinizados de rim de dois ratos Wistar machos de seis semanas de

idade. Para tanto, as lminas foram desparafinizadas, reidratadas e

expostas a uma soluo de ris-EDA (pH 9) a 95 para a recuperao

antignica. A atividade de peroxidase endgena foi bloqueada com

perxido de hidrognio a 3% e adicionalmente com uma soluo

bloqueadora de protena (Envision, DAKO, USA). Seguiu-se com a

incubao do anticorpo primrio -SMA (Abcam, USA) na titulao

de 1:300, e com a incubao com o polmero marcado (Envision,

DAKO,USA), usando duas incubaes sequenciais de 30 minutos

temperatura ambiente. A marcao foi revelada pela colorao como cromgeno 3,3 diaminobenzidina (DAB), corando o antgeno

especfico de marrom, seguida pela contracolorao pela hematoxilina.

2.2 CAPURA E ANLISE DE IMAGEM

As imagens utilizadas para anlise foram capturadas com

microscopia de campo claro e objetiva de 20 X por meio de um sistema

de captura (Carl Zeiss, Germany) composto de: microscpio AxioPhot

I, equipado com cmera AxioCam ICc3 e software AxioVision v

4.7.2.0.

Em lminas provenientes dos dois animais, foram capturadas dez

reas distintas da regio do crtex renal contendo regies positivas,

ou seja, coradas de marrom. As 20 imagens geradas foram gravadas

em RGB (24-bit) no formato iff, sem compresso, e possuam a

dimenso de 2080 x 1540 pixels.

O processamento e anlise das imagens foram realizados com o

software de domnio pblico ImageJ 1.43a, verso 64-bits (National

Institutes of Health, Bethesda, USA; http://rsbweb.nih.gov/ij/), que

um aplicativo Java que pode ser executado na maioria dos sistemas

7/26/2019 1470-4460-1

3/5

78


operacionais (CARMONA et al., 2007). No presente estudo, o software

ImageJ foi instalado em um computador com processador Intel Core

Duo (Intel Corporation, USA), com 4 gigabyte de memria RAM e

sistema operacional Windows 7, de 64 bits (Microsoft Corporation,

USA).

Para o clculo da imagem normalizada pelo azul (BN), cadaimagem RGB foi inicialmente duplicada e separada em trs imagens

distintas de tons de cinza (8-bit), levando informaes dos canais de

cor vermelha, verde e azul, respectivamente. Uma nova imagem (BN)

de 8-bit e dimenses 2080 x 1540 foi criada para receber, pixel a pixel,

os valores provenientes do clculo da frmula (1) aplicada sobre os

valores contidos em cada pixel das imagens dos trs canais de cor:

,onde R, G e B so os valores dos pixels dos trs canais de cor

(vermelho, verde e azul, respectivamente) e * indica multiplicao

(Brey et al., 2003).

O cdigo programado em comandos de macro para gerar a imagem

normalizada BN, seguindo a orientao acima, est apresentado a

seguir. Notar a presena de comentrios aps todos os comandos com

finalidade didtica. Os comentrios esto separados dos comandos

pela marca de comentrio // e no so executados pelo programa,

servindo apenas de anotaes:

macro RGB_to_BN {

// inicializa-se o cdigo com o nome da macro

orig = getitle();

// armazena o nome do arquivo de origem

run(Duplicate..., title=temp);

// gera uma cpia da imagem de origem

M = getWidth();

// armazena a largura da imagem

N = getHeight();

// armazena a altura da imagem

setBatchMode(true);

// seleciona o modo de execuo em Batch, que 20 vezes maisrpido que o modo normal

run(Split Channels);

// executa a separao dos canais de cor gerando as trs imagens

de 8-bit

newImage(orig+_BN, 8-bit Black, M, N, 1);

// cria-se uma nova imagem BN vazia de 8-bit

for (v=0; v, no modo automtico, porm o

melhor ponto de corte, aquele que melhor delimitava a rea marcada

sem englobar o background, se necessrio, era ajustado pelo operador

para cada imagem. Aps o ajuste, o comando Measure do menu

Analyze era aplicado para se registrar a porcentagem da rea ocupada,limitando-se regio selecionada pelo comando Treshold.

2.3 ANLISE ESASICA

As variveis quantitativas avaliadas foram: (i) o tempo de execuo

do cdigo durante o processamento da gerao das imagens normalizadas

BN; (ii) os valores das reas imunomarcadas calculadas. Para a comparao

destas variveis, obtidas nas imagens dos animais I e II, foi utilizado o teste

t de Student com nvel de significncia = 5 %.

7/26/2019 1470-4460-1

4/5

79


3 RESULADOS E DISCUSSO

Neste trabalho foram processadas e analisadas 20 imagens

capturadas de lminas imunomarcadas para alfa-actina de msculo

liso (SMA), revelado pelo DAB e contracoradas pela hematoxilina.

As imagens provenientes do animal I (n=10) apresentaram-seextensamente imunomarcadas, enquanto as imagens do animal II

(n=10) apresentaram-se focalmente coradas pelo DAB (Figura 1a e

1b). A diferena da extenso da imunomarcao foi qualitativamente

evidente entre as imagens dos dois animais utilizados neste estudo.

Entretanto, para uma comparao quantitativa destas reas marcadas,

fez-se necessrio o clculo da porcentagem da rea ocupada pelo

corante DAB em relao rea total da imagem.

A programao seguindo o mtodo das imagens BN foi realizada

utilizando a linguagem de macro, que uma maneira relativamente

simples de se automatizar comandos no ImageJ (COLLINS, 2007). A

macro utilizada foi eficiente na converso das imagens RGB (24-bit) emimagens de tons de cinza normalizadas para o azul (Figura 1c e 1d).

O tempo para o processamento de cada imagem foi de 12,66 0,25

segundos nas imagens do Animal I e de 12,51 0,14 segundos nas

imagens do Animal II, valores expressos em mdia desvio padro, no

havendo diferena estatstica entre os grupos de imagens. Este tempo

foi relativo ao processamento da frmula (1) aplicada pixel a pixel,

perfazendo 3.203.200 (trs milhes, duzentas e trs mil e duzentas)

operaes em cada imagem de tamanho 2080 x 1540 pixels. O tempo

de processamento no foi sensvel quantidade de rea marcada visto ser

em operaes pixel a pixel em todos os pixels da imagem, podendo ser

reduzido ou aumentado, caso o tamanho das imagens fosse menor ou

maior, respectivamente. Este tempo poder ser reduzido caso o cdigo

seja implementado na linguagem JAVA, mais potente que a macro,

atravs de programao de Plug-in para o ImageJ (COLLINS, 2007).

Aps o processamento, as reas imunomarcadas foram

segmentadas pelo mtodo de Treshold das imagens BN obtidas.

Em cada imagem, o comando Treshold foi executado no modo

automtico, porm em todas as imagens foi necessrio o adequado

ajuste do ponto de corte para se obter uma melhor delimitao da

rea marcada pelo DAB em relao s imagens de contracolorao.

Para o mtodo ser automatizado, imagens de teste devem ser utilizadaspara se obter o melhor ponto de corte antes de aplicar o mtodo nas

imagens subsequentes (BREY et al., 2003). A iluminao e colorao

no homogneas das lminas podem dificultar a distino entre

as imagens marcadas e as imagens de fundo, levando as tcnicas de

segmentao baseadas no Treshold global ao erro. Na maioria das

vezes, necessria a interveno manual para a soluo de casos difceis

ou ambguos (DI CAALDO et al., 2010).

As porcentagens das reas reveladas pelo DAB em relao rea

total das imagens foram ento quantificadas, apresentando o grupo de

imagens do animal I (n=10) e animal II (n=10), 23,48 6,52% e 0,10

0,04%, respectivamente (Figura 1e e 1f), valores expressos em mdia

desvio padro, com diferena estatstica significativa (p < 0,0001).

Esses valores esto de acordo com a avaliao qualitativa inicial, na

qual as imagens do animal I apresentavam extensas reas de DAB e do

animal II, pequenas reas focais.

Figura 1 Imagens das lminas de imuno-histoqumica com a coloraomarrom representando as reas imunomarcadas para -SMA, reveladas pelocromgeno DAB e a contracolorao por hematoxilina com a cor azuladade fundo representando reas que no expressam o antgeno de interesse. (a)imagem com imunomarcao extensa; (b) imagem com imunomarcao focal(setas); (c,d) imagens em tons de cinza, normalizadas pelo azul (BN), geradaspela execuo da macro aplicada sobre as imagens em (a) e (b), respectivamente;(e,f ) imagens resultantes da aplicao do comando threshold sobre as imagens(c) e (d), identificando a rea marcada positivamente (em branco) e a imagemde fundo no marcada (em preto). O clculo da porcentagem da rea marcada feito automaticamente pelo ImagJ por meio do comando Measure, limitados reas previamente selecionadas pelo Treshold em (e) e (f).

4 CONCLUSES

O software ImageJ mostrou-se adequado para a aplicao do

mtodo de normalizao pelo canal azul para a seleo automtica

de reas marcadas por imuno-histoqumica, utilizando o cromgeno

DAB e contracorados pela hematoxilina, embora a interveno do

operador seja necessria para a correta identificao dos pontos de

corte do threshold, supervisionando a correta separao das reas

imunomarcadas em relao as reas contracoradas.

5 REFERNCIAS

BREY, E.M.; LALANI, Z.; JOHNSON, C.; et al. Automatedselection of DAB-labeled tissue for immunohistochemicalquantification.Te Journal of Histochemistry and Cytochemistry,Baltimore, v. 51, n. 5, p. 575-584, 2003.

BURGER, W.; BURGE, M. Digital Image Processing: AnAlgorithmic Introduction Using Java. 1. ed. New York: Springer,2008.

7/26/2019 1470-4460-1

5/5

80


CARMONA, R.; MACAS, D.; GUADIX, J.A.; PORILLO, V.;PREZ-ROMARES, J.M.; MUOZ-CHAPULI, R. A simpletechnique of image analysis for specific nuclear immunolocalizationof proteins.Journal of Microscopy, Oxford, v. 225, n. Pt 1, p. 96-99, 2007.

COLLINS, .J. ImageJ for microscopy. Biotechniques, Natick, v.43, n. 1, p. 25-30, 2007.

DI CAALDO, S.; FICARRA, E.; ACQUAVIVA, A.; MACII, E.Automated segmentation pf tissue images for computerized IHCanalysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine,Amsterdam, v. 100, n. 1, p. 1-15, 2010.

GOO, M.; NAGAOMO, Y.; HASUI, K.; YAMANAKA,H.; MURASHIMA, S.; SAO, E. Chromaticity analysis ofimmunostained tumor specimens. Pathology, Research andPractice, Stuttgard v. 188, n. 4-5, p. 433-437, 1992.

KING, .W.; BREY, E.M.; YOUSSEF, A.A.; JOHNSON, C.;PARICK, C.W.Jr. Quantification of vascular density using asemiautomated technique for immunostained specimens.Analyticaland Quantitative Cytology and Histology, St. Louis, v. 24, n. 1,p. 39-48, 2002.

KOHLBERGER, P.D.; BREENECKER, F.; KAIDER, A.; etal. Modified true-color computer-assisted image analysis versussubjective scoring of estrogen receptor expression in breast cancer:a comparison.Anticancer Research, Athens, v. 19, n. 3B, p. 2189-2193, 1999.

LEHR, H.A.; MANKOGG, D.A.; CORWIN, D.; SANEUSANIO,

G.; GOWN, A.M. Application of photoshop-based image analysis toquantification of hormone receptor expression in breast cancer. TeJournal of Histochemistry and Cytochemistry, Baltimore, v. 45,n. 11, p. 1559-1565, 1997.

MA, W.; LOZANOFF, S. A full color system for quantitativeassessment of histochemical and immunohistochemical stainingpatterns. Biotechnic & Histochemistry, Baltimore, v. 74, n. 1,p. 1-9, 1999.

MONIRONI, R.; DIAMANI, L.; HOMPON, D.; BARELS,H.G.; BARELS, P. H. Analysis of the capillary architecture in the

precursors of prostate cancer: recent findings and new concepts.European Urology, Basel, v. 30, n. 2, p. 191-200, 1996.

RUIFROK, A.C. Quantification of immunohistochemical stainingby color translation and automated thresholding. Analytical andQuantitative Cytology and Histology, St. Louis, v. 19, n. 2, p.107-113, 1997.

RUIFROK, A.C.; JOHNSON, D.A. Quantification ofhistochemical staining by color deconvolution. Analytical andQuantitative Cytology and Histology, St. Louis, v. 23, n. 4, p. 291-299, 2001.

SEMJKAL, G.B.; SHAINOFF, J.R. Enhanced digital imaging ofdiaminobenzidenestained immunoblots. Biotechniques, Natick,v. 22, n. 3, p. 462, 1997.

UNDERWOOD, R.A.; GIBRAN, N.S.; MUFFLEY, L.A.; USUI,

M.L.; OLERUD, J.E. Color subtractive-computer-assisted imageanalysis for quantification of cutaneous nerves in a diabetic mousemodel. Te Journal of Histochemical and Cytochemistry,Baltimore, v. 49, n. 10, p. 1285-1291, 2001.

VILAPLANA, J.; LAVIALLE, M.A. A method to quantify glialfibrillary acidic protein immunoreactivity on the suprachiasmaticnucleus.Journal of Neuroscience Methods, v. 88, n. 2, p. 181-187,1999.

1470-4460-1

Documents