LA GENETICA DEI TUMORILA GENETICA DEI TUMORI

Single disease? Single disease?

No, group of No, group of multifactorialmultifactorial diseases diseases

(100 types of cancer have been classified: (100 types of cancer have been classified: leukemiasleukemias/lymphomas, /lymphomas,

carcinomas/carcinomas/adenocarcinomasadenocarcinomas, sarcomas), sarcomas)

Malattia geneticaMalattia genetica

� Mutazioni dominanti (attivazione di

oncogeni)

� Mutazioni recessive (Inattivazione di

oncosoppressori)

� Aploinsufficienza (alterata funzione di geni

regolatori della risposta al danno)

� Stile di vita (es. fumo, dieta, comportamento

sessuale, etc)

� Ambiente (es. esposizione a carcinogeni,

mutageni, UV, etc)

� Vita riproduttiva (contraccezione, età primo

parto, trattamenti per la fertilità, etc)

� Altro (difetti metabolici ���� produzione ROS,

prodotti mutageni, etc)

Malattia ambientaleMalattia ambientale

La base genetica del cancroLa base genetica del cancro

1.1. ereditereditàà clonaleclonale

2.2. induzione di tumore da parte di virusinduzione di tumore da parte di virus

3.3. il tumore può essere indotto da agenti mutageniil tumore può essere indotto da agenti mutageni

4.4. familiaritfamiliaritàà di alcuni tipi di tumoridi alcuni tipi di tumori

5.5. associazione tra tumori e alterazioni cromosomicheassociazione tra tumori e alterazioni cromosomiche

……unun tumore maligno e' un evento rarissimo!tumore maligno e' un evento rarissimo!

- Nel corpo umano ci sono circa 1011 cellule che replicano (su circa 1014 totali)

-Il tasso di mutazione spontanea nell’uomo è di 10-4 - 10-5/gene/generazione;

Nonostante l’alto numero di mutazioni che presumibilmente si verificano, non

si sviluppa un tumore

-molte di queste mutazioni sono riparate e corrette (tasso ridotto tra 10-9 e 10-

11);

- altri meccanismi protettivi (checkpoint, apoptosi, senescenza, sistema

immunitario, etc)

- necessità di più mutazioni

- elevati tempi di latenza

Il tumore Il tumore èè la seconda causa di morte in Italiala seconda causa di morte in Italia(rilevazione ISTAT 2010)(rilevazione ISTAT 2010)

TuttaviaTuttavia……....

Il tumore Il tumore èè un processo un processo multistepmultistep(modello di Fearon e Vogelstein per lo sviluppo del carcinoma colorettale)

DisplasiaDisplasia Carcinoma Carcinoma in situin situ Carcinoma metastaticoCarcinoma metastaticoEpitelio normaleEpitelio normale

No single No single mutationmutation can can convertconvert a a normalnormal cellcell intointo a a malignantmalignant oneone !!!!!!

Mutazioni

modificazioni epigenetiche

Attivazione di oncogeni Inattivazione di oncosoppressori

Trasformazione neoplastica

Il cancro e' una malattia (Il cancro e' una malattia (epiepi)genetica)genetica

(>30)(>30)(>100)(>100)

STOP

““StopStop”” and and ““gogo”” signalssignals

Oncogene as the accelerator Tumor suppressor as the brake

In tumors

OncosoppressoriOncosoppressori::

� Regolatori del ciclo cellulare (INK4a, pRb, p53)

� Proteine dei “checkpoint” (p53, ATM, CHK1 e 2)

� Enzimi di riparazione del DNA (BRCA1 e 2)

Oncogeni:Oncogeni:

� Fattori di crescita (c-sis/PDGF)

� Recettori per fattori di crescita (ErbB2, HER/neu)

� Trasduttori del segnale (Ras, Src, Abl)

� Fattori trascrizionali (ββββ-catenina, myc)

� Effettori coinvolti nella proliferazione (ciclina D1)

CancerCancer and and apoptosisapoptosis

ApoptosiApoptosi

citocromo c/

Via intrinsecaVia intrinseca Via estrinsecaVia estrinseca

oncogene oncosuppressor

� Regolatori negativi delle giunzioni cellulari ���� (Twist, Twist, SnailSnail, , metalloproteasimetalloproteasi))

� Fattori angiogenici (VEGF)(VEGF)

“Metastasis suppressors”:

� Componenti o regolatori delle adesioni cellulari ���� ((EE--caderinacaderina, inibitori delle , inibitori delle

metalloproteasimetalloproteasi))

GENI DELLA PROGRESSIONE TUMORALEGENI DELLA PROGRESSIONE TUMORALE

“Metastasis inducers”:

From Hanahan and Weinberg, 2000

The hallmarks of cancerThe hallmarks of cancer

From Hanahan and Weinberg, 2000

e.g. activate Ha-Ras oncogene

e.g. loseRb suppressor

e.g. producesurvivor factors like IGF

e.g. inactivate E-cadherine.g. produce VEGF

e.g. turn on telomerase

The hallmarks of cancerThe hallmarks of cancer

Cancers are microcosms of evolution(Merlo et al., Nat Rev Cancer, 2006)

“…mutant cells compete for space and resources, evade predation by

the immune system and can ever cooperate to disperse and colonize

new organs…………”

“…mutant clones can expand or contract by natural selection and

genetic drift, regardless of any negative effect on the

organism…………”

“…dispersion is an advantage for escape from deteriorating local

conditions caused by population growth and the over-consumption

of resources…………”

differenziamento

malignità

Differenziamento e Differenziamento e malignitmalignità…à…

……sonosono inversamente proporzionaliinversamente proporzionali

Tiroide normale Carcinoma follicolare

Carcinoma papilliferoCarcinoma anaplastico

LL’’esempio del carcinoma tiroideoesempio del carcinoma tiroideo

Cancer stem cells

La cellula trasformata origina da cellule differenziate (a) o staminali (b)?

Probabilmente da entrambe!!!

Mutazioni dominanti degli oncogeniMutazioni dominanti degli oncogeni

Oncogeni (>100):Oncogeni (>100):

� Fattori di crescita

� Recettori per fattori di crescita

� Trasduttori del segnale

� Fattori trascrizionali

� Effettori coinvolti nella proliferazione

� Fattori anti-apoptotici

� Regolatori negativi delle giunzioni cellulari

� Fattori angiogenici

�Inibitori di oncosoppressori

Retrovirus e oncogeni virali (Retrovirus e oncogeni virali (vv--onconc))

� (19111911) Peyton ROUSROUS : scopre il primo virus tumorale come agente eziologico del sarcoma dei polli che prende il suo nome (sarcoma di Rous).Il virus contiene l’omologo del gene cellulare src

�Identificazione di altri 20 oncogeni virali tra cui:v-srcv-erbBv-ablv-sisv-fmsv-fosv-Ha-Ras

SrcSrcEGFEGF--RRAblAblPDGFPDGFCSFCSF--11FosFosRasRas

� v-onc sono omologhi a geni cellulari (c-onc) detti protoproto--oncogenioncogeni

VIRUS A DNA:VIRUS A DNA:

�� PAPOVAVIRUSPAPOVAVIRUS

Virus Virus umanoumano del del papillomapapilloma (HPV) (HPV) ���� Carcinoma del collo dell'utero ((ssierotipi ad

alto rischio: 16, 18, 31)

�� HERPESVIRUSHERPESVIRUS

Virus Virus didi EpsteinEpstein--Barr (EBV)Barr (EBV) ���� Linfoma di Burkitt, Carcinoma nasofaringeo

Virus Virus erpeticoerpetico umanoumano didi tipotipo 8 (HHV8 (HHV--8)8) ���� Sarcoma di Kaposi

�� HEPADNAVIRUSHEPADNAVIRUS

Virus Virus dell'epatitedell'epatite B e C (HBV e HCV)B e C (HBV e HCV) ���� Carcinoma epatico

Virus Virus oncògenioncògeni umaniumani

Il 15% circa dei tumori umani ha una probabile eziologia viraleIl 15% circa dei tumori umani ha una probabile eziologia virale

VIRUS A RNA:VIRUS A RNA:

�� RETROVIRUSRETROVIRUS

Virus Virus umanoumano TT--linfotropicolinfotropico (HTLV(HTLV--1)1) ���� Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL)

�� LENTIVIRUSLENTIVIRUS

Virus Virus delldell’’immunodeficienzaimmunodeficienza umanaumana (HIV(HIV--1) 1) �������� Linfomi associati all’AIDS

RbRb p53p53

Adenovirus

E1AE1A

E1BE1B

Large TLarge T

SV40SV40

Virus del Virus del papillomapapillomaE7E7

E6E6

Meccanismo direttoMeccanismo diretto �������� OncoproteineOncoproteine virali possono inattivare virali possono inattivare

oncosoppressorioncosoppressori cellularicellulari

Meccanismo indirettoMeccanismo indiretto �������� LL’’infezione cronica favorisce lo sviluppo infezione cronica favorisce lo sviluppo

del tumore (es. HBV)del tumore (es. HBV)

Attraverso quali meccanismi un protoAttraverso quali meccanismi un proto--oncogene diventa oncogene?oncogene diventa oncogene?

�� Mutazioni puntiformiMutazioni puntiformi

�� DelezioniDelezioni/Inserzioni/Inserzioni

�� Amplificazione genicaAmplificazione genica

�� TraslocazioneTraslocazione cromosomicacromosomica

Guanine nucleotideGuanine nucleotide

Exchange FactorsExchange Factors

GTPaseGTPase ActivatingActivating

ProteinsProteins

da The Biology of Cancer, Garland Science, 2006

Una mutazione puntiforme Una mutazione puntiforme ––unun oncogene: loncogene: l’’es. di Rases. di Ras

Gly12����Val

stimulationstimulation

of of cellcell

proliferationproliferation

StimulationStimulation

of of cellcell

motilitymotilitystimulationstimulation

of of cellcell

proliferationproliferation

InhibitionInhibition

ofof

apoptosisapoptosis

Modificata da The Biology of Cancer, Garland Science, 2007

AmplificazioneAmplificazione genicagenica: : eses. . didi NN--MycMyc nelnel neuroblastomaneuroblastoma

2p= homogeneous staining chromosomal regions

4, 9 o 13

HowHow do do oncogenesoncogenes amplifyamplify??

A B C

Double minutes

From Snustad & Simmons “Principles of Genetics” 2006

CML

FISH image of bcr/abl positive

rearranged metaphase

BCR= Breakpoint Cluster Region

TraslocazioniTraslocazioni cromosomichecromosomiche �������� fusionefusione genicagenica

bcr ablN-term C-term

Constitutively active c-Abl tyrosine kinase

Fusion gene

activation of cell cycle-controlling proteins

inhibition of DNA repair

induction of genomic instability

Figure 24.7 A reciprocal translocation involved in Burkitt’s lymphoma.

Only the translocation chromosome (14q+) that carries both the c-myc oncogene

and the immunoglobulin heavy chain genes (IgH) is shown.

From Snustad & Simmons “Principles of Genetics” 2006

Burkitt’s lymphoma

TraslocazioniTraslocazioni cromosomichecromosomiche �������� overover--espressioneespressione

Il linfoma di Burkitt è una neoplasia di linfociti B maturilinfociti B maturi, endemica nell’Africa equatoriale,

strettamente associata all’infezione del virus di Epstein Barr (agente eziologico?).

Costituisce il 70% dei tumori infantili.

Esiste anche una forma sporadica, presente in Europa e nelle Americhe, e una associata

ad immunodeficienza (es.HIV)

Esordisce come tumefazioni delle ossa mascellari e degenerazioni delle mucose

circostanti.

La traslocazione più comune è la t(8;14) che coinvolge c-myc e il gene per la catena

pesante delle immunoglobuline.

Le varianti t(2;8) e t(8;22) coinvolge c-myc e il gene per le catene leggere κ e λ delle

immunoglobuline, rispettivamente.

Promoter Exon 1 Exon 2 Exon 3

Enhancer JH DH VHCH

myc

IgH

Chr 8

Chr 14

Exon 2 Exon 3CHEnhancer IgH-myct(8;14)

cellula normale

cellula tumorale

Mutazioni recessive degli Mutazioni recessive degli oncosoppressorioncosoppressori

e perdita delle perdita dell’’eterozigositeterozigositàà

X

CycCyc/CDK/CDK

I principali I principali tumortumor suppressorsuppressor: : RbRb ……....

ATM/ATRATM/ATR

CHK1/2CHK1/2

p53p53BRCA1/2BRCA1/2

othersothers

SensorsSensors

TransducersTransducers

EffectorsEffectors

UV, IR, UV, IR, stalledstalled replicationreplication

DNA DNA repairrepair

CellCell cyclecycle arrestarrestApoptosisApoptosis

……ee p53p53

EsempiEsempi di di mutazionimutazioni a a caricocarico di di oncosoppressorioncosoppressori

� Silenziamento per metilazione del DNA

�Mutazioni puntiformi - missenso

- nonsenso

- con frameshift

- con effetto sullo splicing

� Traslocazioni cromosomiche

� Perdita di eterozigosi

� Delezioni/Inserzioni

INK4a, BRCA1

Rb/FHIT

FHIT

P53, Rb, BRCA1, etc

INK4a, BRCA1

Mutazioni recessive ���� loss-of-function (es. Rb, APC, BRCA1)

Mutazioni dominanti ���� loss-of function (es. p53)

Mutazioni dominanti ���� gain-of-function (es. p53)

Aploinsufficienza ���� dosaggio genico (es. p21, enzimi di riparazione del DNA)

La genetica della perdita di funzione degli La genetica della perdita di funzione degli oncosoppressorioncosoppressori

funzione mantenuta nell’eterozigote

(ma trasmette la predisposizione allo sviluppo di

tumore)Tetrameri attivi

funzione compromessa nell’eterozigote

In alcuni casi guadagno di funzione

Etero-tetrameri

inattivi

mutante

wild-type

Oncosoppressori attivi come monomeri

(es. pRb)

Oncosoppressori attivi come multimeri

(es. p53)

Mutazioni recessive Mutazioni dominanti

Il gene p53Il gene p53

Genetica:Genetica:

Mutato in più del 50% dei tumori umani

Le mutazioni somatichemutazioni somatiche sono circa due ordini di grandezza più frequenti delle mutazioni

germline (riconosciute ~ 1700 diverse mutazioni di p53 ; le più comuni cadono negli esoni

5-8, codificante per il DNA-binding domain).

La mutazione mutazione germlinegermline è in realtà molto rara e avviene in una sindrome (Li-Fraumeni

syndrome), in cui gli individui eterozigoti hanno un’alta probabilità, se esposti ad agenti

danneggianti o agenti mutageni, di sviluppare tumori (“cancer-prone”).

Sistemi modello:Sistemi modello:

Linee cellulari p53-/-: ipersensibili al danno, difettive per l’induzione di apoptosi,

sviluppano instabilità genetica

Topo p53-/- : vitale, ma altamente “cancer-prone”

MDM2

HPV E6

Ad E1B

SV40 TAg

Box I-V: altamente conservate tra i membri della famiglia p53

La proteina p53: domini strutturali e mutazioniLa proteina p53: domini strutturali e mutazioni

DNADamage

Apoptosis

p53

Transient cell cycle arrest

p53

Re-entry in thecell cycle DNA Repair

p53 p53

p53p53

p53 p53

p53p53Bax, PUMA, etc

p21

p53 p53

p53p53GADD45

p53 guardiano del genomap53 guardiano del genoma

p53 mutants

wild-type p53

mutant p53

Gain-of-functionLoss-of-function

Genetica:Genetica:

Frequenza del retinoblastoma: 1/14.000 nascite � le

cellule tumorali sono prive di entrambi gli alleli Rb-1

funzionali

Variante familiare (40% dei casi)

Variante sporadica (60% dei casi)

Assetto più frequente:

(i) piccola delezione trasmessa dalla linea germinale

(ii) mutazione di senso sull’allele omologo: si origina un clone somatico

Predisposizione allo sviluppo di tumori dominantePredisposizione allo sviluppo di tumori dominante: un cromosoma "difettivo"

predispone i portatori a sviluppare tumori

Sviluppo di tumori recessivoSviluppo di tumori recessivo: il tumore si sviluppa in completa assenza del

prodotto, quando entrambi gli alleli sono deleti e/o mutati

Il gene Rb-1

BRCA1/2BRCA1/2

Genetica:Genetica:

Mutazioni di BRCA1 (Mutazioni di BRCA1 (chrchr 17q21) 17q21) � 85% probabilità di sviluppare carcinoma mammario

ereditari, 40-50% probabilità di sviluppare carcinoma ovarico

Mutazioni generalmente frameshift o nonsense � produzione di una proteina tronca

Carattere autosomico dominante � LOH in tutti i tumori con mutazioni di BRCA1

Genetica:Genetica:

Mutazioni di BRCA2 (Mutazioni di BRCA2 (chrchr 13q12) 13q12) � 80% probabilità di sviluppare carcinoma mammario

ereditario, 10% probabilità di sviluppare carcinoma ovarico; alta incidenza di altri tumori

(es.pancreas)

Carattere autosomico dominante ad alta penetranza � LOH in tutti i tumori con

mutazioni di BRCA2

BRCA2BRCA2 TAD

Rad51

BRCA1BRCA1 TAD

p53 Rad51

BRCA2

P P

CHK2 ATM

UV, γγγγ-ray

CHK2ATM/ATR

BRCA1

P P

DNA-damage repair

Regulation of gene expressionCell-cycle control

APCAPC

Genetica:Genetica:

Mutazioni nella “mutation cluster region” di APC sono correlate con l’insorgenza della

Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) � proteina tronca non più in grado di fosforilare la

β-catenina

La FAP è una malattia autosomica dominante con penetranza completa.

Myc, cyclin D1

FHITFHIT

Genetica:Genetica:

Mutazioni nel gene FHIT (fragile Mutazioni nel gene FHIT (fragile histidinehistidine triadtriad gene) sul chr3 gene) sul chr3 � presenti nel 90% di

pazienti fumatori

Aumentato rischio di sviluppare vari tipi di tumori (polmone, mammella, esofago,

stomaco, reni) e una forma ereditaria di carcinoma prostatico

Sono stati descritte delezioni, traslocationi (3;8), integrazioni da parte del virus HPV e

metilazione del promotore (in fumatori cronici).

Enzima con attività idrosilasica, regola l’apoptosi e la riparazione del DNA

EreditarietEreditarietàà dei tumoridei tumori

(1971 (1971 -- Alfred Alfred KnudsonKnudson))

RETINOBLASTOMA:

Eredità autosomica dominante anche se il carattere è recessivo a livello cellulare

tumore

tumore

LOH

LOH

Teoria del Teoria del ““doppio colpodoppio colpo””

Modified from Wijnhoven et al., 2001

PotentialPotential mechanismsmechanisms ofof loss loss ofof heterozygosityheterozygosity (LOH) (LOH)

Meccanismi di LOHMeccanismi di LOH

= oncosoppressore mutato

DNA helicaseBLM15q26.1Solid tumorsBloom's syndrome

DNA repairATM11q22LymphomaAtaxia telangiectasia

Inhibitor of CDKsp16 (CDKN2)9p21MelanomaFamilial melanoma

Regulates transcriptional

elongation by RNA polymerase IIVHL3p25Renal cancer

von Hippel-Lindau (VHL)

syndrome

DNA repair BRCA213q12Breast cancerFamilial breast cancer 2

Repair of double-strand breaksBRCA117q21Breast cancerFamilial breast cancer 1

Transcriptional repressorWT111p13Wilms’ tumorWilms’ tumor

Linkage to cytoskeletonNF222q12.2Acoustic neuromas,

meningiomas

Neurofibromatosis type 2

(NF2)

GAP for p21 ras proteinsNF117q11.2NeurofibromasNeurofibromatosis type

1 (NF1)

DNA mismatch repairMSH2, MLH1

PMS1, PMS22p16, 3p21 2q32, 7p22Colorectal cancer

Hereditary nonpolyposis

colorectal cancer (HNPCC)

Regulation of β-cateninAPC5q21Colorectal cancerFamilial adenomatous

polyposis (FAP)

Transcription factor; response to

DNA damage and stress;

apoptosis

p53 (TP53)17p13.1Sarcomas, breast

cancerLi-Fraumeni Syndrome (LFS)

Cell cycle and transcriptional

regulationRB113q14.3RetinoblastomaFamilial retinoblastoma

Proposed function of gene Proposed function of gene

productproductClonedCloned genegene

ChromosomeChromosome

locationlocationPrimaryPrimary tumortumorSyndromeSyndrome

In most families, the tumour predisposition segregates as an

autosomal dominant trait with high (90%) penetrance

Rare instances of familial retinoblastoma with low penetrance and variable

expressivity have been described.

Pedigree di una forma di Pedigree di una forma di retinoblastomaretinoblastoma familiarefamiliare

A A typicaltypical pedigree of pedigree of LiLi--FraumeniFraumeni syndromesyndrome

bilateral breast cancer

diagnosed at age 40

brain tumor

at age 35

soft tissue sarcoma at age 19

and breast cancer at age 33

breast cancer

at age 32

osteosarcoma

at age 8leukemia

at age 2

soft tissue sarcoma

at age 3

Caratteristiche generali dei tumori familiari ereditari

� Stesse (o correlate) forme di tumori in due o più persone della stessa famiglia

� Comparsa precoce del tumore in una o più persone della stessa famiglia

� Tumori bilaterali in organi doppi

� Tumori primari multipli nello stesso individuo

� Trasmissione autosomica dominante della suscettibilità allo sviluppo di tumori

http://http://www.sanger.ac.ukwww.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census//genetics/CGP/Census/

Molecular signatures for specific cancers

~350 cancer genes/ ~ 25000 total genes

microRNAmicroRNA e tumorie tumori

microRNA come oncogeni e geni oncosoppressori

miRNA profiling come STRUMENTO CLINICO

� DIAGNOSIS Disease identification

Good prognosis

Bad prognosis

Metastatic cancer of

unknown primary site

mRNA profiling

miRNA profiling potere predittivo

miRNA profiling

� PROGNOSIS Disease evolution

La terapia anti-tumorale

� Chemio/radio-terapia (induzione di morte cellulare)

� Inibitori di tirosine-chinasi

� Agenti differenzianti (es. agenti demetilanti il DNA, retinoidi etc.)

� Terapie farmacologiche (es. inibitori dell’angiogenesi, inibitori del

proteasoma, etc)

� Vettori per “target-are” nel tumore farmaci o geni

� Terapia genica (es. trasduzione di p53)